HU193381B - Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto - Google Patents

Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto Download PDF

Info

Publication number
HU193381B
HU193381B HU52285A HU52285A HU193381B HU 193381 B HU193381 B HU 193381B HU 52285 A HU52285 A HU 52285A HU 52285 A HU52285 A HU 52285A HU 193381 B HU193381 B HU 193381B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
radioligand
reaction
process according
cyclophosphate
Prior art date
Application number
HU52285A
Other languages
Hungarian (hu)
Other versions
HUT41127A (en
Inventor
Istvan Mucha
Andras Seregi
Peter Serfoezoe
Bela Tanacs
Julianna Benkoe
Original Assignee
Mta Izotop Intezete
Mta Kiserleti Orvostudomanyi K
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mta Izotop Intezete, Mta Kiserleti Orvostudomanyi K filed Critical Mta Izotop Intezete
Priority to HU52285A priority Critical patent/HU193381B/en
Publication of HUT41127A publication Critical patent/HUT41127A/en
Publication of HU193381B publication Critical patent/HU193381B/en

Links

Landscapes

  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Method is based on an antigen-autitest reaction used for the detm. of adenosine 3'-5'cyclo-phosphate (C-AMP) concn. employs a radio ligand of a novel structure. The ligand is a 2'-O-(2'',3''-3H2-) succinyl C-AMP deriv. (I) exhibiting excellent moler activity acid extended half life. - R is a hydroxy or L-(3,5-3H)Me-tyrosine group. (I) is prepd. by reaction of tritium-contg. succinic acid anhydride (II) and adenosine 3,-5' cyclophosphate or its salts. A product (1A) being similar to (I) can if required react with a tyrosine deriv.

Description

A találmány tárgya eljárás biológiai szövetminta (szövet, vér, vizelet, stb.) adenozin-3’,5’-cikloíoszfát (továbbiakban: c-AMP) tartalmának radioímmunológíai meghatározására ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP származék és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai közegmintá/k/ jelenlétében, amelynek során megmérjük a nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban: radioligand) specifikus antitesttel való kötődését és az ismert mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP hígítási sorozat által okozott kötésváltozás és az (előnyösen acetilezett) közegminta által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát.The present invention relates to a method for the radioimmunoassay of adenosine 3 ', 5'-cyclo-phosphate (hereinafter c-AMP) content of biological tissue samples (tissue, blood, urine, etc.) in known amounts of c-AMP derivatives of various concentrations (preferably acetylated). to be determined in the presence (preferably acetylated) biological media sample (s) by measuring the binding of the highly specific activity radioactive tracer (hereinafter radioligand) to a specific antibody and the change in binding caused by a known amount of (preferably acetylated) c-AMP dilution series. preferably, based on the change in binding caused by the acetylated medium sample, the active substance content of each medium sample is calculated.

A találmány szerint ebben az immunokémíai reakcióban radioligandként egy önmagában ismert c-AMP származék találmány szerinti triciálásával kapott új szerkezetű vegyületet alkalmazunk.According to the invention, the radioligand used in this immunochemical reaction is a novel compound obtained by trituration of a known c-AMP derivative according to the invention.

A találmány tárgya továbbá ennek az új szerkezetű radioligandnak az előállítására szolgáló eljárás.The present invention further relates to a process for the preparation of this novel structure radioligand.

A c-AMP az élő szervezetekben előforduló, biológiailag aktív vegyület: a hormonok és ingerületátvivők hatásának ún. másodlagos hírvivője [részletesen tárgyalja pl.: Recent Prog. Hormoné Rés., 21, (1965) 623—646]. A c-AMP mennyiségének érzékeny, pontos meghatározása rendkívül fontos az endokrinológiai, neurokémiai és farmakológiai kutatások szempontjából. A c-AMP meghatározás több módszerét ismerteti az irodalom.C-AMP is a biologically active compound in living organisms: the so-called hormone and neurotransmitter. secondary messenger [discussed in detail in Recent Prog. Hormones Res., 21, 623-646 (1965). Sensitive, accurate quantification of c-AMP is extremely important for endocrinological, neurochemical and pharmacological research. Several methods for the determination of c-AMP are described in the literature.

AJ. Bioi. Chem., 247, (1972), 1106—1113, illetve a Biochem. J., 121, (1971), 561—562 források ismertetik az ún, protein binding assay eljárás két változatát, amelyek szerint vázizomból vagy mellékveséből izolálnak fehérjefrakciót, és figyelik egyfelől a tricium-jelzett 3H-c-AMP, másfelől a nem-jelzett c-AMP vetélkedését az izolált fehérjefrakció kötés-helyein.AJ. Biol. Chem., 1977, 247, 1106-1133 and Biochem. J., 121, pp. 561-562 (1971) disclose two variants of the so-called protein binding assay method, which isolates protein fractions from skeletal muscle or adrenal gland and monitors tritium-labeled 3 Hc-AMP on the one hand and unlabeled c -AMP competition at the binding sites of the isolated protein fraction.

A módszer hátránya, hogy nem elég érzékeny, mérési tartománya 1 —16 pikomól; előnye viszont a hatóanyag tartóssága: felezési ideje mintegy 12 év.The disadvantage of the method is that it is not sensitive enough and has a measuring range of 1 to 16 picomoles; the advantage is the durability of the active ingredient: the half-life is about 12 years.

Egy másik forrás [Adv. in Cyclic Nucleotide Rés., 10, (1979), 1—33; Raven Press, New-York] olyan eljárást ismertet, amelynél a radioimmunassay-ben kötőfehérjeként alkalmazott specifikus antitest képződését 2’-0-szukcinil-c-AMP-nek testidegen fehérjékkel alkotott konjugátumaival váltják ki állatokban. Radioligandként a c-AMP-nek 125 tömegszámú jóddal jelzett 2’-0-szukcinil-tirozin-metilészterét használják. A mérés ezen radioligandnak és a nem-jelzett (adott esetben acetilezett) c-AMP-nek az antitest kötéshelyeiért való vetélkedésén alapul. Ennek a módszernek az előnye, hogy jobb az érzékenysége, mérési tartománya kb. 0,01—0,2 pikomól és az alkalmazott antitest igen olcson, nagy mennyiségben előállítható és hosszan tárolható, ezáltal folyamatos felhasználást tesz lehetővé; a módszer hátránya, hogy a jód felezési ideje rövid, mindössze 60 nap.Another source [Adv. in Cyclic Nucleotide Res., 10 (1979) 1-33; Raven Press, New York, discloses a method in which the formation of a specific antibody used as a binding protein in radioimmunassay is induced in animals by conjugates of 2'-O-succinyl-c-AMP with foreign proteins. The radioligand used is the 2'-O-succinyl tyrosine methyl ester of c-AMP, 125 weighted by iodine. The assay is based on competition between this radioligand and unlabeled (optionally acetylated) c-AMP for antibody binding sites. The advantage of this method is that it has a better sensitivity and measuring range of approx. 0.01-0.2 picomoles, and the antibody used can be produced at low cost, in large quantities, and can be stored for long periods, thus allowing continuous use; The disadvantage of this method is that the half-life of iodine is short, only 60 days.

A találmány alapja az a felismerés, hogy e két módszer előnyei egyesíthetők azok hátrányai nélkül, ha az immunokémiai reakcióban radioligandként a c-AMP önmagában ismert származékainak új módon való jelzésével kapott (I) általános képletű 2’-0- [2,3” -3H2]-szukcinil-c-AMP származékok valamelyikét alkalmazzuk, amely képletben R jelentése hidroxilcsoport vagy L- [3,5-3H]-metil-tirozilcsoport; ezeknek a radioligandoknak hoszszú a felezési idejük (12,3 év), nagy a moláris aktivitásuk [70—130 Ci/mmól] és az ugyancsak találmányunkat képező szintetizáló eljárással ezek a radioligandok kedvező feltételek között állíthatók elő.The present invention is based on the discovery that the advantages of these two methods can be combined without the disadvantages of reacting the 2'-O- [2,3 '- of the formula (I) as a radioligand by novel labeling of the known derivatives of c-AMP in the immunochemical reaction. One of 3 H 2 ] succinyl-c-AMP derivatives wherein R is hydroxy or L- [3,5- 3 H] -methyl-tyrosyl; these radioligands have a long half-life (12.3 years), high molar activity [70-130 Ci / mmole], and can also be prepared under favorable conditions by the synthesis process of the present invention.

Tapasztalati tény, hogy a c-AMP alapmolekula a specifikus antitesthez rosszul kötődik; az alapmolekula triciálása problematikus,és az alapmolekula triciált formája ebben az immunokémiai reakcióban radioligandként akkor sem lenne alkalmazható, ha annak fajlagos aktivitását növelni lehetne.Experience shows that the c-AMP parent molecule binds poorly to the specific antibody; tritiation of the parent molecule is problematic and the tritiated form of the parent molecule would not be useful as a radioligand in this immunochemical reaction even if its specific activity could be increased.

