ES2707878T3 - Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para regular el equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda - Google Patents

Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para regular el equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda Download PDF

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Abstract

Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos y en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID nº 23).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para regular el equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda.
Campo de la invención
El campo en el que se sitúa la presente invención es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina para la regulación del equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
Antecedentes
El péptido adrenomedulina (ADM) fue descrito por primera vez en 1993 (Kitamura K. et al., "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 192 (2), páginas 553 a 560, 1993) como nuevo péptido hipotensor que comprende 52 aminoácidos, que ha sido aislado a partir de un feocromocitoma humano, SEC ID n° 21. En el mismo año, también se describió ADNc codificante de un péptido precursor que comprendía 185 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos completa de este péptido precursor. El péptido precursor, que comprende, entre otros, una secuencia de señal de 21 aminoácidos en el extremo N-terminal, se denomina "preproadrenomedulina" (preproADM). En la presente descripción, todas las posiciones aminoácidas especificadas habitualmente se refieren al pre-proADM que comprende los 185 aminoácidos. El péptido adrenomedulina (ADM) es un péptido que comprende 52 aminoácidos (SEC ID n° 21) y que comprende los aminoácidos 95 a 146 de pre-proADM, a partir del cual se forma mediante corte proteolítico. Hasta el momento, sólo se han caracterizado con más exactitud sustancialmente sólo unos cuantos fragmentos de los fragmentos peptídicos formados en el corte de preproADM, en particular los péptidos fisiológicamente activos adrenomedulina (ADM) y "PAMP", un péptido que comprende 20 aminoácidos (22-41) que sigue a los 21 aminoácidos del péptido de señal en pre-proADM. La identificación y caracterización de ADM en 1993 promovió una intensa actividad investigadora, los resultados de la cual se han resumido en diversos artículos de revisión, en el contexto de la presente descripción, se hace referencia en particular a los artículos en un número de "Peptides" dedicado a ADN, en particular (Editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, vol. 22, página 1691, 2001) y (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001). Otra revisión es (Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol. 21(2), pp. 138-167 (2000)). En las investigaciones científicas hasta el momento, se ha encontrado, entre otros, que ADM puede considerarse un péptido regulador polifuncional. Se libera a la circulación en una forma inactiva extendida por glicina (Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.
244(2), páginas 551 a 555, 1998. sólo el resumen). También existe una proteína de unión (Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, vol. 276(15), páginas 12292 a 12300 (2001)) que es específica de ADM y probablemente de manera similar modula el efecto de ADM. Dichos efectos fisiológicos de ADM, así como de PAMp, que son de importancia primordial en las investigaciones actuales son los efectos de influencia sobre la presión sanguínea.
Por lo tanto, la ADM es un vasodilatador eficaz y, de esta manera, resulta posible asociar el efecto hipotensor a segmentos peptídicos particulares de la parte C-terminal de la ADM. Se ha encontrado además que el péptido fisiológicamente activo adicional anteriormente mencionado PAMP, formado a partir de pre-proADM de manera similar muestra un efecto hipotensor, aunque aparentemente presenta un mecanismo de acción diferente del de ADM (ver, además de los artículos de revisión anteriormente indicados (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001) y (Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, vol. 21(2), páginas 138 a 167, 2000), también (Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett, Vol. 414(1), páginas 105 a 110, 1997, sólo el resumen) (Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., vol. 36 (Pt. 5), páginas 622 a 628, 1999, sólo el resumen) o (Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., vol. 69(2), páginas 239 a 245, 2001; sólo el resumen) y el documento n° EP-A20622458). Se ha encontrado además que las concentraciones de ADM que pueden medirse en la circulación y en otros líquidos biológicos en varios estados patológicos se encuentran a niveles superiores a las concentraciones que se observan en las personas de control sanas. De esta manera, el nivel de ADM en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensivos, diabetes mellitus, en la etapa aguda de choque y en la sepsis y el choque séptico, se encuentran significativamente incrementadas, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP también se encuentran incrementadas en algunos de dichos estados patológicos, aunque los niveles plasmáticos se encuentren reducidos respecto a ADM ((Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001); página 1702). Se conoce además que las concentraciones inusualmente elevadas de ADM se observan en la sepsis, y las concentraciones más altas, en el choque séptico (ver (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001) y (Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 81(4), páginas 1449 a 1453, 1996), (Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp Clin Endocrinol Diabetes, Vol. 105, página 156 a 162, 1997), (Tomoda, Y., et al., "Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides, vol. 22, páginas 1783 a 1794, 2001), (Ueda, S., et al., "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 160, páginas 132 a 136, 1999) y (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, vol. 22, páginas 1835 a 1840, 2001).
La adrenomedulina puede utilizarse en terapia, ya que se ha demostrado que el pretratamiento con adrenomedulina protege frente al edema cerebral causado por isquemia/reperfusión (Kondoh, et al., "Pretreatment of adrenomedullin suppresses cerebral edema caused by transient focal cerebral ischemia in rats detected by magnetic resonance imaging", Brain Research Bulletin, vol. 84, páginas 69 a 74, 2011).
En la técnica se conoce además un método para identificar la inmunorreactividad de la adrenomedulina en líquidos biológicos con fines diagnósticos y, en particular dentro del alcance del diagnóstico de la sepsis, del diagnóstico cardiaco y del diagnóstico del cáncer. Según la exposición, se mide el péptido parcial de la región intermedia de la proadrenomedulina, que contiene los aminoácidos (45-92) de la preproadrenomedulina completa, utilizando un inmunoensayo que funciona con por lo menos un anticuerpo marcado que reconoce específicamente una secuencia de la parte intermedia de proADM (documento n°WO2004/090546).
El documento WO-A1 2004/097423 describe la utilización de un anticuerpo contra la adrenomedulina para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de trastornos cardiovasculares. El tratamiento de enfermedades mediante el bloqueo del receptor de ADM también se encuentra descrito en la técnica (por ejemplo, en los documentos WO-A1 2006/027147 y WO-A1 2007/062676); dichas enfermedades pueden ser sepsis, choque séptico, enfermedades cardiovasculares, infecciones, enfermedades dermatológicas, enfermedades endocrinológicas, enfermedades metabólicas, enfermedades gastroenterológicas, cáncer, inflamación, enfermedades hematológicas, enfermedades respiratorias, enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades neurológicas y enfermedades urológicas.
Se informa para la etapa temprana de la sepsis que la ADM mejora la función cardiaca y el suministro sanguíneo al hígado, bazo, riñón e intestino delgado. Los anticuerpos neutralizadores de ADM neutralizan los efectos anteriormente indicados durante la etapa temprana de la sepsis (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, vol. 22, páginas 1835 a 1840, 2001; Wang, P., et al., "The Pivotal role of adrenomedullin in producing hyperdynamic circulation during early stage of sepsis", Archives of Surgery, vol. 133, páginas 1298 a 1304, 1998).
En la última etapa de la sepsis, la etapa hipodinámica de la sepsis, la ADM constituye un factor de riesgo que está fuertemente asociado a la mortalidad de los pacientes en choque séptico. (Schütz et al., "Circulating Precursor levels of endothelin-1 and adrenomedullin, two endothelium-derived, counteracting substances, in sepsis", Endothelium, 14:345-351, 2007). Los métodos para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes críticamente enfermos, por ejemplo en las etapas muy tardías de la sepsis, y la utilización de endotelina y agonistas de endotelina con actividad vasoconstrictora para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de pacientes críticamente enfermos se ha descrito en el documento WO-A1 2007/062676. Se describe adicionalmente en el documento WO-A1 2007/062676 la utilización, en lugar de endotelina y/o agonistas de endotelina, o en combinación con la misma, de antagonistas de adrenomedulina, es decir, moléculas que evitan o atenúan la acción vasodilatadora de la adrenomedulina, por ejemplo mediante el bloqueo de sus receptores relevantes, o sustancias que evitan la unión de la adrenomedulina a su receptor (por ejemplo, ligantes específicos tales como, por ejemplo, anticuerpos de unión a la adrenomedulina y que bloquean sus sitios de unión a receptor; "neutralización inmunológica"). Tal utilización, o utilización combinada, incluyendo una utilización separada posterior o anterior, se ha descrito en determinados casos que resulta deseable, por ejemplo para mejorar el éxito terapéutico, o para evitar estrés fisiológico indeseable o efectos secundarios. De esta manera, se informa de que los anticuerpos de ADM neutralizantes pueden utilizarse para el tratamiento de sepsis en la etapa tardía de la sepsis.
La administración de ADM en combinación con la proteína 1 de unión a ADM se ha descrito en la técnica para el tratamiento de la sepsis y el choque séptico. Se supone que el tratamiento de animales sépticos con ADM y proteína 1 de unión a ADM evita la transición a la etapa tardía de la sepsis. Debe indicarse que en un organismo vivo la proteína de unión a ADM (factor H del complemento) se encuentra presente en la circulación de dicho organismo a altas concentraciones (Pio et al., Identification, characterization, and physiological actions of factor H as an Adrenomedullin binding Protein present in Human Plasma; Microscopy Res. and Technique, 55:23-27 (2002) y Martínez et al.; Mapping of the Adrenomedullin-Binding domains in Human Complement factor H; Hypertens Res Vol. 26, supl. (2003), S56-59).
De acuerdo con la exposición, la proteína 1 de unión a ADM también puede denominarse proteína 1 de unión a ADM (factor H del complemento).
Los pacientes con una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, especialmente los pacientes en la UCI (unidad de cuidados intensivos) pueden sufrir de un desequilibrio de líquidos. Esto puede provocar sucesos adversos severos, tales como la insuficiencia renal y mortalidad.
El objetivo de la presente invención es proporcionar un medicamento para la regulación del equilibrio de líquidos y/o para mejorar el equilibrio de líquidos de tales pacientes.
La disolución es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM ligante de adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM ligante de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos y en el que dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos (aa) 1-21 de la ADM humana madura:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID n° 23).
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
La expresión "regulador del equilibrio de líquidos" en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier corrección de un manifiesto desequilibrio en el equilibrio de líquidos del paciente debido a una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda subyacente. Dicha corrección se realiza en favor del restablecimiento de la normotensión en dichos pacientes. El experto en la materia es plenamente consciente de que la presión sanguínea en general, así como la hipertensión y la hipotensión está estrechamente relacionada con el equilibrio de líquidos de un paciente. El equilibrio de líquidos es el equilibrio entre la entrada y salida de líquidos en el cuerpo para permitir el funcionamiento de los procesos metabólicos. La deshidratación se define como una pérdida de 1% o superior de la masa corporal como resultado de la pérdida de líquidos. Los tres elementos para evaluar el equilibrio de líquidos y el estado de hidratación son: la evaluación clínica de peso corporal y producción de orina, revisión de los diagramas de equilibrio de líquidos y revisión de la química sanguínea. Todo lo anterior es muy bien conocido por el experto en la materia (Alison Shepherd, Nursing Tomes 19.07.11/vol 107, n° 28, páginas 12 a 16).
De esta manera, en una forma de realización, una persona que necesita regular el equilibrio de líquidos y/o mejorar el equilibrio de líquidos de tales pacientes es una persona que presenta una pérdida de 1% o superior de la masa corporal como resultado de la pérdida de líquidos. El equilibrio de líquidos puede evaluarse según Scales y Pilsworth (2008) Nursing Standard 22:47, 50-57. Por ejemplo, la producción normal de orina se encuentra en el intervalo de 0,5 a 2 ml/kg de peso corporal por hora. La producción de orina aceptable mínima para un paciente con función renal normal es de 0,5 ml/kg por hora. Todos estos estándares pueden utilizarse para evaluar si un paciente necesita regular el equilibrio de líquidos y/o mejorar el equilibrio de líquidos.
A lo largo de la presente memoria, los "anticuerpos" o "fragmentos de anticuerpo" o "andamiajes no Ig" según la invención son capaces de unirse a ADM y, de esta manera, están dirigidos contra ADM y, de esta manera, pueden denominarse "anticuerpos anti-ADM", "fragmentos de anticuerpo anti-ADM" o "andamiajes no Ig anti-ADM".
En otra forma de realización de la invención, los anticuerpos anti-ADM, fragmentos de anticuerpo anti-ADM o andamiajes no Ig anti-ADM según la invención son capaces de unirse a la ADM circulante y, de esta manera, están dirigidos contra la ADM circulante.
En otra forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM del mismo y/o andamiaje no Ig de ADM debe utilizarse en combinación con líquidos administrados por vía intravenosa, en la que dicha combinación está destinada a la utilización en terapia para una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
En otra forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM del mismo o un andamiaje no Ig de ADM debe utilizarse en combinación con agentes vasopresores, por ejemplo catecolamina, en el que dicha combinación está destinada a la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o de una afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos. El objeto de la presente invención es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la regulación del equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
El objeto de la presente invención es un método para regular el equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda. Según la invención, dicho paciente es un paciente que necesita regulación del equilibrio de líquidos.
El objeto de la presente invención es un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
Un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) es un anticuerpo que se une específicamente a ADN, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina es un fragmento de un anticuerpo anti-ADM, en el que dicho fragmento se une específicamente a ADM. Un andamiaje no Ig anti-ADM es un andamiaje no Ig que se une específicamente a ADM.
Específicamente, la unión a ADN también permite la unión a otros antígenos. Es decir, esta especificidad no excluiría que el anticuerpo pueda reaccionar cruzadamente con otros polipéptidos contra los que se ha generado.
El paciente en estado de desequilibrio de líquidos puede obtener líquidos mediante administración intravenosa como medida de cuidado estándar, especialmente en un contexto de UCI. Sin embargo, resulta deseable reducir o evitar la administración adicional de líquidos debido a complicaciones que podrían producirse, tales como, por ejemplo, la incidencia de edema (acroedema). El edema se refiere a la hinchazón causada por líquidos en los tejidos corporales. Puede producirse en pies y piernas, aunque puede afectar a todo el cuerpo y puede afectar a órganos, tales como, por ejemplo, pulmones, corazón y ojos. De esta manera, el anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM puede administrarse en un punto temporal en el que el paciente requiere la administración de líquidos. Según la invención, dicho paciente es un paciente que necesita regulación del equilibrio de líquidos.
De esta manera, el objeto de la presente invención también es un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos, que incluye, aunque sin limitación, la prevención o reducción del edema, en el que dicho paciente sufre de desequilibrio de líquidos y en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(SEC ID n° 23).
El anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM también puede administrarse preventivamente antes de que el paciente muestre ningún signo de desequilibrio de líquidos. Este podría ser el caso si el paciente presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda en que puedan esperarse problemas de desequilibrio de líquidos, por ejemplo que comprenda infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, ictus, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, envenenamiento, daños por quimioterapia. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
En los criterios clínicos siguientes de SIRS, se define la sepsis, la sepsis severa y el choque séptico.
