JPH02247157A - メサドンのアッセイ法、それに用いる化合物およびアッセイキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、尿などの試験試料中のメサドンを検出するた
めの方法および試薬に関する。さらに詳しくは、本発明
は、試料中のメサドンの存在または量を決定するための
蛍光偏光イムノアッセイ法、該方法に試薬として用いる
トレーサー化合物、および核力法に試薬として用いる抗
体産生用の免疫原化合物に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）メサ
ドンは、モルヒネおよびヘロイン中毒の治療としてメン
テナンスプログラム（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｐｒｏ
ｇｒａｍｓ）に用いられている合成麻薬鎮痛剤である。

メサドンは、ヘロインの投与中止による急性の作用を食
い止め、また不安、抑欝および渇望などの中毒後症候群
を軽減もしくは排除する。しかしながら、この薬剤を過
剰に使用すると習慣性になったり中毒になったりするこ
とがある。

メサドンの検出のために最も頻繁に用いられる生物学的
流体は尿である。しかしながら、池の生物学的試料、た
とえば血清、血漿または組織なども試験試料として用い
ることができる。過去においてメサドンは、薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（Ｇ
　Ｃ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を含む多くの方法により検出されてきた。一般に、これ
らの方法は試験試料からの薬物の複雑な化学的抽出手順
を含むが、このような手順は高度な教育を受けた専門家
を必要とし、アッセイ時間も長くかかる。

ＧＣＸＴＬＣおよびＨＰＬＣのような化学的方法に代わ
る好ましい方法として結合アッセイ法がある。抗原およ
び抗体を検出するための結合アッセイは、これら物質を
特徴付けている免疫学的反応性に依存している。一般に
、これらのアッセイをまとめてイムノアッセイと称する
。

イムノアッセイ法は、生物にとって異物である抗原の存
在に応答して抗体が産生されるという高等生物の免疫系
機構を利用したものである。特定の抗原に対する応答と
して１種または２種以上の抗体が産生され、これらの抗
体は該特定の抗原と反応することができ、かくして高度
に特異的な反応機構が生み出される。この反応機構は、
生物学的試料中の該特定の抗原の存在または濃度を決定
するためにインビトロで用いることができる。

特定の分析対象物を測定するための競合結合アッセイは
、試験試料中の分析対象物と標識試薬（すなわちトレー
サー）とが、該分析対象物およびトレーサーの両方に特
異的な結合成分（たとえば抗体）上の限られた数の結合
部位に対して競合することに基づいている。試料中の分
析対象物の濃度により、該抗体に結合するトレーサーの
量が決定される。生成したトレーサー／抗体複合体の量
は定量的に測定するこができ、試験試料中の分析対象物
の量に反比例する。

蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイにおいて生成し
たトレーサー／抗体複合体の量を測定するための定量手
段を提供する。この方法は、蛍光標識したトレーサーが
直線偏光により励起されると急速に回転し、該回転トレ
ーサーから放出される蛍光がそのような急速な回転によ
って部分的に脱分極されるようになるという原理に基づ
いている。その結果、トレーサーによって放出される蛍
光は偏光の度合がトレーサーの回転速度とは逆の相関性
を有するものとなる。すなわち、回転が大きくなればな
るほど放出光の偏光は小さくなる（または放出光の脱分
極が大きくなる）。回転のスピードおよび脱分極の大き
さは、トレーサーがより重量の大きい分子と結合したと
き、たとえば比較的重量の大きい抗体分子と結合したと
きに減少する。蛍光トレーサー／抗体複合体が直線偏光
によって励起されると、この蛍光団は急速な回転が抑制
されるので、−層多くの放出光が偏光として残ることに
なる。「遊離の」トレーサー（すなわち抗体に結合して
いないトレーサー）が直線偏光によって励起されると、
その回転は複合体の回転よりもはるかに速く、それゆえ
放出光は脱分極されることになる。

蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａ）は、結合ト
レーサーを遊離トレーサーから分離していない溶液から
最終的な偏光の読み取りを行う均一アッセイである。不
均一アッセイ法においては、読み取りを行う前に結合ト
レーサーを遊離トレーサーから分離しなければならない
。

未知量の分析対象物を含む試験試料と比較するために標
準調製物を用いることにより、ＰＰＩＡは競合アッセイ
において生成したトレーサー／抗体複合体の量の測定の
ための定量手段を提供する。

この方法は、現在、アボット・ラボラトリーズにより市
販のＴＤＫセラビューティック・ドラッグ・モニタリン
グ・システム（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ＤｒｕｇＭｏ
ｎｉｔｏｒｉｎｇ　Ｓ　ｙｓｔｅｍ）で用いられており
、また米国特許第４．２６９，５１１号および同第４，
４２０．５６８号各明細書に記載されている。

上記両特許明細書に開示されているように、ＦＰＩＡに
おいてトレーサーは抗体への結合に関し分析対象物と競
合しなければならないので、トレーサーは該分析対象物
に特異的な抗体によって認識されることができるように
該分析対象物と充分に類似した分子構造を有していなけ
ればならない。

この理由からトレーサーはまた蛍光標識した分析対象物
類似体としても言及され、その実質部分は分析対象物と
同じ空間的および極性構造を有し、抗体上の結合部位に
対して分析対象物と競合し得る１または２以上の決定基
を画定する。

試料中のメサドンの存在を検出するために、正確で感度
の良いＦＰＩＡを行うためのアッセイ法および試薬を提
供する必要性が依然存在する。

（課題を解決するための手段） 本発明の目的は、試験試料中のメサドンの存在または量
を決定するための抗体を産生させるのに有用な、一般式 （式中、Ｒｏは、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和も
しくは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子
からなり、そのうちへテロ原子の数が６個以下であるス
ペーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ
原子の数は２個以下であるものＸは０または１の整数；
ＭはＣ＝Ｏ１−ＮＨ−１Ｏ−Ｃ＝Ｏ，Ｎ−Ｃ＝○および
Ｎ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選ばれた結合基、Ｑは免疫原
性担体である）で示される免疫原化合物 一般式： （式中、Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もし
くは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子か
らなり、そのうちへテロ原子の数が６個以下であるスペ
ーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ原
子の数は２個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生
しているちの（式中、Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖に配列
した飽和もしくは不飽和の０〜１５個の炭素原子および
ヘテロ原子からなり、そのうちへテロ原子の数が６個以
下であるスペーサー基であり、ただし連続して結合して
いるヘテロ原子の数は２個以下であり該分枝鎖は炭素原
子上でのみ生じているものＸはＯまたはｌの整数１Ｍは
Ｃ−０，−ＮＨ−０−Ｃ＝Ｏ，Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ
＝Ｓよりなる群から選ばれた結合基：Ｑは免疫原性担体
である）で示される免疫原化合物； 試験試料中のメサドンの存在または量を決定するための
抗体を産生させるのに有用な、一般式Ｙは−ＣＯＯＨ，
−ＮＨ２、−ＣＨｏおよび−ＯＨよりなる群から選ばれ
た結合基である）で示されるハプテン化合物； 式。

で示されるハプテン化合物 試験試料中のメサドンの存在または量を決定するための
アッセイに有用な、一般式 （式中、Ｒ，およびＲ２は、それぞれＨもしくは０ト■
であるかまたはＲ３とＲ２が一緒になって一〇を表し；
Ｒ３はエチル基または式ＲＭＦＩ（式中、Ｒは、直鎖も
しくは分岐鎖に配列した飽和らしくは不飽和の０〜１５
個の炭素原子およびヘテロ原子からなり、そのうりへテ
ロ原子の数が６個以下であるスペーサー基であり、ただ
し連続して結合しているペテロ原子の数は２個以下であ
り該分枝鎖は炭素原子上でのみ生じているもの；Ｍは、
Ｃ−０、−ＮＨ−１Ｏ−Ｃ＝Ｏ，Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮＣ
−８よりなる群から選ばれた結合基、Ｆｌは、フルオレ
セインまたはフルオレセイン誘導体である）で示される
基：Ｒ４は、Ｒ３がＲＭＦＩであるときに２−ジメチル
アミノプロピル基、またはＲ８がエチル基であるときに
式・ＲＭＦＩ（式中、ＲｌＭおよびＦｌは前記と同じ）
で示される基である）で示されるトレーサー化合物 試験試料中のメサドンの存在または量を決定する方法で
あって、 （ａ）該試料を上記一般式 て−示されるトレーサー化合物、および該メサドンサト
ンおよび該トレーサーを特異的に認識し得る抗体と接触
させて溶液を得、 （ｂ）該溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、つ
いて （ｃ）該蛍光偏光応答を検出して試料中のメサドンの存
在または量を測定する ことを特徴とする。

本発明はまた、上記方法に試薬として用いるトレーサー
化合物、および上記方法に試薬として用いる抗体産生用
の免疫原化合物をも提供する。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

炙麹 本発明において下記定義が適用される。

本明細書において「決定基」とは、抗原と抗体との間の
特異的結合反応に関与する抗原上の領域をいう。本質的
に、免疫学的特異性に基づき抗原、従って抗体を互いに
区別するものはこの決定基である。

本明細書において「分析対象物」とは、それに対して結
合成分（たとえば抗体）が得られるかま几はおよび該ト
レーサー化合物を特異的に認識し得る抗体と混合して溶
液を得、 （ｂ）該溶液中に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、
ついで （ｃ）該蛍光偏光応答を検出して試料中のメサドンの存
在または量を決定する ことを特徴とする方法、および 試験試料中のメサドンの存在または量を決定するだめの
アッセイキットであって、上記一般式。

で示されるトレーサー化合物、および該メサドンおよび
該トレーサー化合物を特異的に認識し得る抗体からなる
キットを提供することにある。

本発明は、蛍光偏光法を用いて試験試料中のメサドンの
存在または量を検出するための方法を提供するものであ
る。本発明の方法は、 （ａ）核試料を蛍光標識したトレーサー、およびメロ 生成することのできる分子をいう。本発明の分析対象物
はメサドンであり、下記構造を有する。

