JP3264757B2

JP3264757B2 - 蛍光化合物

Info

Publication number: JP3264757B2
Application number: JP27995193A
Authority: JP
Inventors: アルバートフイレイモンド; サラシュヴェンツァーキャスリン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-09
Publication date: 2002-03-11
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: CA2108919A1; JPH06211867A; JP2002022741A; DE69329963D1; EP0597333A3; ES2155825T3; DE69329963T2; US5315015A; EP0597333A2; EP0597333B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は蛍光偏光免疫検定法にお
いて改良された蛍光を有する化合物に関し、かつまたそ
の化合物を利用する免疫検定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】競合的結合免疫検定法は周知でありかつ
試料中のリガンドを定量的に検出するために利用するこ
とができる。一般に、免疫検定法の手順は問題のリガン
ドのアナログに標識、例えば、蛍光標識、または放射性
標識（例えば、トリチウム、³²Ｐ、¹²⁵Ｉまたは¹⁴Ｃ）
を付けることを含む。この標識アナログ（便宜上「トレ
ーサー」と名づける）を問題のリガンドを含むと疑われ
る試料に混入する。この試料に、前記リガンドとリガン
ドアナログの両者を共に認識することができる抗体を混
合する。試料混合物中で、リガンドとリガンドアナログ
は限定された数の抗体結合部位に対して競合する。試料
中のトレーサー抗体複合体の測定量は試料中におけるリ
ガンド量の逆関数である。

【０００３】トレーサーが蛍光標識を有する場合には、
トレーサー抗体複合体を慣用の蛍光偏光免疫検定法（Ｆ
ＰＩＡ）を使用して検出することができる。一般的な意
味で、蛍光標識トレーサーが直線偏光により励起される
と、放出された光の観察される偏光度はトレーサーの回
転速度に逆比例する。結合されたトレーサー分子に比較
して、結合されなかったトレーサー分子はより速く回転
するので、これは放出された光を抗体に結合されたトレ
ーサー分子からの光よりも高度に偏光解消させる。偏光
された蛍光の放出度はＦＰＩＡ法により容易に測定され
ることができ、これは試料中に存在するトレーサー抗体
複合体の量に比例することになる。かくして、ＦＰＩＡ
は競合的結合免疫検定において生成したトレーサー抗体
複合体の量を定量的に測定するために使用することがで
きる。

【０００４】ＦＰＩＡに役立つ多くの種類の蛍光標識ト
レーサーが当業界に公知である。例えば、米国特許第
４，６６８，６４０号はカルボキシフルオレセイン誘導
体を記載しており、また米国特許第４，２５５，３２９
号は蛍光標識にリガンドアナログを結合させる結合基を
記載している。このような結合基は一般にカルボキシメ
トキシイミノ、アセチルグリシル、ブチリルグリシル、
グリシル、クロトニルグリシル、アセチル、クロトニ
ル、スクシンジオイル、およびオキサリルとして記載さ
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は次式のトレー
サー化合物に関する。

【化３】式中、Ｆは蛍光化合物であり；Ｙは−ＮＨ−または単共
有結合であり；Ｚは少なくとも１つの極性親水基により
置換される、２〜１０の炭素原子を有する直鎖または分
枝鎖アルキレン結合基であり；Ｑは酸素または硫黄であ
り；Ｘは対応するリガンドに対して特異的な抗体により
識別されることができるリガンド・アナログである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明はさらに生体液
（例えば、尿、血漿、血清、脊髄液、羊膜液含む）の試
料中のリガンドを検出する方法に関する。この方法は試
料を式Ｉの化合物と混合する段階およびリガンドおよび
リガンドアナログの両者に対して特異的抗体と混合する
段階、および前記試料中のリガンドの濃度を蛍光偏光法
により測定する段階を包含する。

【０００７】ここで使用される、用語「蛍光化合物」
は、適当な波長の偏光により励起されるとき、一般的意
味においてその回転速度に逆比例する偏光度を有する蛍
光を放出するすべての慣用の化合物を意味する。例え
ば、Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚによる「蛍光分光学の原
理」（“ＰｒｉｃｉｐｌｅｓｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，１９８３）を参照されたい。本発明にお
ける使用に適する式Ｉ中のＦにより表わされる代表的な
蛍光化合物には、例えば、フルオレセイニル、置換フル
オレセイニル、ロダミニル、置換ロダミニル、およびナ
フトフルオレセイニルがある。特に好ましいものは５−
フルオレセイニルまたは６−フルオレセイニルである。
しかし前記の特性を有する化合物はいずれも本発明にお
ける使用に適する。

【０００８】ここで使用される、用語「リガンド」は生
物学的意義を有し、生体液試料中のその存在が本発明を
用いることにより検出される、通常のタンパク質を含ま
ない低分子量化合物のいずれか、例えば誤用の薬物およ
び治療用化合物を意味する。例えば、米国特許第４，２
５５，３２９号、米国特許第４，６６８，６４０号、Ｃ
ｏｌｂｅｒｔｅｔａｌ，Ａｎａｌｙｓｔ，１１２
（１９８７），１４８３−１４８６，Ｄａｎｄｌｉｋｅ
ｒｅｔａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
９７３，１０，２１９−２２７を参照されたい。また例
えば、Ｆａｉｒｃｌｏｕｇｈ＆Ｃａｎｔｏｒ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４８（１９
７８），３４７−３７９頁も参照されたい。本発明を用
いて試料中において検出し得るリガンドの代表的例には
限定する訳ではなく、テトラヒドロカンナビノイド、麻
酔剤、Ｎ−アセチルプロカインアミド、カルバマゼピ
ン、フェニトイン、およびそれぞれの代謝産物がある。

【０００９】「タンパクを含まない低分子量化合物」に
よって意味されるものは、少なくとも１つの極性官能基
を有し、その構造中にアミノ酸部分を含む又は含まな
い、典型的には２０００より少ない分子量を有する有機
化合物であって、それが異物である動物に導入された場
合に、それ自身では一般に免疫応答を誘発することがで
きない有機化合物である。

【００１０】用語「リガンドアナログ」により意味され
るものは、リガンドに化学構造において十分に類似して
おり、その結果前記リガンドを良好な特異性をもって識
別するある抗体がまた前記リガンドアナログにも良好な
特異性をもって識別するような化合物である。用語「リ
ガンドアナログ」はリガンド自体をまた包含してもよ
い。例えば、式Ｉの中のＸは６ａ，７，１０，１０ａ−
テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３
−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ−〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−
イルまたは６ａ，７，８，１０ａ−テトラヒドロ−１−
ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−
ジベンゾ−〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イルのようなテトラ
ヒドロカンナビノイドアナログてありうる。

【００１１】式ＩにおけるＺによって表わされる連結
基、すなわち「少なくとも１つの極性親水基により置換
される、２〜１０の炭素原子を有する直鎖または分子鎖
アルキレン連結基」には少なくとも１つの極性親水基に
よって置換される、エチレン、プロピレン、ブチレン、
ペンチル、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニ
レン、デシレン、およびそれらのすべての官能異性体
（例えば、イソプロピレン、ｔ−ブチレンなど）があ
る。