1) Respuesta inflamatoria sistémica del huésped (SIRS) caracterizada por como mínimo dos de los síntomas siguientes:
• pacientes que muestran hipotensión (presión arterial media <65 mmHg)
• nivel elevado de lactato en suero, siendo >4 mmoles/l
• glucosa sanguínea >7,7 mmoles/l (en ausencia de diabetes)
• presión venosa central no comprendida en el intervalo de 8 a 12 mmHg
• producción de orina <0,5 ml x kg-1 x h-1
• saturación venosa central de oxígeno (vena cava superior) <70% o venosa mixta <65%
• frecuencia cardiaca >90 latidos/min
• temperatura <36°C o >38°C
• tasa respiratoria >20/min
• recuento leucocitario <4 o >12x109/l (leucocitos); >10% neutrófilos inmaduros
2) Sepsis
Después de como mínimo dos de los síntomas mencionados en 1) y adicionalmente una sospecha clínica de nueva infección, siendo:
• tos/esputo/dolor torácico
• dolor abdominal/distensión/diarrea
• infección de la línea
• endocarditis
• disuria
• cefalea con rigidez del cuello
• celulitis/herida/infección de articulación
• microbiología positiva para cualquier infección
3) Sepsis severa
En el caso de que la sepsis sea manifiesta en el paciente y adicionalmente se tenga una sospecha clínica de cualquier disfunción orgánica, siendo:
• presión sanguínea sistólica < 90/media; < 65 mmHg
• lactato > 2 mmoles/l
• bilirrubina > 34 pmoles/l
• producción de orina < 0,5 ml/kg/h durante 2 h
• creatinina > 177 pmoles/l
• plaquetas < 100x109/l
• SpO2 > 90% a menos que se proporcione O2
4) Choque séptico
Es manifiesto por lo menos un signo de disfunción de órgano terminal tal como se ha mencionado en 3). Se indica choque séptico en el caso de hipotensión refractaria que no responde al tratamiento y la administración intravenosa de líquidos por sí sola resulta insuficiente para evitar la hipotensión de la presión sanguínea del paciente; también indicado para la administración de un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención.
De esta manera, la enfermedad aguda o afecciones agudas pueden seleccionarse del grupo, aunque sin limitación, que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), o sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, ictus, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, envenenamiento y daños inducidos por quimioterapia. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
En una forma de realización de la presente invención, el paciente no sufre de SIRS, infección severa, sepsis, o choque, tal como, por ejemplo, choque séptico. Dicha infección severa se refiere a por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis severa y choque, tal como, por ejemplo, choque séptico. A este respecto, una sepsis severa se caracteriza porque la sepsis se manifiesta en dicho paciente y, adicionalmente, se tiene una sospecha clínica de disfunción de cualquier órgano, siendo:
• presión sanguínea sistólica < 90/media; < 65 mmHg
• lactato > 2 mmoles/l
• bilirrubina > 34 pmoles/l
• producción de orina < 0,5 ml/kg/h durante 2 h
• creatinina >177 pmoles/l
• plaquetas < 100x109/l
• SpO2 > 90% a menos que se proporcione O2
En otra forma de realización, dicha enfermedad aguda o afección aguda no es sepsis, o no es sepsis severa, o no es SIRS o no es choque, o no es choque séptico.
En otra forma de realización, dicha enfermedad aguda o afección aguda no es sepsis.
En otra forma de realización, dicha enfermedad aguda o afección aguda se selecciona del grupo que comprende meningitis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, ictus, ateroesclerosis, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, envenenamiento y daños inducidos por quimioterapia.
Equilibrio de líquidos/terapia de líquidos
En un contexto hospitalario de agudos, por ejemplo un contexto de UCI, habitualmente el equilibrio de líquidos es monitorizado cuidadosamente por el personal clínico, ya que ello proporciona información particular sobre el estado actual de hidratación del paciente y, de esta manera, de la función renal y cardiovascular.
Sin embargo, si la pérdida aguda de líquidos es superior a la ganancia de líquidos, se hace referencia a que el paciente está en equilibrio negativo de líquidos. En este caso, con frecuencia el médico proporciona líquidos fisiológicos por vía intravenosa para compensar para dicha pérdida.
En contraste, un equilibrio positivo de líquidos en que la ganancia de líquidos es superior a la pérdida de líquidos puede proporcionar información sobre un problema con el sistema renal o el sistema cardiovascular.
Esto significa particularmente en el contexto de, por ejemplo, SIRS, sepsis, sepsis severa y choque séptico, que la presión sanguínea es baja (habitualmente denominado hipotensión) y la tasa de filtración en los riñones se reducirá, causando de esta manera menos reabsorción de líquidos y menor producción de orina.
La expresión "terapia de líquidos" en general se refiere a la administración terapéutica de líquidos (tal como disolución salina fisiológica o agua para inyección (API)) en un paciente como tratamiento o medida preventiva. Puede administrarse mediante vías intravenosa, intraperitoneal, intraósea, subcutánea y oral.
La terapia de líquidos está indicada en el caso de que se produzca una pérdida de líquidos o un riesgo de pérdida de líquidos debido a una enfermedad o condición subyacente. La severidad de la pérdida de líquidos y el compartimiento del que se han perdido, influye sobre la elección de líquido y la velocidad a la que deben administrarse. En el caso de que se lleve a cabo una terapia de líquidos como tratamiento, resultará necesario diagnosticar y tratar la enfermedad o condición subyacente. La terapia de líquidos está rutinariamente indicada en el caso de hipotensión, hipovolemia, trastornos metabólicos, administración reducida de oxígeno, SIRS, sepsis, sepsis severa, choque y choque séptico.
Sin embargo, debe enfatizarse que los medicamentos proporcionados por la presente invención, siendo anticuerpos anti-ADM, fragmentos de anticuerpo anti-ADM o andamiajes no Ig anti-ADM, sólo están destinados a ser utilizados para regular el equilibrio de líquidos y, de esta manera, no están destinados a constituir ningún método de tratamiento primario de la enfermedad o condición crónica o aguda misma. Lo anterior implica que la presente invención no proporciona una terapia de cicatrización/curación, por ejemplo, de meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) o sepsis, o sepsis severa; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, ictus, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, envenenamiento o daños inducidos por quimioterapia dentro del alcance de la invención.
El efecto de regulación de líquidos del anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM, de esta manera, sustenta la terapia primaria de dicha enfermedad crónica o aguda o afección aguda. En el caso de una enfermedad crónica o aguda o afección aguda como las infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis o similar, la terapia primaria sería, por ejemplo, la administración de antibióticos. El anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM regularía el equilibrio de líquidos y ayudaría a evitar el agravamiento de la condición crítica de dicho paciente hasta que tenga efecto el, por ejemplo, antibiótico, administrado. Tal como se ha mencionado anteriormente, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo anti-ADM o el andamiaje no Ig anti-ADM puede administrarse de una manera preventiva o de una manera terapéutica; ello significa con el fin de evitar problemas de desequilibrio de líquidos o con el fin de reducir el desequilibrio de líquidos en el caso de encontrarse presentes en dicho paciente problemas de desequilibrio de líquidos. El edema se encuentra incluido en la expresión problemas de desequilibrio de líquidos.
Debe enfatizarse que según la invención los pacientes pueden presentar una enfermedad crónica o aguda o afección aguda como enfermedad primaria o subyacente, tal como, por ejemplo, cáncer o diabetes mellitus. Sin embargo, dichas enfermedades primarias o subyacentes a primera vista no son la diana del tratamiento terapéutico según la invención. En contraste, el tratamiento terapéutico de acuerdo con la invención está dirigido únicamente contra síntomas agudos que han sido diagnosticados o indicados para la terapia de líquidos.
De esta manera, la invención no proporciona una terapia primaria para el cáncer, diabetes mellitus, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis o similar, sino para una terapia de pacientes que sufren de desequilibrio de líquidos que se debe a una enfermedad aguda o afección aguda, y de esta manera, requieren de la administración de líquidos.
En una forma de realización de la invención, se utiliza un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM en combinación con líquidos administrados por vía intravenosa, en la que dicha combinación es para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos de dicho paciente.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad o condición crónica o aguda que requiere de la regulación del equilibrio de líquidos se caracteriza por la necesidad de dicho paciente de obtener líquidos intravenosos. En otra forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad o condición crónica o aguda que requiere de la regulación del equilibrio de líquidos se caracteriza por el riesgo de que dicho paciente adquiera edema o por la presencia de edema en dicho paciente.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de un paciente que requiere de líquidos intravenosos o para la utilización en terapia de un paciente que presenta un riesgo de presentar edema o por la presencia de edema en dicho paciente.
En otra forma de realización de la invención, se utiliza un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM en combinación con agentes vasopresores, por ejemplo, catecolamina, en el que dicha combinación es para la utilización en terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad o condición crónica o aguda que requiere de la regulación del equilibrio de líquidos se caracteriza por la necesidad de dicho paciente de recibir la administración de agentes vasopresores, por ejemplo, catecolamina.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de un paciente que requiere del tratamiento con un agente vasopresor, por ejemplo, catecolamina.
Un paciente que requiere la mejora del equilibrio de líquidos puede caracterizarse por una fuga capilar y puede presentar una producción de orina </= 0,5-1 cm3/kg por hora.
Además, en una forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM es monoespecífico. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM monoespecífico se refiere a que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región específica que comprende por lo menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana. El anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM nonoespecífico son anticuerpos antiadrenomedulina (ADM) o fragmentos de anticuerpo anti-adrneomedulina o andamiajes no Ig anti-ADM la totalidad de los cuales presenta afinidad para el mismo antígeno.
En una forma de realización específica y preferente, la presente invención proporciona un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM monoespecífico, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región específica que comprende por lo menos 4 aminoácidos dentro de la ADM diana.
En otra forma de realización especial, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo que se une a ADM es un anticuerpo monoespecífico. Monoespecífico significa que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una región específica que comprende preferentemente por lo menos 4 o por lo menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana. Los anticuerpos o fragmentos monoespecíficos son anticuerpos o fragmentos la totalidad de los cuales presenta afinidad para el mismo antígeno. Los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos, pero también pueden producirse anticuerpos monoespecíficos por otros medios diferentes de su producción por una célula germinal común.
Un anticuerpo según la presente invención es una proteína que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que se unen específicamente a un antígeno. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD), epsilón (IgE) y mu (IgM), así como la multitud de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa generalmente presentan una longitud de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa generalmente presentan una longitud de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos. Las cadenas ligeras están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2-terminal (de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. Las cadenas pesadas están codificadas de manera similar por un gen de región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos de longitud) y uno de los otros genes de región constante.
La unidad estructural básica de un anticuerpo es generalmente un tetrámero que consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, en los que cada par presenta una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen a un antígeno, y las regiones constantes median en funciones efectoras. Las inmunoglobulinas también existen en una diversidad de otras formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y (Fab')2, así como anticuerpos híbridos bifuncionales y cadenas sencillas (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105,1987; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2a ed., 1984; Hunkapiller y Hood, Nature 323:15-16,1986). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una región marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) (ver Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Tal como se ha indicado anteriormente, los CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Un complejo inmunológico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano, o fragmento de anticuerpo funcional, específicamente unido al antígeno. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos los genes de cadena ligera y pesada de los cuales se han construido típicamente mediante ingeniería genética, a partir de genes de región variable y constante de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico terapéutico es, de esta manera, una proteína híbrida compuesta del dominio variable o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio constante o efector de un anticuerpo humano, aunque pueden utilizarse otras especies de mamífero, o la región variable puede producirse mediante técnicas moleculares. Los métodos de generación de anticuerpos quiméricos son bien conocidos de la técnica, por ejemplo, ver la patente US n° 5.807.715. Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (tal como un ratón, rata o sintético). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". En una forma de realización, todas las CDR procedente de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, aunque, si están presentes, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, por lo menos aproximadamente 85-90%, tal como aproximadamente 95% o más, idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente los CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede presentar un número limitado de sustituciones por aminoácidos obtenidos del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden presentar sustituciones conservadoras adicionales de aminoácidos que no presentan sustancialmente ningún efecto sobre la unión de antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Son sustituciones conservadoras ejemplares, gly, ala, val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Pueden construirse inmunoglobulinas humanizados mediante ingeniería genética (por ejemplo, ver la patente US n° 5.585.089). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en el que los genes de cadena ligera y pesada son de origen humano. Pueden generarse anticuerpos humanos utilizando métodos conocidos de la técnica. Pueden producirse anticuerpos humanos mediante la inmortalización de una célula B humana que secreta el anticuerpo de interés. La inmortalización puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante infección de VEB o mediante la fusión de una célula B humana con un mieloma o célula de hibridoma para producir una célula de trioma. También pueden producirse anticuerpos humanos mediante métodos de expresión fágica (ver, por ejemplo, Dower et al., publicación de patente PCT WO91/17271; McCafferty et al., publicación de patente PCT WO92/001047; y Winter, publicación de patente PCT WO92/20791), o seleccionarse de una biblioteca combinatorial de anticuerpos monoclonales (ver el sitio de internet de Morphosys). También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la utilización de animales transgénicos portadores de un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ver Lonberg et al., publicación de patente PCT WO93/12227; y Kucherlapati, publicación de patente PCT WO91/10741).
De esta manera, el anticuerpo anti-ADM puede presentar formatos conocidos de la técnica. Son ejemplos los anticuerpos humanos, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos con injertación de CDR. En una forma de realización preferente, los anticuerpos según la presente invención son anticuerpos producidos recombinantemente tales como, por ejemplo, IgG,, una inmunoglobulina de longitud completa típica, o fragmentos de anticuerpos que contienen por lo menos el dominio variable F de cadena pesada y/o ligera, tal como, por ejemplo, anticuerpos acoplados químicamente (unión de antígeno a fragmento), incluyendo, aunque sin limitación, fragmentos Fab que incluyen minicuerpos Fab, anticuerpo de Fab de cadena sencilla, anticuerpo Fab monovalente con etiquetas epítopo, por ejemplo Fav-V5Sx2, Fab bivalente (minianticuerpo) dimerizado con el dominio CH3, Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo formado mediante multimerización con la ayuda de un dominio heterólogo, por ejemplo mediante dimerización de dominios dHLX, por ejemplo, Fab-dHLX-FSx2; fragmentos F(ab')2 , fragmentos scFv, fragmentos scFv multivalentes multimerizados y/o multiespecíficos scFv, diacuerpos bivalentes y/o biespecíficos, BITE® (acoplador biespecífico de células T), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo de una clase diferente de G, anticuerpos de dominio único, por ejemplo nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camélido o de pez, y numerosos otros.
Además de los anticuerpos anti-ADM, es bien conocido de la técnica que otros andamiajes de biopolímero acomplejan una molécula diana y se han utilizado para la generación de biopolímeros altamente específicos de diana. Son ejemplos, aptámeros, spiegélmeros, anticalinas y conotoxinas. A título ilustrativo de formatos de anticuerpo, ver la figura 1a, 1b y 1c.
En una forma de realización preferente, el formato de anticuerpo de ADM se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión de scFv-Fc. En otra forma de realización preferente, el formato de anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugaos de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como los fragmentos PEGilados. Uno de los formatos más preferentes es el formato scFab.
Los andamiajes no Ig pueden ser andamiajes de proteínas y pueden utilizarse como miméticos de anticuerpos, ya que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los andamiajes no Ig pueden seleccionarse del grupo que comprende andamiajes no Ig basados en tetranectina (por ejemplo, descritos en el documento n° US 2010/0028995), andamiajes de fibronectina (por ejemplo, descritos en la patente n° EP 1266 025; andamiajes basados en lipocalina ((por ejemplo descritos en el documento WO 2011/154420); andamiajes de ubiquitina (por ejemplo descritos en el documento WO 2011/073214), andamiajes de transferencia (por ejemplo Descritos en el documento US 2004/0023334), andamiajes de proteína A (por ejemplo descritos en la patente EP 2231860), andamiajes basados en repetición de anquirina (p.e. descritos en el documento WO 2010/060748), andamiajes microproteínas, preferentemente de microproteínas que forman un nudo de cistinas) (por ejemplo, descritos en la patente n° EP 2314308), andamiajes basados en el dominio Fyn-SH3 (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/023685), andamiajes basados en dominio EGFR-A (por ejemplo descritos en el documento WO 2005/040229) y andamiajes basados en dominio Kunitz (por ejemplo descritos en la patente n° EP 1941867). En una forma de realización de la invención, pueden producirse anticuerpos según la presente invención de la manera siguiente:
Se inmunizó un ratón Balb/c con ADM-100 |jg de conjugado de péptido-BSA los días 0 y 14 (emulsionados en 100 j l de adyuvante completo de Freund) y 50 jg los días 21 y 28 (en 100 j l de adyuvante incompleto de Freund). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 jg del conjugado disueltos en 100 j l de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos procedentes del ratón inmunizado y células del mieloma línea celular SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron mediante el cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y suplemento HAT). Tras dos semanas, se sustituyó el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno al medio de cultivo celular normal. Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a cribado primario para anticuerpos Ig específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos con resultado positivo en el ensayo se transfirieron a placas de 24 pocillos para la propagación. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron utilizando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (ver también Lane R.D. (1985). A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler, B. et al. (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res. 28: 11­ 15).