そのような分析対象物は、低分子量、一般に５０〜４０
００の範囲、より好ましくは１００〜２０００の範囲の
タンパク質不含化合物である。そのような分析対象物は
動物中に注射したときに抗体産生を引き起こさないが、
抗体に対しては反応性である。

本明細書において「分析対象物類似体」とは、所定の分
析対象物上の１または２以上の決定基と実質的に同じ空
間的および極性構造を有する分子をいう。その上うな分
析対象物は、低分子量、一般に５０〜４０００の範囲、
より好ましくは１００〜２０００の範囲のタンパク質不
含化合物である。

このように決定基が重複していることによって、分析対
象物特異的結合成分（たとえば抗体）上の結合部位に対
して分析対象物類似体が試験試料中の分析対象物と競合
するようになる。加えて、分析対象物特異的結合成分へ
の結合に必要な決定基を保持しながらも分析対象物と同
一ではなくなるように、分析対象物類似体を修飾するこ
ともできる。

分析対象物類似体の決定基の構造は分析対象物の決定基
と全く同一である必要はなく、分析対象物類似体が適当
な決定基を実質的に重複させておれば充分である。それ
ゆえ、分析対象物類似体は、分析対象物決定基を実質的
に重複させており、そのことによって特異的結合成分（
すなわち、抗体、レセプター、ヌクレオチド配列など）
がそのような実質的に重複する決定基を認識し結合する
ことができる限りにおいて、分析対象物のものとは異な
る化学基、アミノ酸もしくはヌクレオチドを含むいかな
る分子構造を有していてもよい。

本明細書において「分析対象物特異的結合成分」とは、
抗体やレセプターのような、分析対象物に特異的に結合
する成分をいう。一般に、そのような分析対象物に対す
る抗体は、まず該分析対象物で励起させ、遊離のトレー
サーおよびトレーサー／抗体複合体により放出された蛍
光の偏光を測定することにより決定する。抗体と複合体
を形成していないトレーサーは、蛍光の吸収および再放
出に必要な時間よりも短い時間の間自由に回転する。

その結果、再放出された光は比較的でたらめに配向して
いるため、抗体と複合体を形成していないトレーサーの
蛍光偏光は低くなり、０に近付く。

トレーサーが特定の抗体と複合体を生成すると、かく生
成したトレーサー／抗体複合体は該抗体分子の回転を引
き受けるが、この回転は比較的小さなトレーサー分子の
回転よりも遅いため、観察される偏光は増大することに
なる。それゆえ、抗体部位に対して分析対象物が該トレ
ーサーと競合するときは、トレーサー／抗体複合体の蛍
光偏光は、遊離のトレーサーの蛍光偏光とトレーサー／
抗体複合体の蛍光偏光との間の値で観察される。試料が
高濃度の分析対象物を含んでいるときは、観察される偏
光値は遊離のトレーサーの偏光値に近くなる、すなわち
低くなる。これに対して、試料かまたは分析対象物類似
体をタンパク質担体に結合させ、ついで該結合体を動物
中に注射することにより産生される。得られた抗体は、
従来のよく知られた抗体単離法により単離することがで
きる。

本明細書において「トレーサー」とは、下記蛍光分子に
結合させた分析対象物または分析対象物類似体をいう。

この蛍光分子はトレーサーの検出可能成分である。

本発明の方法に従えば、所定の分析対象物を含有してい
ると思われる試験試料をトレーサー、および該分析対象
物およびトレーサーに特異的な抗体と混合する。トレー
サーと試料中に存在する分析対象物とは、該抗体上の限
られた数の結合部位に対して競合し、その結果、分析対
象物／抗体複合体およびトレーサー／抗体複合体が生成
する。

トレーサーと抗体の濃度を一定に保つことにより、トレ
ーサー／抗体複合体に対する分析対象物／抗体複合体の
生成の比は、試料中に存在する分析対象物の量に正比例
する。

試料中の分析対象物の量は、上記混合物を偏光低濃度の
分析対象物を含んでいるときは、偏光値は結合トレーサ
ーの偏光値に近くなる、すなわち高くなる。イムノアッ
セイの反応混合物を垂直偏光ついで平面偏光で連続的に
励起させ、放出光の垂直成分のみを分析することにより
、反応混合物の蛍光偏光を正確に決定することができる
。決定しようとする分析対象物と偏光との間の正確な関
係は、既知濃度のカリブレーク−の偏光値を測定するこ
とにより確立する。分析対象物の濃度は、このようにし
て作成した標準曲線から内挿することかできる。

本発明のイムノアッセイは均一アッセイと称されるが、
このことは結合トレーサーを遊離のトレーサーから分離
していない溶液から最終的な偏光の読み取りを行うこと
を意味する。このことは、読み取りを行う前に遊離トレ
ーサーから結合トレーサーを分離しなければならない不
均一イムノアッセイ法に比べて顕著な利点である。

分析対象物類似体を標識し、かくしてトレーサーを生成
するための蛍光分子の選択は、有利にム融通性があり、
実際に行う人の好みに主として合わせられる。蛍光標識
はその大きさに従って理想的に選択されること、すなわ
ち、分子が小さくなればなるほど一層速く回転すること
ができ、ＦＰＩＡのトレーサー化合物として一層効果的
になることは容易に評価されるであろう。本発明におい
て好ましい蛍光標識は、フルオレセインおよびフルオレ
セイン誘導体である。これらの化合物は適当な波長の偏
光で励起したときに蛍光応答が得られ、かくして蛍光偏
光測定が可能となる。たとえば、以下のフルオレセイン
誘導体のいずれをも用いることができる・フルオレセイ
ンアミン：カルボキシフルオレセイン・α−ヨードアセ
トアミドフルオレセイン；アミノメチルフルオレセイン
、Ｎ−アルキルアミノメチルフルオレセイン；２，４−
ジクロロ−１，３，５−）リアジン−２−イルアミノフ
ルオレセイン（ＤＴＡＰ）；４−クロロ−６−メドキン
ー１　３　５−トリアジン−２−イルアミノフルオレセ
イン・およびフルオレセインイソチオシアネート。特に
好ましいフルオレセイン誘導体＝２３ の化合物としてであるかまたはトレーサーの成分として
であるかにかかわらず、蛍光の意味あいで用いるとき以
外は、それらがいやしくも特定の分子として存在してい
るならば開環形および閉環形の両方を含むものとする。

開環形は、蛍光を生じさせるために必要である。

以下の実施例でも説明するように、本発明に従って調製
した特定のトレーサーは良好なアッセイ結果をもたらす
ことがわかった。本発明に従って決定することのできる
分析対象物の濃度は、約１０−’〜約１０−”Ｍである
。試験試料を希釈することにより、−層高濃度の分析対
象物を決定することができる。試料中の分析対象物の濃
度範囲は試験試薬、すなわちトレーサーおよび抗体の濃
度範囲を決定するであろうが、個々の試薬濃度はアッセ
イの感度を最適にすべく経験的に決定する。

適当なトレーサーおよび抗体濃度は、当業者により確か
めることができる。

賦釆 ■、ハプテン は、アミノメチルフルオレセインおよびフルオレセイン
アミン（異性体ｒおよび■）である。

フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）に依存して２
つの互変体として存在する。開環（酸）形では、フルオ
レセインまたはフルオレセイン誘導体（すなわち蛍光分
子を含有するトレーサー）は青色の光を吸収し、約４ナ
ノ秒の励起状態寿命の後に緑色の蛍光を放出することが
できる。開環形と閉環形が共存するときは、ｐＨレベル
を調節することにより開環形と閉環形との分子の相対濃
度を容易に変えることかできる。一般に、本発明のトレ
ーサーは、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩
などの生物学的に許容し得る塩として溶液中で調製され
るため、該化合物を開環した蛍光形で存在させることが
できる。存在する特定の塩は、ｐＨレベルを調節するの
に用いたバッファーｌｅ依存するであろう。たとえば、
リン酸ナトリウムバッファーの存在下では本発明の化合
物は一般に開環形のナトリウム塩として存在するであろ
う。

本明細書において「フルオレセインコとは、個々メサド
ンに類似した構造を有するハプテンは、抗体を産生させ
るための免疫原として、および／またはトレーサーの分
析対象物類似体として用いるために調製する。メサドン
のエチルケトン側鎖を官能化するかまたはメサドンのジ
メチルアミノ側鎖をスペーサー基で置換することにより
、該ハプテンにポリ（アミノ酸）担体または蛍光分子を
結合させる。

本発明の好ましいハプテンは、下記一般式（式中、Ｒは
、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もしくは不飽和の
０〜＋５１１１の炭素原子およびヘテロ原子からなり、
そのうちへテロ原子の数が６ｇ以下であるスペーサー基
であり、ただし連続して結合しているヘテロ原子の数は
２個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生している
乙のＹは一層　〇　〇　８１Ｎ　＋（２、−ＣＨＯおよ
び−〇Ｈよりなる群から選ばれた結合基である）で表さ
れる化合物である。

上記式においてＲが炭素原子のみを含むときは、Ｒは１
〜１０個の炭素原子であるのが好ましい。

適当なヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、硫黄
原子、ケイ素原子およびリン原子が挙げられる。たとえ
ば、Ｒがへテロ原子として窒素原子および酸素原子を含
むときは、Ｒは−ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−０−ＣＨ２−であっ
てよい。２個以上のへテロ原子が連続して結合した化合
物は適当でないように思われる。

本発明の他の好ましいハプテンは、下記式で示される。

このようなハプテンは、当業者に知られた方法に従い、
所望の決定基の化学基と実質的に類似した化学基を含む
側鎖を有する化合物を製造して調ることかできる。本発
明の免疫原は、下記一般式のいずれかの構造を有する。

（式中、Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もし
くは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子か
らなり、そのうちへテロ原子の数が６個以下であるスペ
ーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ原
子の数は２個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生
じているもの：Ｒ′は、直鎖もしくは分枝鎖に配列した
飽和もしくは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテ
ロ原子からなり、そのうちへテロ原子の数が６個以下で
あるスペーサー基であり、ただし連続して結合している
ヘテロ原子の数は２個以下であるもの；Ｘは０または１
の整数；Ｍｆｉ　Ｃ＝　Ｏ，Ｎ　Ｈｏ−ｃ−ｏ、ｈ＋−
ｃ−ｏおよびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選ばれた結合基
、Ｑは免疫原性担体てあ製する。ついで、これらの化合
物またはその誘導体をポリ（アミノ酸）担体かまたは蛍
光分子に結合させる。