【００１２】「極性親水基」により意味されるものは少
なくとも２つの原子を包含する官能基であり、前記原子
のうち少なくとも１つはヘテロ原子（例えば、酸素、窒
素、硫黄、またはリン）でありかつ前記官能基はそれ自
身の中でまたはそれ自身と分子の残りの部分（例えば、
本発明のアルキレン連結基）との付着点との間のいずれ
かにおいて電荷の分極の特性を有し、典型的には水分子
に対し、または他の極性基に対して水素結合を形成する
ことができる、これについては古典的に例えば、Ｌｉｎ
ｕｓＰａｕｌｉｎｇにより“ＴｈｅＮａｔｕｒｅ
ｏｆｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｏｎｄ”，Ｃｏｒｎ
ｅｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，第３版、
１９６０，第１２章において記載されかつ論じられてい
る。本発明に適切な極性基に含まれるものは（但し、こ
れらに限定されない）ヒドロキシ、カルボキシ、カルボ
ン酸エステル（−Ｃ（Ｏ）ＯＲ′，Ｒ′＝アルキル）、
カルバモイル、チオカルバミル、アミノ（第１級、第２
級、または第３級）、アシルアミノ、スルフィノ、スル
ホ、スルファミル、ホスホノ、並びにヒドロキシアルコ
キシとアミノアルコキシであってそれぞれ１〜８の炭素
原子を有する基である。特に好ましい極性親水基はヒド
ロキシ、カルボキシ、カルボン酸エステル、アミノ（第
１級、第２級、または第３級）、アシルアミノ、１〜８
の炭素原子を有するヒドロキシアルコキシ、および１〜
８の炭素原子を有するアミノアルコキシである。

【００１３】ここで使用される、用語「置換される」と
は、アルキレン連結基の少なくとも１つの水素原子が極
性親水基に取り替えられることを意味する。

【００１４】用語「アルキル」によって意味されるもの
は、式−Ｃ_nＨ_2n+1（ｎは１から８までの整数）の直鎖
または分枝鎖脂肪族炭化水素基のいずれかである。

【００１５】「アルコキシ」により意味されるものは、
式−Ｏ−Ｃ_mＨ_2m+1（ｍは１から８までの整数）の直鎖
または分枝鎖の脂肪族炭化水素基のいずれかである。

【００１６】用語「アシルアミノ」は、式−Ｎ（Ｒ₁）
−Ｃ（Ｏ）−Ｒ₂（式中Ｒ₁はＨまたはアルキルであ
り、Ｒ₂はＨまたはアルキルまたはアルコキシである）
を有する基を意味する。

【００１７】本発明の競合結合免疫検定法において使用
される抗体は慣用の周知の方法を用いて生成されかつ精
製されることができる。そのような方法は、例えばＣｏ
ｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５
６、ｐｐ．４９５−４９７（１９７５）；“Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ”，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ＆Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ
ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ｐｐ．５５−１４４（１９８８）；Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ＆Ｍ．Ｃｈａｓｅ，“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ”，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ，Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐ．３，（１９６７）；およ
びＳ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，“ｍｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１，Ｃｈａｐ．５
７，ｐｐ．５９６−６１５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８６）に記載されてい
る。一般に、ある免疫原が動物に投与されて免疫原に対
する免疫応答を引き出す。問題のリガンドとリガンドア
ナログの両者に対して特異的な抗体はリガンドとリガン
ドアナログの同じ一般構造を有する免疫原を使用するこ
とにより産生することができる。免疫原に対して産生さ
れるポリクローナル抗体は動物の抗血清から得られ、そ
れから周知の方法を用いて精製される。免疫原に対する
モノクローナル抗体は周知の方法を用いてハイブリドー
マ細胞から得ることができる。

【００１８】テトラヒドロカンナビノイドのリガンドお
よびテトラヒドロカンナビノイドのリガンドアナログに
対するポリクローナル抗体を産生するために適切な免疫
原に含まれるものは次式の化合物であるが、但しこれら
に限定されない。

【化４】〔ＫＬＨ〕＝カギアナカサガイの血青素（Ｋｅｙｈｏｌ
ｅＬｉｍｐｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎ）

【００１９】羊または山羊は上記化合物により免疫感作
されることができ、そして当業界に周知の方法により抗
血清を得ることができる。

【００２０】テトラヒドロカンナビノイドのリガンドお
よびテトラヒドロカンナビノイドのリガンドアナログに
対するモノクローナル抗体の産生は上記の免疫原（この
場合にＫＬＨは牛のチログロブリンに取り替えられる）
を用いて作用されることができる。それからマウスが前
記の免疫原により免疫感作されることができ、そして必
要なクローン融合が当業界に周知の方法を用いて行われ
た後にモノクローナル抗体を得ることができる。

【００２１】上記の免疫原は単なる説明のための例に過
ぎない、そしていずれかのタンパクまたはポリアミノ酸
もまた当業者に明らかな方法で担体として使用されう
る。

【００２２】本発明の好ましい連結基は２−ヒドロキシ
プロピレン、カルボキシエチレン、１−カルボキシペン
チレン、１−エチル−カルボキシラートペンチレン、お
よび１−カルボキシブチレンである。

【００２３】好ましいトレーサーは、Ｑが酸素でありか
つＺが２−ヒドロキシプロピレンであるものである。さ
らに好ましいトレーサーは次の式を有するものである。トレーサーＩａ

【化５】トレーサーＩｂ

【化６】トレーサーＩｃ

【化７】トレーサーＩｄ

【化８】トレーサーＩｅ

【化９】トレーサーＩｆ

【化１０】トレーサーＩｇ

【化１１】トレーサーＩｈ

【化１２】トレーサーＩｉ

【化１３】トレーサーＩｊ

【化１４】トレーサーＩｋ

【化１５】トレーサーＩｌ

【化１６】トレーサーＩｍ

【化１７】

【００２４】トレーサーＩｃはテトラヒドロカンナビノ
イド（ＴＨＣ）の部分において、（−）−６ａＲ，１０
ａＲの異性体であり、そしてトレーサーＩｉはＴＨＣ部
分におけるラセミ体でありかつトレーサーＩｃとＩｆの
１：１混合物である。

【００２５】式ＩのトレーサーはＦＰＩＡ法に使用され
たとき著しく良好な強度を有することによりおよび著し
く大きなスパンを与えることにより当業界に公知の化合
物にまさる改良された特性を備えている。そのスパン
は、添加されたリガンドの濃度増加に伴う観測されたｍ
Ｐ（蛍光偏光）単位における減少総量の尺度である。ス
パンが大きければ大きいほど、測定の精度も良くなる。

【００２６】前記の強度は、バックグランド上の信号
（ｓｉｇｎａｌ）の強さの尺度である。したがって、強
度が高ければ高いほど、測定の精度も高くなる。全体の
スパンが大きいとき、検定におけるリガンドまたはトレ
ーサーの濃度の小さな変化は、観測されるｍＰ値の著し
く大きな変化を生む。これにより臨床試料に典型的に存
在するリガンド（薬物被験体）の少量の測定において著
しく大きな感度と精度がもたらされる。トレーサーの強
度が高いとき、信号対雑音比は（ｓｉｇｎａｌｔｏｎ
ｏｉｓｅｒａｔｉｏ）は高い。これにより検定におい
て、低い強度を示すトレーサーに比較して、良好な信号
対雑音比を生じさせるために検定に使用するトレーサー
必要量の減少を可能にする。検定に使用されるトレーサ
ーの量のこのような減少は一般的な意味において、比較
的少ないトレーサー分子（それぞれはその構造の部分と
してリガンドアナログを含む）が、分析される試料中に
存在する限定された量の抗体にリガンドと競合して結合
するため利用できることを意味する。これは次には存在
するリガンドの増加と共に、特にリガンドの低い濃度に
おいて、観測される蛍光偏光の著しく急勾配の減少に寄
与する。このことは標準曲線のスパンの増加に役立ちか
つ免疫検定の感度の増加に役立つ。