Los anticuerpos pueden producirse mediante expresión fágica según el procedimiento siguiente: Las bibliotecas génicas de anticuerpos no sensibilizados humanos HAL7/8 se utilizaron para el aislamiento de dominios variables F de cadena sencilla recombinantes (scFv) contra el péptido adrenomedulina. Las bibliotecas génicas de anticuerpo se cribaron con una estrategia de selección por 'panning' que comprende la utilización de péptidos que contienen una etiqueta de biotina unida mediante dos espaciadores diferentes a la secuencia del péptido adrenomedulina. Se utilizó una mezcla de rondas de 'panning' utilizando antígeno unido no específicamente y antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de panning se han utilizado para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monoclonal. El sobrenadante del cultivo de estas cepas clonales se ha utilizado directamente para un ensayo de ELISA de antígenos (ver Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).
La humanización de anticuerpos murinos puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento siguiente: Para la humanización de un anticuerpo de origen murino, la secuencia de anticuerpo se analiza para la interacción estructural de las regiones marco (FR) con las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y el antígeno. Basándose en el modelado estructural, se seleccionó una FR de origen humano y se trasplantaron las secuencias de CDR murinas en la FR humana. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR o FR para recuperar interacciones estructurales, las cuales pueden anularse mediante el intercambio de espeice de las secuencias de FR. Esta recuperación de interacciones estructurales puede conseguirse mediante un enfoque aleatorio, utilizando bibliotecas de expresión fágica o mediante un enfoque dirigido que se guíe por el modelado molecular (ver Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci.
2008 Ene 1;13:1619-33).
En una forma de realización preferida, el formato de anticuerpo de ADM se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión de scFv-Fc. En otra forma de realización preferente, el formato de anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugaos de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como los fragmentos PEGilados. Uno de los formatos más preferentes es el formato scFab.
En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, el fragmento de anticuerpo anti-ADM o el andamiaje no Ig anti-ADM es un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 5 aminoácidos de longitud completa contenido en aa 1-21 de la ADM humana madura.
En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 4 aminoácidos de longitud completa contenido en aa 1-21 de la a DM humana madura.
En una forma de realización específica de la invención, el anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina se proporciona para la utilización en terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje no es proteína 1 de unión a ADM (factor del complemento H).
En una forma de realización específica de la invención, el anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina se proporciona para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a una región de preferentemente por lo menos 4 o por lo menos 5 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura:
SEC ID n° 23:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.
En una forma de realización preferida de la presente invención, dicho anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se une a una región de ADM de preferentemente por lo menos 4 o por lo menos 5 aminoácidos que se sitúa en la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina (ver la figura 2).
En una forma de realización más preferida, el anticuerpo antiadrenomedulina o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig antiadrenomedulina se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 4 aminoácidos de longitud completa contenido en aa 1-21 de la ADM humana madura.
En otra forma de realización preferida, dicho anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM reconoce y se une al extremo N-terminal (aa 1) de la adrenomedulina. Extremo N-terminal se refiere a que el aminoácido 1 que es "Y" en la SEC ID n° 21 o 23 es obligatorio para la unión del anticuerpo. Dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje no se uniría a adrenomedulina extendida por el extremo N-terminal o modificada por el extremo N-terminal o degradada por el extremo N-terminal.
En otra forma de realización específica según la invención, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM proporcionado en la presente memoria no se une a la parte C-terminal de ADM, es decir, los aa 43-52 de ADM (SEC ID n° 25):
PRSKISPQGY-NH2
(SEC ID n° 25)
En una forma de realización específica, resulta preferente utilizar un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención, en la que dicho anticuerpo de adrenomedulina, dicho fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig es un anticuerpo estabilizador de ADM, un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina que potencia la semivida (ti/2 ; semitiempo de retención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
La semivida (semitiempo de retención) de ADM puede determinarse en plasma humano en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM o un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente, utilizando un inmunoensayo para la cuantificación de la ADM.
Pueden llevarse a cabo las etapas siguientes:
• La ADM puede diluirse en plasma citrato humano en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM, de un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o de un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente, y puede incubarse a 24°C.
• Se recogieron alícuotas en puntos temporales seleccionados (por ejemplo, dentro de las 24 horas) y la degradación de la ADM puede detenerse en dichas alícuotas mediante congelación a -20°C.
• La cantidad de ADM puede determinarse mediante un inmunoensayo de ADMh directamente, en el caso de que el ensayo seleccionado no esté influido por el anticuerpo estabilizador. Alternativamente, la alícuota puede tratarse con agentes desnaturalizantes (como HCl) y, tras clarificar la muestra (por ejemplo, mediante centrifugación) el pH puede neutralizarse y cuantificarse la ADM mediante un inmunoensayo de ADM. Alternativamente, pueden utilizarse tecnologías no de inmunoensayo (por ejemplo, rpHPLC) para la cuantificación de la ADM.
• La semivida de la ADM se calculó para la ADM incubada en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM o un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente.
• La potenciación de la semivida se calcula para la ADM estabilizada en comparación con ADM que ha sido incubada en ausencia de un anticuerpo estabilizador de ADN o un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina.
Un incremento de dos veces de la semivida de ADM es una potenciación de la semivida de 100%.
Se define semivida (semitiempo de retención) como el periodo que requiere la concentración de un compuesto químico o fármaco específica para caer hasta la mitad de su concentración de línea base en el líquido especificado o sangre.
Un ensayo que puede utilizarse para la determinación de la semivida (semitiempo de retención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma se describe en el ejemplo 3.
Para algunas enfermedades, el bloqueo de la ADM puede resultar beneficioso en cierto grado. Sin embargo, también puede resultar perjudicial neutralizar totalmente la ADM, ya que puede requerirse una determinada cantidad de ADM para varias funciones fisiológicas. En muchos informes se ha enfatizado que la administración de ADM puede resultar beneficiosa en determinadas enfermedades. En contraste con lo anterior, en otros informes se ha informado de que la ADM puede resultar potencialmente letal al administrarla bajo determinadas condiciones.
En una forma de realización específica, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM es un anticuerpo, fragmento o andamiaje no Ig no neutralizador. Un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM neutralizador bloquearía la bioactividad de ADM hasta prácticamente l00%, hasta por lo menos más de 90%, preferentemente hasta por lo menos más de En contraste, un anticuerpo anti-ADM no neutralizador, o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM bloquea la bioactividad de ADM menos de 100%, preferentemente a menos de 95%, preferentemente a menos de 90%, más preferentemente a menos de 80% y todavía más preferentemente a menos de 50%. Lo anterior significa que la bioactividad residual de ADM unido al anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM no neutralizador sería superior a 0%, preferentemente superior a 5%, preferentemente superior a 10%, más preferentemente superior a 20%, más preferentemente superior a 50%.
En el presente contexto, una o más moléculas, sean de un anticuerpo, o de un fragmento de anticuerpo o de un andamiaje no Ig con "actividad anti-ADM no neutralizadora", denominadas colectivamente en la presente memoria por simplicidad anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig "no neutralizador", que, por ejemplo, bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80% se define como
• una molécula o moléculas de unión a ADM, que con la adición a un cultivo de una línea celular eucariótica que expresa un receptor de ADM recombinante humano funcional compuesto de RTRC (receptor de tipo receptor de calcitonina) y RAMP3 (proteína 3 modificadora de la actividad de receptor) reduce la cantidad de AMPc producida por la línea celular mediante la acción de péptido ADM sintético humano añadido en paralelo, en el que dicha ADM sintética humana se añade en una cantidad que, en ausencia del anticuerpo no neutralizador que debe analizarse, conduce a una estimulación semimáxima de la síntesis de AMPc, en la que la reducción del nivel de AMPc por la unión de dicha molécula o moléculas a ADM tiene lugar en una medida que no es superior a 80%, ni siquiera al añadir la molécula o moléculas no neutralizadoras de unión a ADM en una cantidad que es 10 veces superior a la cantidad que se requiere para obtener la reducción máxima de la síntesis de AMPc obtenible con el anticuerpo no neutralizador que debe analizarse.
La misma definición se aplica a los demás intervalos, 95%, 90%, 50%, etc.
En una forma de realización específica según la presente invención, se utiliza un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50% (de los valores de línea base). Esto es en el sentido de bloquear la ADM circulante de no más de 80% o no más de 50%, respectivamente.
Se entiende que dicho bloqueo limitado de la bioactividad de ADM se produce incluso a una concentración en exceso del anticuerpo, fragmento o andamiaje, es decir un exceso del anticuerpo, fragmento o andamiaje en relación a la ADM. Dicho bloqueo limitado es una propiedad intrínseca del ligante de ADM mismo. Lo anterior implica que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje presenta una inhibición máxima de 80% o 50%, respectivamente. En una forma de realización preferente, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM, bloquearía la bioactividad de ADM hasta por lo menos 5%.
Lo anteriormente indicado significa que aproximadamente 20% o 50% o incluso 95% de la bioactividad de ADM residual sigue estando presente, respectivamente.
De esta manera, según la presente invención, los anticuerpos anti-ADM, fragmentos de anticuerpo anti-ADM y andamiajes no Ig anti-ADM proporcionados no neutralizan la bioactividad de ADM circulante respectiva.
La bioactividad se define como el efecto que produce una sustancia sobre un organismo, tejido, órgano o unidad funcional viva, in vivo o in vitro (por ejemplo en un ensayo) después de su interacción. En el caso de la bioactividad de ADM, lo anterior puede ser el efecto de la ADM en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana. De esta manera, según la presente invención, la bioactividad se define mediante un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina. Las etapas siguientes pueden llevarse a cabo con el fin de determinar la bioactividad de ADM en tal ensayo.
• Se generan curvas de dosis-respuesta con ADM en dicho ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana.
• Puede calcularse la concentración de ADM de estimulación semimáxima de AMPc.
• Se generan curvas de dosis-respuesta a concentraciones de ADM estimuladoras de AMPc semimáxima constante (hasta 100 pg/ml, concentración final) con un anticuerpo estabilizador de ADM, fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente.
Una inhibición máxima en dicho bioensayo de ADM de 50% significa que dicho anticuerpo anti-ADM, dicho fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o dicho andamiaje no Ig antiadrenomedulina, respectivamente, bloquea la bioactividad a 50% de los valores de línea base. Una inhibición máxima en dicho bioensayo de ADM de 80% significa que dicho anticuerpo anti-ADM, dicho fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o dicho andamiaje no Ig antiadrenomedulina, respectivamente, bloquea la bioactividad a 80%. Esto es en el sentido de bloqueo de la bioactividad de ADM a no más de 80%. Lo anterior significa que sigue presente aproximadamente 20% de actividad residual de la ADM.
Sin embargo, en la presente memoria y en el contexto anterior, la expresión "bloquea la bioactividad de ADM" en relación a los anticuerpos anti-ADM, fragmentos de anticuerpo anti-ADM y andamiajes no Ig anti-ADM dados a conocer en la presente memoria debe entenderse como una mera reducción de la bioactividad de ADM, preferentemente reduciendo la bioactividad de ADM circulante de 100% a 20% de la bioactividad de ADM remanente como máximo, preferentemente reduciendo la bioactividad de ADM de 100% a 50% de la bioactividad de ADM remanente, aunque en cualquier caso existe bioactividad de ADM remanente que puede determinarse tal como se ha detallado anteriormente.
La bioactividad de ADM puede determinarse en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina) según el ejemplo 2.
En una forma de realización preferida, se utiliza un anticuerpo anti-ADM modulador, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o un andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador, en la terapia de una enfermedad aguda o de una afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
Tal anticuerpo anti-ADM modulador, fragmento de anticuerpo anti-ADM modulador o andamiaje no Ig anti-ADM modulador puede resultar especialmente útil en el tratamiento de la sepsis. Un anticuerpo anti-ADM modulador o un fragmento de anticuerpo anti-ADM modulador o un andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador potencia la bioactividad de ADM en la etapa temprana de la sepsis y reduce los efectos perjudiciales de la ADM en la etapa tardía de la sepsis.
Un anticuerpo "modulador" o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina modulador o un andamiaje no Ig de adrenomedulina modulador es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig que potencia la semivida (t-i/2, semitiempo de retención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM hasta menos de 80%, preferentemente a menos de 50%. Estos valores relacionados con la semivida y el bloqueo de la bioactividad deben entenderse en relación a los ensayos y definiciones anteriormente mencionados a fin de determinar estos valores.
Debe subrayarse que el bloqueo de la bioactividad de la ADM es en el sentido de no más de 80% y, de esta manera, 20% de bioactividad residual de la ADM. Lo mismo resulta de aplicación al bloqueo de la bioactividad de la ADM a no más de 50% y, de esta manera, una bioactividad residual de la ADM de 50%.
Tal modulación del anticuerpo anti-ADM o modulación de fragmento de anticuerpo anti-ADM o modulación de andamiaje no Ig antiadrenomedulina ofrece la ventaja de que se facilita la dosificación de la administración. La combinación de bloqueo parcial o reducción parcial de la bioactividad de la adrenomedulina y el incremento de la semivida in vivo (incremento de la bioactividad de la adrenomedulina) conduce a una simplificación beneficiosa de la administración de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina. En una situación de exceso de adrenomedulina endógena (estimulación máxima, etapa de sepsis tardía, choque, etapa hipodinámica), el efecto de reducción de la actividad es el impacto principal del anticuerpo, fragmento o andamiaje, limitando el efecto (negativo) de la adrenomedulina. En el caso de concentraciones endógenas bajas o normales de adrenomedulina, el efecto biológico del anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM es una combinación de reducción (o bloqueo parcial) e incremento de la semivida de la adrenomedulina. En el caso de que el efecto de semivida sea más fuerte que el efecto de bloqueo, la actividad biológica neta de la adrenomedulina endógena resulta beneficiosamente incrementada en las etapas tempranas de la sepsis (baja adrenomedulina, etapa hiperdinámica). De esta manera, el anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina no neutralizador y modulador actúa como un tampón de la actividad de la ADM con el fin de mantener la bioactividad de la ADM dentro de un determinado intervalo fisiológico.
De esta manera, la administración del anticuerpo/fragmento/andamiaje anti-ADM en, por ejemplo, la sepsis, puede seleccionarse de una concentración excesiva, debido a que ambas etapas de sepsis (temprana y tardía) benefician del tratamiento del exceso de anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM en el caso de un efecto modulador. Medios excesivos: La concentración de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM es superior a la concentración de adrenomedulina endógena durante la etapa tardía (choque) de, por ejemplo, la sepsis. Esto significa, en el caso de un anticuerpo anti-ADM modulador, fragmento de anticuerpo anti-ADM modulador o andamiaje anti-ADM modulador, la administración en la sepsis puede ser la siguiente:
La concentración de adrenomedulina en el choque séptico es de 226+/-66 fmoles/ml (Nishio et al., "Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxation of vascular tone in patients with septic shock.", Crit Care Med. 1997, 25(6):953-7), una concentración equimolar e anticuerpo, fragmento o andamiaje es de 42,5 |jg/l de sangre (respecto a 6 l de volumen de sangre / 80 kg de peso corporal) 3,2 jg/kg de peso corporal. Exceso se refiere a por lo menos el doble (media) de la concentración de adrenomedulina de choque séptico, por lo menos >3 jg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal, preferentemente por lo menos 6,4 jg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal. Preferentemente >10 jg/kg, más preferentemente >20 jg/kg, todavía más preferentemente >100 jg/kg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal. Lo anterior también puede aplicarse a otras condiciones severas y agudas aparte del choque séptico. En una forma de realización específica de la invención, el anticuerpo anti-ADM es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo anti-ADM del mismo. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM es un anticuerpo humano o humanizado o derivado del mismo. En una forma de realización específica, se injerta uno o más CDR (murinos) en un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo.