ＰＰＴＡにおいて、トレーサーと試験試料中に存在する
メサドンとは抗体上の結合部位に対して競合する。この
目的を達成するために、免疫原およびトレーサーの構造
を幅広く変化させることができる。

２、抗体 本発明に利用する抗体は、動物中で下記免疫原の１つに
対する応答を引き起こすことにより調製する。当業者に
よく知られた方法に従い、免疫原を投与し適当な抗体を
選択する。本明細書の実験に使用した免疫宿主はウサギ
およびヒツジであったが、免疫原に対する抗体を産生ず
ることのできるあらゆるインビボまたはインビトロ宿主
を用いることが可能である。このような抗体は、試験試
料中のメサドンおよびトレーサーと結合する。

ａ　免疫原の構造 免疫原は、広範囲のメサドン誘導体から製造する） 上記ハプテンの場合と同様に、上記式中、ＲまたはＲ゛
が炭素原子のみを含むときは、ＲまたはＲ′は２〜ＩＯ
個の炭素原子であるのが好ましい。

ヘテロ原子としては上記と同じものを用いることができ
る。ある場合には結合基Ｍが含まれない。

本発明で行った試験により良好な抗体応答を引き起こし
た免疫原は、下記一般式 （式中、Ｑはポリ（アミノ酸）担体である）で示される
構造を有するものである。

ポリ（アミノ酸）免疫原担体としては種りのタンパク質
担体を用いることができる。適当な免疫原担体としては
、アルブミン、血清タンパク質（たとえば、グロブリン
）、眼の水晶体タンパク質、リポタンパク質などが挙げ
られる。タンパク質担体の具体例としては、ウノ面清ア
ルブミノ（１３ＳＡ）、キーホールリンペソトヘモンア
ニン、卵アルブミン、チログロブリンおよびウンγ−グ
ロブリンが挙げられる。これらの中では、チログロブリ
ンが好ましい免疫原担体である。別の例として、アミノ
酸のリジンにおけるような、充分な数の利用できるアミ
ノ基を有する合成ポリ（アミノ酸）を利用することもで
きる。

ｂ　免疫原の合成 本発明の免疫原において、カルポキンル基含有メサドン
ハプテンとタンパク質担体上のアミノ基との間の化学結
合を、当業者に知られた種々の方法を用いて確立するこ
とができる。アミド結合を生成させることはしばしば好
ましい。アミド結合を生成させるには、まず脱離基試薬
（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクンンイミド、■−ヒド
ロキシベンズトリアゾール、ｐ−ニトロフェノールなど
）と反応させてメサドンハプテンのカルボン酸残基を活
性化させる。活性化試薬（ｌ、３−ノンクロヘキンル力
ルポジイミド、ジイソプロピルカルボジイミトなと）を
用いることができる。ついて、上Ｉ ハプテンをタンパク質担体に結合させるには、まずホス
ゲンまたはホスゲン等捕物（たとえばジホスゲンやカル
ボジイミジゾール）と反応させて高度に反応性のクロロ
ホルメートまたはイミダゾロホルメート誘導体を生成さ
せる（通常、単離しない）。ついて、得られた活性ホル
メートエステルを緩衝水溶液中でタンパク質担体と反応
させて免疫原を得ることができる。

３、トレーサー ａ、トレーサーの構造：　　４ 本発明のトレーサーは広範囲のメサドン誘導体から製造
することができ、下記一般式 （式中、ＲｏおよびＲ２は、それぞれＨもしくはＯＨで
あるかまたはＲ３とＲ２か一緒になって−０を表し；Ｒ
３はエチル基または式ＲＭＦ’ｌ（式中、Ｒは、直鎖も
しくは分枝鎖に配列した飽和らしくは記メサドンハブテ
ンの活性形をタンパク質担体を含有する緩衝溶液と反応
させる。別法として、カルボン酸ハブテンを単離して、
または単離することなく、高度に反応性の混合無水物ま
たは混合カーボネートに変換し、ついでタンパク質担体
と結合さけてもよい。

末端アミン官能性を有するメサドンハプテンは、適当な
溶媒、たとえばアセトニトリルまたはジメチルホルムア
ミドなどの存在下でＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカー
ボネートと反応させることにより、高度に反応性のＮ−
ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換することがで
きる。ついで、得られｆニラレタンを緩衝水溶液中でタ
ンパク質担体と反応させて免疫原を得る。

末端アルデヒド官能性を有するメサドンハプテンは、当
業者に知られ几方法に従い、水素化ンアノホウ素ナトリ
ウムの存在下、緩衝水溶液中で還元的アミノ化を行うこ
とによりタンパク質担体に結合させることができる。

別法として、アルコール基を含有するメサドン不飽和の
０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子からなり、その
うちへテロ原子の数が６個以下であるスペーサー基であ
り、ただし連続して結合しているヘテロ原子の数は２個
以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生じているもの
１Ｍは、Ｃ＝０、−ＮＨ−１Ｏ−Ｃ＝Ｏ１Ｎ−Ｃ＝Ｏお
よびＮＣ−８よりなる群から選ばれた結合基；Ｆｌは、
フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である）で
示される基；Ｒ４は、Ｒ３がＲＭＦｌであるときに２−
ジメチルアミノプロピル基、またはＲ３がエチル基であ
るときに式：ＲＭＦ　ｌ（式中、ＲｌＭおよびＦｌは前
記と同じ）で示される基である）で示される構造を有す
る。

上記のように、上記一般式においてＲが炭素原子のみを
含むときはＲは２〜１０個の炭素原子であるのが好まし
い。上記と同じへテロ原子を用いることができる。たと
えば、Ｒがへテロ原子として窒素原子を含むときは、Ｒ
は−（ｃＨ２）Ｊ　Ｎ　ＨＣＨ２ＣＨ２−であってよい
。

良好な結合能を示すトレーサーは、下記式（式中、Ｆｌ
はフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である）
で示される構造を有するものである。

ｂ、　　トレーサーの合成： 上記のようにして調製したメサドンハプテン（アミノ基
かまたはカルボキシル基を含む）をフルオレセインまた
はフルオレセイン誘導体に結合させて本発明のトレーサ
ーを調製することができる。

末端カルボキシル基を有するメサドンハプテンをアミノ
末端フルオレセイン誘導体に結合させるには、まず１．
３−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化剤で
カルボン酸残基を活性化し、ついで、これをＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、ｌ−ヒドロキシベンズトリアゾー
ル、ｐ−ニトロフェノールなどの脱離基試薬と反応させ
て活性化ハプテンを調製する。ついで、この活性化ハブ
テ含有ハプテンはまた、適当な溶媒中でＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドで活性化したカルボキンフルオレセイン
誘導体に結合させることができる。

別法として、アルコール基を含有するメサドンハプテン
をアミノ末端フルオレセイン誘導体に結合さ什るには、
まずホスゲンまたはホスゲン等飾物（７′：とえばジホ
スゲンやカルボジイミジゾール）と反応させて高度に反
応性のクロロホルメートまたはイミダゾロホルメート誘
導体を生成させる（通常、単離しない）。ついて、得ら
れた活性ホルメートエステルを適当な溶媒、たとえばジ
メチルホルムアミド中でアミノ末端フルオレセイン誘導
体と反応させてトレーサーを生成させることができる。

４、アッセイ法 本発明のトレーサー、および免疫原に対して産生さ什た
抗体は、メサドンの半定量的検出のための本発明の蛍光
偏光アッセイにおいて侵れｆ二結果をもたらす。

本発明のアッセイは、下記一般手順に従って行ンをフル
オレセイン誘導体の溶液と反応さ什てトレーサーを生成
させることができる。他の活性化剤、たとえばＮ　Ｎ’
−ジスクンンイミジルカーボネートおよび２−エチル−
５−フェニルイソキノリウム−３°−スルホネートを用
いることができる。別法として、カルボン酸ハプテンを
単離し、または単離することなく、高度に反応性のアシ
ルクロリド、混合無水物、混合カーボネートまたはアシ
ルイミダゾリドに変換し、ついでアミノ末端フルオレセ
イン誘導体と結合させることができる。

末端アミン官能性を有するメサドンハプテンは、適当な
溶媒、たとえばアセトニトリルやジメチルホルムアミド
中でＮ、Ｎ’−ジスクソンイミジルカーポネートと反応
させることにより高度に反応性のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドウレタンに変換することができる。得られたウ
レタンをジメチルホルムアミドまたは他の適当な溶媒の
溶液（通常、塩基性にしである）中のフルオレセイン誘
導体と混合することにより、アミノ末端フルオレセイン
残基に尿素を結合させることができる。アミノ基つ。

（１）容量を測定した標準液またはメサドンを含有する
もしくは含有すると思われる試験試料を試験管中に入れ
る。

（２）ついで既知濃度のトレーサーを上記試験管に加え
る。

（３）既知濃度の分析対象物特異的抗体（上記免疫原を
用いて産生させたもの）を上記試験管に加える。

（４）上記反応混合物をインキュベートすると、限られ
た抗体結合部位に対してトレーサーと分析対象物とが競
合し、トレーサー／抗体複合体および分析対象物／抗体
複合体が生成する。

（５）ついで、トレーサー／抗体複合体の量を蛍光偏光
により測定して試験試料中の分析対象物の存在または量
を決定する。

好ましい手順は、ＴＤＸセラビューティック・ドラッグ
・モニタリング・ノステムまた：よＡＤＸアビューズド
・ドラッグ・ンステム（Ａｂｕｓｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｓｙ
ｓｔｅｍ）（両者とらアホソト・ラホラトリーズ、アボ
ット・パーク、イリノイより入手可能）上で行うように
設計した。上記ＴＤＸかまｆ館よＡＤｘノステムを用い
たときは、アッセイは前処理から最後の読み取りにいた
るまで完全に自動化される。