【００２７】本発明のトレーサーは後記の一般反応式１
−７およびその後に続く実施例に従って製造することが
できる。一般に、それらのトレーサーは、６ａ，７，１
０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−
ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピ
ラン−９−カルボン酸または６ａ，７，８，１０ａ−テ
トラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−
ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カル
ボン酸のいずれかと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと
をカルボジイミドカップリング剤を用いて反応させるこ
とにより製造することができる。次に生成する化合物を
ジアミノ連結剤化合物と反応させ、引き続いて５−また
は６−カルボキシ−フルオレセインＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルと、あるいは５−または６−イソシ
アナトフルオレセインと、あるいは５−または６−イソ
チオシアナトフルオレセインと反応させることができ
る。

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【００２８】

【実施例】次の実施例は本発明の説明のためのものであ
って、その範囲を限定するためのものではない。特に示
さないかぎり、すべての例は記載のとおりに実施した。
例の中で使用されるとき、「後処理（ｗｏｒｋ−ｕ
ｐ）」は反応の消滅または停止および有機化学の熟練者
に周知の方法による反応から生成物の最初の単離を意味
し、「室温」とは約２３℃を意味する。さらに、すべて
の溶媒比は体積比として表わす。

【００２９】例１（トランス−ラセミック）−６ａ，
７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９（８Ｈ）−オン（Ｉ）の分割

【００３０】反応式１に関して、１００ｍｌ乾燥トルエ
ン中５．００ｇ（０．０１６モル）の（トランス−ラセ
ミック）−６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１
−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ
−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９（８Ｈ）−オン（Ｆａ
ｈｒｅｎｈｏｌｔｚ，Ｌｕｒｉｅ＆Ｋｉｅｒｓｔｅ
ａｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６７，８
９，５９３４；ＭｃＮａｌｌｙ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆
Ｕｓａｔｅｇｕｉ，米国特許第４，８３３，０７３
号）の溶液に３．８０ｇ（０．０１７モル、１．０５当
量）の（＋）−ジイソプロピルＬ−タルトレート（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）および０．２５ｇのｐ−トルエンスルホ
ン酸−水和物（ＭＣＢ）を加えた。この溶液を還流下に
沸とうさせ、同時に反応中生成する水をジーン・スター
ク（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ）トラップの中に採取した。
１８時間後、褐色の反応混合物を室温に冷却させ、約２
０ｍｌの量にまで真空濃縮してからガラス炉過器中のシ
リカゲル６０のプラグ（３．５ｃｍ深さ×４．５ｃｍ直
径）を通過させ、１００ｍｌのトルエン次いで１００ｍ
ｌのヘキサンを通して洗い、そしてその洗液を一緒にし
た（フラクション１）。次に前記シリカゲルプラグをさ
らに２００ｍｌのジエチルエーテルで溶出させた（フラ
クション２）、次に追加して２００ｍｌのジエチルエー
テルで溶出させた（フラクション３）。次にフラクショ
ン１を真空蒸発させると５．５２ｇの発泡体を生じ、こ
れは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析により主と
して（６ａＳ，１０ａＳ）異性体（ＩＩＩ）および（６
ａＲ，１０ａＲ）異性体（ＩＩ）を共に含むことが示さ
れた。フラクション２を真空蒸発させると３．７２ｇの
発泡体を与え、これは薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）分析により主として（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を共
に含むことが示された。フラクション１および２から物
質を一緒にしてからＷａｔｅｒＰｒｅｐ５００Ａ
ＬＣシステムのシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、
ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）−ヘキサン（５：９５〜１
５：８５体積比）により勾配溶離し、同時に混合したフ
ラクションを再クロマトグラフィーにかけると、極性の
弱い（６ａＳ，１０ａＳ）異性体（ＩＩＩ）（２．９２
ｇ，３５％）を灰白色の発泡体として得た。その分析試
料は〔α〕_D−５３°（ＣＨＣｌ₃）、Ｍ⁺５３２．３
０１３（計算値５３２．３０３６）を有していた。そし
て極性の強い（６ａＲ，１０ａＲ）異性体（ＩＩ）
（２．３１ｇ，２７％）灰白色の発泡体として得た。こ
の分析試料は〔α〕_D−５６°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺５
３２．３００４（計算値５３２．３０３６）を有した。
さらにそれらと共に０．７９ｇ（９％）の純度のより低
い（ＩＩ）を得た。

【００３１】例２（６ａＲ，１０ａＲ）−６ａ，７，
１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６
−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕
ピラン−９（８Ｈ）−オン（ＩＶ）

【００３２】引き続き反応式１に関し、精製テトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）（４０ｍｌ）中タルトレートケター
ル（ＩＩ）（０．７６ｇ，１．４３ミリモル）の溶液に
アルゴン下に３Ｎ過塩素酸水溶液（２５ｍｌ）を加えて
から、その透明な溶液を還流冷却器の下で７０℃に１
７．５時間加熱した。冷却した（室温に）、淡黄色溶液
を水（４０ｍｌ）で希釈し、固形ＮａＨＣＯ₃を慎重に
加え（泡立てながら）飽和させ、生じた溶液を４回Ｅｔ
ＯＡｃで抽出した。各有機層を一緒に集めて飽和ＮａＣ
ｌで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させてから真空蒸発さ
せると５４０ｍｇの無色の結晶性固体を得た。これを室
温でメチレンクロリド（約５ｍｌ）に浸し、その結果生
成した白い固形物を含む溶液をシリカゲル６０のプラグ
の頂上に注いだ。このシリカに２５０ｍｌのＥｔＯＡｃ
−ヘキサン（３：７）混液を通して洗浄してから、その
淡黄色炉液を真空濃縮すると４４１ｍｇの淡黄色発泡体
を得た。これをシリカ上で中圧液体クロマトグラフィ
（ＭＰＬＣ）にかけ、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（３：７）
混液で溶出させて４００ｍｇ、８９％、の純（６ａＲ，
１０ａＲ）−ケトン（ＩＶ）を白色結晶性発泡体として
得た。融点１１４−１１７℃；〔α〕_D−９１°（ＣＨ
Ｃｌ₃）、Ｍ⁺３１６．２０３２（計算値３１６．２０
３８）；分析結果，Ｃ₂₀Ｈ₂₈Ｏ₃とした計算値：Ｃ，７
５．９１；Ｈ，８．９２，測定値：Ｃ，７５．９６；
Ｈ，８．８１％。

【００３３】例３（６ａＳ，１０ａＳ）−６ａ，７，
１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６
−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕
ピラン−９（８Ｈ）−オン（Ｖ）

【００３４】（ＩＶ）に関して述べかつ反応式１に示し
た手順と同様にして、（ＩＩＩ）（０．６０ｇ，１．１
３ミリモル）を蒸留したＴＨＦ（１０ｍｌ）中で３Ｎ
ＨＣｌＯ₄（１０ｍｌ）により７０℃でアルゴン下に３
時間加水分解させると、後処理の後、３２６ｍｇの淡黄
褐色のガムを生成した。これをシリカ上の分取ＴＬＣに
かけ、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（３：７）混液で溶出する
と、主生成物バンドから、２２０ｍｇ，６２％、の式
（Ｖ）に示された（６ａＳ，１０ａＳ）−ケトンを得
た。その分析用試料を−２０℃でヘキサンから再結晶さ
せると無色の針状物を生成した。融点１１５−１１７
℃；〔α〕_D＋９２°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺３１６．２
０３４（計算値３１６．２０３８）；分析結果、Ｃ₂₀Ｈ
₂₈Ｏ₃とした計算値：Ｃ，７５．９１；Ｈ，８．９２、
測定値：Ｃ，７５．７０；Ｈ，９．０９％。

【００３５】例４（６ａＲ，９Ｓ，１０ａＲ）−６
ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９
−ジヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボニトリル
（ＶＩ）および（６ａＲ，９Ｒ，１０ａＲ）−６ａ，
７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９−ジ
ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−
ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボニトリル（ＶＩ
Ｉ）