La materia objeto de la presente invención en un aspecto es un anticuerpo con injertación de CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a los aa 1-21 de la ADM humana madura, en el que el anticuerpo con injertación de CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una cadena pesada (cadena H) de anticuerpo que comprende:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST
y/o
SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y/o comprende además una cadena ligera (cadena L) de anticuerpo que comprende:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS
y/o
SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización específica de la invención, la materia objeto de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a aa 1-21 de la ADM humana madura o un fragmento de anticuerpo del mismo, en el que la cadena pesada comprende por lo menos un CDR seleccionado del grupo que comprende:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende por lo menos una CDR seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY
SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización más específica de la invención, la materia objeto de la invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a aa 1-21 de la ADM humana madura o fragmento de anticuerpo de la misma, en el que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización muy específica, el anticuerpo anti-ADM presenta una secuencia seleccionada del grupo que comprende: SEC ID n° 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.
El anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención muestra una afinidad para la ADM humana de manera que la constante de afinidad es superior a 10"7 M, preferentemente 10"8 M, la afinidad preferente es superior a 10"9 M, más preferentemente es superior a 10"10 M. El experto en la materia conoce que puede considerarse que compensa una afinidad inferior mediante la aplicación de una dosis más alta de compuestos y esta medida no conduciría a salirse del alcance de la invención. Las constantes de afinidad puedes determinarse según el método descrito en el ejemplo 1. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza para reducir el riesgo de mortalidad durante dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda de un paciente.
La enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, según la presente invención puede ser una enfermedad o condición seleccionada del grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares aguda y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, ictus, arteriesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática o fuga capilar, traumatismo, envenenamiento, cirugía. Resulta especialmente útil el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención para reducir el riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de sepsis.
Debe enfatizarse en la presente memoria que el paciente puede presentar una enfermedad o condición crónica o aguda como enfermedad primaria o subyacente tal como se indica de manera general en el párrafo anterior; sin embargo, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM según la invención no está destinado a la terapia primaria de dichas enfermedades, sino por el contrario para regular el equilibrio de líquidos de un paciente que necesita la administración de líquidos, que puede considerarse de esta manera una enfermedad aguda o afección aguda aparte de la enfermedad primaria. Además, dicha necesidad de administración de líquidos puede estar asociada a una enfermedad subyacente primaria, aunque esto no es obligatorio dentro del alcance de la presente invención.
De esta manera, en una forma de realización, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza en terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la presente invención, en la que dicho paciente es un paciente de UCI. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza en la terapia de una enfermedad aguda de un paciente según la presente invención, en el que dicho paciente se encuentra críticamente enfermo. Críticamente enfermo se refiere a que el paciente presenta una enfermedad o estado en el que la muerte resulta posible o inminente.
El objeto de la presente invención es además un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda de un paciente según la presente invención, en la que dicho anticuerpo o fragmento debe utilizarse en combinación con proteína de unión a ADM. La proteína de unión a ADM también se encuentra naturalmente presente en la circulación de dicho paciente.
Debe enfatizarse que la expresión proteína de unión a ADM también se refiere a la proteína 1 de unión a ADM (factor del complemento H), que sin embargo no es un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM no neutralizador y modulador tal como según la invención.
El objeto de la presente invención es además un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad o afección aguda de un paciente según la presente invención, en la que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje debe utilizarse en combinación con principios activos adicionales.
La materia objeto de la invención es también un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en combinación con un medicamento primario, en el que dicha combinación es para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o condición agua de un paciente para regular el equilibrio de líquidos de dicho paciente.
Medicamento primario se refiere a un medicamento que actúa contra la causa primaria de dicha enfermedad o condición. Dicho medicamento primario pueden ser antibióticos en el caso de infecciones.
Debería subrayarse que dicha causa primaria está relacionada con la enfermedad o condición primaria y subyacente, y no está relacionada con la enfermedad aguda o afección aguda que está asociada al desequilibrio de líquidos de un paciente, para el que está destinada la terapia proporcionada en la presente memoria de regulación del equilibrio de líquidos.
En una forma de realización específica de las combinaciones anteriormente mencionadas, dichas combinaciones deben utilizarse en combinación con vasopresores, por ejemplo catecolamina, en la que dicha combinación adicional es para la utilización en la terapia de una enfermedad o afección aguda de un paciente para regular el equilibrio de líquidos.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad o condición crónica o aguda que requiere de la regulación del equilibrio de líquidos se caracteriza por la necesidad de dicho paciente de recibir la administración de vasopresores, por ejemplo, de catecolamina.
Debería subrayarse que dicho paciente presenta una enfermedad crónica o aguda o condición crónica, tal como cáncer o diabetes, y, de esta manera, esta puede considerarse una enfermedad subyacente primaria, aunque además dicho paciente presenta una necesidad aguda de regular el equilibrio de líquidos, que puede deberse a otra enfermedad aguda o afección aguda, tal como, por ejemplo, SIRS, sepsis, sepsis severa, choque, o choque séptico.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM que debe utilizarse en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales para la utilización en la terapia de un paciente que necesita el tratamiento de vasopresores, por ejemplo, el tratamiento de catecolamina.
En una forma de realización específica de las combinaciones anteriormente mencionadas, dichas combinaciones deben utilizarse en combinación con líquidos administrados por vía intravenosa, en la que dicha combinación es para la utilización en la terapia de una enfermedad o afección aguda de un paciente para regular el equilibrio de líquidos.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad o condición crónica o aguda que requiere de la regulación del equilibrio de líquidos se caracteriza por la necesidad de dicho paciente de obtener líquidos intravenosos.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales para la utilización en la terapia de un paciente que necesita de líquidos intravenosos.
Dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM o combinaciones de los mismos con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales pueden utilizarse en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina y/o con líquidos administrados por vía intravenosa para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente para regular el equilibrio de líquidos.
La materia objeto de la invención también es un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención que debe utilizarse en combinación con anticuerpos de TNF-alfa. Los anticuerpos de TNF-alfa se encuentran disponibles comercialmente para el tratamiento de los pacientes.
El objeto de la presente invención es además una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje de anticuerpo anti-ADM según la presente invención. El objeto de la presente invención es además una formulación farmacéutica según la presente invención en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
Dicha formulación farmacéutica puede administrarse por vía intramuscular. Dicha formulación farmacéutica puede administrarse por vía intravascular. Dicha formulación farmacéutica puede administrarse mediante infusión.
Debe subrayarse que la formulación farmacéutica según la invención que puede administrarse por vía intramuscular, intravascular o mediante infusión preferentemente se administra en el paciente para regular el equilibrio sistémico de líquidos con la condición de que dichos pacientes necesiten regular el equilibrio de líquidos.
Por lo tanto, en otra forma de realización de la presente invención, la formulación farmacéutica según la presente invención debe administrarse en el paciente para regular el equilibrio sistémico de líquidos con la condición de que dicho paciente necesite la regulación del equilibrio de líquidos.
La expresión "regular el equilibrio de líquidos" en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier corrección de un manifiesto desequilibrio en el equilibrio de líquidos del paciente debido a una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda subyacente. Dicha corrección se realiza en favor del restablecimiento de la normotensión en dichos pacientes. El experto en la materia es plenamente consciente de que la presión sanguínea en general, así como la hipertensión y la hipotensión está estrechamente relacionada con el equilibrio de líquidos de un paciente. El equilibrio de líquidos es el equilibrio entre la entrada y salida de líquidos en el cuerpo para permitir el funcionamiento de los procesos metabólicos. La deshidratación se define como una pérdida de 1% o superior de la masa corporal como resultado de la pérdida de líquidos. Los tres elementos para evaluar el equilibrio de líquidos y el estado de hidratación son: la evaluación clínica de peso corporal y producción de orina, revisión de los diagramas de equilibrio de líquidos y revisión de la química sanguínea. Todo lo anterior es muy bien conocido por el experto en la materia (Alison Shepherd, Nursing Tomes 19.07.11/vol 107, n° 28, páginas 12 a 16).
De esta manera, en una forma de realización, una persona que necesita regular el equilibrio de líquidos y/o mejorar el equilibrio de líquidos de tales pacientes es una persona que presenta una pérdida de 1% o superior de la masa corporal como resultado de la pérdida de líquidos. El equilibrio de líquidos puede evaluarse según Scales y Pilsworth (2008) Nursing Standard 22:47, 50-57. Por ejemplo, la producción normal de orina se encuentra en el intervalo de 0,5 a 2 ml/kg de peso corporal por hora. La producción de orina aceptable mínima para un paciente con función renal normal es de 0,5 ml/kg por hora. Todos estos estándares pueden utilizarse para evaluar si un paciente necesita regular el equilibrio de líquidos y/o mejorar el equilibrio de líquidos.
En otra forma de realización el objeto de la presente invención es además una formulación farmacéutica según la presente invención en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado seco para la reconstitución antes de la utilización.
En otra forma de realización el objeto de la presente invención es además una formulación farmacéutica según la presente invención en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
Las formas de realización siguientes son únicamente una ilustración de la exposición y no definen la invención: 1. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
2. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)Fragmentos de anticuerpo y proteína de fusión de scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo estabilizador de ADM o fragmento de anticuerpo estabilizador de ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho paciente es un paciente de UCI.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador que potencia el semitiempo de retención t1/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos en 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
10. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
13. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
15. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda o afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
2. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
3. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de DAM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda o afección aguda según la reivindicación 1 o 2 para la prevención o reducción del edema en dicho paciente.
4. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
5. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
7. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo estabilizador de ADM o fragmento estabilizador de ADM o andamiaje no Ig estabilizador de ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención t-ic) de la adrenomedulina en suero ,sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >10o%.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de AM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende SIRS, sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
11. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C) QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPG S G STN YNEKFKGKATIT ADTSSNTA YMQLS SLTSEDS AV YY CTEGYEYDGFD Y W GQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRTLP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNnCVDKRV EFKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILP GSGSTNYAQKFQGRVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVIITFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNIIKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSCiVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNIIKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C) DVLLSQTPLSLPVSLGDQAT1SCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIK RTVAAPSVF1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLP VTLGQPASISCRS SQSIV YSNGNT YLNW F QQRPGQSPRRLIYRV
SNRDSGVPDRPSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRR1JYRV
SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSrLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho paciente es un paciente de UCI.
13. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador que potencia la semivida (semitiempo de retención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos en 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
14. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la utilización en combinación con catecolamina y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
15. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 12, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
16. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
18. Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
20. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
21. Formulación farmacéutica según la reivindicación 20, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la estabilización de la circulación.
2. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo estabilizador de ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50 %.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo de ADM modulador o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina modulador que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal.
10. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
13. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
15. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de a Dm para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la estabilización de la circulación.
2. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reduce la necesidad de vasopresor, por ejemplo, la necesidad de catecolamina, de dicho paciente.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
5. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
7. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje modulador que potencia la semivida (semitiempo de retención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
11. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C) QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPG SGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYW GQGTTLTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EP KHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRJLP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESl’STAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY
g a l t s g v f it f p a v l q s s g l y s l s s v v t v p s s s l g t q t y ic n v n h k p s n t k v d k r v EPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
q v q l v q s g a e v k k p g s s v k v s c k a t g y t f s r y w is w v r q a p g q g l e w m g e il p GSGSTNYAQKFQGRVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY
w g q g t t v t v s s a s t k g p s v f p l a p s s k s t s g g t a a l g c l v k d y f p e p v t v s w n s
g a l t s g v h t f p a v l q s s g l y s l s s v v t v p s s s l g t q t y ic n v n h k p s n t k v d k r v EPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
q v q l v q s g a e v k k p g s s v k v s c k a t g y t f s r y w ie w v r q a p g q g l e w m g e il p GSGSTNYAQKFQGRVTFFADESTSTAYMELSSt,RSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSG VHTFP AVLQS S GLYSLS S V VTVPSS SLGTQT YICNVNHKP SNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C) DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPY I'FGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKGSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRV
SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK
RTVA APS VFIFPPSDEQLKSGTAS V VCLLNNF YPREAKVQ WKVDN ALQ S GNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRV
SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKTSRVEAEDVGVYYCFQGSHTPYTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende SIRS, sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal.
13. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la utilización en combinación con catecolamina y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 10, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en el tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y/o en el que dicho anticuerpo bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
2) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en el tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador de la ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
3) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o agua según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento según la reivindicación 3 se une al extremo N-terminal de la adrenomedulina.
5) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente 100%. 6) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende SIRS, sepsis, choque séptico, diabetes, cáncer, insuficiencia cardíaca, choque, insuficiencia orgánica, disfunción renal, desequilibrio agudo de líquidos y presión sanguínea baja.
8) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad es choque séptico o sepsis.
9) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento regula el equilibrio de líquidos de dicho paciente.
10) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomeedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento utilizado para la prevención de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
11) Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento utilizado para la prevención de la disfunción renal o la insuficiencia renal.
12) Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo o fragmento se utiliza para estabilizar la circulación.
13) Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilizaci'n en u ntratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente.
14) Anticuerpo de DAM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente.
15) Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho anticuerpo o fragmento puede administrarse a una dosis de por lo menos 3 pg/kg de peso corporal.
16)Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o andamiaje es un anticuerpo no neutralizador.
2. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de la ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y/o en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
3. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador de la ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
4. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de DAM, en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o andamiaje según la reivindicación 3 se une al extremo N-terminal de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o dicho andamiaje es un anticuerpo o fragmento estabilizador de ADM que potencia el semitiempo de retención, t-i/2 , de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente 100%.
7. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización como sustancia farmacéutica activa. 8. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda o afección aguda, en la que dicha enfermedad o condición se selecciona del grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, ictus, aterosclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía o traumatismos.
9. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad es choque séptico o sepsis.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo, en el que la cadena pesada comprende por lo menos una de las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y/o en la que la cadena ligera comprende por lo menos una de las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C) QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPG SGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYW GQGTTLl'VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV'I VSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KHHHHHFI SEC ID n° 8 (AM-VH1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAEGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILP GSGS1 NYAQKFQGRVTFi ADESTSTAYMELSSERSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMHLSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGrAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH
SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV KPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C) DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE S V1EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEC ID n° 13 (AM-VL1) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQS1VYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRV SNRDSGVPDR FSGSGSGTDF rLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDS'rYSLSSTLTLSRADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40) DVVMTQSPLSLPVTLGQPAS1SCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLJYRV SNRDSGVPDRFSCiSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la regulación del equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o afección aguda.
Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o afección aguda.
Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 10, en el que el órgano es riñón o hígado.
Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la estabilización de la circulación en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o afección aguda.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina.
Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la utilización en combinación con la administración de líquidos por vía intravenosa.
19. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la utilización en combinación con un anticuerpo de TNF-alfa.
20. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la utilización en un tratamiento de un paciente que necesita del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento puede administrarse en una dosis de por lo menos 3 pg/kg de peso corporal.
21. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
22. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, o condición crónica.
23. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según la reivindicación 22, en el que dicha enfermedad es sepsis.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda severa de un paciente para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente.
2. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)Fragmentos de anticuerpo y proteína de fusión de scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho paciente es un paciente de UCI.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el riesgo de mortalidad se reduce evitando sucesos adversos, en el que los últimos se seleccionan del grupo que comprende SIRS, sepsis, choque séptico, insuficiencia orgánica, insuficiencia renal, desequilibrio de líquidos y presión arterial baja.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento es para la utilización en combinación de proteína de unión a ADM.
11. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
13. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
15. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en terapia de una enfermedad severa crónica o aguda o afección aguda de un paciente para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
2. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)Fragmentos de anticuerpo y proteína de fusión de scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1­ 21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, ictus, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática; quemaduras, cirugía y traumatismos.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende SIRS, una infección severa, sepsis, choque, por ejemplo, choque séptico.
9. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho paciente es un paciente de UCI. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el riesgo de mortalidad se reduce mediante la prevención de un suceso adversos en el que este último se selecciona del grupo que comprende SIRS, sepsis, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca aguda, infarto de miocardio, ictus; insuficiencia orgánica, tal como, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia hepática, desequilibrio de líquidos y baja presión arterial.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
12. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPG
SGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYW
GQGTTLTVSSAS 1 KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVl VSWNSGA
LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP
KHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKFGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILP
GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY
w g q g t t v t v s s a s t k g p s v f p l a p s s k l s t s g g t a a l g c l v k d y f p e p v t v s w n s
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
EPKHHHHHH
SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEV KKPGS S VKV SCKASG YTFSR Y WIE WVRQ APGQGLEWMGRILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVi'VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
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GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
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GSGSTNYAQKFQÜRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
D VLLSQTPLSLP V S LGDQATISCRS SQ SI V YSNGNT YLE WYLQKPGQSPKLLIYRV
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SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
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RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKIIKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKÍSRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDF.QLKSGTASVVCLLNNFYPREAICVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
13. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 10 , para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
21. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina en preferentemente la ADM humana.
22. Anticuerpo, fragmento o andamiaje según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa 1) de la adrenomedulina.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la prevención de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
2. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda según la reivindicación 1, en el que dicho órgano es el riñón.
3. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)Fragmentos de anticuerpo y proteína de fusión de scFv-Fc.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca y choque.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho paciente es un paciente de UCI.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador que potencia el semitiempo de retención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
11. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
13. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
15. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Las formas de realización siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo de la exposición y no definen la invención:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente para la prevención o reducción de la disfunción orgánica, o para la prevención de la insuficiencia orgánica en dicho paciente.
2. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o enfermedad aguda, según la reivindicación 1, en el que dicho órgano es riñón o hígado.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
4. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
5. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
7. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (semitiempo de retención ti/2) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca y choque.
Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKJSCKATGYTFSRYWEWVKQRPGHGLEWIGEILPG SGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYW GQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEP KHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNFIKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH
SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILP GS GS TN Y AQKFQGR VTIT ADESTSTAY MELS SLRSEDT AVYY CTEG YE YDGFD Y WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNIIKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSl’NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG'IAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILP GSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSS ASTKGPS VFPL AP SSKSTS GGT AALGCL VKD YFPEP VTVS WNS GALTSGVHTFP AVLQ S SGLYSLS S V VT VPS SSLGTQ TYICNVNHKPSNTK VDKRV EPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C) DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLK.1SRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIK RTVAAPSVF1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKIIKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHTPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLTYRV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCELNNFYPREAKVQWKVDNAEQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador que potencia la semivida (semitiempo de retención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
13. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una combinación según la reivindicación 13, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 18, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Ejemplos
Debe subrayarse que los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y andamiajes no Ig de la parte de ejemplos según la invención se unen a la ADM y, de esta manera, deberían considerarse anticuerpos/fragmentos de anticuerpo/andamiajes no Ig anti-ADM.
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos y determinación de sus constantes de afinidad
Se produjeron varios anticuerpos humanos y murinos y se determinaron sus constantes de afinidad (ver las Tablas 1 y 2).
Péptidos/conjugados para la inmunización
Se sintetizaron péptidos para la inmunización; ver la tabla 1 (JPT Technologies, Berlin, Alemania) con un residuo N-terminal adicional de cisteína (en caso de no encontrarse presente cisteína dentro de la secuencia de ADM seleccionada) para la conjugación de los péptidos a albúmina de suero bovino (BSA). Los péptidos se unieron covalentemente a BSA mediante la utilización del gel de acoplamiento Sulfolink (Perbio-Science, Bonn, Alemania). El procedimiento de acoplamiento se llevó a cabo según el manual de Perbio.
Se generaron los anticuerpos murinos siguiendo el método a continuación:
se inmunizó un ratón Balb/c con 100 |jg de conjugado de péptido-BSA los días 0 y 14 (emulsionados en 100 j l de adyuvante completo de Freund) y 50 jg los días 21 y 28 (en 100 j l de adyuvante incompleto de Freund). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 jg del conjugado disueltos en 100 j l de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos procedentes del ratón inmunizado y células de la línea celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron mediante el cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y suplemento HAT). Tras dos semanas, se sustituyó el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno al medio de cultivo celular normal.
Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a cribado primario para anticuerpos Ig específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos con resultado positivo en el ensayo se transfirieron a placas de 24 pocillos para la propagación. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron utilizando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (ver también Lane R.D., "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).
Producción de anticuerpos monoclonales de ratón:
Se produjeron los anticuerpos mediante métodos estándares de producción de anticuerpos (Marx et al, Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997) y se purificaron mediante proteína A. Las purezas de anticuerpos eran >95% según el análisis de electroforesis en gel de SDS.
Anticuerpos humanos
Se produjeron anticuerpos humanos mediante expresión fágica siguiendo el procedimiento a continuación:
Las bibliotecas génicas de anticuerpos no sensibilizados humanos HAL7/8 se utilizaron para el aislamiento de dominios variables F de cadena sencilla recombinantes (scFv) contra el péptido adrenomedulina. Las bibliotecas génicas de anticuerpo se cribaron con una estrategia de selección por 'panning' que comprende la utilización de péptidos que contienen una etiqueta de biotina unida mediante dos espaciadores diferentes a la secuencia del péptido adrenomedulina. Se utilizó una mezcla de rondas de 'panning' utilizando antígeno unido no específicamente y antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de panning se han utilizado para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monoclonal. El sobrenadante del cultivo de estas cepas clonales se ha utilizado directamente para un ensayo de ELISA de antígenos (ver también Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I, Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).
Se seleccionaron los clones positivos basándose en una señal positiva en el ELISA para el antígeno y negativa en las placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina. Para una caracterización adicional, el marco de lectura abierto de scFv se clonó en el plásmido de expresión pOPE107 (Hust et al., J. Biotechn. 2011) capturado del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados y se purificó mediante una cromatografía de exclusión por tamaño.
Constantes de afinidad
Para determinar la afinidad de los anticuerpos de adrenomedulina, se determinó la cinética de la unión de la adrenomedulina al anticuerpo inmovilizado mediante resonancia del plasmón superficial sin marcaje utilizando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania). Se llevó a cabo la inmovilización reversible de los anticuerpos utilizando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente a alta densidad con la superficie de un sensor CM5 siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare). (Lorenz et al.," Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy"; Antimicrob Agents Chemother. enero de 2011; 55(1): 165-173.)
Se generaron los anticuerpos monoclonales contra las regiones de ADM ilustradas a continuación de la ADM humana y murina, respectivamente. La tabla a continuación representa una selección de los anticuerpos obtenidos utilizados en experimentos adicionales. La selección se basó en la región diana:
Tabla 1:
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A continuación, se proporciona una lista de los anticuerpos monoclonales adicionales obtenidos:
Listado de anticuerpos anti-ADM
Tabla 2:
Figure imgf000041_0001
Generación de fragmentos de anticuerpos mediante digestión enzimática:
La generación de fragmentos Fab y F(ab)2 se llevó a cabo mediante digestión enzimática del anticuerpo de longitud completa murino NT-M. El anticuerpo NT-M se digirió utilizando: a) el kit de preparación de F(ab)2 a base de pepsina (Pierce 44988) y b) el kit de preparación de Fab a base de papaína (Pierce 44985). Los procedimientos de fragmentación se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones proporcionadas por el proveedor. La digestión se llevó a cabo en el caso de la fragmentación de F(ab)2 durante 8 h a 37°C. La digestión de fragmentación de Fab se llevó a cabo durante 16 h, respectivamente.
Procedimiento para la generación y purificación de Fab:
La papaína inmovilizada se equilibró mediante lavado de la resina con 0,5 ml de tampón de digestión y se centrifugó la columna a 5.000xg durante 1 minuto. Después se descartó el tampón. La columna de desalado se preparó mediante eliminación de la disolución de almacenamiento y lavado de la misma con tampón de digestión, centrifugándola posteriormente cada vez a 1.000xg durante 2 minutos. Se añadieron 0,5 ml de la muestra de IgG preparada al tubo de la columna de centrifugación que contenía la papaína inmovilizada equilibrada. La incubación de la reacción de digestión se llevó a cabo durante 16 h en un agitador basculante de laboratorio a 37°C. La columna se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto para separar el digerido de la papaína inmovilizada. Después, la resina se lavó con 0,5 ml de PBS y se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto. La fracción de lavado se añadió al anticuerpo digerido de manera que el volumen total de la muestra era de 1,0 ml. La columna de NAb-proteína A se equilibró con PBS y tampón de elución de IgG a temperatura ambiente. La columna se centrifugó durante 1 minuto para eliminar la disolución de almacenamiento (contiene azida sódica al 0,02%) y se equilibró mediante la adición de 2 ml de PBS; se centrifugó nuevamente durante 1 minuto y se descartó el eluido. La muestra se aplicó a la columna y se resuspendió mediante inversión. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente con mezcla vertical durante 10 minutos. La columna se centrifugó durante 1 minuto, guardando el eluido con los fragmentos Fab.
(Referencias: Coulter, A. y Harris, R. (1983). J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner I. et al. (2010) {alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signaling. Cancer Res. 70, 277-87.; Kaufmann B. et al. (2010) Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS. 107, 18950-5.; Chen X. et al. (2010) Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin axp2. PNAS. 107, 14727­ 32.; Uysal H. et al. (2009) Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthitis. J. Exp. Med. 206, 449-62.; Thomas G. M. et al. (2009) Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo. J. Exp. Med. 206, 1913-27.; Kong F. et al. (2009) Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. J. Cell Biol. 185, 1275-84).
Procedimiento para la generación y purificación de fragmentos F(ab')?
La pepsina inmovilizada se equilibró mediante lavado de la resina con 0,5 ml de tampón de digestión y se centrifugó la columna a 5.000xg durante 1 minuto. Después se descartó el tampón. La columna de desalado se preparó mediante eliminación de la disolución de almacenamiento y lavado de la misma con tampón de digestión, centrifugándola posteriormente cada vez a 1.000xg durante 2 minutos. Se añadieron 0,5 ml de la muestra de IgG preparada al tubo de la columna de centrifugación que contenía la pepsina inmovilizada equilibrada. La incubación de la reacción de digestión se llevó a cabo durante 16 h en un agitador basculante de laboratorio a 37°C. La columna se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto para separar el digerido de la papaína inmovilizada. Después, la resina se lavó con 0,5 ml de PBS y se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto. La fracción de lavado se añadió al anticuerpo digerido de manera que el volumen total de la muestra era de 1,0 ml. La columna de NAb-proteína A se equilibró con PBS y tampón de elución de IgG a temperatura ambiente. La columna se centrifugó durante 1 minuto para eliminar la disolución de almacenamiento (contiene azida sódica al O, 02%) y se equilibró mediante la adición de 2 ml de PBS; se centrifugó nuevamente durante 1 minuto y se descartó el eluido. La muestra se aplicó a la columna y se resuspendió mediante inversión. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente con mezcla vertical durante 10 minutos. La columna se centrifugó durante 1 minuto, guardando el eluido con los fragmentos Fab.
(Referencias: Mariani, M., et al. (1991). A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgG1. Mol. Immunol. 28: 69-77; Beale, D. (1987). Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp Comp Immunol 11:287-96.; Ellerson, J.R., et al. (1972). A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity. FEBS Letters 24(3):318-22.; Kerbel, R.S. and Elliot, B.E. (1983). Detection of Fc receptors. Meth Enzymol 93:113-147.; Kulkarni, P.N., et al. (1985). Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab')2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4.; Lamoyi, E. (1986). Preparación de fragmentos F(ab')2 de IgG de ratón de diversas subclases. Meth Enzymol 121:652-663.; Parham, P. , et al. (1982). Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens. J Immunol Meth 53:133-73.; Raychaudhuri, G., et al. (1985). Human IgG1 and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines. Mol Immunol 22(9):1009-19.; Rousseaux, J., et al. (1980). The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain an pepsin. Mol Immunol 17:469-82.; Rousseaux, J., et al. (1983). Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J Immunol Meth 64:141-6.; Wilson, K.M., et al. (1991). Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate. J Immunol Meth 138:111-9).
Humanización de fragmentos de anticuerpo NT-H
El fragmento de anticuerpo se humanizó mediante el método de injertación de CDR (Jones, P. T., Dear, P. H., Foote, J., Neuberger, M. S. y Winter, G. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525).
Se llevaron a cabo las etapas siguientes para conseguir la secuencia humanizada:
Extracción del ARN total: Se extrajo el ARN total a partir de los hibridomas de NT-H utilizando el kit de Qiagen.
RT-PCR de primera ronda: Se utilizó el kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (n° de cat. 210210). Se llevó a cabo la RT-PCR con juegos de cebadores específicos para las cadenas pesada y ligera. Para cada muestra de ARN, se prepararon 12 reacciones de rT-PCR individuales de cadena pesada y 11 de cadena ligera, utilizando mezclas de cebadores directos degenerados que cubrían las secuencias-líder de las regiones variables. Los cebadores inversos se encuentran situados en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. No se introdujeron sitios de restricción en los cebadores.
Configuración de reacción: 5x tampón de RT-PCR QIAGEN® OneStep, 5,0 pl, mezcla de dNTP (que contenía 10 mM de cada dNTP), 0,8 pl; juego de cebadores, 0,5 pl; mezcla de enzimas de RT-Pc R QIAGEN® OneStep, 0,8 pl; ARN molde, 2,0 pl; agua libre de ARNasa hasta 20,0 pl; volumen total: 20,0 pl.
Condición de PCR: Transcripción inversa: 50°C, 30 min; activación de PCR inicial: 95°C, 15 min Ciclado: 20 ciclos de 94°C, 25 s; 54°C, 30 s; 72°C, 30 s; Extensión final: 72°C, 10 min
PCR semianidada de segunda ronda: Los productos de RT-PCR procedentes de las reacciones de primera ronda se amplificaron adicionalmente en la PCR de segunda ronda. Se configuraron 12 reacciones de RT-PCR individuales de cadena pesada y 11 de cadena ligera, utilizando juegos de cebadores semianidados específicos para las regiones variables de anticuerpo.
Configuración de reacción: 2x mezcla de PCR, 10 pl; juego de cebadores, 2 pl; producto de PCR de primera ronda, 8 pl; volumen total, 20 pl; informe de clonación de hibridoma de anticuerpo
Condición de PCR: desnaturalización inicial de 5 min a 95°C; 25 ciclos de 95°C durante 25 s, 57°C durante 30 s, 68°C durante 30 s; extensión final: 10 min a 68°C.