しかしながら、手動アッセイもまた行うことかできる。

本発明の原理を手動アッセイに適用することはできるが
、ＴＤｘおよびＡＤＸンステムの自動化性能によりアッ
セイおよびデータ解析を行う几めの技術的時間が最小に
なることが保証される。

得られた結果は、［ミリ偏光単位（ｍｉｌｌｉｐｏｌａ
ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｕｎｉｊｓ）Ｊ、「スパン（ｓｐａ
ｎ）Ｊ（ミリ偏光単位にて）および「相対強度（ｒｅｌ
ａｔｉｖｅ　１ｎｔｅｎｓｉｔｙ）Ｊにより定量するこ
とかてきる。ミリ偏光単位の測定値は、試験試料中にメ
サドンが不在であるときに最大量のトレーサーが抗体に
結合したときの最大偏光を示す。正味のミリ偏光単位が
大きくなればなる（王ど、トレーサーの抗体への結合は
良くなる。本発明の目的のためには、正味のミリ偏光１
直は少なくとも約１５０であるのが好ましい。

スパンは、正味のミリ偏光と、最少量のトレイ手順の間
にこのｐＨに調整し維持するために種々のバッファーを
用いることができる。代表的なバッファーとしては、ホ
ウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビツールなど
が挙げられる。特定のバッファーを用いることは本発明
にとって重要ではないが、トリスおよびリン酸塩バッフ
ァーが好ましい。

加えて、リボフラビンによる蛍光妨害を防ぐ几めにリボ
フラビン結合タンパク質（ＲＢＰ）をアッセイシステム
に用いることができる。リボフラビン（すなわちビタミ
ンＢ２）は多くの食品および市販のビタミン補強剤の共
通成分である。リボフラビンは尿中に排出され、フルオ
レセインと類似の蛍光スペクトルを有する。リボフラビ
ンを普通に摂取している限り尿中に痕跡量以上のりボフ
ラビンが出てくることはないが、メサドンの検出を妨害
する意図をもった被験者により過剰量のりホフラヒンが
摂取された場合には尿試験結果がゆがめられることがあ
る。

つぎに、実施例に基づき本発明の免疫原およびサーが抗
体に結合したときのミリ偏光との差異を示ス。スパンが
大きいほどデータの数値分析は良くなる。本発明の目的
のためには、少なくとも約８０ミリ偏光単位のスパンが
好ましい。

相対強度は、パックグラウンド蛍光を越える蛍光シグナ
ルの強度の測定単位である。それゆえ、この強度が大き
いほどより正確な測定が得られることになる。この強度
は、水平偏光強度を２倍したものと垂直偏光強度との合
計として決定される。

この強度は、トレーサーおよび他のアッセイ変量の濃度
に依存してバックグラウンドノイズの約３倍から約３０
倍の範囲のシグナルであってよい。

本発明の目的のためには、バックグラウンドノイズの約
１０倍から約２０倍の強度であることが好ましい。

本発明の方法を行うときのｐ）（は、トレーサーのフル
オレセイン残基が開環形で存在することかてきるのに充
分な乙のでなければならない。Ｉ）　Ｉ−１の範囲は、
約４〜９、好ましくは約６〜８、最ら好ましくは約７．
０〜７．５であってよい。アソセＩＯ トレーサーの合成法およびアッセイ法をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらに限られるしのではない。な
お下記実施例において、実施例１〜３は免疫原化合物の
合成を、実施例４〜９はトレーサー化合物の合成を、実
施例１０はＦＰＩＡを記載する。

実施例１ ２−ジメチルアミノ−４４−ジフェニル−５オキソノナ
ナール、チログロブリン免疫原の合成テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ、１３５ｚ（ｊ）中の２２−ジフェニルアセ
トニトリル（５５９）の溶液を、窒素雰囲気下、水素化
ナトリウム（無機油中に８０％、１７．１９、ヘキサジ
で２回洗浄）お゛よび無水ＴＨＦ（９０ｘのの撹拌スラ
リーに滴下した。気体の発生が止まるまで、約２０分間
、撹拌を続げた。固体の２−ジメヂルアミノイソプ口ピ
ルクロリド塩酸塩（４５９）を加え、得られた混合物を
還流下に５時間撹拌した。水を加え、得られた水性混合
物を酢酸エチル（３回）で抽出した。抽出物を集めて水
および食塩水（１回ずつ）で洗浄し、乾燥させた（Ｍｇ
ＳＯ４）。得られた溶液を回転蒸発さ什て淡褐色の油状
物を得、これをヘキサン／酢酸エチル（１００・ｌ）か
ら再結晶させて２４９の４−ジメチルアミノ−２，２−
ジフェニルペンクンニトリルを白色固体として得た。

トルエン（７、５ＭＱ）中の１．５Ｍ水素化ジイソブチ
ルアンモニウムの溶液を、窒素雰囲気下、７８０Ｃにて
ＴＨＦ（７，５１１！の中の４−ジメチルアミノ２２−
ジフェニルペンクンニトリル（３ｇ）の撹拌溶液に加え
た。ついで、得られた混合物をドライアイス／アセトン
浴から除き、室温に温めた。

室温にて撹拌を１日続は几。飽和塩化アンモニウム溶液
を加え、得られた混合物を酢酸エチル（３回）で抽出し
た。抽出物を集め、食塩水で洗浄し、乾燥させた（Ｍｇ
ＳＯ４）。等容量の１０％硫酸を加え、この混合物を室
温にて３時間撹拌した。水をの溶液を回転蒸発させて粗
製の物質を得、これをシリカゲル上のフラッシュクロマ
トグラフィーにかけた。クロロホルム（ｃＨＣ１３）／
メタノール（２０１）で溶出して０　にの２−ジメチル
アミノ４４−ジフェニル−９−デセン−５−オールを２
つの異性体の混合物として得た。

メチレンクロリド（４０１ｆ２）中のオキサリルクロリ
ド（４，８ｉのの撹拌溶液（５０〜６０°Ｃに保持）に
、無水ンメチルスルホキシド（ＤＭＳｏ、８．８ｍ（１
）をスポイトで注意深く加えた。ついて、この混合物を
２分間撹拌した。メチレンクロリド（２１１Ｑ）中の２
−ジメチルアミノ−４，４−ジフェニル９−デセン−５
−オール（１ｇ）の溶液を加え、撹拌を５分間続けた。

この混合物を室温に温め、水で希釈し、炭酸水素ナトリ
ウム溶液で洗浄した。

この溶液を回転蒸発させて粗製の生成物を得、これをシ
リカゲル上のフラッンユクロマトグラフィーにかけた。

クロロホルム／メタノール（２０：ｌ）で溶出して０．
５ｇの２−ジメチルアミノ−４，４ジフェニル−９−デ
セン−５−オンを得た。

加え、この水性混合物を酢酸エチル（３回）で再び抽出
した。抽出物を集め、水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳ
Ｏ４）。この溶液を回転蒸発させて粗製の生成物を得、
これを無水エーテルで処理した。分離した固体物質を濾
取し、濾液を再び回転蒸発させて１．４９の４−ジメチ
ルアミノ−２２−ジフェニルペンタナールを粘性残渣と
して得、これを放置して固化した。

無水ＴＨＦ中の５−ブロモ−１−ペンテン（４８ｇ）の
溶液を、窒素雰囲気下で激しく撹拌しながらＴＨＦ（１
５酎）中のマグネシウムくず（１９）に滴下した。最初
の発熱反応が静まった後、この混合物を４５℃で４時間
撹拌した。ついで、ＴＨＦ（５ｍ（１）中に溶解した４
−ジメチルアミノ−２２−ジフェニルペンタナール（上
記のようにして調製、１２ｇ）の溶液を加えた。得られ
た混合物を１８時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶
液を加え、この水性混合物を水と酢酸エチルとの間に分
配した（３回）。有機層を集めて食塩水および水（１回
ずつ）で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。こメタノ
ール（５靜）中の２−ジメチルアミノ−４４−′）フェ
ニル−９−デセン−５−オン（２７０ｐｇ）の溶液にト
リフルオロ酢酸（Ｉ　１ｉ２）を加えてｐＨを２．０に
調節した。この溶液を回転蒸発させ、残渣をメタノール
中に取った。溶液の色が空色に変わるまで、この溶液に
一７８８Ｃにて穏やかなオゾン流を通した。この反応混
合物を一２０℃に温め、ジメチルスルフィド（３ｍのを
加えた。この溶液を回転蒸発させて粗製の物質を得、こ
れをシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにか
けた。クロロホルム／メタノール（３０：ｌ）で溶出し
て８０ａｙの２−ジメチルアミノ−４，４−ジフェニル
−５−オキソノナナールを得た。

１８Ｍ９の２−ジメチルアミノ−４，４−ジフェニル−
５＝オキソノナナール（０，０５１ミリモル）をＤＭＳ
Ｏ（１，０＊（り中に溶解し、渦まかせてハプテンをシ
ンチレーンヨンバイアル側部から離して溶解させた。２
００ｚｙのヂログロプリンを２０ｍｇの００５Ｍリン酸
バッフｙ−（ｐＨ９，０）中に溶解することによりｌ０
ｍｇ／ｍＱのチＣグロプリン溶液を調製した。上記溶解
ハプテンをチログロブリン溶液に滴下した。ハブテンバ
イアルをさらに０　、５　ｘＱのＤＭＳＯで濯ぎ、上記
溶液に加えた。

得られた混合物を室温にて１時間撹拌した。この混合物
に５１の水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、この溶
液を室温にて０５時間撹拌した。

この溶液のｐＨを０．１Ｎ　ＨＣＩを用いて７．３に調
節した。さらに５．０　Ｈの水素化シアノホウ素ナトリ
ウムを加え、この溶液を再び０．５時間撹拌した。この
操作をさらにもう１回繰り返して水素化シアノホウ素ナ
トリウムの総添加量を１５０ｍｇとした。この溶液を０
．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）に対して透析
して２−ジメチルアミノ−４，４−ジフェニル−５−オ
キソノナナール、チログロブリン免疫原の溶液を製造し
た。