【００３６】反応式２に関して、無水メタノール（２０
ｍｌ）中（６ａＲ，１０ａＲ）−ケトン（ＩＶ）（０．
３０ｇ，０．９５ミリモル）の溶液にシアン化ナトリウ
ム（０．３０ｇ，６．１２ミリモル）を加えてから、そ
の混合物をアルゴン下に室温で１７時間攪拌すると無色
の溶液を生成した。次に氷酢酸（０．３８ｍｌ）を加え
ると淡黄色の溶液を生じた。これを室温で３時間攪拌す
ると殆ど無色の溶液を生じた。次に塩化水素ガスを泡立
てて通気してｐＨ１にして、今や白色沈殿を含む反応混
合物を室温で２４時間攪拌し、真空蒸発させて乾固に至
らせ、そして残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（７０ｍｌ）と水（３
０ｍｌ）との間に分配した。その水層をさらにＣＨ₂ Ｃ
ｌ₂（２×３０ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機相を
乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄ ）てから、真空蒸発させるとジ
アステレオマーのシアノヒドリン（ＶＩ）と（ＶＩＩ）
の３：２混合物（３３５ｍｇ）を灰白色の結晶性発泡体
として得た。

【００３７】この発泡体の一部をシリカ（Ｍｅｒｃｋ）
上の分取ＴＬＣにかけ、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ−ヘキサ
ン（２０：１０：７０）混液により溶出させると極性の
弱い（６ａＲ，９Ｒ，１０ａＲ）異性体（ＶＩＩ）を白
色発泡体として、〔α〕_D−１０６°（ＣＨＣｌ₃），
（Ｍ＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）３４４．２２２０（計算値３４
４．２２２６）、および極性の強い（６ａＲ，９Ｓ，１
０ａＲ）異性体ＶＩをもまた白色発泡体、〔α〕_D−５
４°（ＣＨＣｌ₃），（Ｍ＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）３４４．
２２１３（計算値３４４．２２２６）を得た。

【００３８】例５（６ａＲ，９Ｓ，１０ａＲ）−６
ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９
−ジヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸メチル
エステル（ＶＩＩＩ）および（６ａＲ，９Ｒ，１０ａ
Ｒ）−６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ
−１，９−ジヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペン
チル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン
酸メチルエステル（ＩＸ）

【００３９】さらに引き続いて反応式２に関し、（Ｖ
Ｉ）と（ＶＩＩ）の混合物（３２８ｍｇ，０．９６ミリ
モル）の無水メタノール（２０ｍｌ）中溶液を氷浴中で
冷却して、これに塩化水素ガスを泡立て通して約１時間
で中和させた。その密封したフラスコを０℃に７０時間
維持した。それから塩酸（６Ｎ，１０ｍｌ）を加え、反
応混合物を室温で１６時間攪拌してから真空蒸発させて
ほぼ乾固に至らせた。残渣を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）
（７０ｍｌ）と水（４０ｍｌ）の間に分配し、水相をＮ
ａＣｌで飽和させ、各相を分離してから、さらに水相を
ＥｔＯＡｃにより抽出した。一緒にした有機相を連続し
て水、飽和ＮａＨＣＯ₃および飽和ＮａＣｌで洗浄し、
乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、そして真空蒸発させると３４
３ｍｇ，９５％の（ＶＩＩＩ）と（ＩＸ）の混合物を灰
白色の発泡体として得た。

【００４０】一部分をシリカ（Ｍｅｒｃｋ）上の分取Ｔ
ＬＣにかけ、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ−ヘキサン（２：
１：７）混液により溶出させると極性の弱い（６ａＲ，
９Ｒ，１０ａＲ）異性体（ＩＸ）をガラス体、〔α〕_D
−６７°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺３７６．２２５７（計算
値３７６．２２５０）、として、および極性の強い（６
ａＲ，９Ｓ，１０ａＲ）異性体（ＶＩＩＩ）をガラス
体、〔α〕_D−６１°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺３７６．２
２３８（計算値３７６．２２５０）、として得た。

【００４１】例６（６ａＲ，１０ａＲ）−６ａ，７，
１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６
−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕
ピラン−９−カルボン酸メチルエステル（Ｘ）

【００４２】さらに引き続き反応式２に関し、乾燥四塩
化炭素（７５ｍｌ）中トリフェニルホスフィン（１．１
８ｇ，４．５ミリモル）および（ＶＩＩＩ）と（ＩＸ）
の混合物（３３５ｍｇ，０．８９ミリモル）の混合物の
溶液を還流下にかつアルゴン下で１８時間煮沸した。冷
却した（室温に）反応混合物（いまトリフェニルホスフ
ィン酸化物を含んでいる）を真空蒸発により乾固させ
た。褐色の斑点ある残渣をメタノール（１００ｍｌ）中
に再び溶解させてから、室温で４．５時間攪拌し、そし
て真空蒸発により乾固させた。その残渣を８ｍｌのメチ
レンクロリド中に溶解させてから、シリカゲル６０のプ
ラグの頂上に置いた。そのシリカを何回かＥｔＯＡｃ−
ヘキサン（３：７）混液を通して洗い、生成物を含む各
フラクションを、シリカ上のＴＬＣにより示されるよう
に、プールしてから真空蒸発させると、２９７ｍｇ，９
３％、の粗製ながらかなり純粋の（Ｘ）を灰白色の結晶
性発泡体として得た。試料をさらにシリカ上のクロマト
グラフィーにより精製し、注意深くＣＨＣｌ₃−ＭｅＯ
Ｈ−ヘキサン（２：１：７）で溶出させると純粋の
（Ｘ）を白色発泡体、〔α〕_D−２８３°（ＣＨＣ
ｌ₃），Ｍ⁺３５８．２１３８（計算値３５８．２１４
４）、として得た。

【００４３】例７（６ａＲ，１０ａＲ）−６ａ，７，
１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６
−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕
ピラン−９−カルボン酸（ＸＩ）

【００４４】さらに引続き反応式２に関し、メタノール
（２５ｍｌ）中（Ｘ）（２９０ｍｇ，０．８１ミリモ
ル）の溶液をアルゴンで０．５時間スパージした。水酸
化ナトリウム（２Ｎ，２０ｍｌ）をアルゴンでスパージ
してから加え、その結果生じた溶液を室温で１５時間攪
拌した。その溶液を次に６ＮＨＣｌによりｐＨ１まで
酸性にしてから真空蒸発させてメタノールを除いた。水
（１０ｍｌ）を加えてからその水相を３回酢酸エチルで
抽出した。それら有機抽出液を一緒にして飽和ＮａＣｌ
で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させてから真空蒸発させ
ると２９６ｍｇの淡褐色の発泡体を得た。この物質をＣ
Ｈ₂ Ｃｌ₂−石油エーテル（３０／６０）混液から再結
晶させると多くの不純物を含む、２７ｍｇの白色結晶を
得た。次に、母液を蒸発させると２６９ｍｇの殆ど純粋
の（ＸＩ）を発泡体として得た。試料をさらにシリカ上
のクロマトグラフィーにより精製し、ＥｔＯＡｃ−ヘキ
サン−ＭｅＯＨ（５：３：２）混液で溶出させると純粋
の（ＸＩ）、〔α〕_D−２８６°（ＥｔＯＨ）（Ｍｅｃ
ｈｏｕｌａｍらはＥｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２９：１１
９３（１９７３）において〔α〕_D−２８７°（ＥｔＯ
Ｈ）を記載している）、〔α〕_D−２３８°（ＣＨＣｌ
₃），Ｍ⁺３４４．１９６３（計算値３４４．１９８
８）を得た。