Tras finalizar la PCR, se aplicaron las muestras de reacción de PCR a un gel de agarosa para visualizar los fragmentos de ADN. Tras la secuenciación de más de 15 fragmentos de ADN clonados, amplificados mediante RT-PCR anidada, se clonaron varias cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo de ratón y aparentemente eran correctos. La alineación de secuencias de proteína y el análisis de CDR identificó una cadena pesada y una cadena ligera. Tras la alineación con secuencias de marco humano homólogas, la secuencia humanizada resultante para la cadena pesada variable era la siguiente: ver la figura 6 (debido a que los aminoácidos en las posiciones 26, 40 y 55 en la cadena pesada variable y el aminoácido ne la posición 40 en la cadena ligera variable resultan críticos para las propiedades de unión, pueden revertirse al original murino. Los candidatos resultantes se ilustran posteriormente) (Padlan, E. A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28, 489-498.; Harris, L. and Bajorath, J. (1995) Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: Comparison of V gene subgroups. Protein Sci. 4, 306-310.).
Anotación para las secuencias de fragmentos de anticuerpos (SEC ID n° 7-14): en negrita y subrayados se señalan las CDR 1, 2, 3 organizadas cronológicamente; en cursiva se señalan las regiones constantes; las regiones bisagra se subrayan con letras en negrita y la etiqueta de histidina, en letras en negrita y cursiva; la mutación puntual de marco presenta un fondo de letras grises.
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Ejemplo 2
Efecto de anticuerpos anti-ADM seleccionados sobre la bioactividad anti-ADM
El efecto de los anticuerpos de ADM seleccionados sobre la bioactividad de la ADM se sometió a ensayo en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina).
Ensayo de anticuerpos con diana en adrenomedulina humana o de ratón en ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina)
Materiales:
Línea celular: CHO-K1
Receptor: Adrenomedulina (CRLR RAMP3)
Línea celular CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016
Las células CHO-K1 que expresan receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) antes del ensayo en medios sin antibiótico se desprendieron mediante enjuague suave con PBS-EDTA (EDTA 5 mM), se recuperaron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón de ensayo (KRH: KCl 5 mM, MgSO4 1,25 mM, NaCl 124 mM, HEPES 25 mM, glucosa 13,3 mM, KH2PO41,25 mM, CaCh 1.45 mM, BSA 0,5 g/l).
Se representaron curvas de respuesta a dosis en paralelo con los agonistas de referencia (ADMh o ADMm). Ensayo de antagonistas (96 pocillos):
Para el ensayo de antagonistas, se mezclaron 6 pl del agonista de referencia (adrenomedulina humana (5,63 nM) o de ratón (0,67 nM)) con 6 pl de las muestras de ensayo a diferentes diluciones de agonista, o con 6 pl de tampón. Tras la incubación durante 60 min a temperatura ambiente, se añadieron 12 pl de células (2.500 células/pocillo). Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la adición del tampón de lisis, se estimó el porcentaje de DeltaF, según la especificación del fabricante, con el kit HTRF de Cis-Bio International (n° de cat. 62a M2 PEB). Se utilizó ADMh 22-52 como antagonista de referencia.
Ensayo de AMPc-HTRF de anticuerpos
Los anticuerpos anti-ADMh (NT-H, MR-H, CT-H) se sometieron a ensayo para la actividad antagonista en ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) en presencia de ADM 1­ 52 humana 5,63 nM a las concentraciones de anticuerpo finales siguientes: 100pg/ml, 20 pg/ml, 4 pg/ml, 0,8 pg/ml y 0,16 pg/ml.
Los anticuerpos anti-ADMm (NT-M, MR-M y CT-M) se sometieron a ensayo para la actividad antagonista en ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) en presencia de ADM 1-50 de ratón 0,67 nM a las concentraciones de anticuerpo finales siguientes: 100 pg/ml, 20 pg/ml, 4 p/ml, 0,8 pg/ml y 0,16 pg/ml. Datos representados: inhibición relativa vs. concentración de antagonista (ver las figs. 3a a 3l). La inhibición máxima por el anticuerpo individual se proporciona en la tabla 3.
Tabla 3:
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Ejemplo 3
Datos de estabilización de ADMh por el anticuerpo anti-ADM
El efecto estabilizador de la ADM humana por anticuerpos de ADM humana se sometió a ensayo utilizando un inmunoensayo de ADMh.
Inmunoensayo de cuantificación de la adrenomedulina humana
La tecnología utilizada era un inmunoensayo de luminiscencia de tubo recubierto en sándwich, basado en el mareaje con éster de acridinio.
Compuesto marcado (trazador): se mezclaron 100 |jg de CT-H (100 jl) (1 mg/ml en PBS, pH 7,4, AdrenoMed AG, Alemania) con 10 j l de NHS-éster de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (patente n° EP 0353971) y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. CT-H marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). El CT-H purificado se diluyó en (fosfato de potasio 300 mmoles/l, NaCl 100 mmoles/l, Na-EDTA 10 mmoles/l, albúmina de suero bovino 5 g/l, pH 7,0). La concentración final era de aprox. 800.000 unidades lumínicas relativas (ULR) de compuesto marcado (aprox. 20 ng de anticuerpo marcado) por cada 200 jl. Se midió la quimioluminiscencia del éster de acridinio mediante la utilización de un AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Fase sólida: se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con MR-H (AdrenoMed Ag , Alemania) (1,5 jg de MR-H/0,3 ml, NaCl 100 mmoles/l, Tris/HCl 50 mmoles/l, pH 7,8). Tras el bloqueo con albúmina de suero bovino al 5%, los tubos se lavaron con PBS, pH 7,4, y se secaron al vacío.
Calibración:
El ensayo se calibró utilizando diluciones de Hadm (Bachem AG, Suiza) en NaCl 250 mmoles/l, Triton X-100 2 g/l, albúmina de suero bovino 50 g/l, 20 tabs/l de cóctel de inhibidor de proteasas (Roche Diagnostics AG, Suiza). Inmunoensayo de ADMh:
Se pipetearon 50 j l de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, tras añadir CT-H marcado (200 jl); los tubos se incubaron durante 4 h a 4°C. El trazador no unido se eliminó mediante lavado 5 veces (cada vez, 1 ml) con disolución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%).
Se midió la quimioluminiscencia unida a tubo mediante la utilización de LB 953
La figura 4 muestra una curva de dosis de ADMh/señal típica. Y una curva de dosis de ADMh/señal en presencia de 100 jg/ml de anticuerpo NT-H.
NT-H no afectó al inmunoensayo de ADMh descrito.
Estabilidad de la adrenomedulina humana:
Se diluyó ADM humana en plasma citrato humano (concentración final: 10 nM) y se incubó a 24°C. En puntos temporales seleccionados, se detuvo la degradación de la ADMh mediante congelación a -20°C. La incubación se llevó a cabo en ausencia y en presencia de NT-H (100 jg/ml). La ADMh restante se cuantificó mediante la utilización del inmunoensayo de ADMh descrito anteriormente.
La figura 5 muestra la estabilidad de la ADMh en plasma (citrato) humano en ausencia y en presencia de anticuerpo NT-H. La semivida de la ADMh sola era de 7,8 h y en presencia de NT-h, la semivida era de 18,3 h (una estabilidad 2,3 veces más elevada).
Ejemplo 4
Mortalidad de sepsis (tratamiento precoz)
Modelo animal
Para el estudio se utilizaron ratones C57B1/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). La peritonitis se indujo quirúrgicamente bajo anestesia suave de isoflurano. Se realizaron incisiones en el cuadrante superior izquierdo de la cavidad peritoneal (localización normal del ciego). Se expuso el ciego y se realizó una ligadura fuerte en torno al ciego con suturas distales respecto a la inserción del intestino delgado. Se realizó una herida de punción con una aguja de calibre 24 en el ciego y extrajeron pequeñas cantidades de contenido cecal a través de la herida. Se reintrodujo el ciego en la cavidad peritoneal y se cerró el sitio de laparatomía. Finalmente, los animales fueron devueltos a sus jaulas con libre acceso a alimentos y agua. Se administraron 500 j l de disolución salina s.c. como reposición de líquidos.
Aplicación y dosis del compuesto (NT-M, MR-M, CT-M)
Los ratones fueron tratados inmediatamente después de la ligación y punción cecal (CLP) (tratamiento temprano). CLP es la abreviatura de ligación y punción cecal.
Grupos de estudio
Se sometieron a ensayo tres compuestos frente a tratamiento con vehículo y frente a tratamiento con compuesto de control. Cada grupo contenía 5 ratones para la extracción de sangre tras 1 día para la determinación de BUN (ensayo de nitrógeno de urea de suero sanguíneo). Se realizó un seguimiento de diez ratones adicionales en cada grupo durante un periodo de 4 días.
Dosis de tratamiento de grupo (10 pl/g de peso corporal)/Seguimiento:
1 NT-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
2 MR-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
3 CT-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
4 IgG no específica de ratón, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
5 Control - PBS, 10 pl/g de peso corporal supervivencia durante 4 días
Química clínica
Se midieron las concentraciones de nitrógeno en urea sanguínea (BUN) para la función renal en la línea base y el día 1 tras CLP. Se obtuvieron muestras de sangre del seno cavernoso con un capilar bajo anestesia suave con éter. Las mediciones se llevaron a cabo mediante la utilización de un multianalizador Olympus AU 400. La mortalidad a 4 días se proporciona en la tabla 4. Las concentraciones medias de BUN se proporcionan en la tabla 5.
Tabla 4:
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Tabla 5:
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Puede observarse en la tabla 4 que el anticuerpo NT-M redujo la mortalidad considerablemente. Tras 4 días, 70% de los ratones sobrevivió al tratarlos con anticuerpo NT-M. Al tratarlos con anticuerpo MR-M, el 30% de los animales sobrevivió y al tratarlos con anticuerpo CT-M, el 10% de los animales sobrevivió tras 4 días. En contraste con lo anterior, todos los ratones estaban muertos tras 4 días al tratarlos con IgG de ratón no específico. Se obtuvo el mismo resultado en el grupo de control, en que se había administrado PBS (solución salina tamponada con fosfato) en los ratones.
Se utilizó el ensayo de nitrógeno de urea sanguínea o BUN para evaluar la función renal, a fin de ayudar a diagnosticar la enfermedad renal y para monitorizar los pacientes con disfunción o insuficiencia renal aguda o crónica.
Los resultados del ensayo de S-BUN revelaron que el anticuerpo NT-M era el más eficaz en la protección del riñón.
Mortalidad por sepsis (tratamiento tardío)
Modelo animal
Para el estudio se utilizaron ratones C57BI/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). La peritonitis se indujo quirúrgicamente bajo anestesia suave de isoflurano. Se realizaron incisiones en el cuadrante superior izquierdo de la cavidad peritoneal (localización normal del ciego). Se expuso el ciego y se realizó una ligadura fuerte en torno al ciego con suturas distales respecto a la inserción del intestino delgado. Se realizó una herida de punción con una aguja de calibre 24 en el ciego y extrajeron pequeñas cantidades de contenido cecal a través de la herida. Se reintrodujo el ciego en la cavidad peritoneal y se cerró el sitio de laparotomía. Finalmente, los animales fueron devueltos a sus jaulas con libre acceso a alimentos y agua. Se administraron 500 pl de disolución salina s.c. como reposición de líquidos.
Aplicación y dosis del compuesto (FAB2 NT-M)
Se sometió a ensayo FAB2 NT-M frente a: tratamiento con vehículo y frente a tratamiento con compuesto de control. El tratamiento se llevó a cabo tras el desarrollo total de sepsis, 6 horas después de CLP (tratamiento tardío). Cada grupo contenía 4 ratones y se realizó un seguimiento durante un periodo de 4 días.
Dosis de tratamiento de grupo (10 pl/g de peso corporal)/Seguimiento:
Grupos de estudio
1 NT-M, FAB20,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
2 control: IIgG no específica de ratón, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
3 vehículo: - PBS 10 pl/g de peso corporal supervivencia durante 4 días
Tabla 6:
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Puede observarse en la tabla 6 que el anticuerpo FAB2 NT-M redujo la mortalidad considerablemente. Tras 4 días, el 75% de los ratones sobrevivió al tratarlos con anticuerpo FAB2 NT-M. En contraste con lo anterior, todos los ratones estaban muertos tras 4 días al tratarlos con IgG de ratón no específico. Se obtuvo el mismo resultado en el grupo de control, en que se había administrado PBS (solución salina tamponada con fosfato) en los ratones.
Ejemplo 5
Efecto progresivo del anticuerpo anti-ADM en animales CLP sumado al tratamiento antibiótico y estabilización de la circulación con catecolaminas, así como la regulación del equilibrio de líquidos
Modelo animal
En el presente estudio, se utilizaron ratones C57B1/6 (8 a 12 semanas, 22 a 30 g). Se utilizó una sepsis polimicrobiana mediante ligación y punción cecal (CLP) como modelo para el estudio del choque séptico (Albuszies G. et al. Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med 2005;33:2332-8), (Albuszies G, et al: The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock. Intensive Care Med 2007;33:1094-101), (Barth E, et al: Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock. Crit Care Med 2006;34:307-13), (Baumgart K, et al: Effect of SOD-1 over-expression on myocardial function during resuscitated murine septic shock. Intensive Care Med 2009;35:344-9),
(Baumgart K, et al: Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med 2010;38:588-95), (Simkova V, et al: The effect of SOD-1 over-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock. Shock 2008;30:578-84), (Wagner F, et al.: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock, im Druck), (Wagner F, et al: Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma: a prospective, randomized controlled trial. Crit Care 2011, presentado para publicación).
Tras pesarlos, los ratones fueron anestesiados mediante la inyección intraperitoneal de 120 pg/g de quetamina, 1,25 pg/g de midazolam y 0,25 pg/g de fentanilo. Durante el procedimiento quirúrgico, se mantuvo la temperatura corporal a 37-38°C. Se llevó a cabo una sección en la línea abdominal de 1 cm para obtener acceso al ciego. A continuación, se ligó el ciego con sutura de seda 3-0 próximo a la base y se aplicó una única punción con una aguja de calibre 18. Se reintrodujo el ciego y se cerró nuevamente la incisión (sutura 4-0). Para la compensación de la pérdida perioperatoria de líquidos, se inyectaron por vía subcutánea en la dermis dorsal 0,5 ml de disolución de Ringer lactato con 1 pg/g de buprenorfina como analgésico. Para la antibiosis, los ratones recibieron Ceftriaxon 30 pg/g y clindamicina 30 pg/g por vía subcutánea en las extremidades inferiores. Tras la cirugía de CLP, los animales se mantuvieron en un ambiente suficientemente calefactado, con agua y alimentos ad libitum.
Se garantizó la cobertura de las necesidades de líquidos mediante una inyección subcutánea dorsal con 0,5 ml de disolución de Ringer lactato con 4 pg/g de glucosa y buprenorfina 1 pg/g, que se aplicaron en un ciclo de 8 horas, tras anestesia a corto plazo de isoflurano. Además, se mantuvo la antibiosis mediante inyecciones subcutáneas de Ceftriaxon 30 pg/g y clindamicina 30 pg/g en las extremidades inferiores.
Administración de sustancias de ensayo
Tratamiento precoz
Inmediatamente después de la cirugía de CLP y el cierre de la incisión, se aplicó el anticuerpo sustancia de ensayo NT-M a una concentración de 500 pg/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección en la vena del pene a una dosis de 2 mg por kg de peso corporal (volumen de dosis: 88 a 120 pl) (5 animales).