実施例２ ３．３−ジフェニル−４−オキソヘキサナール、チログ
ロブリン免疫原の合成 合物を撹拌しながら３時間加熱還流した。室温に冷却し
た後、この粗製の中間体をＩＮ塩酸とともに３時間撹拌
した。得られた加水分解物を水と酢酸エチルとの間に分
配した（３回）。抽出物を集め、水および食塩水で洗浄
し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、回転蒸発させて粗製の物
質を得、これをシリカゲル上のフラッシュクロマトグラ
フィーにかけた。

ヘキサン／酢酸エチル（５：Ｉ）で溶出して１．０ｇの
４４−ジフェニル−６−へブテン−３−オンを無色油状
物として得た。

４．４−ジフェニル−６−へブテン−３−オン（１４４
＋Ｈ）をジオキサンと水との混合物（３，１，１１靜）
中に溶解した。四酸化オスミウムの１０％水溶液（０，
５ｉＱ、）を加えた。得られた溶液を室温にて５分間撹
拌した。ついで、水中の過ヨウ素酸ナトリウム（５５０
ｉｇ）の溶液を滴下した。この反応混合物を１６時間撹
拌した。水を加え、この水性混合物を酢酸エチル（３回
）で抽出した。抽出物を集め、水で洗浄（１回）シ、乾
燥させた（ＭｇＳＯ−）。

この溶液を回転蒸発させて粗製の生成物を得、こＴＨＦ
（２２，５ｉ１２）中の２，２−ジフェニルアセトニト
リル（９，１５ｙ）の溶液を、窒素雰囲気下、８０％水
素化ナトリウム（２，８５９、ヘキサンで２回洗浄）お
よびＴＨＦの撹拌スラリーに滴下した。気体の発生が止
まるまで、この混合物を激しく撹拌した。アリルプロミ
ド（６，３ｙ）をスポイトで加え、得られた混合物を室
温にて１８時間撹拌した。この混合物を氷水中に注意深
く注ぎ、この水性混合物を酢酸エチル（３回）で抽出し
た。抽出物を集めて水および食塩水（１回ずつ）で洗浄
し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、回転蒸発させて１１１こ
の２２−ジフェニル−４−ペンテンニトリルを油状生成
物として得７二。

２．２−ジフェニル−４−ペンテンニトリル（２゜３３
ｇ）、エーテル（１０ｍρ）中の３．ＯＭ、ｌ−チルマ
グネシウムプロミドおよびベンゼン（３０１１ｆ２）の
混れをシリカゲル上のプレバラティブ薄層クロマトグラ
フィー（Ｐ　Ｔ　Ｌ　Ｃ）にかけて精製した。ヘキサン
／酢酸エチル（２：１）で展開して３つのバンドを得た
。最も低いバンド（ＲｒＯ，６６）をプレートからこす
り取り、メタノールで溶出して２５ｍ９の３，３−ジフ
ェニル−４−オキソヘキサナールを得た。

１５ｉｙの３．３−ジフェニル−４−オキソヘキサナー
ル（０，０４３ミリモル）をＤＭＳＯ（ｌ靜）中に溶解
した。１７０１Ｍ９のチログロブリンを１７Ｈの００５
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９，０）中に溶解することに
よりＬｏｎｇ／ｍＱのチログロブリン溶液を調製した。

撹拌しながら、上記溶解ハプテンをチログロブリン溶液
に滴下した。ハブテンバイアルをさらに０．５ｚｊのＤ
ＭＳＯで濯ぎ、上記溶液に滴下した。得られた混合物を
室温にて１時間撹拌した。この混合物に５１１ｇの水素
化シアノホウ素ナトリウムを加え、この溶液を室温にて
０５時間撹拌した。この溶液のｌ）　Ｉ−１を０．１Ｎ
ＨＣ１を用いて７．５に調節した。さらに５．０Ｍ＠の
水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、この溶液を再び
０５時間撹拌した。この操作をさらにもう１回繰り返し
て水素化シアノホウ素ナトリウムの総添加量を１５．Ｏ
ｉｇとした。この溶液を０．０５Ｍリン酸バッファー（
ｐＨ７，５）に対して透析した。

この溶液を４００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離して清
澄化して３．３−ジフェニル−４−オキソヘキサナール
、チログロブリン免疫原の溶液を製造した。

実施例３ ５．５−ジフェニル−６−オキソ−３−オクチン酸、チ
ログロブリン免疫原の合成： ３．３−ジフェニル−４−オキソヘキサナール（４５ｘ
ｇ）［実施例２から］、マロン酸（４０ｚ９）およびピ
リジン（１，５ｆｆｆｆ）の混合物を撹拌しながら８０
〜９０°Ｃにて１８時間加熱した。揮発成分を真空Ｉ ７仄Ｑのチログロブリン溶液を調製した。上記溶解ハブ
テンをチログロブリン溶液に滴下し、得られた溶液を室
温にて１時間撹拌した。この溶液を００５Ｍリン酸バッ
ファー（ｐＨ７，５）に対して透析した。透析後に沈澱
が消失して５．５−ジフェニル−６−オキソ−３−オク
テン酸、チログロブリン免疫原の溶液を製造した。

実施例４ ６．６−ジフェニル−８−ジメチルアミノノナン酸、ア
ミノフルオレセインアミドトレーサーの合成： ベンゼン（２０ｍの中の４−ジメチルアミノ−２２−ジ
フェニルペンタナール（実施例（で調製したらの；３７
ｇ、＋　３．１６ミリモル）の溶液を回転蒸発器上で蒸
発乾固して透明な油状物を得た。

共沸乾燥を繰り返した後、このアルデヒドを高真下で除
き、残渣を水とクロロホルムとの間に分配した（３回）
。抽出物を集めて水で洗浄し、乾燥させた（Ｎａｚｓｏ
４）。この溶液を回転蒸発させて粗製の物質を得、これ
をＰＴＬＣにより精製した。

ヘキサン／酢酸エチル（２：Ｉ）で展開して２つのバン
ドを得た。始点に近い低い方のバンドをプレートからこ
すり取り、メタノールで溶出した。この溶液を回転蒸発
させて３８Ｍ９の５．５−ジフェニル−６−オキソ−３
−オクチン酸を得た。

１９Ｅ９の５．５−ジフェニル−６−オキソ−３−オク
テン酸（０，０６２ミリモル）をｐ−ジオキサン（１、
ＯｘＱ＞中に溶解し、渦まかせてハプテンをシンチレー
ションバイアル側部から離して溶解させた。この溶液の
色は黄−褐色であった。撹拌しながら、この溶液にイソ
ブチルクロロホルメート（１１μ（２）、ついでトリエ
チルアミン（１１μ（２）を加えた。この溶液の色か乳
白色に変わった。この溶液を室温にて１時間撹拌を続け
た。２５０ｍｇのチログロブリンを２５蝦の００５Ｍ５
Ｍリン酸バッファ（ｐｌ−１９、５）中に溶解すること
により１Ｏｘｙ中下にてポンプで３０分間くみ下ろした
。フリードリッヒ（Ｆ　ｒｉｅｄｒｉｃｈ）冷却器、撹
拌棒および隔壁を備えた２５０靜容のオーブン乾燥２首
フラスコに亜鉛顆粒（１，７１９）を加えた。このフラ
スコをアルゴン（Ａ　ｒ）流（乾燥窒素）下で火炎乾燥
させた。

冷却後、ベンゼン（２０ｆｆｌｆり中の上記アルデヒド
を加え、ついでさらに４０ｘ（！のベンゼンを加えた。

この撹拌懸濁液に蒸留した４−ブロモクロトン酸エチル
（５，５ｚ（２，４０ミリモル）を加え、この反応混合
物をＡｒ下で還流し、ついで、このアルデヒドがもはや
検出されなくなるまで（約４５分間）ＴＬＣ（２０％メ
タノール／ＣＨＣｌ３）を行った。

このオレンジ−褐色の反応混合物を室温に冷却し、飽和
ＮＨ，Ｃ１（５仄Ｑ）および酢酸エチル（１００靜）で
処理し、１０分間激しく撹拌した。得られた白色の水性
沈澱から透明な有機層をデカントし、この沈澱を酢酸エ
チル（７５，１１１りで再び抽出した。この有機層を２
５０１容の分別漏斗に移し、残った水性物質を廃棄した
。

上記有機抽出物を濃縮し、エーテル（５０ｚＱ）て希釈
して無機固体を沈澱させた。この懸濁液を酢酸エチル／
エーテル（２１，５０ｉＱ）で希釈し、ついで固体をセ
ライトパッドで濾過して除去した。

この濾液を濃縮乾固し、フラッシュシリカゲルのカラム
に加えた。ＣＨＣｌ３中の３５％メタノールで溶出して
２．３０９の所望のα／γアルコールを得た。このガラ
ス状の固体をＮＭＲ（２００１ｖＩＨｚ）にかけたとこ
ろ、α付加物に対するγ付加物の比は８４：１６であり
、幾らかの未反応４−ブロモクロトネートが存在するこ
とが示された。この混合物を上記フラッシュカラムに再
びかけて１゜７７９の８−ジメチルアミノ−６，６−ジ
フェニル５−ヒドロキシノン−２−エノン酸エチルを得
た。

一３０℃（ｃＣｌ、／アセトン／Ｃｏ２）のＣＨ２Ｃｔ
、（ａ　ＯＭＱ）中の８−ツメチルアミノ−６，６−ジ
フェニル−５−ヒドロキシノン−２−エノン酸エチル（
１，７７！？、４．４７ミリモル）の撹拌溶液にトリエ
チルアミン（２，４９ｉＬ　　Ｌ７．８８ミリモル）を
加え、この溶液を５分間撹拌した。ついて６０ｐｓｉ圧
力にてパールシェーカー水素添加を行った。１時間後、
さらに１５０ｏの触媒を加え、水素添加反応を３時間続
けた。ＴＬＣにより反応が完了したことが示された。濾
過により触媒を除去し、濾液を濃縮乾固して８６３ｕの
６．６−ジフェニル−８−ジメチルアミノノナン酸エチ
ルを透明な淡黄色の油状物として得た。