A c-AMP molekula szukcinil származékai viszont nagyságrendekkel jobb kötődést biztosítanak [Anal. Biochem., 56, (1973), 383—393]; felismertük, hogy a c-AMP szukcinil származékai egy új szintézis keretében jól triciálhatók és az immunokémiai reakció hatékonysága javítható, ha az így kapott (I) általános képletű vegyületek valamelyikét alkalmazzuk radioligandként. Felismerésünk szerint az (I) általános képletű triciált c-AMP származékok kedvező feltételek között úgy állíthatók elő, hogy előbb triciummal jelzünk az (I) általános képletű vegyület oldalláncának szukcinilcsoportjává konvertálható vegyületet, majd a triciált vegyületet (II) képletű triciált borostyánkősavanhidriddé konvertáljuk, és ezzel reagáltatjuk az inaktív c-AMP alapmolekulát vagy annak sóját, előnyösen nátriumsóját. Így kapjuk az (I) általános képlet körébe tartozó (la) képletű célterméket, amelyet közvetlenül is alkalmazhatunk radioligandként, továbbá kívánt esetben úgy konvertálhatunk még nagyobb moláris aktivitású (Ib) képletű céltermékké, hogy reagáltatjuk (IV) képletű triciált tirozin-metilészterrel. A kétféle (I) általános képletű radioligandot tehát úgy állíthatjuk elő, hogy a c-AMP-t inaktív szerkezetében alkalmazhatjuk kiindulási anyagként: elkerülhető a c-AMP molekula radiokémiái szintézise, az alapmolekula triciálása. Az (la) képletű céltermék szintézisének lépéseit az A Folyamatábra, az (la) — (Ib) konverzió lépéseit a B Folyamatábra szemlélteti.The succinyl derivatives of the c-AMP molecule, on the other hand, provide orders of magnitude better binding [Anal. Biochem., 56, 383-393 (1973)]; We have discovered that the succinyl derivatives of c-AMP can be tritiated well in a novel synthesis and the efficiency of the immunochemical reaction can be improved by using one of the compounds of formula (I) thus obtained as a radioligand. It has now been found that tritiated c-AMP derivatives of formula (I) can be prepared under favorable conditions by first treating a compound that is convertible to a succinyl group of a compound of formula (I) with tritium, followed by tritiated succinic anhydride of formula (II) reacting the inactive c-AMP parent molecule or a salt thereof, preferably its sodium salt. This yields the target product of formula Ia, which can be used directly as a radioligand, and optionally converted to an even higher molar activity target product of formula Ib by reaction with tritiated tyrosine methyl ester of formula IV. Thus, the two types of radioligand of Formula (I) can be prepared by using c-AMP as a starting material in its inactive structure: avoiding the radiochemical synthesis of the c-AMP molecule and trituration of the parent molecule. The steps for the synthesis of the target product of formula (Ia) are illustrated in Scheme A and the steps of conversion (Ia) to (Ib) are illustrated in Scheme B.

A találmány tárgya tehát antitest-antigén reakciós meghatározási eljárás, amely az ismert és a fentiekben körvonalazott radioimmunassay eljárástól abban különbözik, hogy radioligandként új szerkezetű, (I) általános képletű tricium-jelzett c-AMP származékot alkalmazunk.The present invention therefore relates to a method for determining an antibody-antigen reaction, which differs from the known radioimmunoassay method outlined above by the use of a novel tritium-labeled c-AMP derivative of formula (I) as the radioligand.

Ennek során úgy járunk el, hogy a radioligandnak specifikus antitesthez való kötődését mérjük ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP jelenlétében, majd az így kapott értékekből az ismeretlen (előnyösen acetilezett) közegminták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó c-AMP koncentrációkat kiszámítjuk.This involves measuring the binding of the radioligand to a specific antibody in the presence of a known amount of c-AMP at various concentrations (preferably acetylated), and then calculating the c-AMP concentrations for binding changes caused by unknown (preferably acetylated) media samples.

Ehhez a radioligandot, továbbá a hígitási sorozat szerint eltérő mennyiségű inaktív c-AMP-t és specifikus antitestet tartalmazó pufferoldatot inkubálunk, majd az antitesthez kötött, illetve nem kötött frakciókat elválasztjuk és mérjük a kötött frakciók radioaktivitását.To do this, incubate the radioligand and buffer containing different amounts of inactive c-AMP and specific antibody according to the dilution series, and separate the bound and non-bound fractions of the antibody and measure the radioactivity of the bound fractions.

Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 és 40°C közötti, az inkubáció időtartama 1 és 50, előnyösen 3 és 20 óra közötti.Depending on the particular composition of the solution, the incubation temperature is between 0 and 40 ° C and the incubation time is between 1 and 50 hours, preferably between 3 and 20 hours.

Általában háromezer és harmincezer, előnyösen hatezer és tizenkétezer közötti cpm beütésszámú radioligandot alkalmazunk, amelyet célszerűen úgy készítünk ki, hogy pufferoldatot tartalmazó sorszámozott kémcsövekbe töltjük a meghatározott, előnyösen pl. tízezer cpm beütésszámú (500 Bq radioaktivitású) (I) képletű radioligandot és a megfelelő sorszámú kémcsőbe pipettázunk a mindenkori hígitási aránynak megfelelően 0—25—50—100—250—500—1000 fmól (10'15 mól) mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP-t és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai mintát; célszerűen azonos hígítással 3—3 mintát vizsgálunk párhuzamosan.Generally, a radioligand having a cpm count of between three thousand and thirty thousand, preferably between six thousand and twelve thousand, is preferably prepared by filling into serially numbered test tubes containing a buffer solution, e.g. ten thousand cpm (500 Bq radioactivity) radioligand formula (I) and pipetted into the appropriate tube serial number corresponding to the respective dilution ratios 0-25-50-100-250-500-1000 fmol (10 ', 15 mol) of a (preferably acetylated) c -AMP and the biological sample to be determined (preferably acetylated); preferably 3 to 3 samples are tested in parallel with the same dilution.

A pufferoldat célszerűen 0,1 — 1 térfogatszázaléknyi (tf%) szérumalbumint, előnyösen szarvasmarha szérumalbumint (BSA) tartalmazó 0,01—0,2 M, előnyösen 0,05 M nátrium-acetát-oldat, amelynek mennyisége 0,1 és 1 tf% közötti, előnyösen 0,5 tf%. Általában ezt az antitest-antigén reakciót savas közegben célszerű végezni, előfordulhat, hogy enyhén lúgos közegben eredményes, így a pufferoldat pH-ját 4 és 8 közötti értékre állíthatjuk, az előnyösen 4,75 körüli.The buffer solution is preferably 0.01-0.2 M, preferably 0.05 M sodium acetate, containing 0.1 to 1% (v / v) serum albumin, preferably bovine serum albumin (BSA). %, preferably 0.5% by volume. Generally, this antibody-antigen reaction is conveniently carried out in an acidic medium and may be carried out in a slightly alkaline medium so that the pH of the buffer solution can be adjusted to between 4 and 8, preferably about 4.75.

A specifikus antitest célszerűen magas titerű (pl. 103—104-szeres hígítású) anti-c-ÁMP immunsavó, amelyből annyit alkalmazunk, amennyi az inaktív c-AMP-t nem tartalmazó mintában a radioligand 40—60, előnyösen kb. 50%-át képes megkötni.The specific antibody is preferably a high titre (e.g., 10 3 to 10 4 fold dilution) of anti-c-AMP antiserum used in the amount of the radioligand 40-60, preferably ca. It can bind 50%.

A minták és az inaktív c-AMP acetilezését célszerűen ecetsavanhidrid reagenssel, trietil-amin jelenlétében végezzük, pl. úgy, hogy azokat kb. 20 tf% trietil-amint tartalmazó 0,005 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) 10 tf% ecetsavanhidriddel reagáltatjuk; a reakció hőmérséklet előnyösen 20— 25°C, a reakcióidő előnyösen 30 perc körüli.Samples and inactive c-AMP are preferably acetylated with acetic anhydride reagent in the presence of triethylamine, e.g. so that they are app. 10% acetic anhydride in 0.005 M sodium acetate buffer (pH 4.75) containing 20% v / v triethylamine; the reaction temperature is preferably 20 to 25 ° C, the reaction time is preferably about 30 minutes.

Az anti-c-AMP immunsavó készítéséhez és a minták és az inaktív c-AMP acetilezéséhez előnyösen a Brooker et al [Adv. in Cyclic Nucleotide Rés., 10, (1979) 1] által ismertetett módszert alkalmazhatjuk.For the preparation of anti-c-AMP immune serum and for the acetylation of samples and inactive c-AMP, it is preferred that Brooker et al., Adv. in Cyclic Nucleotide Res., 10, 1979 (1).