Tratamiento tardío
Tras el desarrollo total de sepsis, 15,5 h después de la cirugía de CLP, los animales fueron anestesiados tal como se ha indicado anteriormente y se aplicó NT-M a una concentración de 500 pg/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección en la vena del pene a una dosis de 2 mg por kg de peso corporal (volumen de dosis: 88 a 120 pl) (3 animales).
El grupo de control (6 animales) recibió una cantidad correspondiente de la disolución de vehículo PBS sin anticuerpo (4 pl/g, 88 a 120 pl) inmediatamente después de la cirugía de CLP.
Grupos de estudio y diseño experimental
Modelo de choque séptico murino bajo monitorización de cuidados intensivos:
se monitorizaron tres grupos con 3, 5 y 6 animales. El grupo 1 (5 animales) recibió el anticuerpo NT-M 15,5 h después de CLP; el grupo 2 recibió el anticuerpo NT-M inmediatamente después de la cirugía de CLP y el grupo 3 recibió una cantidad comparable de PBS (4 pl/g). Incubación de 16 horas post-CLP (para permitir el avance de la sepsis polimicrobiana); el experimento se continuó con la monitorización e intervenciones comparables a un régimen de cuidados médicos intensivos. Por lo tanto, tras pesar los animales, se anestesiaron tal como se indica en la parte de cirugía de CLP (excepto los animales con tratamiento tardío, que se anestesiaron antes del tratamiento). Se mantuvo la temperatura corporal a 37-38°C durante el resto del experimento. Tras una traqueotomía e intubación, se monitorizó la respiración y se apoyó con un ventilador pulmonar para animales de laboratorio Flexivent®, (Emka Technologies, FiO2 0,5, PEEP 10 H2O, VT 8(pl/g, I:E 1:1,5, AF 70-140 según la temperatura).
Se mantuvo la anestesia durante todo el experimento mediante canulación de la vena yugular externa derecha con una infusión continua de quetamina 30 pg/g x h y fentanilo 0,3 pg/g x h. Además, la arteria carótida común derecha se canuló para la monitorización continua del pulso cardíaco y la presión arterial media (PAM). La presión arterial media se mantuvo a PAM>65 mmHg mediante infusión intravenosa (vena yugular) de coloides (80 pl/g x h, Hextend®) y, en caso necesario, noradrenalina disuelta en coloides como vasopresor. Se extrajeron muestras de sangre (120 pl) por la arteria carótida canulada a las 0 y 4 horas para la determinación de la creatinina. Se realizó una punción en la vejiga y se recogió orina mediante un catéter vesicular. El experimento se terminó tras 6 horas o antes en el caso de que no pudiese mantenerse la PAM >65 mmHg (vena yugular) con la administración del vasopresor.
Parámetros medidos
Se midieron y analizaron los parámetros siguientes: consumo total de noradrenalina (pg NA/g), tasa de consumo de noradrenalina (pg NA/g/h), volumen total de orina recogida durante el experimento, concentración de creatinina (pg/ml) al final del experimento y lavado medio de creatinina (pl/min).
Tabla 7:
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Se midió la necesidad de catecolamina tras la administración de IgG de ratón no específica en un total de 6 ratones como grupo de control; anticuerpo NT-murino en un grupo de 5 ratones inmediatamente después de CLP (tratamiento precoz) o anticuerpo NT-murino en un grupo de 3 ratones 15,5 h después de CLP (tratamiento tardío).
La reducción de la necesidad de catecolamina es una medida de la estabilización de la circulación. De esta manera, los datos muestran que el anticuerpo de ADM, especialmente el anticuerpo NT-M, conduce a una considerable estabilización de la circulación y a una reducción considerable de la necesidad de catecolamina. Se obtuvo el efecto estabilizador de la circulación en el tratamiento precoz (inmediatamente después de CLP) y el tratamiento después del desarrollo total de sepsis (tratamiento tardío) (ver la figura 7).
Regulación de equilibrio de líquidos
Un equilibrio más positivo de líquidos tanto precozmente durante la resucitación y acumuladamente durante 4 días se asocia a un riesgo incrementado de mortalidad en el choque séptico. El control del equilibrio de líquidos es de la máxima importante para el curso de la enfermedad en pacientes que presentan sepsis (s. Boyd et al, 2011). El control del equilibrio de líquidos de los pacientes críticamente enfermos sigue constituyendo un reto sustancial en la medicina de cuidados intensivos. Tal como puede observarse en la tabla 8, el tratamiento de los ratones tras CLP (ver los procedimientos experimentales en "Modelo animal") con anticuerpo NT-M condujo a una potenciación del volumen total de orina excretada. La orina excretada era aprox. tres veces superior en los animales tratados con NT-M que en los ratones no tratados. Se obtuvo el efecto positivo del tratamiento en el tratamiento precoz y en el tratamiento tardío. Se mejoró el equilibrio de líquidos en aproximadamente 20% a 30% también en ambos tratamientos, el precoz y el tardío. De esta manera, los datos muestran que la utilización del anticuerpo de ADM, especialmente la utilización del anticuerpo NT- ADM, resulta favorable para la regulación del equilibrio de líquidos en los pacientes (ver la tabla 8 y las figuras 8 y 9).
Tabla 8
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Mejora de la función renal
La combinación de insuficiencia renal aguda y sepsis está asociada a una mortalidad de 70 por ciento en comparación con una mortalidad de 45 por ciento en pacientes con solo insuficiencia renal aguda. (Schrier and Wang, "Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis"; The New England Journal of Medicine; 351:159-69; 2004). La concentración de creatinina y el lavado de creatinina son parámetros de laboratorio estándares para la monitorización de la (dis)función renal (Jacob, "Acute Renal Failure", Indian J. Anaesth.; 47 (5): 367-372; 2003). Los datos de creatinina y lavado de creatinina del experimento animal anteriormente descrito (tratamiento precoz) se proporcionan en la tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000050_0002
En comparación con los animales sépticos de control, se redujo la concentración de creatinina en 42% y se mejoró el lavado de la creatinina en más de 100% como resultado del tratamiento de NT-M (tabla 9). Los datos muestran que la administración de ADM-anticuerpo, especialmente de NT-M, conducen a una mejora de la función renal.
Mejora del estado de inflamación hepática
Se homogeneizó el tejido hepático de animales de control y tratados precozmente y se lisó en tampón de lisis. Para la preparación de extracto celular, las células se resuspendieron, se lisaron sobre hielo y se centrifugaron. El sobrenadante (extracto de proteínas) se almacenó a -80°C. Se determinó la activación del intensificador génico de factor nuclear de las cadenas ligeras kappa en células B (NF-kB) tal como se ha descrito anteriormente, utilizando un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)l,2. Se incubaron extractos celulares (10 |jg) sobre hielo con ácido poli-doxi-inosínico-desoxi-citidílico (poli-dl-dC) y oligonucleótido de doble cadena marcado con 32P (Biomers, Ulm, Alemania) que contenía NF-kB (HIV KBsite) (5'-GGATCCTCAACAGAGGGGACtTt CCGAGGCCA-3'). Se separaron los complejos en geles de poliacrilamida nativos, se secaron y se expusieron a películas radiográficas. Se utilizó un Phosphorimager y software de análisis de imágenes (analizador de imágenes AIDA, Raytest) para cuantificar NF-kB marcado radioactivamente mediante densitometría. Para la comparación entre geles individuales, se relacionó la intensidad de cada banda con la de animales de control cargados simultáneamente que no habían sido sometidos a cirugía y CLP. Por lo tanto, los datos de EMSA se expresan como factor de incremento respecto a los valores de control. Estadísticas: todos los datos se presentan como medianas (intervalos), a menos que se indique lo contrario; se analizaron las diferencias entre los dos grupos con el ensayo de suma de rangos de MannWhitney para muestras no emparejadas. Resultados: Los animales tratados con NT-M presentaban una activación de NF-kB en el tejido hepático significativamente atenuada (2,27 (1,97-2,53)) en comparación con los animales administrados vehículo (2,92 (2,50-3,81)) (p<0,001) (ver la figura 10).
Referencias:
1. Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35(4):396-402
2. Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest traumainduced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71(6):1659-67
Ejemplo 6
Determinación de efectos secundarios in vivo del anticuerpo NT-M
Para el estudio se utilizaron ratones C57B1/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). Se trataron 6 ratones con una dosis (10 jl/g de peso corporal) de NT-M, 0,2 mg/ml. Como control, se trataron 6 ratones con PBS (10 jl/g de peso corporal). Se monitorizó durante 14 días la supervivencia y condición física. La mortalidad era 0 en ambos grupos; no se observaron diferencias de condición física entre el grupo de NT-M y el grupo de control.
Ejemplo 7
Nefrotoxicidad inducida por gentamicina
Se ha establecido un modelo de lesión renal aguda no séptica, que utiliza la nefrotoxicidad inducida con gentamicina (Chiu PJS. Models used to assess renal functions. Drug Develop Res 32:247-255, 1994.). Se utilizó este modelo para evaluar si el tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina podía mejorar la función renal. El experimento se llevó a cabo de la manera siguiente:
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0004
Se utilizaron grupos de 8 ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250 ± 20 g. Los animales fueron retados con gentamicina a razón de 120 mg/kg i.m. durante siete días consecutivos (grupos 1 y 2). Se inyectó por vía intravenosa compuesto de ensayo (anticuerpo antiadrenomedulina NT-M) y vehículo (solución salina tamponada con fosfato) 5 min antes de la gentamicina el día 0, seguido de la inyección los días 2, 4 y 6. Se monitorizaron diariamente los pesos corporales y los signos clínicos. Se llevaron a cabo recolecciones de orina de veinticuatro horas (24) los días 0, 2 y 6. Los especímenes de orina se sometieron a ensayo para concentraciones de Na+, K+ y creatinina. Se recolectaron muestras de sangre para la química clínica los días 1 (antes de la gentamicina), 3 (antes de la gentamicina) y 7. Los analitos primarios que se monitorizaron para evaluar la función renal fueron los electrolitos séricos (Na+ y K+), la creatinina y BUN. Se recolectaron muestras de plasma en tubos con EDTA (días 1 y 3: 100 jl; día 7: 120 jl). Se calculó el lavado de creatinina. El volumen de orina, electrolitos urinarios y creatinina se expresó como cantidad excretada por cada 100 g de peso corporal de animal. Todos los animales fueron sacrificados el día 7. Se pesaron los riñones.
Recolección de orina. Los animales se introdujeron en jaulas individuales en donde se recolectó la orina durante 24 h los días 0, 2 y 6. Se midió el volumen de orina, y el nivel urinario de Na+, K+ y creatinina.
Se calculó el lavado de creatinina endógena de la manera siguiente:
Figure imgf000052_0003
la excreción urinaria durante 24 h de sodio (Na+) se calculó de la manera siguiente:
Figure imgf000052_0002
se calculó de manera similar la excreción urinaria durante 24 h de NAG y NGAL
La excreción fraccional de Na+ (FENa) o el porcentaje del sodio filtrado que se excreta en la orina final es una medida de la función de reabsorción tubular del Na+. Se calculó de la manera siguiente:
Figure imgf000052_0001
El tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina mejoró varias medidas de la función renal el día 7 en comparación con vehículo: creatinina sérica, 1,01 mg/dL (NT-M) vs 1,55mg/dL (vehículo) (figura 11), BUN 32,08 mg/dl (NT-M) vs. 52,41 mg/dl (vehículo) (figura 12), el lavado de creatinina endógena, 934,43 ml/24 h (NT-M) vs. 613,34 ml/24 h (vehículo) (figura 13), secreción fraccional de Na+, 0,98 % (NT-M) vs. 1,75 % (vehículo) (figura 14).
Ejemplo 8
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre varios parámetros de la función renal.
NT-M causó una diuresis y lavado de creatinina tres y dos veces más altas, respectivamente, resultando en última instancia en concentraciones en sangre más bajas de creatinina, urea y NGAL al final del experimento (ver la tabla 10). Además, las concentraciones de quimiocina derivada de queratinocitos (KC) en el riñón se redujeron significativamente mediante el tratamiento con NT-M (figura 15).
Tabla 10: Parámetros de función renal en animales tratados con vehículo (n=11) y con NT-M (n=9). Se midieron las concentraciones en sangre en muestras obtenidas al final del experimento. NGAL=lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo Todos los datos eran medianas (cuartiles)
Figure imgf000052_0005
Los experimentos se llevaron a cabo de la manera siguiente:
Creatinina, urea y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo (NGAL)
Se midieron las concentraciones de NGAL en sangre utilizando un ELIA comercial (NGAL de ratón, RUO 042, BioPorto Diagnostics A/S, Dinamarca, Gentofte). Se midieron las concentraciones de urea y creatinina con una columna capilar (Optima-5MS, Macherey-Nagel, Düren, Alemania), sistema de cromatografía de gases/espectrometría de masas (Agilent 5890/5970, Boblingen, Alemania) utilizando 2H3-creatinina (CDN isotopes, Pointe-Claire, QU, Canadá) y metil-urea (FlukaChemikalien, Buchs, Suiza) como estándares internos. Tras la desproteinización con acetonitrilo, centrifugación y evaporación a sequedad, se reconstituyó el sobrenadante en ácido fórmico y se extrajo por una columna de intercambio aniónico débil (WCX, Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). El acetonitrilo más N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida y N-(terc-butildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamida permitieron la formación de los derivados terc-butil-dimetilsililo y creatinín-trimetilsililo de urea, respectivamente. Se monitorizaron los iones m/z 231 y 245, y m/z 329 y 332 para los analitos urea y creatinina y los estándares internos, respectivamente. A partir de la producción de orina y las concentraciones plasmática y urinaria de creatinina, se calculó el lavado de creatinina utilizando la fórmula estándar.
Preparación de muestras
Los riñones, almacenados a -80°C, se fragmentaron con un homogeneizador en PBS y se lisaron con un tampón concentrado 2 veces para obtener un lisado de células completas (Tris 100 mM, pH 7,6; NaCl 500 mM; EDTA 6 mM; EGTA 6 mM; Triton-X-100 al 1%; NP 40 al 0,5%; glicerol al 10%; inhibidores de proteasas (p-glicerolfosfato 2 mM; DTT 4 mM; leupeptina 20 pM; ortovanadato de sodio 0,2 mM)) y posteriormente se centrifugaron. Se obtuvo el lisado de células completas a partir del sobrenadante; el pellet que consistía en residuos celulares se descartó. Se determinó la cantidad de proteína fotométricamente utilizando un ensayo de proteínas disponible comercialmente (Bio-Rad, Hercules, CA) y los especímenes se ajustaron de manera que la concentración final de proteína fuese de 4 pg/pl. Las muestras para el análisis Multiplex y EMSA se diluyeron 1:1 con tampón EMSA (Hepes 10 mM; KCl 50 mM; glicerol al 10%; EDTA 0,1 mM; DtT 1 mM), las muestras con inmunotransferencias 1:1 con tampón para muestras, 2 veces (SDS al 2%, Tris-HCl 125 mM (pH 6,8 a 25°C); glicerol al 10%; DTT 50 mM; azul de bromofenol al 0,01%).
Se determinaron los niveles de quimiocina derivados de queratinocitos (KC) utilizando un kit de citocinas multiplex de ratón (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), el ensayo se llevó a cabo mediante la utilización del sistema de matriz por suspensión Bio-plex siguiendo las instrucciones del fabricante (ver también Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667). Brevemente, se añadieron los estándares y muestras de citocinas apropiados a una placa de filtración. Las muestras se incubaron con anticuerpos unidos químicamente a microperlas marcadas fluorescentemente. Después, se añadieron a cada pocillo anticuerpos de detección premezclados y posteriormente se añadió estreptavidina-ficoeritrina. A continuación, las perlas se suspendieron y la mezcla de reacción de citocinas se cuantificó utilizando el lector de matrices de proteínas Bio-Plex. Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Los niveles inferiores al límite de detección de los ensayos se fijaron en cero con fines estadísticos.