６６−ジフェニル−８−ジメチルアミノノナン酸エチル
（８６３ｉ９）をメタノール（７酎）中に取り、メタノ
ール中のＩＭ　ＫＯＨ（７，４ｉ（りで処理した。この
混合物をＡｒ下で２５時間還流し、冷却した。得られた
薄黄色の溶液を濃縮乾固して透明な薄黄色のガラス状物
質を得た。この残渣を水（２吋）中に取り、ｔｓｕｃｔ
で滴下処理してｐＨを６とした。ついで、この溶液を蒸
発乾固し、１２ｔｒｔＱのメタノール中に溶解して沈澱
を得、これを濾過した。この手順を８ｆｆ１２のメタノ
ールを用いて繰り返し、濾液を蒸発乾固した。このうち
２５０ｍｇの部分をメタノール（＋２ｉ１２）中に溶解
し、ＰＴＬＣて精製した。３０％メタノール／　ＣＩ（
ｃＩ＋てトリフルオロメタンスルホニルクロリド（０３
８ｍｇ、４．９１ミリモル）を滴下した。この反応混合
物を一３０°Ｃで１５分間撹拌し、１時間かけて室温に
温め、ついで室温にて２時間撹拌した。この混合物をＣ
Ｈ２Ｃ１２（２０＝ので希釈し、５％ＮａＨＣ０３（２
０ｍ（１）中に注いだ。得られた層を分離し、有機抽出
物を食塩水（３０ｆｆＱ）で洗浄した。この抽出物をＮ
　ａ２　ｓ　Ｏ４／痕跡Ｋ　２　ＣＯ３上で乾燥させ、
濾過し、回転蒸発器上で真空濃縮した。得られた油状の
褐色残渣を上記カラムに適用し、ＣＨＣ１３中の６％メ
タノールで溶出して１．０５９の６，６ジフエニルー８
−ジメチルアミノノナ−２，４ジエノン酸エチルを透明
な淡褐色の流動性油状物として得た。

１．０５ｇの６．６−ジフェニル−８−ジメチルアミノ
ノナ−２，４−ジェノン酸エチルをトルエン（５靜）中
に溶解し、２回蒸発乾固した。得られた曲状物を９５％
エタノール（２５ｍｌり中に取り、１０％パラジウム／
活性炭素（Ｐｔｉ／Ｃ１＋９０ｘｙ）を入れたパールシ
ェーカーびん中に置いた。室温、展開して主要バンド（
Ｒｆ範囲：０．’１２〜０．３１）を得、これをプレー
トからこすり取り、メタノールで溶出した。このメタノ
ール抽出物を蒸発させ、得られた残渣をトルエン（３好
）で２回共蒸発させて１６７Ｈの６．６−ジフェニル−
８−ジメチルアミノノナン酸を透明な油状物として得た
。

乾燥１．４−ジオキサン（０２４靜）および新たに蒸留
したＴＨＦ（０，１１ｍ（り中の６．６−ジフェニル−
８−ジメチルアミノノナン酸（１５，６ｘｙ、０．０４
４ミリモル）の冷溶液（０℃）にイソブチルクロロホル
メート（５，８μｅ、、０．０４５ミリモル）を加え、
得られた混合物を０℃にて１３０分間撹拌した。この溶
液は不透明になった。Ｎ−メチルピロリジノン（０，１
６＋＋１２）中のフルオレセインアミン異性体Ｉを加え
、この混合物を室温に温めた。

散光中で４０時間撹拌した後、この反応混合物を３滴の
飽和炭酸ナトリウム溶液で処理し、５分間撹拌した。つ
いて、この混合物を１０％ＨＣＩ（７滴）、最後に０．
０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７５）で注意深く中性に
した。この牡副液を３５１のメタノールで可溶性にし、
２．５〜３　、　ＯｍＱに真空濃縮した。得られた生成
物をプレバラティブＴＬＣプレートに加え、クロロホル
ム中の３０％メタノールで２回展開した。Ｒｆが０．２
６〜０．３５の範囲の蛍光バンドを除去し、メタノール
でゲルから溶出した。濃縮後、トレーサーを単一の逆相
シリカゲルプレートに加え、１０ｍＭ酢酸アンモニウム
中の５０％アセトニトリルで１回展開した。所望のバン
ドをプレートから除き、メタノールで溶出し、濃縮して
ＩＯ，９ｘｙの純粋な６，６ジフエニルー８−ジメチル
アミノノナン酸、アミノフルオレセインアミドトレーサ
ーを得た。

実施例５ ６−シメチルアミノー４．４−ジフェニルへブタン酸、
アミノフルオレセインアミドトレーサーの合成 一５９＝ 時間水素添加した。この混合物をセライトの短いパッド
で濾過し、濾液を回転蒸発させて６−シメチルアミノー
４，４−ジフェニルヘプテン酸メチルを粗製の物質とし
て得、ついで、これを真空乾燥させた。

上記で得た６−ジメチルアミノ−４，４−ンフエニルヘ
プテン酸メチル、炭酸カリウム（５００ｚｙ）、メタノ
ール（５Ｉのおよび水（１１ｉ２）の混合物を室温にて
２４時間撹拌した。この反応混合物を水で希釈し、ＩＮ
　ＨＣＩでｐＨ１の酸性にし、クロロホルム（３回）で
抽出した。抽出物を集めて水および食塩水（各１回）で
洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、得られ
た溶液を回転蒸発させて４０Ｍ９の６−シメチルアミノ
ー４．４−ジフェニルヘプテン酸を得た。

６−シメチルアミノー４４−ジフェニルヘプテン酸（３
，２５ｍ９）、ジシクロへキシルカルボジイミド（４，
１ｘｙ）、Ｎ−ヒドロキコハク酸ハイドライド（１、３
ｍｇ）およびピリジン（０２屑ρ）の混合物を室温にて
１時間撹拌した。フルオレセインア１２−ジメチルエタ
ン（ＤＭＥ、ｌ靜）中のトリメチルホスホノアセテート
（１８２ｘ９）の溶液をＤ　Ｍ　Ｅ　（３ｍｃ）中の８
０％水素化ナトリウム（２４だ２、ヘキサンて旧態て洗
浄）のスラリーに滴下することにより、ホスホネートア
ニオンを得た。室温にて３０分間撹拌した後、ＤＭＥ（
Ｉｆｆ＋２）中の４ジメチルアミノ−２，２−ジフェニ
ルペンタナール（実施例１にて調製したもの、２８１１
１１９）の溶液をゆっくりと加えた。この混合物を２４
時間撹拌した。水を加え、この水性混合物を酢酸エチル
（３回）で抽出した。抽出物を集めて水および食塩水（
各１回）で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。この溶
液を回転蒸発させて粗製の生成物を得、これをシリカゲ
ル上のフラッシュクロマトグラフィーにかけた。クロロ
ホルム／メタノール（２０：Ｉ）で溶出して９３ｍｇの
６−シメチルアミノー４４−ジフェニル−２−ヘプテン
酸メチルを得た。

６−シメチルアミノー４．４−ジフェニル−２ヘプテン
酸メチル（６０巧）、１０％Ｐｄ／Ｃ（１０罪）および
メタノールの混合物を室温にて１８ミン異性体ＩＩ（３
，４７＊９）を加え、この混合物を１８時間撹拌した。

得られた粗製の生成物を２つのプレパラティブＴＬＣプ
レートに加えた。クロロホルム／メタノール（３ｌ）で
展開して４つの主要なバンドを得た。所望のバンドをプ
レートからこすり取り、メタノールで溶出して純粋な６
ジメチルアミノー４４−ジフェニルヘプテン酸、アミノ
フルオレセインアミドトレーサーを得た。

実施例６ ３３−ジフェニル−４−オキソヘキサナール１−（０−
カルボキシメチル）オキシム、アミノフルオレセインア
ミドトレーサーの合成 ３．３−ジフェニル−４−オキソヘキサナール（実施例
２て調製、＋ｏｚ９）、カルボキシメトキシルアミンヘ
ミ塩酸塩（１４ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）
および無水エタノールの混合物を室温にて１６時間撹拌
しに。水を加え、この水性混合物（ｐＨ４）を酢酸エチ
ル（３回）で抽出した。抽出物を集めて水で洗浄し、乾
燥させた（ＭｇＳＯ４）。この溶液を回転蒸発させて粗
製の生成物を得、これをＰＴＬＣで精製した。クロロホ
ルム／メタノール（５：Ｉ）で展開して３つのバンドを
得た。真ん中のバンド（ＲｆＯ，３）をプレートからこ
すり取り、メタノールで溶出した。溶出液を回転蒸発さ
せて６７ｍ９の３．３−ジフェニル−４−才キソヘキサ
ナール−１−（０−カルボキシメチル）オキシムを油状
残渣として得、これをさらに真空乾燥させた。

ピリジン（０２仄の中の３．３−ジフェニル−４−才キ
ソヘキサナール−１−（０−カルボキシメチル）オキシ
ム（３，４ｍｇ）の撹拌溶液に室温にてジシクロへキシ
ルカルボジイミド（４，５ｆｆ！？）を加えた。Ｎ−ヒ
ドロキンスクンンイミド（２，０ｍｇ）を加えた。撹拌
を２時間続け、ついでフルオレセインアミン異性体■を
加えた。この混合物を１６時間撹拌した。得られた粗製
の生成物をプレバラティブＴＬＣプレートに加えた。ク
ロロホルム／メタロ３ ｎｏ４を破壊した。この混合物を分別漏斗に移し、水層
を廃棄した。有機抽出物を水で洗浄し、乾燥させた（Ｍ
ｇＳＯ４）。ａ過し、真空濃縮して１２４Ｅ９の４−オ
キソ−３，３−ジフェニルヘキサン酸を粘性の薄黄色の
油状物として得た。