A kötött, illetve nem kötött radioligand frakciók elválasztásához előnyösen 0,25% BSA-t és 0,2% csontszenet tartalmazó 0,1 M kálium-foszfátos pufferoldatot [pH=6,8] alkalmazunk. A 0,15% végkoncentrációjú csontszén megköti a radioligand nem kötött frakcióját és a centrifugálás után felülúszóként kapott kötött frakciót folyadékszcjntillációs módszerrel mérjük.Preferably, 0.1 M potassium phosphate buffer solution (pH 6.8) containing 0.25% BSA and 0.2% charcoal is used to separate the bound and unbound radioligand fractions. Charcoal at a final concentration of 0.15% binds the unbound fraction of the radioligand and the bound fraction obtained after centrifugation as a supernatant is measured by liquid distillation.

A találmány tárgya továbbá eljárás a radioligandként alkalmazható (I) általános képletű 2’-0- [2”,3”-3H2] -szukcinil-c-AMP származékok előállítására.The present invention also relates to a process for the preparation of 2'-O- [2 ', 3' - 3 H 2 ] -succinyl-c-AMP derivatives of formula (I) for use as a radioligand.

A találmány szerint az (I) általános képletű triciált c-ÁMP származékokat úgy állítjuk elő, hogy (II) képletű triciált borostyánkősavanhidridet adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal vagy annak sójával, előnyösen nátriumsójával reagáltatunk,és kívánt esetben a kapott reakcióterméket (IV) képletű [3,5-3H]-tirozin-metilészterrel reagáltatjuk poláros oldószerben, tercier amin, pl. trietil-amin és klór-hangyasav-etilészter jelenlétében. (Az A Folyamatábra azt a foganatosítási módot szemlélteti, amelynél a (II) képletű kiindulási anyagot (III) képletű c-AMP-nátriumsóval reagáltatjuk) .According to the invention, the tritiated c-AMMP derivatives of formula I are prepared by reacting the tritiated succinic anhydride of formula II with adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate or a salt thereof, preferably the sodium salt thereof, and optionally the reaction product (IV). ) wherein [3,5- 3 H] tyrosine methyl ester in a polar solvent, a tertiary amine, e. triethylamine and ethyl chloroformate. (Scheme A illustrates an embodiment of reacting the starting material of formula II with the c-AMP sodium salt of formula III).

A (II) képletű kiindulási anyagot a továbbiakban ismertetendő kétféle eljárásváltozattal is előállíthatjuk, amely változatok egyike szerint kapott termék moláris aktivitása 30—50 Ci/mmól, míg a másik eljárásváltozatban kapott termék moláris aktivitása 70—80 Ci/mmól. így az első lépésben szintetizált (la) képletű céltermék moláris aktivitása is lehet eltérő, 30—80 Ci/mmól tartományon belül. A (IV) képletű kiindulási anyag a továbbiakban ismertetendő szintézissel úgy állítható elő, hogy annak moláris aktivitása 40 -50 Ci/mmól, így a második lépésben kapott (Ib) képletű céltermék moláris aktivitása 70—130 Ci/mmól.The starting material of formula (II) can also be prepared by the two process variants described below, one having a molar activity of 30-50 Ci / mmol and a product having another molar activity of 70-80 Ci / mmol. Thus, the molar activity of the target product (1a) synthesized in the first step may also vary within a range of 30 to 80 Ci / mmol. The starting material of formula (IV) can be prepared by the synthesis described below having a molar activity of 40 to 50 Ci / mmol, so that the target product of formula (Ib) obtained in the second step has a molar activity of 70 to 130 Ci / mmol.

Külön előnye a találmány szerinti eljárásnak, hogy a kiindulási anyagok előállítása során nincs szükség a c-AMP radiokémiái szintézisére (triciálására), és hogy a két triciált reagens alkalmazásával az (Ib) képletű célterméket eredményező totálszintézis szobahőmérsékleten mehet végbe.A particular advantage of the process according to the invention is that there is no need for the radiochemical synthesis (c) of c-AMP in the preparation of the starting materials and that the total synthesis of the target product of formula Ib can be carried out using the two tritiated reagents.

Az (la) képletű vegyület szintézisében oldószerként célszerűen trietil-amin és aceton elegyét alkalmazzuk, előnyösen 1:4 térfogatarányban, a (II) képletű kiindulási anyag egy móljára számított 8—15, előnyösen 10 mólnyi mennyiségben. A c-AMP (só)t a (II) képletű kiindulási anyag móljára számított 0,1—0,3, előnyösen 0,15 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk. A kapott reakcióelegyet savanyítjuk, a kivált csapadékot leszűrjük. A savanyításhoz előnyösen 2M sósavat alkalmazunk. A csapadékot mossuk és szárítjuk, a kapott (la) képletű vegyületet alkalmazhatjuk rad'oligandként az immunokémiai reakcióban vagy az (Ib) vegyület szintéziséhez kiindulási anyagként.Suitably the solvent for the synthesis of the compound of formula (Ia) is triethylamine / acetone, preferably in a ratio of 1: 4 by volume, from 8 to 15, preferably 10 mol, per mole of starting material (II). The c-AMP (salt) is used in an amount of 0.1 to 0.3, preferably 0.15 mol, per mole of starting material of formula (II). The reaction mixture was acidified and the precipitate was filtered off. Preferably 2M hydrochloric acid is used for acidification. The precipitate is washed and dried, and the resulting compound of formula (Ia) can be used as a radioligand in the immunochemical reaction or as a starting material for the synthesis of compound (Ib).

-3193381-3193381

Az (1b) képletü vegyület szintézisében a reakcióidő az egyéb reakciókörülményektől függően négy és tíz óra közötti, előnyösen hat óra. Az (la) képietű kiindulási anyagot előnyösen feloldjuk dimetil-formamidban (DMF) úgy, hogy annak 0,3 vegyes százalékos — oldott súly/oldó térfogatarány kifejezése %-bán — oldatát kapjuk, ehhez töltünk a tercier amin 10 tf%-os DMF oldatából 3 tf%-nyi mennyiséget és a klór-hangyasav-etilészter — 2—2,5 tf%-os — DMF oldatából 3—4 mólnyi, előnyösen 3,5 mólnyi mennyiséget; az elegyet ezután jól elkeverjük, előnyösen kb. 0°C hőmérsékleten mintegy 15 percen át. Ezután adjuk hozzá az ugyancsak DMF-ben oldott (IV) képietű kiindulási anyagot 2—2,5 mólnyi mennyiségben. Az előnyösen hat óra tartamú reakció közben — már az elegy előzetes kevertetésétől kezdődően — inért reakciótér (vízmentesség) fenntartását biztosítjuk, pl. argongáz áramoltatással és az elegyet a reakció teljes tartamára kevertetjük.In the synthesis of the compound of formula (1b), the reaction time is from four to ten hours, preferably six hours, depending on other reaction conditions. Preferably, the starting material of formula (Ia) is dissolved in dimethylformamide (DMF) to give a 0.3% w / v solution in% by weight of a solution of tertiary amine in 10% v / v DMF. 3% v / v and 3 to 4 molar, preferably 3.5 molar, of a 2 to 2.5% v / v DMF solution of ethyl chloroformate; the mixture is then thoroughly mixed, preferably ca. 0 ° C for about 15 minutes. Then, the starting material (IV), also dissolved in DMF, is added in an amount of 2 to 2.5 moles. During the reaction, which is preferably carried out for a period of six hours, the reaction mixture (anhydrous) is maintained, starting from the premix of the mixture, e.g. under argon and the mixture was stirred for the complete reaction.

A reakció lezajlása után az oldószert ledesztilláljuk. Ezt a műveletet célszerűen a köztitermékek előállításának egyes műveleteinél is alkalmazandó vákuumhídon végezzük, mintegy 40°C hőmérsékleten és 0,00133 bar (1 mmHg) nyomáson, cseppfolyós nitrogénnel hűtött lombikba.After completion of the reaction, the solvent was distilled off. This operation is conveniently carried out in a vacuum bridge, which is also used for some of the steps in the preparation of the intermediates, at a temperature of about 40 ° C and a pressure of 0.00133 bar (1 mm Hg) in a liquid nitrogen cooled flask.