Ejemplo 9
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre el hígado.
NT-M causó una reducción significativa de las concentraciones de quimiocinas (KC) derivadas de queratinocitos en el hígado (figura 16).
La medición de quimiocinas derivadas de queratinocitos (KC) se llevó a cabo análogamente al ejemplo 8 (riñón).
Ejemplo 10
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con el anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre varias citocinas y quimioquinesina en la circulación sanguínea (plasma).
Concentraciones de citocina y de quimiocina
Se determinaron los niveles plasmáticos de factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interleucina (IL)-6, proteína quimioatrayante de monocitos (MCP)-1 y de quimiocinas derivadas de queratinocitos (KC) utilizando un kit de citocinas multiplex de ratón (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), el ensayo se llevó a cabo mediante la utilización del sistema de matriz por suspensión Bio-plex siguiendo las instrucciones del fabricante (ver también Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl mW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667). Brevemente, se añadieron los estándares y muestras de citocinas apropiados a una placa de filtración. Las muestras se incubaron con anticuerpos unidos químicamente a microperlas marcadas fluorescentemente. Después, se añadieron a cada pocillo anticuerpos de detección premezclados y posteriormente se añadió estreptavidina-ficoeritrina. A continuación, las perlas se suspendieron y la mezcla de reacción de citocinas se cuantificó utilizando el lector de matrices de proteínas Bio-Plex. Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Los niveles inferiores al límite de detección de los ensayos se fijaron en cero con fines estadísticos.
Los niveles plasmáticos y concentraciones en tejido renal de factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interleucina (IL)-6 e IL-10, proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-1 y quimiocinas derivadas de queratinocitos (KC) se determinaron utilizando un "kit de citocinas multiplex" disponible comercialmente (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro Precision Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), que permite recoger varios parámetros de una sola muestra. Las etapas de trabajo individuales se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante (ver también Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667).
Brevemente, se añadieron microesferas marcadas con fluorescencia ("perlas") a una placa de 96 pocillos, seguido de dos etapas de lavado, la adición de estándares internas y la adición de muestras de homogenado de plasma y riñón. Durante la posterior incubación, las citocinas individuales se unieron a los anticuerpos fijados a las perlas de poliestireno. Tras la adición de los anticuerpos marcados con biotina específicos de citocina, que eran para la detección de las citocinas individuales, y un tiempo de incubación adicional, posteriormente se añadió estreptavidina marcada con ficoeritrina. Tras un tiempo de incubación adicional, seguidamente las perlas se resuspendieron y las placas pudieron medirse con un citómetro de flujo específico (sistema de matriz por suspensión Bio-Plex, Bio-Rad, Hercules, CA). Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Para los niveles en plasma, la concentración se proporciona en pg *m l-1; la concentración de los homogenados de riñón se convirtió en la concentración de proteína apropiada y se proporciona en pg * mg-1 de proteína.
NT-M causó una reducción significativa de las concentraciones plasmáticas de IL-6 (figura 17), IL-10 (figura 18), quimiocina derivada de queratinocitos (KC) (figura 19), proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (figura 20) y TNF-alfa (figura 21).
Ejemplo 11
Lesión renal aguda inducida por isquemia/reperfusión
Se ha establecido otro modelo de lesión renal aguda no séptica en el que se induce una lesión renal aguda mediante isquemia/reperfusión (Nakamoto M, Shapiro JI, Shanley PF, Chan L y Schrier RW. In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure. J ClinInvest 80:698-705, 1987., Chintala MS, Bernardino V y Chiu PJS. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemiareperfusion in anesthetized rats. J Pharmacol. Exp. Ther. 271:1203-1208, 1994). Se utilizó este modelo para evaluar si el tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina podía mejorar la función renal.
El experimento se llevó a cabo de la manera siguiente:
Effecto de un NT-M sobre la lesión renal aguda inducida por isquemia/reperfusión en ratas
Diseño del estudio:
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Observaciones clínicas: diariamente antes de la cirugía, después de la cirugía y durante el tratamiento.
Se utilizaron grupos de 8 ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250 a 280 g. Los animales se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y recibieron una dieta estándar con agua destilada ad libitum. Los animales recibieron suplementos de líquidos (NaCl al 0,9% y dextrosa al 5%/1:1 10 ml/kg p.o.). 30 min antes de la cirugía (día 0). Las ratas se anestesiaron con pentobarbital (50 mg/kg i.p.). Se expuso la cavidad abdominal mediante una incisión en la línea media, seguido de la administración intravenosa de heparina (100 U/kg, i.v.) y se ocluyeron ambas arterias renales durante 45 min mediante la utilización de pinzas vasculares. Inmediatamente después de la retirada de las pinzas renales, se observaron los riñones durante 1 min adicional para garantizar el cambio de color, indicando la reperfusión sanguínea. El compuesto de ensayo (NT-M) y el vehículo (solución salina tamponada con fosfato) se inyectaron por vía intravenosa 5 min antes de la reperfusión, seguido de la inyección diaria los días 1 y 2.
Recolección de orina. Se inició la recolección de orina de 24 h sobre hielo a las 24 h antes de la isquemia/reperfusión el día -1 (-24 h a 0 h) y el día 0 (0-24 h), el día 1 (24-48 h) y el día 2 (48-72 h) después de la reperfusión. Recolección de sangre: Se recolectaron 0,4 ml de sangre por la vena de la cola en tubos con EDTA a 0 h (antes de la cirugía I RI), 24 h (antes de vehículo o TA), 48 h (antes de vehículo o TA) y 72 h, para la determinación de la creatinina/Na+/K+ plasmática y BUN; se recolectaron 2 ml de sangre por la vena cava terminalmente.
Se introdujeron los animales en jaulas individuales en las que se recolectó la orina durante 24 h -1 (-24 h-0 h), el día 0 (0-24 h), el día 1 (24-48 h) y el día 2 (48-72 h) después de la reperfusión el día 0. Se midió el volumen de orina, y el nivel urinario de Na+, K+ y creatinina.
Se calculó el lavado de creatinina (LCr) de la manera siguiente:
CCr (ml/24 h) = [UCr (rag/ml) x V (ml/24 h)] / PCr (mg/ml)
Se calculó la excreción urinaria de 24 h de sodio (Na+) de la manera siguiente:
UNaV (q£q/24 h) - UNa (qEq/ml) x V (ml/24 h)
La excreción fraccional de Na+ (FENa) o el porcentaje del sodio filtrado que se excreta en la orina final es una medida de la función de reabsorción tubular del Na+. Se calculó de la manera siguiente:
FENa (%) -300 x [UNa (qEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (qEq/ml) X CCr (ml/24 h) El tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina mejoró varias medidas de la función renal:
el nitrógeno de urea en sangre (BUN) mostró un fuerte incremento en el grupo de vehículo (0 h: 17,49 mg/dl, 24 h: 98,85 mg/dl, 48 h: 109,84 mg/dl, 72 h: 91,88 mg/dl), que era menos pronunciado con el tratamiento de NT-M (0 h: 16,33 mg/dl, 24 h: 84,2 mg/dl, 48 h: 82,61 mg/dl, 72 h: 64,54 mg/dl) (figura 22).
La creatinina sérica se desarrolló de manera similar: Grupo de vehículo (0 h: 0,61 mg/dl, 24 h: 3,3 mg/dl, 48 h: 3,16 mg/dl, 72 h: 2,31 mg/dl), grupo de NT-M: (0 h: 0,59 mg/dl, 24 h: 2,96 mg/dl, 48 h: 2,31 mg/dl, 72 h: 1,8 mg/dl) (figura 23).
El lavado de creatinina endógena cayó drásticamente el día uno y posteriormente mejoró en mayor medida en el grupo de NT-M que en el grupo de vehículo. Grupo de vehículo: (0 h: 65,17 ml/h, 24 h: 3,5 ml/h, 48 h: 12,61 ml/h, 72 h: 20,88 ml/h), grupo de NT-M (0 h): 70,11 ml/h, 24 h: 5,84 ml/h, 48 h: 21,23 ml/h, 72 h: 26,61 ml/h) (figura 24).
Descripción de las figuras
Figura 1a: Ilustración de formatos de anticuerpo: variantes de Fv y de scFv
Figura 1b: Ilustración de formatos de anticuerpo: fusiones heterólogas y anticuerpos bifuncionales Figura 1c: Ilustración de formatos de anticuerpo: anticuerpos bivalentes y anticuerpos biespecíficos Figura 2:
ADMh 1-52 (SEC ID n° 21)
ADMh 1-50 (SEC ID n° 22)
aa 1-21 de la ADM humana (SEC ID n° 23)
aa 1-42 de la ADM humana (SEC ID n° 24)
aa 43-52 de la ADM humana (SEC ID n° 25)
aa 1-14 de la ADM humana (SeC ID n° 26)
aa 1-10 de la ADM humana (SEC ID n° 27)
aa 1-6 de la ADM humana (SeC ID n° 28)
aa 1-32 de la ADM humana madura (SEC ID n° 29)
aa 1-40 de la ADM murina madura (SeC ID n° 30)
aa 1-31 de la ADM murina madura (SEC ID n° 31)
Figura 3:
a: curva de respuesta a dosis de la ADM humana. La estimulación máxima de AMPc se ajustó a una activación de 100%.
b: curva de dosis/inhibición de la ADM 22-52 humana (antagonista de receptor de ADM) en presencia de ADMh 5,63 nM.
c: curva de dosis/inhibición de CT-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
d: curva de dosis/inhibición de CT-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
e: curva de dosis/inhibición de CT-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
f: curva de respuesta a dosis de la ADM de ratón. La estimulación máxima de AMPc se ajustó a una activación de 100%.
g: curva de dosis/inhibición de la ADM 22-52 humana (antagonista de receptor de ADM) en presencia de ADMm 0,67 nM.
h: curva de dosis/inhibición de CT-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
i: curva de dosis/inhibición de MR-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
j: curva de dosis/inhibición de NT-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
K: muestra la inhibición de ADM por F(ab)2 NT-M y por Fab NT-M.
l: muestra la inhibición de ADM por F(ab)2 NT-M y por Fab NT-M.
Figura 4: la presente figura muestra una curva de dosis de ADMh/señal típica. Y una curva de dosis de ADMh/señal en presencia de 100 pg/ml de anticuerpo NT-H.
Figura 5: la presente figura muestra la estabilidad de la ADMh en plasma humano (citrato) en ausencia y en presencia de anticuerpo NT-H.
Figura 6: alineación de Fab con las secuencias de marco humanas homólogas.
Figura 7: la presente figura muestra las necesidades de noradrenalina para el tratamiento precoz y tardío con NT-M.
Figura 8: la presente figura muestra la producción de orina tras el tratamiento precoz y tardío con NT-M. Figura 9: la presente figura muestra el equilibrio de líquidos tras el tratamiento precoz y tardío con NT-M. Figura 10: Activación en tejido hepático del intensificador génico de cadena ligera kappa de factor nuclear en células B (NF-kB) analizada mediante ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). # indica p<0,001 vs. vehículo.
Figura 11: desarrollo de creatinina sérica con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 12: desarrollo de nitrógeno de urea en sangre (NUS) con el tiempo. Se muestran medias /- SEM Figura 13: desarrollo de lavado de creatinina endógena con el tiempo. Se muestran medias /- SEM Figura 14: desarrollo de secreción fraccional de Na+ con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 15: niveles de quimiocina (QC) derivada de queratinocitos determinados en relación a las proteínas renales totales extraídas. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 16: niveles de quimiocina (QC) derivada de queratinocitos determinados en relación a las proteínas hepáticas totales extraídas. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 17: niveles plasmáticos de IL-6. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 18: niveles plasmáticos de IL-10. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 19: niveles plasmáticos de quimiocinas (QC) derivadas de queratinocitos. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 20: niveles plasmáticos de proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1). El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 21: niveles plasmáticos de TNF-alfa. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M. Figura 22: desarrollo de nitrógeno de urea en sangre (NUS) con el tiempo. Se muestran medias /- SEM Figura 23: desarrollo de creatinina sérica con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 24: desarrollo de lavado de creatinina endógena con el tiempo. Se muestran medias /- SEM

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos y en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura:
    YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
    (SEC ID n° 23).
    2. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la reivindicación 1, en el que dicho paciente es un paciente que necesita regular el equilibrio de líquidos.
    3. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para prevenir o reducir un edema en dicho paciente.
    4. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig es monoespecífico.
    5. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además por que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje presenta una afinidad de unión a ADM de por lo menos 10-7 M, en el que dicha afinidad de unión se determina según el ejemplo 1.
    6. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje no es la proteína-1 de unión a ADM, factor H de complemento.
    7. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje reconoce y se une a un epítopo que contiene el aminoácido 1 del extremo N-terminal de la ADM humana madura y en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje no se uniría a adrenomedulina con extensión N-terminal ni con modificación N-terminal ni a adrenomedulina con degradación N-terminal.
    8. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje es un anticuerpo estabilizador de ADM o fragmento de anticuerpo estabilizador de ADM o andamiaje no Ig estabilizador de ADM que aumenta la semivida, semitiempo de retención t-i/2 , de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
    9. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de la ADM circulante no más de 80%, preferentemente no más de 50%, en el que la bioactividad de la ADM se determina en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humano según el ejemplo 2.
    10. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho paciente sufre de una enfermedad que se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardíaca, choque y disfunción renal.
    11. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento que se une a la ADM, en el que la cadena pesada comprende las secuencias:
    SEC ID n° 1
    GYTFSRYW SEC ID n° 2
    ILPGSGST SEC ID n° 3
    TEGYEYDGFDY,
    y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
    SEC ID n° 4
    QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
    RVS SEC ID n° 6
    FQGSHIPYT.
    12. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico humano o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la reivindicación 11, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
    SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
    QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL PGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGF DYWGQGTTLTVSS ASTKGPS VFPLAP S SKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKRVEPKHHHHHH
    SEC ID n° 8 (AM-VH1)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRI LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKHHHHHH
    SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRI LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKHHHHHH
    SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEI LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKHHHHHH
    SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEI LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKHHHHHH
    SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
    DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRJFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
    GN SQES VTEQDSKD S T YS LS S TLTLSKAD YEKHKV Y ACEVTHQGL S SP VTKSF NRGEC
    SEC ID n° 13 (AM-VL1)
    DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIY RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTFIQGLSSPVTKS FNRGEC
    SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
    DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSrVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIY
    RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC.
    13. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje es un anticuerpo modulador o fragmento modulador o andamiaje modulador que aumenta la semivida, semitiempo de retención t-i/2 , de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM no más de 80%, preferentemente no más de 50%, cuando la bioactividad de la ADM se determina en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humano según el ejemplo 2.
    14. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además por que dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig no se une a la parte C-terminal de ADM, siendo ésta aa 43-52 de la ADM:
    PRSKISPQGY-NH2
    (SEC ID n° 25).
    15. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para ser utilizado en combinación con catecolamina y/o líquidos que se administran por vía intravenosa.
    16. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o combinación para la utilización según la reivindicación 15 para su utilización en combinación con una proteína de unión a ADM y/o unos principios activos adicionales.
    17. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha terapia no es un método de tratamiento primario para dicha enfermedad aguda o afección aguda.
    18. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos.
    19. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la reivindicación 18, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
    20. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la reivindicación 19, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
    21. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a la adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la que dicha formulación farmacéutica es para ser administrada a un paciente que sufre de desequilibrio de líquidos con la condición de que dicho paciente necesite regular el equilibrio de líquidos.
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