無水ジオキサン（０，３ｚｆｆ）中の４−オキソ−３３
−ジフェニルヘキサン酸（８，８μｇ、００３１ミリモ
ル）の溶液に無水トリエチルアミン（５，０μｇ、０．
０３５　ミリモル）を加えた。撹拌しながらイソブチル
クロロホルメート（４，２μｐ、ｏ、。

３３ミリモル）を加え、この混合物を室温にて３０分間
撹拌した。かくして調製した混合カーボネートを、無水
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＳｏ、１ｘＱ）
中のアミノメチルフルオレセイン塩酸塩（１１，１ｚｇ
、００２８ミリモル）およびトリエチルアミン（８，５
μ（りの撹拌溶液にスポイトで加えた。この混合物を室
温、暗所にて１８時間撹拌し、蒸発乾固し、ＰＴＬＣプ
レートに加えｆこ。

このプレートをクロロホルム中の５％メタノールで２回
展開し、Ｒｒか０３４〜０３９の範囲のノール（３・１
）で展開して純粋な３，３−ジフェニル−４−オキソヘ
キサナール−１−（〇−カルボキシメチル）オキシム、
アミノフルオレセインアミドトレーサーを得た。

実施例７ ４−才キソー３．３−ジフェニルヘキサン酸、アミノフ
ルオレセインアミドトレーサーの合成ベンゼン（Ｉ　Ｒ
Ｑ＞中の４．４−ジフェニルヘプト６−エン−３−オン
（１３４，２ｚ９．０．５１ミリモル）の溶液を、ベン
ゼン／水（１：Ｌ　　２．ｖｆｆ）中の過マンガン酸カ
リウム（３２２Ｈ１２，０３ミリモル）およびトリカプ
リルメチルアンモニウムクロリド（１０Ｂ）の激しく撹
拌した懸濁液に加え１為１４時間激しく撹拌した後、こ
の混合物をベンゼン（２０屑ρ）で希釈し、過剰のヒド
ロ亜硫酸ナトリウムで処理し、ｌＮＨＣｌを加えて未反
応のＫｌｖ１バンドを得た。このバンドをプレートから
こすり取り、溶出し、他のプレート上で再精製して０２
Ｈの純粋な４−オキソ−３，３−ジフェニルヘキサン酸
、アミノメチルフルオレセインアミドトレーサーを得た
。

実施例８ ６−オキソ−５，５−ジフェニルオクタン酸、アミノフ
ルオレセインアミトドレーザーの合成。

乾燥ＴＨＦ（１０ｍ１２）中のジフェニルアセトニトリ
ル（９６６所、５．０ミリモル）の溶液を、Ｔ）Ｉｐ（
＋０＊Ｃ）中のヘキサン洗浄ＮａＨの撹拌懸濁液に０℃
にて滴下した。気体の発生か止まったとき、この混合物
を室温に温め、５−ブロモ−１−ペンテン（０，７１ｘ
ｃ、６．０ミリモル）をスポイトで加えた。この混合物
を１６時間加温還流し、冷却し、０　、５　、ｗ（２の
ＩＮＨｃＩで処［、ＦＡ発Ｑ’ｉ固１．り。

得られた残渣を酢酸エチル（３０，ｔ！２）中に取り、
食塩水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。濾過し、
ついで蒸発させて１．２６９の１．１−ジフェニル５−
ヘキセンニトリルを得た。

ジイソブチルアルミニウムハイドライト（ＤＴＰＡＨ，
トルエン中の１．５Ｍ溶液２５ｍ（，３゜７５ミリモル
）を−７８℃にて乾燥Ｔ　ＨＦ　（６ｚ（２）中の１．
１−ジフェニル−５−ヘキセンニトリル（９１１πｙ、
３．４ミリモル）の溶液に加えた。この混合物をゆっく
りと一夜かけて室温にもっていつ几。

この混合物を１００ｉ（ｉの砕氷、３０ｚｊの６ＮＨ２
ＳＯ４中に投；ｆ込み、この水性混合物を１５分間撹拌
した。この混合物をエーテル（各２０ｚρ）で抽出しく
３回）、エーテル層を集め、食塩水で洗浄し、乾燥させ
た（ＭｇＳＯ，）。溶媒を蒸発させて７６８２ｇの６，
６−ジフェニルヘプト−６−エナールを得た。

７６Ｆ３ｔｇの６．６−ジフェニルヘプト−６−エナー
ルを乾燥ＴＨＦ（ｌ　Ｏｉρ）中に溶解し、ｏ’ｃに冷
却し、エーテル中のエチルマグネシウムブロミリジニル
）ホスフィン酸クロリド（ＢＱＰ−Ｃｌ３．４巧、００
３３ミリモル）を、６−オキソ５５−ジフェニルオクタ
ン酸（１０，４黄２．０．０３３ミリモル）、フルオレ
セインアミン異性体１（１１，４Ｍ９．０．０３３ミリ
モル）およびトリエチルアミン（２０μ９，０．０６９
ミリモル）の溶液に室温にて加えた。この反応混合物を
室温にて７２時間撹拌し、ついで溶媒を真空除去した。

得られｆコ残渣を最小量のメタノール中に取り、プレー
トに加え、クロロホルム中の１０％メタノールで３回展
開した。Ｒｆが０．７５〜０，８９の範囲のバンドを除
去し、メタノールでゲルから溶出した。この物質を同様
にプレート上のクロマトグラフィーにかけ、クロロホル
ム中の１５％メタノールで２回展開して０　、６１１９
の純粋な６−オキソ−５，５−ジフェニルオクタン酸、
アミノフルオレセインアミドトレーサーを得た。

実施例９ Ｎ−（２−アミノエチル）−８−ジメチルアミノ６．６
−ジフェニル−５−ヒドロキンノニルアミドの３．０Ｍ
溶液（１，５ｍ（りで処理した。室温にて１時間撹拌後
、この混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で反応停止さ
せ、エーテルで希釈した。このエーテル抽出物を食塩水
で洗浄し、蒸発乾固した。残渣をＳｉＯ２のカラムに加
え、ヘキサン中の５〜２５％勾配エーテルで溶出して１
７０ｚ９の純粋な４．４−ジフェニルノン−８−エン−
３−オールを得た。

１７０ｍ９の４．４−ジフェニルノン−８−エン３−オ
ールをアセトン（１０ｚｃ）中に溶解し、ついで２．７
Ｍクロム酸溶液（０，０４ｆｆＣ）で処理した。

１０分後、過剰の酸化剤をイソプロパツールで破壊し、
この混合物をエーテル（２０ｍＱ）で希釈した。

セライトパッドで濾過し、濃縮して１３３ｘｙの４４−
ジフェニルノン−８−エン−３−オンヲ無定形の白色固
体として得た。

実施例７と同様の手順で４．４−ジフェニルノン−８−
エン−３−オンを酸化して５４Ｍ９の６オキソー５，５
−ジフェニルオクタン酸を得た。

撹拌しながらビス（２−才キソー３−オキサゾロ８ ン、ＤＴＡＦ）レーサーの合成： メタノール（０、５ｒｔｔ、１２）中の２−ジメチルア
ミノ−４，４−ジフェニル−５−オキソノナナール（実
施例１と同様にして調製、１２ｍ９）の溶液にエチレン
ジアミンを加えた。この混合物を室温にて撹拌した後、
水素化シアノホウ素ナトリウム（１０ｎ９）を加えた。

この混合物を室温にて１８時間撹拌し、水を加え、この
水性混合物をクロロホルムで抽出した。抽出物を集めて
食塩水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ，）。回転蒸発
させて粗製の生成物を得、これをさらに真空乾燥させて
４ＨのＮ　　（２アミノエチル）−８−ジメチルアミノ
−６，６ジフエニル−５−ヒドロキシノニルアミンを得
ｆ二。

Ｎ−（２−アミノエチル）−８−ジメチルアミノ６．６
−ジフェニル−５−ヒドロキシノニルアミン（４ｍ！／
）、ＤＴＡＦ異性体１（３ｘｙ）、トリエチルアミン（
１滴）およびメタノール（０，２Ｍのの〆混合物を室温
にて１８時間撹拌した。この混合物をプレパラティブＴ
ＬＣプレートに加えた。クロロホルム／メタノール（３
：　ｌ　）で展開して４つのバンドを得た。所望のバン
ドをプレートからこすり取り、メタノールで溶出して純
粋なＮ−（２−アミノエチル）−８−ジメチルアミノ−
６，６−ジフェニル−５−ヒドロキシノニルアミン、Ｄ
ＴＡＦトレーサーを得た。

実施例１０ メサドン蛍光偏光イムノアッセイ すてに述べたように、本発明のＦＰＩＡ用試薬は、本発
明のトレーサー、および本発明の免疫原に対して産生じ
たメサドン特異的抗体からなる。

加えて、希釈バッファーなどの従来より用いられている
アッセイ溶液、メサドンカリブレーク−およびコントロ
ールを調製ずろ。

好ましい手順は自動ＴＤＫまたはＡＤｘソステムと連結
して用いるよう設計したものであったが、手動アッセイ
らまた行うことができる。両手類に２）ＴＤＸバッファ
ー（０，０１％ウシγ−グロブリンおよび０．１％アジ
化ナトリウムを含有する０１Ｍリン酸塩バッファー、ｐ
Ｈ７，５）中の５％コール酸中に希釈したトレーサー ３）２％エチレングリコールおよび０．１％アジ化ナト
リウムを含むＯ，１Ｍクエン酸塩中に希釈した抗体（メ
サドン免疫原に対して産生させたヒツジ抗血清） ４）ＴＤｘバッファーからなる洗浄溶液５）ＴＤｘバッ
ファーからなる希釈バッファー６）プールした正常ヒト
尿（０，１％アジ化ナトリウムて貯蔵、０，００．０．
１５．０，２５．０５０．１．００および４．００μｙ
／ｉｆ７のメサドンを含有）からなるカリブレーク−；
および７）プールした正常ヒト尿（０，１％アジ化ナト
リウムで貯蔵、０３０．０．７５．２．００μ９／ｚ（
１のメサドンを含有）からなるコントロール。