A maradékot feloldjuk és kromatografáljuk. Az oldószer előnyösen etil-alkohol, a kromatografáláshoz előnyösen műanyagfóliás cellulóz réteget és három komponens, n-butanokecetsav.víz 12:3:5 térvogatarányú elegyét alkalmazzuk, amely elegy felső fázisában kromatografáljuk a reakcióterméket. A terméket radiokromatográfiás módszerrel azonosítjuk (pl. Berthold LB 2001 Dünnschicht Scannerrel), a rétegről a terméket leoldjuk (pl. a már megadott háromkomponensű elegygyel), majd az oldószert ledesztilláljuk, előnyösen 40°C körüli hőmérsékleten, 0,02 bar (15 mmHg) körüli nyomáson. A kapott termék, amelynek moláris aktivitása — a köztitermék triciálására alkalmazott módszertől függően — meghaladja a 70, illetve a 110 Ci/mmólt, biztosítja a radioimmunassay hatékonyságát.The residue was dissolved and chromatographed. Preferably, the solvent is ethyl alcohol, preferably a plastic film cellulose layer for chromatography and a 12: 3: 5 by volume mixture of ternary n-butanoacetic acid / water, which is chromatographed in the upper phase of the reaction product. The product is identified by radiographic chromatography (e.g., Berthold LB 2001 Dünnschicht Scanner), the product is leached from the layer (eg, the ternary mixture already indicated) and the solvent is distilled off, preferably at about 40 ° C, 0.02 bar (15 mm Hg). pressure. The resulting product, which has a molar activity in excess of 70 and 110 Ci / mmole, respectively, depending on the method used for trituration of the intermediate, provides radioimmunoassay efficiency.

A (IV) képietű tirozinszármazék kiindulási anyagot úgy állíthatjuk elő, hogy (V) képletü 3,5-dibróm-L-tirozin-metilésztert triciálunk poláros oldószerben, katalizátor jelenlétében, csökkentett — pl. 0,933 bar (700 mmHg) — nyomáson. Célszerűen alumínium - oxid hordozóra felvitt palládium katalizátort alkalmazunk, oldószerként pedig DMF és dioxán 1:5—1:20, előnyösen 1:8 térfogatarányú elegyét. Reagensként hordozómentes triciumgázt alkalmazunk. A katalizátort szűréssel választjuk le, a szűrletbőí az oldószert — pl. a már említett vákuumhíd alkalmazásával,0,00133 bar (1 mmHg) nyomáson — ledesztilláljuk, a maradékot pedig csökkentett nyomáson foszfor-pentoxidon szárítjuk.The tyrosine derivative of formula (IV) may be prepared by trituration of a 3,5-dibromo-L-tyrosine methyl ester of formula (V) in a polar solvent in the presence of a reduced, e.g. At a pressure of 0.933 bar (700 mmHg). Preferably, the palladium catalyst is supported on an alumina support and the solvent is a mixture of DMF and dioxane (1: 5 to 1:20, preferably 1: 8). The reagent is carrier-free tritium gas. The catalyst is separated by filtration, and the solvent, e.g. using a vacuum bridge as mentioned above, distilling off the residue at 0.00133 bar (1 mm Hg) and drying under reduced pressure over phosphorus pentoxide.

A szilárd maradékot kromatografáljuk és radiokromatográfiás módszerrel azonosítjuk, az (Ib) képietű célterméknél alkalmazott utókezeléshez hasonlóan.The solid residue is chromatographed and identified by radiographic chromatography, similar to the post-treatment of the target product of formula (Ib).

A találmány igen lényeges előnye, hogy az (la) képietű célterméket — és természetesen az annak további konvertálásával kapott (1b) képietű célterméket is — úgy nyerjük, hogy inaktív (nem-jelzett) c-AMP-t reagáltatunk olyan triciált kiindulási anyaggal, amely már triciált állapotban tartalmazza a szintézis során a c-AMP oldalláncába beépülő csoportot. Az A Folyamatábrán jól látható, hogy előbb az oldallánc triciálandó elemeit tartalmazó vegyületet triciálunk, és az így kapott köztitermékből tovább visszük a triciált csoportot.A very important advantage of the present invention is that the target product of formula (Ia) - and of course the target product of formula (1b) obtained by further conversion thereof - is obtained by reacting inactive (unlabeled) c-AMP with a tritiated starting material which already contains a tricyclic moiety incorporated into the c-AMP side chain. It is clearly shown in Flow Diagram A that the compound containing the side elements to be triturated is first triturated and the resulting tritiated group is further transported from the resulting intermediate.

Az (la) céltermék szintézisében alkalmazott (II) képietű — triciált — borostyánkősavanhidrid kiindulási anyagot ugyancsak már triciált (VI) képietű [2,3- HJ-borostyánkősavból állíthatjuk elő. Az acetil-klorid 3—5, előnyösen 4 mólarányú alkalmazásával foganatosított reakció hőmérséklete 80—150, előnyösen 110°C, a reakcióidő 1 —10, előnyösen 3 perc. A termékről az oldószert ledesztillaljuk.The tritiated succinic anhydride starting material (II) used in the synthesis of the target product (Ia) can also be prepared from tritiated [2,3-H] succinic acid (VI). The reaction temperature of the acetyl chloride using 3-5 molar, preferably 4 molar ratios, is 80-150, preferably 110 ° C, reaction time is 1-10, preferably 3 minutes. The solvent was distilled off from the product.

A (VI) képietű triciált borostyánkősavat előállíthatjuk egy lépésben (VII) képletü acetilén-dikarbonsav triciálásával (a-változat) és két lépésben (IX) képletü acetilén-dikarbonsav-dimetilészter triciálásával és a kapott (VIII) képletíí [2,3-3H2]-borostyánkősav-dimetilészter redukálásával (b-változat).(VI) tritiated succinic acid of formula may be prepared in one step (VII) acetylene dicarboxylic triciálásával (the variant) and two stages (IX) acetylene dicarboxylate and the resulting triciálásával (VIII): Formula III [2,3- 3 H 2 ] -Succinic acid dimethyl ester (variant b).

Az a-változat szerint kapott (VI) képletíí a-köztitermék moláris aktivitása 30 és 50 Ci/ /mmól közötti, a kétlépéses b-változat szerint kapott (VI) képletü b-köztiterméké 70 és 80 Ci/mmól közötti. A nagyobb hatékonyságú b-köztitermék viszont kisebb összkitermeléssel állítható elő, mint az egy lépésben kapott a-köztitermék.Intermediate a of formula (VI) obtained in variant a) has a molar activity of 30 to 50 Ci / mmole, and intermediate b of intermediate (VI) obtained in two-stage variant b has a molar activity of between 70 and 80 Ci / mmole. On the other hand, the more efficient b-intermediate can be obtained in a lower total yield than the one-step intermediate.

a-változat (VII) képietű acetilén-dikarbonsavat hordozómentes triciumgázzal reagáltatunk palládium katalizátor jelenlétében, csökkentett — 0,866 bar (650 mmHg) körüli — nyomáson. Oldószerként 2,0 vegyes százalékos dioxánt alkalmazhatunk, katalizátorként 5%-os csontszenes palládiumot. A reakció lezajlása után a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet csökkentett — előnyösen 0,00133 bar (1 mmHg) — nyomáson bepároljuk, a maradékot — ugyancsak csökkentett nyomáson — foszfor-pentoxidon szárítjuk.The α-variant acetylene dicarboxylic acid (VII) is reacted with a carrier-free tritium gas in the presence of palladium catalyst under reduced pressure of about 0.866 bar (650 mm Hg). The solvent used is 2.0% w / v dioxane and the catalyst 5% palladium on charcoal. After completion of the reaction, the catalyst is filtered off, the filtrate is concentrated under reduced pressure, preferably 0.00133 bar (1 mm Hg), and the residue is dried over phosphorus pentoxide, also under reduced pressure.

b-változatb-version

A (IX) képietű acetilén-dikarbonsav-dimetilészter kiindulási anyagot is hordozómentes triciumgázzal reagáltatjuk. A reakciókörülmények megegyeznek az a-változat szerintiekkel azzal az eltéréssel, hogy az oldószer célszerűen 0,67 vegyes százalékos dioxán. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet vízzel — mintegy tízszeresére — hígítjuk és ioncserélő gyantával szobahőmérséklet feletti, előnyösen 40°C körüli hőmérsék-4193381 létén kevertetjük legalább 2, előnyösen 20 órán át. A gyantát ezután leszűrjük, a szűrletet az a-változatban leírt módon kezeljük.The acetylene dicarboxylic acid dimethyl ester starting material (IX) is also reacted with carrier-free tritium gas. The reaction conditions are the same as those of variant a, except that the solvent is preferably 0.67% w / v dioxane. After filtration of the catalyst, the filtrate is diluted with water to about 10 times and stirred with ion exchange resin at room temperature, preferably about 40 ° C for at least 2 hours, preferably 20 hours. The resin is then filtered off and the filtrate is treated as described in variant a.

A találmányt a továbbiakban részletesebben példák keretében magyarázzuk, amelyekre a találmány természetesen nem korlátozódik.The invention will now be explained in more detail by the following examples, which are, of course, not limited to the present invention.