【００４５】例８（６ａＲ，１０ａＲ）−１−
〔〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒ
ドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジ
ベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕オキ
シ〕−２，５−ピロリジンジオン（ＸＩＩ）さらに反応式２に関して、乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）（４ｍｌ）中（ＸＩ）（５０ｍｇ，０．１４５ミ
リモル）の溶液にアルゴン下で、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ；１２０ｍｇ，０．５８ミ
リモル）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ；１０２ｍｇ，０．８９ミリモル）とを加えた。そ
の溶液を室温で１時間、次に４０℃で３時間攪拌し、そ
の後シリカ上のＴＬＣはもはや出発原料が残っていない
ことを示した。反応混合物を室温に冷却させ、ジシクロ
ヘキシル尿素の結晶性沈殿を濾別し、そして濾液を真空
蒸発させると固化するガムを生成した。シリカ上の分取
ＴＬＣ、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：１）混液による抽
出は５７ｍｇの主バンドから単離された固体物質を与え
たが、¹ＨＮＭＲにより４４ｍｇ、６９％のＮＨＳエ
ステル（ＸＩＩ）および１３ｍｇのジシクロヘキシル尿
素を含むことが示された。この混合物をそれ以上の精製
を行わずに、例１４に記載のように化合物（ＸＸＩ）
（トレーサーＩｃ）の製造に使用した。

【００４６】他の一方法として、２当量の１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒ
ドロクロリド（ＥＤＣ−ＨＣｌ）を（ＸＩ）の反応のカ
ップリング剤として１．５当量のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドとＣＨ₂ Ｃｌ₂中で還流させながら２４時間混
合した。その結果生成する反応混合物をＥｔＯＡｃで希
釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ₃、飽和ＮａＣｌで洗い、Ｎ
ａ₂ＳＯ₄上で乾燥させてから真空蒸発させるとガムを
生じた。これをシリカ上のクロマトグラフィーにかけ、
ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：１）混液で溶出させると
（ＸＩＩ）を灰白色の発泡体、〔α〕_D−２０８°（Ｃ
ＨＣｌ₃），（Ｍ＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）４４２．２２６０
（計算値４４２．２２３０）を得た。

【００４７】例９（６ａＳ，９Ｓ，１０ａＳ）−６
ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９
−ジヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボニトリル
（ＸＩＩＩ）および（６ａＳ，９Ｒ，１０ａＳ）−６
ａ，７，８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９
−ジヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボニトリル
（ＸＩＶ）

【００４８】反応式３に関して、例４において化合物
（ＶＩ）と（ＶＩＩ）について記載された通りの同じ手
順により、６ａＳ，１０ａＳ−ケトン（Ｖ）（１００ｍ
ｇ，０．３１６ミリモル）とＮａＣＮ（１００ｍｇ，
２．０４ミリモル）を乾燥メタノール（５ｍｌ）中で反
応させてから、前記のように後処理すると１０３ｍｇ，
９５％、の（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）の３：２混合物を
灰白色の結晶性発泡体、（Ｍ＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）３４
４．２２２９（計算値３４４．２２２６）として得た。

【００４９】例１０（６ａＳ，９Ｓ，１０ａＳ）−６ａ，７，８，
９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９−ジヒドロキ
シ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸メチルエステル（Ｘ
Ｖ）および（６ａＳ，９Ｒ，１０ａＳ）−６ａ，７，
８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−１，９−ジヒド
ロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベ
ンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸メチルエステル
（ＸＶＩ）さらに引き続いて反応式３に関して、例５において（Ｖ
ＩＩＩ）および（ＩＸ）の製造について記載の通り同じ
方法を適用して、（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）（１００ｍ
ｇ，０．２９１ミリモル）の混合物をＨＣｌ（ガス）で
飽和したメタノール（５ｍｌ）中で４日間反応させる
と、後処理の後、１０７ｍｇ，９８％粗収率、の（Ｘ
Ｖ）と（ＸＶＩ）の混合物を灰白色の発泡体として得
た。

【００５０】さらにこの物質の一部分をシリカ上の分取
ＴＬＣにより精製し、ヘキサン−ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ
（７５：２０：５）混液により注意深く溶出すると、
（６ａＳ，９Ｓ，１０ａＳ）異性体（ＸＶ）を極性の弱
いバンドから白色発泡体、〔α〕_D＋６７°（ＣＨＣｌ
₃），Ｍ⁺３７６．２２３３（計算値３７６．２２５
０）として、および（６ａＳ，９Ｒ，１０ａＳ）異性体
（ＸＶＩ）を極性の強いバンドからやはり白色発泡体、
〔α〕_D＋６６°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺３７６．２２３
４（計算値３７６．２２５０）、として得た。

【００５１】例１１（６ａＳ，１０ａＳ）−６ａ，
７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸メチルエステル（Ｘ
ＶＩＩ）

【００５２】（Ｘ）を製造するために述べたものと同じ
方法に従いおよび反応式と例６に従って、（ＸＶ）と
（ＸＶＩ）の混合物（１０１ｍｇ，０．２６８ミリモ
ル）とトリフェニルホスフィン（Ａｌｄｒｉｃｈ；３５
２ｍｇ，１．３４ミリモル）を四塩化炭素（１０ｍｌ）
中で還流させながら１６時間反応させると、後処理の後
９１ｍｇ，９５％、のエステル（ＸＶＩＩ）を白色発泡
体として生成した。一試料をさらにシリカ上の分取ＴＬ
Ｃにより精製し、ヘキサン−ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（７
５：２０：５）混液で注意深く溶出すると純粋の（ＸＶ
ＩＩ）を白色の発泡体、〔α〕_D＋２９８°（ＣＨＣｌ
₃），Ｍ⁺３５８．２１６９（計算値３５８．２１４
４）として得た。

【００５３】例１２（６ａＳ，１０ａＳ）−６ａ，
７，８，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ
−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸（ＸＶＩＩＩ）

【００５４】例７において（ＸＩ）を製造するため前記
した同じ方法により、（６ａＳ，１０ａＳ）−エステル
（ＸＶＩＩ）（２２ｍｇ，０．０６１ミリモル）をアル
ゴンでスパージしたメタノール（４ｍｌ）中で、アルゴ
ンスパージした２ＮＮａＯＨ（３ｍｌ）により室温で
１８時間に加水分解すると、後処理の後、２２ｍｇのガ
ムを生成した。これをシリカ上の分取ＴＬＣにかけ、ヘ
キサン−ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（７：２：１）混液で溶
出すると、主バンドから、１６ｍｇ，７６％、の（６ａ
Ｓ，１０ａＳ）−酸（ＸＶＩＩＩ）をガラス体、〔α〕
_D＋３１０°（ＣＨＣｌ₃），Ｍ⁺３４４．１９８３
（計算値３４４．１９８８）、として得た。

【００５５】例１３（６ａＳ，１０ａＳ）−１−
〔〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒ
ドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジ
ベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕オキ
シ〕−２，５−ピロリジンジオン（ＸＩＸ）

【００５６】反応式３に関し、乾燥ＴＨＦ（２ｍｌ）中
（ＸＶＩＩＩ）（６ｍｇ，０．０１７ミリモル）の溶液
に、アルゴン下に、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（Ａｌｄｒｉｃｈ；１３ｍｇ，０．０６３ミリモル）と
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ；１１
ｍｇ，０．０９６ミリモル）を加えた。その結果生じた
反応混合物を４３時間攪拌し、ジシクロヘキシル尿素か
ら濾別し、その濾液を真空蒸発させると白色固体を生成
した。この物質を少量のＴＨＦに浸漬してから、不溶部
分（尿素）を濾別した。その濾液を真空蒸発により乾固
させ、そしてこの操作を繰返すと発泡体を生成し、それ
をシリカ上の分取ＴＬＣにかけてから、ＥｔＯＡｃ−ヘ
キサン（１：１）混液で溶出させると、５ｍｇ，６７％
のＮＨＳエステルを灰白色の発泡体として得た。