すべての偏光蛍光測定はＴＤＸ装置を用いて行い、下記
プロトコールに従ってアッセイを行っｒ二。

１）２５μａの標準まｆ二：よ未知試験試料を前希釈つ
おいて、バックグラウンドの読み取りを行う前に試験試
料を希釈バッファー中の前処理溶液と混合することがで
きる。ついで、トレーサーを試験溶液に加え、ついで抗
体を加える。インキュベーンコン後、蛍光偏光の読み取
りを行う。

自動化アッセイにおいては、各カリブレーク−コントロ
ールまたは試験試料の蛍光偏光値は、ＴＤＫまたはＡＤ
Ｘ装置の出力テープ上で決定されプリントされる。これ
ら装置ではまた、非線形回帰分析を用い、各カリブレー
ターの濃度に対して偏光値をプロットすることにより標
準曲線が作成される。各コントロールまたは試料の濃度
は、貯蔵されたカリプレーター曲線から読み取られ、出
力テープ上にプリントされる。

好ましい自動化メサドンアッセイにおいて下記試薬を用
いた。

１）０．０１％ウシγ−グロブリンおよび０１％アジ化
ナトリウムを含有し、０１Ｍトリスバッフｙ　　（ｐ）
１７．５）中のＲＢ　Ｐ　（４寸／ｆｆ！りからなる前
処理溶液 エル中に入れ、充分な量の希釈バッファーを加えて容量
を５００μｇまで上げｒ二。

２）前希釈からの試料の一部と１２．５μＱの前処理溶
液をキュベツト中にピペットで入れ、バックグラウンド
強度を読み取った。

３）各２５μＱのトレーサーおよび抗体、および試料の
残りをキュベツトに加え、充分な量の希釈バッファーを
加えて容量を２　、　ＯｍＱに上げた。

４）この反応混合物をインキュベートした。

５）この混合物の最終的な偏光蛍光強度からバックグラ
ウンドの偏光蛍光強度を差し引くことにより、トレーサ
ーの抗体への結合に基づく蛍光偏光を得た。

６）未知試験試料の偏光値を、メサドン含量の知られた
カリブレーク−を用いて作成した標準曲線と比較した。

本発明のイムノアッセイから得られ几データを以下にま
とめる。トレーサーの抗体への結合、および試料中に存
在するメサドンによるトレーサーの置換を下記第１表に
まとめて示す。上記実施例のごとく、免疫原に応答して
産生させた抗体とトレーサーとの種々の組合わせを試験
した。トレーサーが抗体に結合した各組合わせにおいて
、正味のミリ偏光値は少なくとも１５０ミリ偏光単位、
スパンは少なくとも８０ミリ偏光単位であり、強度比は
バックグラウンドノイズの強度の１０〜２０倍の間で変
化した。実施例２の免疫原により産生させた抗体と実施
例４のトレーサーとの組合わせからは、トレーサーが抗
体への良好な結合およびメサドンによる良好な置換を示
した限りにおいて予期しない結果が得られん（免疫原の
ハブテンはトレーサーの分析対象物類似体よりも構造的
に異なる）。

塞七表 ＊＊　バックグラウンドノイズに対する正加えて、メサ
ドンの主要な尿代謝産物との交差反応性についてもまた
本発明のメサドンＦＰ■Ａを試験した。この代謝産物の
アッセイは１００μ９／好の濃度で行った。第３表に示
すように、第一の代謝産物である２−エチリデン−１，
５−ジメチル−３，３−ジフェニルピロリンツ（ＥＤＤ
Ｐ）、および第二の代謝産物である２−エチル−５−メ
チル−３３−ジフェニルピロリン（ＢＭＤＰ）のいづれ
ら、本発明のアッセイの感Ｋ（０，１０μ９味の強度の
比として表しである。

＊＊＊：抗体に対するトレーサーの結合か低すぎてスパ
ン試験に使用することが できなかった。

本発明のメサドンＦＰＩＡシステムはメサドンに特異的
である。下記第２表にまとめて示すように、種々の構造
類似薬剤の交差反応性を試験した。

被験化合物のアッセイは、既知量の被験化合物を薬剤不
含の正常ヒト尿に加え、試験試料をＴＤｘ装置上でアッ
セイすることにおり行った。これら化合物は１００μ９
／靜の濃度で試験し几。本発明の免疫原に応答して産生
される抗血清はメサドンに対して極めて特異的であり、
本発明のトレーサーと組合わせて感度の高いメサトノＰ
ＰＩＡか提供される。

／ｆｆ（りよりも大きな交差反応性を示さなかった。

（注）＊：濃度（８９７Ｍ（１） 場合によりプロメタシンを本発明のアッセインステムに
用いることができる。プロメタシンをアッセイに加える
ことにより、構造類似化合物が高濃度で存在することに
よるわずかな妨害作用も最小になる。プロメタシンの濃
度は約１〜２０μ９／ｎａ１好ましくは約８〜１２μ９
／ｍ（２の範囲であってよく、約１０μｇ／ｍρの濃度
が最も好ましい。

使用した試料前処理試薬にｌＯμｇ／πｇのプロメタシ
ンを加えて実験を行った。２％のアスコルビン酸ナトリ
ウムをも前処理試薬に加えた。実施例１の免疫原により
産生じた抗体と実施例４のトレーサーとの組合わせを用
いた。第４表に示すように、プロメタシンを加えてもな
お許容し得る正味のミリ偏光値、スパンおよび強度のア
ッセイη＼得られた。

第４表 （注）＊：ミリ偏光単位で示す。

＊＊・バックグラウンドノイズに対する正味の強度の比
として表しである。

加えて、種々の構造類似薬剤の交差反応性を試験した。

被験化合物は１００μ９／費（の濃度で試験した。第５
表に示すように、プロメタシンを前処理試薬に加えると
、構造関連化合物の交差反応性によるシグナルはアッセ
イの感度（ＯｌＯμ９／１Ｒｆりよりも低いレベルに減
少した。メサドンＦＰＩＡは試料中のメサドンを特異的
に定量し、また構造類似化合物との交差反応性が最小の
アッセイである。

（以下余白） 本発明の発明概念の多くを他の結合アッセイにも同様に
適用し得ることは当業者には評価されるであろう。上記
で挙げた態様は例示として掲げたものであり、本発明を
限定することを意図するものではない。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験試料中のメサドンの存在または量を決定する
   ための抗体を産生させるのに有用な、一般式：▲数式、
   化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もし
   くは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子か
   らなり、そのうちヘテロ原子の数が６個以下であるスペ
   ーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ原
   子の数は２個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生
   じているもの：Ｘは０または１の整数；ＭはＣ＝Ｏ、−
   ＮＨ−、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓより
   なる群から選ばれた結合基；Ｑは免疫原性担体である）
   で示される免疫原化合物。
2. （２）試験試料中のメサドンの存在または量を決定する
   ための抗体を産生させるのに有用な、一般式：▲数式、
   化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ’は、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和も
   しくは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子
   からなり、そのうちヘテロ原子の数が６個以下であるス
   ペーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ
   原子の数は２個以下であるもの；Ｘは０または１の整数
   ；ＭはＣ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝Ｏおよ
   びＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選ばれた結合基；Ｑは免疫
   原性担体である）で示される免疫原化合物。
3. （３）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もし
   くは不飽和の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子か
   らなり、そのうちヘテロ原子の数が６個以下であるスペ
   ーサー基であり、ただし連続して結合しているヘテロ原
   子の数は２個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生
   じているもの；Ｙは−ＣＯＯＨ、−ＮＨ＿２、−ＣＨＯ
   および−ＯＨよりなる群から選ばれた結合基である）で
   示されるハプテン化合物。
4. （４）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるハプテン化合物。
5. （５）試験試料中のメサドンの存在または量を決定する
   ためのアッセイに有用な、一般式。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は、それぞれＨもしくはＯ
   ＨであるかまたはＲ＿１とＲ＿２が一緒になって＝Ｏを
   表し：Ｒ＿３はエチル基または式：ＲＭＦ１（式中、Ｒ
   は、直鎖もしくは分枝鎖に配列した飽和もしくは不飽和
   の０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子からなり、そ
   のうちヘテロ原子の数が６個以下であるスペーサー基で
   あり、ただし連続して結合しているヘテロ原子の数は２
   個以下であり該分枝鎖は炭素原子上でのみ生じているも
   の；Ｍは、Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝Ｏ
   およびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選ばれた結合基；Ｆ１
   は、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である
   ）で示される基；Ｒ＿４は、Ｒ＿３がＲＭＦ１であると
   きに２−ジメチルアミノプロピル基、またはＲ＿３がエ
   チル基であるときに式：ＲＭＦＩ（式中、Ｒ、Ｍおよび
   Ｆ１は前記と同じ）で示される基である）で示されるト
   レーサー化合物。
6. （６）試験試料中のメサドンの存在または量を決定する
   方法であって、 （ａ）該試料を請求項（５）に記載のトレーサー化合物
   、および該メサドンおよび該トレーサー化合物を特異的
   に認識し得る抗体と混合して溶液を得、（ｂ）該溶液中
   に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、ついで （ｃ）該蛍光偏光応答を検出して試料中のメサドンの存
   在または量を決定する ことを特徴とする方法。
7. （７）工程（ａ）においてリボフラビン結合タンパク質
   が、リボフラビンの蛍光を実質的に減少させるのに充分
   な量で存在する請求項（６）に記載の方法。
8. （８）工程（ａ）においてプロメタシンが約１μｇ／ｍ
   ｌの濃度で存在する請求項（６）に記載の方法。
9. （９）試験試料中のメサドンの存在または量を決定する
   ためのアッセイキットであって、請求項（５）に記載の
   トレーサー化合物、および該メサドンおよび該トレーサ
   ー化合物を特異的に認識し得る抗体からなるキット。
10. （１０）さらにプロメタシンを約１μｇ／ｍｌから２０
    μｇ／ｍｌの濃度で含む請求項（９）に記載のアッセイ
    キット。
11. （１１）さらにリボフラビン結合タンパク質を、リボフ
    ラビンの蛍光を実質的に減少させるのに充分な量で含む
    請求項（９）に記載のアッセイキット。