1. példaExample 1

A (II) képletű borostyánkősavanhidrid előállítása b-köztitermékbőlPreparation of succinic anhydride of formula II from intermediate b

16,7 mg (118 pmól) frissen desztillált acetilén-dikarbonsav-dimetilésztert feloldunk 0,25 ml frissen desztillált dioxánban, majd hozzáadunk 1,5 mg 5%-os csontszenes palládium katalizátort. Az elegyet evakuáló láncon, 0,866 bar (650 mmHg) nyomáson hordozómentes triciumgázzal reagáltatjuk addig, amíg a gázfelvétel megszűnik; a reakcióidő egy óra körüli. A felvett tricium mennyisége 4,18 normál ml (273 K és légköri nyomás esetén mérhető térfogat), ami megfelel 10,86 Ci radioaktivitásnak. A katalizátort szűrőpapíron leszűrjük, a szűrőt 0,5 ml vízzel mossuk, a szürlethez adunk 2 ml vizet és 300 mg — Ín sósavval frissen aktivált, 30—70 pm szemcseméretű — Dowex 50 gyantát és 40°C hőmérsékleten 20 órán át kevertetjük. Ezután üvegszürőn leszűrjük a gyantát, a szűrőt négyszer mossuk 0,5 ml etanollal, majd a szűrletből az oldószert vákuumhídon, 0,00133 bar (1 mmHg) nyomáson — cseppfolyós nitrogénnel hűtött — lombikba desztilláljuk, és a maradékot ugyanezen berendezésben foszfor-pentoxidon szárítjuk egy órán át. így kapunk 12,4 mg (kitermelés: 89%) (VI) képletű b-köztiterméket, amelynek radioaktivitása 6,36 Ci, moláris aktivitása 74,9 Cí/mmól. A (VI) képletű b-köztitermékhez adunk 50 pl frissen desztillált acetil-kloridot, és az elegyet 110°C hőmérsékleten, olajfürdőn 3 percig melegítjük. Az így kapott (II) képletű triciált borostyánkősavanhidrid súlya 10,0 mg (összkitermelés: 84,7%, radioaktivitásaFreshly distilled dimethyl ester of acetylene dicarboxylic acid (16.7 mg, 118 pmol) was dissolved in freshly distilled dioxane (0.25 mL) and then 5% palladium on carbon (1.5 mg) was added. The mixture was reacted with carrier tritium gas at 0.866 bar (650 mmHg) in an evacuation chain until gas uptake ceased; the reaction time is about one hour. The amount of tritium taken up was 4.18 normal ml (volume measured at 273 K and atmospheric pressure), corresponding to 10.86 Ci radioactivity. The catalyst is filtered off with filter paper, the filter is washed with 0.5 ml of water, and 2 ml of water are added to the filtrate and 300 mg of Dowex 50 resin (30-70 µm freshly activated with hydrochloric acid) and stirred at 40 ° C for 20 hours. The resin is then filtered through a glass filter, the filter is washed four times with 0.5 ml of ethanol, and the solvent is distilled off under vacuum at 0.00133 bar (1 mm Hg) in a liquid nitrogen-cooled flask and the residue is treated with phosphorus pentoxide in the same apparatus. hours. There was thus obtained 12.4 mg (yield: 89%) of intermediate (VI) having a radioactivity of 6.36 Ci and a molar activity of 74.9 Ci / mmol. To intermediate b-intermediate (VI) was added 50 µl of freshly distilled acetyl chloride and the mixture was heated at 110 ° C in an oil bath for 3 minutes. The tritiated succinic anhydride of formula (II) thus obtained weighed 10.0 mg (total yield: 84.7%, radioactivity).

5,92 Ci, moláris aktivitása 73,2 Ci/mmól.5.92 Ci, molar activity 73.2 Ci / mmol.

2. példaExample 2

A (II) képletű kiindulási anyag előállítása a-köztitermékbőlPreparation of starting material of formula II from intermediate a

10,0 mg (87,7 pmól) acetilén-dikarbonsavat 0,5 ml frissen desztillált dioxánban az10.0 mg (87.7 pmoles) of acetylene dicarboxylic acid in 0.5 ml of freshly distilled dioxane

I. példához hasonlóan triciálunk. A triciumfelvétel egy óra alatt 4,0 normál ml, ami megfelelSimilarly to Example I, we tritiate. The uptake of tritium per hour is 4.0 normal ml, which is adequate

II, 6 Ci radioaktivitásnak. A katalizátort az 1. példában leírt módon leszűrjük, a szűrőt 0,5 ml dioxánban mossuk, majd a szűrletet az 1. példa szerint oldószermentesítjuk és szárítjuk. Ezután a nyersterméket — elkülönítést mellőzve — az 1. példában leírt módon kezeljük; az 1. példa szerint végzett szárítás után kapott borostyánkősavanhidrid súlya 8,5 mg (kitermelés: 96,6%), radioaktivitása 4,21 Ci, moláris aktivitása 49,5 Ci/mmól.II, 6 Ci radioactivity. The catalyst was filtered off as described in Example 1, the filter was washed with 0.5 mL of dioxane, and the filtrate was de-solvented as in Example 1 and dried. The crude product is then treated without isolation as described in Example 1; the succinic anhydride obtained after drying according to Example 1 weighed 8.5 mg (96.6%), had a radioactivity of 4.21 Ci and a molar activity of 49.5 Ci / mmol.

3. példaExample 3

Az (la) képletű céltermék előállításaPreparation of the target product of formula (Ia)

Az 1., illetve 2. példa szerint kapott aktív borostyánkősavanhidridet 0,1 ml oldószerben feloldjuk, amely 4:1 térfogatárányban aceton.trietil-amin elegy; hozzáadunk 25 pl desztillált vízben feloldott 5 mg (14 pmól) c-AMP-nátriumsót,és az elegyet szobahőmérsékleten húsz percen át kevertetjük, majd 0,02 bar (15 mmHg) nyomáson, 30°C hőmérsékleten szárazra pároljuk. A maradékot feloldjuk 0,3 ml vízben, majd 2M sósavval pH= =3-ra savanyítjuk, és a kivált fehér kristályos anyagot kiszűrjük (a szűrőt 0,5 ml etanollal mossuk) és 0,00132 bar (1 mmHg) nyomáson foszfor-pentoxidón szárítjuk. így kapunk 3,0 mg (kitermelés: 47%) (la) képletű célterméket, amelynek radioaktivitása, illetve moláris aktivitása a-köztitermék alkalmazása esetén 0,322 Ci, illetve 48 Ci/mmól és b-köztitermék alkalmazása esetén 0,476 Ci, illetve 71 Ci/mmól.The active succinic anhydride obtained in Examples 1 and 2 was dissolved in 0.1 ml of a solvent containing 4: 1 by volume acetone / triethylamine; 25 mg of c-AMP sodium salt (5 mg, 14 pmol) dissolved in distilled water were added and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes and then evaporated to dryness at 0.02 bar (15 mmHg) at 30 ° C. The residue was dissolved in water (0.3 mL), acidified to pH = 3 with 2M hydrochloric acid, and the precipitated white crystalline material was filtered (washed with 0.5 mL ethanol) and pressurized with phosphorus pentoxidone (0.00132 bar (1 mm Hg)). dried. This gives 3.0 mg (47% yield) of the target product of formula (Ia), which has a radioactivity and a molar activity of 0.322 Ci and 48 Ci / mmol, respectively, in intermediate a and 0.476 Ci and 71 Ci in intermediate b, respectively. mmol.

4. példaExample 4

A (IV) képletű kiindulási anyag előállításaPreparation of starting material of formula (IV)