【００５７】例１４（６ａＲ，１０ａＲ）−Ｎ−〔３
−〔〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−
ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−
ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕ア
ミノ〕−２−ヒドロキシプロピル〕−３′，６′−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９′−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキ
サミド（ＸＸＩ）（トレーサーＩｃ）

【００５８】反応式４ａに関し、乾燥ピリジン（５ｍ
ｌ）中ＮＨＳエステル（ＸＩＩ）（４４ｍｇ，０．１０
ミリモル、の（ＸＩＩ）および１３ｍｇのジシクロヘキ
シル尿素を包む混合物５７ｍｇ）の溶液に１，３−ジア
ミノ−２−ヒドロキシプロパン（Ａｌｄｒｉｃｈ；１０
０ｍｇ，１．１１ミリモル）を加えてから、その溶液を
室温でアルゴン下に１７時間攪拌した。その透明な溶液
を真空蒸発により乾固させてから、ジエチルエーテル
（１００ｍｌ）と水（３０ｍｌ）の間に分配した。各相
を分離し、そして水相をさらに２回ジエチルエーテルで
抽出した。有機相を一緒に集めて飽和ＮａＣｌ（３０ｍ
ｌ）で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、真空蒸発させ
てから、かくして得られた残渣を真空下（０．２トル）
に室温で３時間放置すると５２ｍｇの粗製（ＸＸ）（¹
ＨＮＭＲによるとまだジシクロヘキシル尿素を含む）を
ガラス体として生成した。

【００５９】この物質を乾燥ピリジン（５ｍｌ）に再溶
解してから、５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒ
ｇａｎｉｃｓ；４８ｍｇ，０．１０ミリモル）を全部一
度に攪拌されている反応混合物に加えた。室温でアルゴ
ン下に１６時間保った後、その透明な黄橙色溶液を真空
蒸発により乾固させるとオレンジ色のガムを生成し、そ
れをメタノール（１ｍｌ）中に再溶解させてからシリカ
上の分取ＴＬＣにより精製し、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ
（６５：３５）混液で溶出した。主なオレンジ色の蛍光
バンドをプレートから取り去って、そのシリカをＣＨＣ
ｌ₃−ＭｅＯＨ（１：１）混液で洗った。その洗液を真
空蒸発させるとオレンジ色の固形物を生成した。これを
再びシリカ上の分取ＴＬＣにかけ、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯ
Ｈ（８５：１５）混液で溶出すると、主バンドからオレ
ンジ色の物質を生成し、これを再び分析級シリカ上の分
取ＴＬＣにかけ、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（６５：３５）
混液で溶出した。その生成物バンドをプレートから分離
してから、そのシリカをＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（１：
１）混液で溶出させ、その溶離液を真空蒸発させるとオ
レンジ色の固体を生成した。これをＣＨＣｌ₃−ＭｅＯ
Ｈ（９５：５）混液中に投入して、０．５ミクロンフィ
ルターで濾過し、濾液を真空蒸発させてから、その残渣
を真空下（０．２トル）に室温で光から保護して放置す
ると４７ｍｇ，６１％、の（ＸＸＩ）（トレーサーＩ
ｃ）をフレーク状の、濃オレンジ色の固体として得た。
融点＞３３０℃（分解）；〔α〕_D−１０８°（ＭｅＯ
Ｈ）；および（Ｍ＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）７７５．３２８８
（計算値７７５．３２３１）。

【００６０】例１５（６ａＳ，１０ａＳ）−Ｎ−〔３
−〔〔（６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−
ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−
ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕ア
ミノ〕−２−ヒドロキシプロピル〕−３′，６′−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９′−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキ
サミド（ＸＸＩＩＩ）（トレーサーＩｆ）

【００６１】反応式４ｂに関し、例１４における（ＸＸ
Ｉ）の製造と同様の方法で、（６ａＳ，１０ａＳ）−エ
ステル（ＸＩＸ）（３ｍｇ，０．００７ミリモル、の
（ＸＩＸ）と２ｍｇのジシクロヘキシル尿素を含む５ｍ
ｇの混合物と１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパ
ン（Ａｌｄｒｉｃｈ；１２ｍｇ，０．１３３ミリモル）
を乾燥ピリジン（１ｍｌ）中で室温に１５時間アルゴン
下で反応させると、後処理の後、４．５ｍｇの粗製（Ｘ
ＸＩＩ）を無色のガラス体として生成した。これを乾燥
ピリジン（１ｍｌ）中に再溶解してから、その溶液を攪
拌しながら５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇ
ａｎｉｃｓ；５ｍｇ，０．０１１ミリモル）を加えた。
室温で１５時間攪拌した後、その透明な黄橙色溶液を真
空蒸発させ、その残渣を前記のような多段クロマトグラ
フィー精製にかけると４ｍｇ，７４％、の（６ａＳ，１
０ａＳ）−トレーサー（ＸＸＩＩＩ）（トレーサーＩ
ｆ）を濃オレンジ色のフレークとして得た。融点＞３３
０℃（分解）；〔α〕_D＋１１４°（ＭｅＯＨ）；（Ｍ
＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）７７５．３２４９（計算値７７５．
３２３１）。

【００６２】例１６（トランス−ラセミック）−６
ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−〔３−
〔〔３′，６′−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９′−〔９Ｈ〕キサンテ
ン−５−イル〕カルボニル〕アミノ〕プロポキシ〕−
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸（ＸＸＶＩＩＩ）

【００６３】乾燥トリエチルアミン（０．０４ｍｌ，
１．１当量）を含む乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中（トラ
ンス−ラセミック）−１−（３−アミノプロポキシ）−
６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−６，６−ジメ
チル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン
−９−カルボン酸モノヒドロクロリド（ＸＸＶＩＩ）；
１０８ｍｇ，０．２４７ミリモル；（ＭｃＮａｌｌｙ
等，米国特許第４，８３３，０７３号）の、溶液に５−
カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ；１
１６ｍｇ，０．２４５ミリモル）を加えた。次にこの反
応混合物を室温で９時間アルゴン下に攪拌し、その後シ
リカ上の薄層クロマトグラフィーにかけ、ＣＨＣｌ₃−
ＭｅＯＨ（７５：２５）混液で溶出するとある程度（Ｘ
ＸＶＩＩ）が残っていることを示した。さらに、５ｍ
ｇ，０．０１ミリモル、のフルオレセイン化合物を加
え、追加の３ｍｌのトリエチルアミンと共にさらに１４
回の攪拌の後、１０ｍｇ，０．０２ミリモル、のフルオ
レセイン化合物を続けて加えた。さらに１６．５時間の
攪拌の後、反応混合物を真空蒸発により乾固させ、その
結果生じたオレンジ色の油状物をシリカ上のＴＬＣにか
け、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨ（７５：２５）で溶出した。
主要なオレンジ色の蛍光バンドをプレートから分離し、
そのシリカをＣＨＣｌ ₃−ＭｅＯＨ（１：１）混液で溶
出し、その洗液を真空蒸発させると１４７ｍｇ、７９％
粗収率、の（ＸＸＶＩＩＩ）をオレンジ色固体として生
成した。これを再び上記のような分取ＴＬＣにかける
と、生成物バンドから、１２６ｍｇ，６７％、の精製さ
れた（ＸＸＶＩＩＩ）を黄橙色の固体として得た。（Ｍ
＋Ｈ）⁺（ＦＡＢ）７６０．３１３６（計算値７６０．
３１２２；分析結果、Ｃ₄₅Ｈ₄₅ＮＯ ₁₀・３Ｈ₂Ｏの計算
値：Ｃ，６６．４１；Ｈ，６．３２；Ｎ，１．７２、測
定値：Ｃ，６６．６３；Ｈ，５．８７；Ｎ，１．８０
％。