8,9 mg (25 pmól) (V) képletű 3,5-dibróm-L-tirozin-metilésztert, amelyet előzőleg DMF-ből frissen átkristályosítottunk (op. 198— 205°C) feloldunk 0,05 ml DMF-ben és teljes oldódásáig melegítjük, majd hozzáadunk 0,4 ml frissen desztillált dioxánt és 4 mg 10%-os Pd/AI2O3 katalizátort, majd 0,933 bar (700 mmHg) nyomáson hordozómentes triciumgázzal reagáltatjuk. A gázfelvétel mintegy négy óra múlva megszűnik, a felvett gáz menynyisége 3,9 normál ml, ami megfelel 11,3 Ci radioaktivitásnak. Az 1. példa szerinti módon leszűrjük a katalizátort, és szárítjuk a nyers terméket, amelyet ezután feloldunk 0,2 ml etanolban és kromatografáljuk DC Alufolien-Kieselgel 60 (Merck,20x20x0,25 cm) rétegen, kloroform:metanol:víz 90:10:1 térfogatarányú elegyét alkalmazva. A terméket — nem-jelzett tirozin-metilészterrel együtt futtatva — a radioaktív csúcsok detektálásával (Berthold LB 2001) azonosítjuk; a megfelelő helyeken a réteget lekaparjuk, 50 ml metanolt teszünk rá és 4°C hőmérsékleten 12 órán át eluáljuk. A szilikagélt leszűrjük, a szürletet 0,02 bar (15 mmHg) nyomáson, 40°C hőmérsékleten szárazra pároljuk. A kapott (IV) képletű kiindulási anyag súlya 1,0 mg (kitermelés: 21,6%), radioaktivitása 0,225 Ci, moláris aktivitása 43,8 Ci/mmól.8.9 mg (25 pmoles) of 3,5-dibromo-L-tyrosine methyl ester (V) previously recrystallized from DMF (m.p. 198-205 ° C) are dissolved in 0.05 ml DMF and completely After addition of 0.4 ml of freshly distilled dioxane and 4 mg of 10% Pd / Al 2 O 3 catalyst, the reaction is carried out at 0.933 bar (700 mmHg) with anhydrous tritium gas. Gas uptake ceases after about four hours, and the amount of gas taken up is 3.9 normal ml, which corresponds to 11.3 Ci of radioactivity. In the same manner as in Example 1, the catalyst was filtered off and the crude product was dried, which was then dissolved in 0.2 ml of ethanol and chromatographed on DC Alufolien-Kieselgel 60 (Merck, 20x20x0.25 cm), chloroform: methanol: water 90:10: Using a 1 volume mixture. The product, when run in conjunction with unlabeled tyrosine methyl ester, is identified by detecting radioactive peaks (Berthold LB 2001); scrape at appropriate places, add methanol (50 mL) and elute at 4 ° C for 12 hours. The silica gel was filtered off and the filtrate was evaporated to dryness at 0.02 bar (15 mm Hg) at 40 ° C. The starting material of the formula (IV) had a weight of 1.0 mg (21.6%), a radioactivity of 0.225 Ci and a molar activity of 43.8 Ci / mmol.

5. példaExample 5

Az (Ib) képletű céltermék előállításaPreparation of the target product of formula Ib

Az 1., illetve 2. példa szerint, b-, illetve a-köztitermék alkalmazásával kapott (la) képletű 2’-0- [2”,3”-3H2] -hemiszukcinil-c-AMP vegyületből 0,3 mg-of (0,67 pmól) feloldunk frissen desztillált DMF-ben és hozzáadunk 10 tf%-ban trietil-amint tartalmazó 3 ml DMF-t és 1:44 arányban klór-hangyasav-etilésztert tartalmazó 16 pl DMF-t; a kapott elegyet 0°C-ra hűtjük és 15 percen át kevertetjük. Ezután hozzáadunk — a 4. példa szerint előállított és 10 tf%-ban trietil-amint tartalmazó 10 pl DMF-ben feloldott — 0,3 mg (1,54 pmól) (IV) képletű triciált L-tirozin-metilészter származékot, és a kapott elegyet szobahőmérsékleten hat órán át kevertetjük. Vízmentesség biztosítása céljából az (la) képletűAccording to Example 1 or 2, b, and applying the obtained intermediate (Ia) 2'-0- formula [2 ', 3' - 3 H 2] -hemiszukcinil c-AMP compound 0.3 mg -of (0.67 pmol) was dissolved in freshly distilled DMF and 3 ml DMF containing 10% v / v triethylamine and 16 µl DMF containing 1:44 ethyl chloroformate; the resulting mixture was cooled to 0 ° C and stirred for 15 minutes. 0.3 mg (1.54 pmol) of the tritiated L-tyrosine methyl ester derivative (IV) prepared in Example 4 and dissolved in 10 µl of triethylamine in 10% by volume are then added and the the resulting mixture was stirred at room temperature for six hours. Formula (Ia) is provided to ensure waterproofing

-5193381 kiindulási anyag feloldásától kezdve a reak ció lezajlásáig a reakciótérben folyamatos argon-áramoltatással inért atmoszférát tartunk fenn. A reakció lezajlása után az oldószert az 1. példában megadott módon ledesztilláljuk, a maradékot 0,1 ml etanolban feloldjuk és kromatografáljuk DC Plastikfolien PEI Cellulose F rétegen (Merck, 20x20x x0,25 cm), háromkomponensű — n-butanol: :ecetsav:víz 12:5:3 arányú — elegy rázótölcsérben elválasztott.felső fázisában, majd a réteget az inaktív szukcinil-c-AMP-tirozin-metilészterrel azonos fy ér.tékű radioaktív csúcshelyein lekaparjuk és 50 ml háromkomponensű eleggyel 4°C hőmérsékleten 12 órán át eluáljuk. Ezután az oldatot 0,02 bar (15 mmHg) nyomáson bepároljuk, a maradékot 100 ml etanolban feloldva törzsoldatot készítünk, amelynek radioaktivitása b-köztitermékből kiinduló szintézis esetén 24,88 mCi és a-köztitermékből kiinduló szintézis esetén 17,45 mCi.From the dissolution of starting material -5193381 to the completion of the reaction, an inert atmosphere of argon is maintained in the reaction space. After completion of the reaction, the solvent was distilled off as described in Example 1, and the residue was dissolved in 0.1 mL of ethanol and chromatographed on DC Plastikfolien PEI Cellulose F layer (Merck, 20x20x0.25 cm), ternary - n-butanol: acetic acid: water. 12: 5: 3 mixture in the upper phase separated in a shaking funnel, then scraped off at the radioactive peak of inactive succinyl-c-AMP-tyrosine methyl ester and eluted with 50 ml of a three-component mixture at 4 ° C for 12 hours. The solution is then concentrated at 0.02 bar (15 mm Hg) and the residue is dissolved in 100 ml of ethanol to give a stock solution having radioactivity of 24.88 mCi for intermediate b and 17.45 mCi for intermediate synthesis.

Mindkét termék radiokémiái tisztasága — vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés tanúsága szerint — 95%-osnál jobb. Ha a kétféle termék jelzőanyagként! hatékonyságának a kétféle moláris aktivitás számtani átlagát tekintjük, a kitermelés b-köztitermékből 32,2% a-köztitermékből 28,6%.The radiochemical purity of both products was found to be better than 95% as determined by TLC. If the two kinds of products as markers! efficiency is considered to be the arithmetic mean of the two molar activities, yield 32.2% of intermediate b, 28.6% of intermediate a.

6. példaExample 6

Agyszövetminta c-AMP tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározása (Ib) képletű radioligand alkalmazásával μΜ koncentrációjú c-AMP törzsoldatból 0,005 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) hígítási sorozatot készítünk úgy, hogy 1 — Imi térfogatú oldatmintákat kapjunk, amelyek c-AMP koncentrációja 0,5—1,0—2,0—5,0— 10—20 nM, illetve 25—50—100—250— —500—1000 fmól/cső. 50 mg nedves szövetet 1 ml 5%-os triklór-ecetsavvat homogenizálunk, majd centrifugáljuk, és a felülúszót háromszor extraháljuk 1 — 1 ml etiléterrel, majd 50°C hőmérsékleten kb. 10 percig rázzuk (oldószermentesítés céljából). Az így kapott biológiai mintákból ugyanezen pufferoldatban ugyancsak 1 — 1 ml térfogatú mintaoldatokat készítünk. A standard-, illetve mintaoldatokat 20 pl trietil-aminnal 1 percen át kevertetjük, majd 10 pl ecetsavanhidridet adunk hozzá és egy perces keverés után 20°C hőmérsékleten félórán át állni hagyjuk. Ezután sorszámozott polietilén- vagy üveg kémcsövekbe automata pipettával bepipettázunk kb. tízezer cpm beütésszámú (500 Bq radioaktivitású) (Ib) képletű triciált tirozin-metilészter-c-AMP-t tartalmazó — a fenti szerinti összetételű — 0,1 ml pufferoldatot, s a standard-, illetve mintaoldatokból egyaránt 0,05 ml-nyit, valamint 0,5% BSA-t tartalmazó 0,05 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) feloldott 0,2 ml kecske anti-c-AMP bnmunsavót olyan hígításban, hogy a Bo/TC érték 40 és 50% közötti legyen, majd a kémcsövek tartalmát vortex keverővei (KUTESZ 6 gyártmánya) néhány másodpercig kevertetjük. A hígítási sorozat mindegyik tagjának megfelelő 3—3 mintát párhuzamosan vizsgálunk egyidejűleg. A nem specifikus kötődés (NSB) meghatározására további három kémcsőbe az antiszérum helyett tiszta pufferoldatot, a 0 standard mérésére pedig a standardoldatok helyett 0,05 ml tiszta pufferoldatot pipettázunk a radioligand mellé. A 0 standarddal azonos összetételű mintát tartalmazó további három kémcsövet a teljes radioaktivitás (TC) mérésére alkalmazunk. A kevertetés befejezése után a kémcsöveket hűtőszekrényben hagyjuk állni (+4°C körüli hőmérsékleten) egy éjszakán át, majd jégvizes hűtés közben a TC mérésére szolgáló kémcsövek kivételével hozzápipettázunk 1 — 1 ml — 0,25%-os BSA-t tartalmazó — 0,2%-os, 0°C hőmérsékletű csontszén · szuszpenziót [Norit-A, Serva (NSZK) gyártmány! - A TC mérésére szolgáló csövekbe ehelyett ezzel egyező térfogatú és összetételű tiszta pufferoldatot pipettázunk. A kémcsöveket 15 percig állni hagyjuk a hűtőszekrényben, majd 4°C hőmérsékleten tíz percen át centrifugáljuk 1500 g gyorsulással, és a felülúszókból 0,5—0,5 ml-nyit pipettázunk folyadékszcintillációs mérőedényekbe. A kivett mintákhoz 10—10 ml szcintillációs elegyet töltünk, amelynek összetétele 1 liter dioxánban oldott 120 g naftalin, 4 g 2,5-difenil-oxazoi (PPO) és 0,3 g p-bisz [2-(5-fenil-oxazolil) ] -benzol (POPOP) és a radioaktivitást ismert folyadékszcintillációs módszerrel mérjük. A számítást is a radioimmunassay eljárásban szokásos módon végezzük. Az 1. ábrán mutatjuk a felvett diagramot, a B/Bo százalékos arányt a pmót/cső függvényében.Reaction Determination of c-AMP Contents of Brain Tissue with Antibody Antigen Reaction Using a radioligand of formula (Ib), prepare a series of dilutions of a µΜ concentration of c-AMP stock solution in 0.005 M sodium acetate buffer (pH 4.75) to give 1 The concentration of c-AMP is 0.5-1.0-2.0-5.0-10.0-20 nM and 25-50-100-250-2500-1000 fmol / tube. 50 mg of wet tissue was homogenized with 1 ml of 5% trichloroacetic acid, centrifuged and the supernatant was extracted three times with 1 ml of ethyl ether and then at 50 ° C for approx. Shake for 10 minutes (to remove solvent). The biological samples thus obtained are also made up to a volume of 1 to 1 ml in the same buffer. The standard and sample solutions were stirred with 20 µl of triethylamine for 1 minute, then 10 µl of acetic anhydride was added and after one minute of stirring, the mixture was allowed to stand at 20 ° C for half an hour. Then pipette into serially numbered polyethylene or glass test tubes with an automatic pipette for approx. tritiated tyrosine methyl ester c-AMP (Ib) containing tens of thousands of cpm (radioactivity 500 Bq) containing 0.1 ml of buffer solution as above and 0.05 ml of both standard and sample solutions, and 0.2 ml of goat anti-c-AMP bovine serum dissolved in 0.05 M sodium acetate buffer, pH 4.75 containing 0.5% BSA, diluted to a Bo / TC value of 40 to 50% the contents of the test tubes are vortexed (made by KUTESZ 6) for a few seconds. Three to three samples corresponding to each member of the dilution series are tested in parallel. For the determination of nonspecific binding (NSB), three additional test tubes are pipetted with pure buffer solution instead of antiserum and 0.05 ml of pure buffer solution is added to the radioligand instead of standard solutions. An additional three test tubes containing a sample of the same composition as standard 0 are used for total radioactivity (TC) measurement. After mixing, allow the tubes to stand in a refrigerator (at + 4 ° C) overnight and pipette with 1 to 1 ml of 0.25% BSA in ice water, except for TC test tubes. 2% charcoal suspension at 0 ° C [Norit-A, Serva (Germany)! Instead, pipette into the TC measuring tubes an equal volume and composition of pure buffer solution. The test tubes were allowed to stand for 15 minutes in the refrigerator, then centrifuged at 1500 g for 10 minutes at 4 ° C and pipetted into 0.5 ml to 0.5 ml of supernatants. The samples were filled with 10 to 10 ml of a scintillation mixture of 120 g of naphthalene, 4 g of 2,5-diphenyloxazole (PPO) and 0.3 g of p-bis [2- (5-phenyloxazolyl) in 1 liter of dioxane. )] benzene (POPOP) and radioactivity was measured by a known liquid scintillation method. The calculation is also carried out in a manner customary for the radioimmunoassay. Figure 1 shows a plotted diagram of B / Bo as a function of pmo / tube.

7. példaExample 7

Agyszövetminta c-AMP tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározása (la) képletű radioligand alkalmazásávalReaction Determination of c-AMP Content of a Brain Tissue Sample Using a Radioligand of Formula (Ia)

A 6. példa szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy radioligandként nem (Ib) képletű, hanem (la) képletű vegyületet alkalmazunk. Ellenőrzésképpen a példát megismételjük olyan radioliganddal, amely az (Ib) képletűtől abban tér el, hogy az oldallánc tirozilcsoportja inaktív (úgy állítottuk elő, hogy a B Folyamatábra szerinti szintézisben inaktív tirozin-metilészter kiindulási anyagot alkalmaztunk a (IV) képletű triciált tirozin-metilészter helyett).Example 6 except that the radioligand is not a compound of formula (Ib) but a compound of formula (Ia). As a control, the example is repeated with a radioligand which differs from formula Ib in that the tyrosyl group of the side chain is inactive (prepared by using an inactive tyrosine methyl ester starting material in the synthesis of Scheme B as tritiated tyrosine methyl ester of formula IV). ).

A 2. ábra mutatja egymással egybevethető módon azokat a B/Bo kötésfüggvényeket, amelyeket az (la) képletű, az (Ib) képletű, illetve az oldalláncában inaktív tirozin-metilésztert tartalmazó radioligandokkal kaptunk, míg a 3. ábra megfelelően mutatja a Bo/TC görbéket a c-AMP koncentráció függvényében. Különösen szembetűnő az érzékenység javulása.Figure 2 shows a comparison of the B / Bo binding functions obtained with radioligands of formula (Ia), (Ib) and inactive side chain tyrosine methyl ester, while Figure 3 shows the corresponding Bo / TC curves as a function of c-AMP concentration. The improvement in sensitivity is particularly striking.

A fentiekből a szakember felmérheti a találmány előnyeit a technika állásához képest. Az előnyökből kiemeljük:From the above, one skilled in the art will appreciate the advantages of the invention over the prior art. Among the benefits we highlight:

-6193381-6193381

Az alkalmazott radiokémiái szintézisek segítségével kedvező feltételek között előállíthatunk olyan radioligandot, nevezetesen az (I) képletű triciált TME-szukcinil-c-AMP származékot, amelynek nagy moláris aktivitása biztosítja a minták c-AMP koncentrációjának hatékony radioimmunológiai meghatározását. Ezt az oldallánci csoportok előzetes jelzésével érjük el, így nincs szükség c-AMP molekula radiokémiái szintézisére.The radiochemical syntheses employed can advantageously yield a radioligand, namely the tritiated TME-succinyl-c-AMP derivative of formula (I), whose high molar activity provides an effective radioimmunoassay of the c-AMP concentration in the samples. This is achieved by preliminary labeling of the side chain groups, so there is no need for radiochemical synthesis of the c-AMP molecule.

A találmány szerinti eljárásban úgy optimálható az oldószerek összetétele és aránya, a hőmérséklet, a reagensek és a katalizátorok adagolása, hogy a radiokémiái szintézisben a radioaktív jelzés paraméterei a lehető legkisebb izotópkiépülést biztosítják.In the process of the invention, the composition and ratio of solvents, the temperature, the addition of reagents and the catalysts can be optimized in such a way that the parameters of radioactive labeling in radiochemical synthesis are as low as possible.

Az alkalmazott radiokémiái szintézis paraméterei másfelől úgy választhatók meg, hogy a lehető legkevesebb radioaktív művelettel, a lehető legkisebb lépték mellett (legfeljebb néhány mg-nyi adag) kielégítően nagy kémiai és radiokémiái kitermelést érjünk el.On the other hand, the parameters of the radiochemical synthesis employed can be selected so that a sufficiently high chemical and radiochemical yield is achieved with as little radioactive activity as possible on the smallest possible scale (up to a few mg doses).

A triciummal jelzett új radioligand alkalmazása olyan c-AMP radioimmunassay megvalósítását teszi lehetővé, amely a hosszú felezési idejű tricium izotóp használata folytán megőrzi a technika állása szerinti protein binding assay alkalmazásával elért méréstechnikai és gyártástechnológiai előnyöket, ugyanakkor lényegesen nagyobb érzékenységet biztosít a specifikus antitestek alkalmazásának előnyei mellett.The use of the new tritium-labeled radioligand allows the realization of a c-AMP radioimmunassay that preserves the engineering and manufacturing benefits of the state-of-the-art protein binding assay by using the long-lived tritium isotope, while providing significantly greater sensitivity over the benefits of using specific antibodies. .