【００６４】例１７トレーサーＩａ，Ｉｄ−Ｉｅ，Ｉ
ｇ−Ｉｉの製造（トランス−ラセミック）−１−〔〔（６ａ，７，１
０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−
ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピ
ラン−９−イル）カルボニル〕オキシ〕−２，５−ピロ
リジンジオン（ＸＸＩＶ）を対応する（トランス−ラセ
ミック）−６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１
−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ
−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−カルボン酸（Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚ＆Ｍａｄａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．，１９８６，５１，５４６３）とＮ−ヒドロキシス
クシンイミドとの反応をジシクロヘキシルカルボジイミ
ドまたは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エ
チルカルボジイミドをカップリング剤として行わせるこ
とにより得た。化合物（ＸＸＩＶ）を１．１〜１０当量
の対応するジアミノ連結剤化合物と共にピリジン溶液中
で反応させ、次いで、中間体化合物の単離を行うかまた
は行わずに、この中間体の次の反応を１〜１．１当量の
５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃ
ｓ；５−カルボキシフルオレセインＮＨＳエステル）と
共にピリジン溶液中で室温下で典型的には１４〜１８時
間行わせた。次にこの反応混合物を真空蒸発させ、残渣
をメタノール中に再び溶解させてから、分取ＴＬＣのシ
リカプレートに塗布した。適切な溶媒または溶媒混合物
（例えば、１：３ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃）により展開し
た後、生成物バンドをプレートから取り去り、そのシリ
カを展開溶媒よりも極性の強い溶媒または溶媒混合物
（例えば、１：１ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃）で溶出させ
た。次に洗液を真空蒸発させると前記トレーサーを生成
し、それらは典型的には上記の手順を繰返すことにより
さらに精製された。

【００６５】（トランス−ラセミック）−１−〔〔（６
ａ，７，８，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕オキシ〕−
２，５−ピロリジンジオン（ＸＸＸＶ）は対応する（ト
ランス−ラセミック）−酸（ＸＸＸＩＩ）とＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドを１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミドをカップリング剤とし
て反応させることにより得られた。

【００６６】トレーサーＩａはＸＸＩＶから、２，３−
ジアミノプロピオン酸とピリジン−ｐＨ８緩衝剤の中で
反応させ、次いで前記のように５−カルボキシフルオレ
セインＮＨＳエステルと反応させることにより得られ
る。

【００６７】トレーサーＩｄは（ＸＸＸＶ）から上記の
一般的手順と同様な方法で得られる。トレーサーＩｅは
（ＸＸＸＶ）から上記の一般的手順と６−カルボキシフ
ルオレセインＮＨＳエステル（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒ
ｇａｎｉｃｓ）を使用する以外は同様な方法で得られ
る、トレーサーＩｄおよびＩｅの反応式は反応式５に示
されている。

【００６８】トレーサーＩｉは（ＸＸＩＶ）から上記の
一般的手順に従ってかつ例１４に対応する方法で製造さ
れる。トレーサーＩｇの場合には中間体化合物が（ＸＸ
ＩＶ）と対応するＮε−^tＢＯＣ保護Ｌ−リジンの反応
により形成され、次いで慣用の方法を用いて５−カルボ
キシフルオレセインＮＨＳエステルとの反応の前にε−
アミノの脱保護が行われる。

【００６９】トレーサーＩｈの場合には、Ｎα−^tＢＯ
ＣＬ−リジンを（ＸＸＩＶ）と反応させて中間体化合
物を得た。α−アミノを脱保護してから慣用の方法に従
って５−カルボキシフルオレセインＮＨＳエステルと反
応させると前記トレーサーが得られた。

【００７０】例１８トレーサーＩｂ，ＩｋおよびＩｍの製造これらのトレーサーは例１７と類似の方法で製造された
が、但し対応する中間体化合物は、５−カルボキシフル
オレセインＮＨＳエステルの代りに５−イソチオシアナ
トフルオレセインと反応させられた。

【００７１】例１９トレーサーＩｊおよびＩｌこれらのトレーサーは例１７の一般的方法により製造さ
れたが、但し対応する中間体化合物を、５−アミノフル
オレセインとホスゲンからトリエチルアミンの存在下で
その場で生成させた５−イソシアナトフルオレセインと
反応させた。

【００７２】例２０本発明のトレーサーを使用する蛍
光偏光免疫検定法検定試薬およびプロトコール、尿試料中のカンナビノイ
ドの蛍光偏光測定用に製作された自動制御のＣＯＢＡＳ
^TMＦＡＲＡ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙ
ｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅＩ
ｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．の子会社）
の機械で行われた：

【００７３】ｉ）試薬の処方：ａ）カンナビノイド代謝物質抗体試薬：０．２％のアジ
ド、１％のエチレングリコール、０．０５％のリボフラ
ビン結合タンパク（ＲＢＰ）、０．２５％のナフタレン
−１−スルホナート、およびカンナビノイドに特定な適
切な希釈剤を含む０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０。ｂ）カンナビノイドトレーサー試薬：０．２％のアジ
ド、０．０１％の牛のガンマグロブリン（ＢＧＧ）、ト
レーサー中１．２６×１０^-7Ｍ，（１．６６×１０^-2）
％のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、０．７７％のア
ルファシクロデキストラン（ＡｍｅｒｉｃａｎＭａｉ
ｚｅ−ＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｈａｍｍｏ
ｎｄ，Ｉｎｄｉａｎａ），および０．０６２％のＥＤＴ
Ａを含む０．１ＭＡＣＥＳｐＨ８．０。ｃ）カンナビノイド代謝物質検量薬：２５ｎｇ／ｍｌカットオフレベル（ｃｕｔ−ｏｆｆｌ
ｅｖｅｌ）の検定用：０，６．２５，１２．５，２５，
３７．５および５０ｎｇ／ｍｌのΔ⁹−１１−ノル−９
−カルボキシ−テトラヒドロカンナビノールの緩衝液
（０．２％アジド、０．０１％ＢＧＧ，（１．６６×１
０^-2）％ドデシル硫酸リチウム、０．７７％アルファシ
クロデキストラン、および０．０６２％ＥＤＴＡを含む
０．１ＭＡＣＥＳｐＨ８．０を含む）の中の溶液、ま
たは０．２％のアジドを含む尿。５０ｎｇ／ｍｌカットオフレベルの検定：０，１２．
５，２５，５０，７５および１００ｎｇ／ｍｌのΔ⁹−
１１−ノル−９−カルボキシ−テトラヒドロカンナビノ
ールの緩衝液（０．２％アジド、０．０１％ＢＧＧ，
（１．６６×１０^-2）％ドデシル硫酸リチウム、０．７
７％アルファシクロデキストラン、および０．０６２％
ＥＤＴＡを含む０．１ＭＡＣＥＳｐＨ８．０を含
む）の中の溶液、または０．２％のアジドを含む尿。１００ｎｇ／ｍｌカットオフレベルの検定：０，２５，
５０，１００，１５０および２００ｎｇ／ｍｌのΔ⁹−
１１−ノル−９−カルボキシ−テトラヒドロカンナビノ
ールの緩衝液（０．２％アシド、０．０１％ＢＧＧ，
（１．６６×１０ ^-2）％ドデシル硫酸リチウム、０．７
７％アルファシクロデキストラン、および０．０６２Ｅ
ＤＴＡを含む０．１ＭＡＣＥＳｐＨ８．０を含む）
の中の溶液、または０．２％アジドを含む尿。ｄ）カンナビノイド代謝物質対照物：１８．７５および
３１．２５ｎｇ／ｍｌのΔ⁹−１１−ノル−９−カルボ
キシテトラヒドロカンナビノールの０．００１％ＬＤＳ
および０．２％アジドを含む尿の中の溶液。

【００７４】ｉｉ）検定プロトコールａ）ＦＡＲＡについて：１．抗体試薬２００μｌ２．トレーサー試薬３０μｌ３ａ．試料（ポリクロナールＡｂと共に）１０μｌ^*または１８μｌ^** ３ｂ．試料（モノクロナールＡｂと共に）２２μｌ^**

【００７５】１．および３．を混合せよ：バックグラウ
ンドを読め；２を加えよ；３０秒間インキュベーション
せよ。蛍光偏光度を読め。

【００７６】記号解：^* ５０ｎｇ／ｍｌカットオフ検定^** １００ｎｇ／ｍｌカットオフ検定^*** ２５ｎｇ／ｍｌカットオフ検定

【００７７】ｂ）前記の検量薬を「試料」として使用す
ることにより標準曲線が得られる。

【００７８】ｃ）尿検体または未知検体は「試料」とし
て使用され、そして蛍光偏光度の読みは標準曲線に対し
比較されることにより試料中のカンナビノイド濃度を与
える。

【００７９】上記（ａ）〜（ｃ）の段階は前記の示した
計器において行なわれる自動制御された段階である。

【００８０】例２１カンバマゼピントレーサーの比較２種のトレーサー化合物のうち１種のトレーサーがヒド
ロキシ置換基を連結基上に含む以外は同じ構造を有する
２種のトレーサー化合物の間で比較が行われ、そして異
なる抗体により行われた。各トレーサーのスパンと強度
がそれぞれ個々の実験において同じ濃度で抗体の存在下
で同じタイター（ｔｉｔｅｒ）（希釈度）で比較された
ことに注意することは重要である。測定は従来のＦＰＩ
Ａ法を用いて行われた。その結果を次の表Ｉに示す。

【００８１】

【表１】

【００８２】表Ｉの結果は、すべての実験において連結
基上にヒドロキシ置換基を持つトレーサーの観測された
蛍光強度（カルバマゼピンを含有する添加された、試料
または検量薬の不在において）はヒドロキシ置換基を有
しないトレーサーのものよりも高い。ヒドロキシ置換ト
レーサーの使用は従って望ましい信号／雑音比を提供す
る。その際にトレーサーが抗体に結合するため添加され
たカルバマゼピン検量薬（０〜２０μｇ／ｍｌ）の増加
する濃度と競合することを許される場合には、観測され
た蛍光偏光度の低下（スパン）は連結基上にヒドロキシ
置換基を持つトレーサーの場合には、ヒドロキシ置換基
を持たないトレーサーよりも大きい。ヒドロキシ置換基
を持つトレーサーをカルバマゼピンの検定に使用する場
合にはこのより大きなスパンは結果として検定のためよ
り広い機能範囲（ｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅ）を生じさ
せ、高い精度を可能にする。

【００８３】例２２テトラヒドロカンナビノイドトレーサー類の比
較テトラヒドロカンナビノイドトレーサー類の中で極性ヒ
ドロキシ置換基を連結基上に持つか持たないものの間で
比較がなされた。トレーサーの相対的蛍光輝度がＦＰＩ
Ａにより測定され、表ＩＩに示されている。

【００８４】

【表２】

【００８５】例２３フェニトイントレーサー類の比較２種のトレーサー化合物において、その１種のトレーサ
ーが連結基上にヒドロキシ置換基を有する以外は構造の
同じ２種のトレーサー化合物の間で比較がなされ、そし
て異なる抗体により比較された。各トレーサーのスパン
と強度が個々の実験において同じタイター（希釈度）に
おける抗体の存在下でトレーサーの同じ濃度において比
較された。測定は慣用のＦＰＩＡ法を用いてなされた。
それらの結果を表３に示す。

【００８６】

【表３】〔Ｆｌ⁵〕＝５−フルオレセイニルスパンはｍＰ単位である。強度は相対的単位である。

【００８７】表ＩＩＩの結果は、すべての実験において
連結基上にヒドロキシ置換基を持つトレーサーの観測さ
れた蛍光強度（フェニトイン検量薬または標準薬の零濃
度における）はヒドロキシ置換基を持たないトレーサー
のそれとほぼ等しいかまたはそれより高いことを示す。
次にトレーサーがその際に抗体に結合するため添加され
たフェニトイン検量薬（０〜４０μｇ／ｍｌ）の増加す
る濃度と競合することを許される場合には、観測された
蛍光偏光度の低下は連結基上にヒドロキシ置換基を持つ
トレーサーの場合には、ヒドロキシ置換基を持たないト
レーサーの場合とほぼ等しいかまたはそれよりも大き
い。抗体１の実験においてスパンとトレーサー強度はい
ずれも連結基上にヒドロキシ置換基を有するトレーサー
につきより大きい。例２１に記載の実験と同様に、上記
の結果はフェニトインについての検定の処方に、連結基
上にヒドロキシ置換基を持つトレーサーが使用されると
きには、ヒドロキシ置換基を持たないトレーサーの場合
よりも高い精度および／またはより大きい信号／雑音比
によって特徴づけられることを許す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キャスリンサラシュヴェンツァーアメリカ合衆国ペンシルバニア州ヤードリィ，アップルウッドサークル 1557 (56)参考文献特開昭59−104554（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−192770（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−150680（ＪＰ，Ａ) 米国特許4255329（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 493/10 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式：【化１】〔式中、Ｆは蛍光化合物残基であって５−フルオレセイ
ニルまたは６−フルオレセイニルであり；Ｙは−ＮＨ−
または単共有結合であり；Ｚは少なくとも１つの極性親
水基により置換される、２〜１０の炭素原子を有する直
鎖または分枝鎖アルキレンであり；Ｑは酸素または硫黄
であり；Ｘは対応するリガンドに対して特異的な抗体に
より識別されることができるリガンド・アナログであっ
て、テトラヒドロカンナビノイドアナログ、カルバマゼ
ピンアナログまたはフェニトインアナログである〕を有する化合物。
【請求項２】該親水基がヒドロキシ、カルボキシ、カ
ルボン酸エステル、カルバミル、チオカルバミル、アミ
ノ（第１級、第２級、または第３級）、アシルアミノ、
スルフィノ、スルホ、スルファミル、ホスホノ、ヒドロ
キシアルコキシ、及びアミノアルコキシから成る群より
選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】Ｘがテトラヒドロカンナビノイドアナロ
グであり、Ｙが単共有結合であり、Ｑが酸素であり、Ｚ
が２−ヒドロキシプロピレンである請求項１に記載の化
合物。
【請求項４】Ｘがテトラヒドロカンナビノイドアナロ
グでありかつＹが−ＮＨ−であり、Ｑが酸素である請求
項１に記載の化合物。
【請求項５】該テトラヒドロカンナビノイドアナログ
が６ａ，７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロ
キシ−６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベン
ゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イルである請求項１〜４のい
ずれかに記載の化合物。
【請求項６】該テトラヒドロカンナビノイドアナログ
が６ａ，７，８，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキ
シ−６，６−ジメチル−３−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イルである請求項１〜４のいず
れかに記載の化合物。