Claims (7)

1. Eljárás biológiai szövetminta (szövet, vér, vizelet, stb.) adenozin-3’,5’-ciklofoszfát (továbbiakban: c-AMP) tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározására ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP származék és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai közegminta jelenlétében, amelynek során megmérjük a nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban: radioligand) specifikus antitesttel való kötődését és az ismert mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP hígítási sorozat által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát, azzal jellemezve, hogy radioligandként (1) általános képletű 2’-0-[2”,3”-3H2j - szukcinil-c-AMP származékot alkalmazunk, amely képletben R jelentése hidroxilcsoport vagy L-[3,5-3Hj-metil-tirozilcsoport.CLAIMS 1. A method for reactively determining the content of adenosine 3 ', 5 ' -cyclophosphate (" c-AMP ") in biological tissue samples (tissues, blood, urine, etc.) in known amounts, preferably acetylated, at various concentrations. In the presence of a -AMP derivative and a biological media sample to be determined (preferably acetylated), which measures binding of a highly specific radioactive tracer (hereinafter radioligand) to a specific antibody and a known amount of (preferably acetylated) c-AMP dilution series. calculating the active substance content of each medium sample, characterized in that the 2'-O- [2 ', 3' - 3 H 2 ' - succinyl-c-AMP derivative of formula (I) is used as the radioligand, wherein R is hydroxy or L- [ 3,5- 3 H-methyl-tyrosyl residue. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy háromezer és harmincezer, előnyösen hatezer és tizenkétezer közötti cpm beütésszámú radioligandot alkalmazunk.The process according to claim 1, wherein the radioligand is cpm of between three thousand and thirty thousand, preferably between six thousand and twelve thousand. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként kecskében előállított anti-c-AMP immunsavót alkalmazunk olyan mennyiségben, amely az in5 aktív (nem-jelzett) c-AMP-t nem tartalmazó mintában a radioligand 40—60, előnyösen 50%-át képes megkötni.3. The method of claim 1 or 2, wherein the antibody is a goat-produced anti-c-AMP antiserum in an amount sufficient to produce a radioligand 40-4 in a sample containing in5 active (unlabeled) c-AMP. It can bind 60%, preferably 50%. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy puffer10 oldatként — szérumalbumint, előnyösen szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó — nátrium-acetát oldatot alkalmazunk, amelynek pH-ja 4 és 8 közötti, előnyösen 4,75 körüli, és amelynek mennyisége 0,1 és 1 térfogat15 százalék közötti, előnyösen 0,5 térfogatszázalék.4. Process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the buffer solution is sodium acetate solution containing a serum albumin, preferably bovine serum albumin, having a pH of between 4 and 8, preferably about 4.75, in an amount of 0.1 to 1 vol. from about 0.5 to about 0.5% by volume. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióidő 1 és 50, előnyösen 3 és 20 óra közötti és5. Process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the reaction time is from 1 to 50 hours, preferably from 3 to 20 hours and 20 a reakció hőmérséklet 0 és 40°C közötti.The reaction temperature is from 0 to 40 ° C. 6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közegminták és az inaktív c-AMP szer acetilezését ecetsavanhidrid reagenssel, tercier amin,6. The process according to any one of claims 1 to 3, wherein the acetylation of the media samples and the inactive c-AMP agent with acetic anhydride reagent, tertiary amine, 25 pl. trietil-amin jelenlétében végezzük.25 pl. in the presence of triethylamine. 7. Eljárás (I) általános képletű 2’-0- [2”,3” -:iH2]-szukcinil-c-AMP származék előállítására, amely képletben R jelentése hídroxilcsoport vagy L- [3,5-3H] -metil-tirozilcsoport,7. A method (I), 2'-0- formula [2 ", 3" -: i H 2] succinyl-c-AMP derivative, wherein R is hydroxy or L- [3,5- 3 H] methyl-tyrosyl residue, 30 azzal jellemezve, hogy (II) képletű triciált borostyánkősavanhidridet adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal vagy annak sójával, előnyösen nátriumsójával reagáltatunk és kívánt esetben a kapott, az (I) általános képlet körébe tartozóCharacterized in that the tritiated succinic anhydride of formula (II) is reacted with adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate or a salt thereof, preferably the sodium salt thereof, and if desired, the resulting compound of formula (I) 35 /la) képletű reakcióterméket (IV) képletű [3,5-3H] -tirozin-metilészterrel reagáltatjuk po'áros oldószerben, tercier amin, pl. trietilamin és klór-hangyasav-etilészter jelenlétében.Reaction products of 35 / l) of formula (IV) with the formula [3,5- 3 H] tyrosine methyl ester po'áros solvent, a tertiary amine, e. in the presence of triethylamine and ethyl chloroformate. 40 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képletű kiindulási anyagot az adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal (annak sójával) trietil-amin és aceton — célszerűen 1:4 térfogatarányú — elegyében8. A process according to claim 7 wherein the starting material of formula II is a mixture of adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate (salt thereof) in triethylamine and acetone, preferably in a volume ratio of 1: 4. 45 reagáltatjuk, és az adenozin-3’,5’-ciklofoszfátot (annak sóját) célszerűen a (II) képletű kiindulási anyag egy móljára számított 0,ΙΟ,3, előnyösen 0,15 mólarányban alkalmazzuk.Preferably, the adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate (salt thereof) is used in an amount of 0.1, 3, preferably 0.15 molar to one mole of the starting material (II). 50 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (la) képletű triciált reakcióterméket a (IV) képletű triciált tirozinszármazékkal dimetil - formamidban reagáltatjuk.9. The process according to claim 7 or 8, wherein the tritiated reaction product of formula (Ia) is reacted with the tritiated tyrosine derivative of formula (IV) in dimethylformamide. 55 10. A 7—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (la) képletű reakcióterméket és a (IV) képletű tirozinszármazékot tartalmazó reakcióelegyet szobahőmérsékleten kevertetjük, és a re60 akcióidő négy és tíz óra közötti, előnyösen hat óra.55 10. A 7-9. Process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the reaction mixture comprising the reaction product of formula (Ia) and the tyrosine derivative of formula (IV) is stirred at room temperature and the reaction time is between four and ten hours, preferably six hours.
HU52285A 1985-02-12 1985-02-12 Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto HU193381B (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU52285A HU193381B (en) 1985-02-12 1985-02-12 Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU52285A HU193381B (en) 1985-02-12 1985-02-12 Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT41127A HUT41127A (en) 1987-03-30
HU193381B true HU193381B (en) 1987-09-28

Family

ID=10949980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU52285A HU193381B (en) 1985-02-12 1985-02-12 Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU193381B (en)

Also Published As

Publication number Publication date
HUT41127A (en) 1987-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4808541A (en) Determination method utilizing reagents covalently labelled with essentially non-fluorescent lanthanide chelates in combination with time-resolved fluorescence spectroscopy and the reagents to be used in the method
EP0321353B1 (en) Cryptates of rare earths, processes for their preparation, intermediates for their synthesis and their use as fluorescent labels
US5534622A (en) Rare earth cryptates, processes for their preparation, synthesis intermediates and application as fluorescent tracers
CA1341637C (en) Chemiluminescent acridinium salts
US5981286A (en) Hydrophilic metal complexes
US5198537A (en) Digoxigenin derivatives and use thereof
KR900001620B1 (en) Process for the preparation of phenobarbital and carbamazepine conjugates
EP0285179B1 (en) Fluorescent diagnostic assay, assay elements, and conjugates
JP2004519677A (en) Photoinduced electron transfer fluorescent sensor molecule
EP0107134B1 (en) Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
AU591673B2 (en) Novel fluorescent compounds and biological diagnostic devices
JPS58757A (en) Method of executing immunity examination using no isotope, analytic substance labelled and kit used for such examination
CA1152492A (en) Reagents for use in binding assays to determine valproic acid
US4894348A (en) Fluorescein-conjugated proteins with enhanced fluorescence
JPH0717672B2 (en) Cobalamin-acid hydrazide, its production method and cobalamin conjugate
US4115065A (en) Saturation analysis of folate compound with selenium-75 labeled folate
JP3714942B2 (en) Reagents and methods for detection and quantification of vancomycin in biological fluids
HU193381B (en) Process for determining the adenosin-3',5'-cyclophosphate content by radioimmunology and for the preparation of radioligand applied thereto
JP3248628B2 (en) Chemiluminescent compound and assay method using the same
JP2698730B2 (en) Labeled dye and its precursor, method for synthesizing the same, and method for detecting methamphetamine using labeled dye
Khawli et al. m-[125I] Iodoaniline: A useful reagent for radiolabeling biotin
US4282151A (en) Reactive asymmetrical dicarboxylic acid esters and reagents for the investigation of cardiac glycosides
EP0812823B1 (en) Chemiluminescent group-containing carbodiimide compound
CA1157017A (en) Reagents for use in binding assays to determine valproic acid
Johnson Jr et al. Preparation of the radioiodinated histamine amide of 4‐0‐(carboxypropyl)‐diethylstilbestrol

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: IZOTOP INTEZET KFT., HU

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee