JP6193872B2 - 慢性又は急性疾患に罹患している患者の体液平衡を調整するための抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場 - Google Patents
慢性又は急性疾患に罹患している患者の体液平衡を調整するための抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場 Download PDFInfo
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Description
本発明の文脈の中での「体液平衡の調整」という表現は、慢性若しくは急性基礎疾患又は急性基礎病態に起因する患者の体液平衡の明白な−平衡障害−のあらゆる矯正に向けられる。前述の矯正は、前述の患者における正常血圧の回復の利益になる。当業者は、一般に、血圧、並びに高血圧及び低血圧が患者の体液平衡と密接に関連していることを十分に認識している。体液平衡とは、代謝過程が機能できるようにする体内への体液の流入量と排出量の平衡である。脱水状態は、体液喪失の結果としての1%以上の体重減少と規定される。体液平衡と水分補給状態を評価するための3つの要素は:臨床的評価、つまり、体重と尿排出量;体液平衡チャートの検討及び血液化学の検討である。当業者にとって、このすべてが十分に周知である(Alison Shepherd, Nursing Tomes 19.07.11/Vol 107 No 28, p 12-16)。
1)以下の症状の少なくとも2つを特徴とする宿主全身性炎症反応(SIRS)
・患者は低血圧を呈する(平均動脈圧が<65mmHg)
・>4mmol/Lになる高い血清乳酸レベル
・血糖>7.7mmol/L(糖尿病の不存在において)
・中心静脈圧が8〜12mmHgの範囲内にない
・尿排出量が<0.5mLxkg-1x時間-1である
・中心静脈(上大静脈)酸素飽和が<70%又は混合静脈で<65%である
・心拍数が>90拍動/分である。
・体温<36℃又は>38℃
・呼吸数>20/分
・白血球数<4又は>12x109/L(白血球);>10%の未熟好中球
1)で触れた症状の少なくとも2つに続いて、更に新たな感染の臨床的な疑いが見られる:
・咳/痰/胸痛
・腹痛/膨満/下痢
・血流感染(line infection)
・心内膜炎
・排尿障害
・頚部硬直に伴う頭痛
・蜂巣炎/損傷/関節感染
・いずれかの感染に関して陽性の微生物学
敗血症が患者に現れていることを条件に、更にいずれかの臓器機能障害の臨床的な疑いが見られる:
・最高血圧<90/平均;<65mmHG
・ラクタート>2mmol/L
・ビリルビン>34μmol/L
・尿排出量2時間で<0.5mL/kg/h
・クレアチニン>177μmol/L
・血小板<100x109/L
・O2が与えられた場合を除いてSpO2>90%
3)で触れたような末端臓器機能障害のうちの少なくとも1つの兆候が現れている。治療に応答しない、静脈内輸液投与だけでは低血圧から患者の血圧を維持するのに不十分である難治性の低血圧が存在するのであれば、敗血症性ショックが示され、本発明による抗ADM抗体、抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場の投与もまた提供する。
重症敗血症は、前述の患者に敗血症が現れており、さらに、以下のいずれかの臓器機能障害に関する臨床的な疑いが存在していることを特徴とする:
・最高血圧<90/平均;<65mmHG
・乳酸>2mmol/L
・ビリルビン>34μmol/L
・尿排出量2時間で<0.5mL/kg/h
・クレアチニン>177μmol/L
・血小板<100x109/L
・O2が与えられた場合を除いてSpO2>90%
例えば、ICU内の状況にある、急性期病院の状況おいて、一般的に体液平衡は、これが患者の実際の水分補給状態に対する特定の情報、ひいては、腎臓及び心血管機能に関する特定の情報を提供するので、臨床スタッフによって慎重に観察される。
配列番号:24
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
本発明の特定の一実施形態において、抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、アドレノメデュリンに結合する抗ADM抗体フラグメント又はアドレノメデュリンに結合する抗ADM非Ig足場は、患者の急性疾患又は急性病態の治療法に使用するために提供され、前述の抗体、フラグメント又は足場が、成熟ヒトADMのaa1−21の配列中の好ましくは少なくとも4個又は少なくとも5個のアミノ酸から成る領域に結合することを特徴とする:
配列番号:23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
本発明の好ましい実施形態において、前述の抗ADM抗体、抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンのN末端部(aa1−21)に位置している、好ましくは少なくとも4個又は少なくとも5個のアミノ酸から成るADMの領域に結合する(図2を参照のこと)。
PRSKISPQGY−NH2
(配列番号:25)
−ADMは、ADM安定化抗体、それぞれアドレノメデュリン安定化抗体フラグメント又はアドレノメデュリン安定化非Ig足場の不存在及び存在下、ヒトクエン酸血漿中に希釈され、そして、24℃にてインキュベートされ、
−選択された時点(例えば、24時間以内)でアリコートが採取され、そして、ADMの分解は、−20℃にて冷凍することによって、前述のアリコート中で止められ、
−選択されたアッセイが安定化抗体によって影響を受けないのであれば、ADMの量が、hADM免疫学的アッセイによってそのまま測定されるか、あるいは、アリコートは、(HClのような)変性剤で処理されてもよくて、(例えば、遠心分離による)サンプルのクリーニング後に、pHが中和されることができ、そして、ADM免疫学的アッセイによってADMが定量化されるか、あるいは、非免疫学的アッセイ技術(例えば、rpHPLC)がADM定量化のために使用でき、
−ADMの半減期が、それぞれADM安定化抗体、アドレノメデュリン安定化抗体フラグメント又はアドレノメデュリン安定化非Ig足場の不存在及び存在下でインキュベートされたADMに関して計算され、
−ADM安定化抗体、アドレノメデュリン安定化抗体フラグメント又はアドレノメデュリン安定化非Ig足場の不存在でインキュベートされたADMと比較して、安定化ADMに関して向上した半減期が計算される。
−ADMに結合する単数若しくは複数の分子であって、そしてそれは、CRLR(カルシトニン受容体様受容体)及びRAMP3(受容体活性修飾タンパク質3)から構成された機能性ヒト遺伝子組み換えADM受容体を発現する真核細胞株の培養物に添加したとき、並行して添加したヒト合成ADMペプチドの作用を通じて細胞株によって産生されるcAMPの量を低減する分子であって、前述の添加したヒト合成ADMが、分析すべき中和抗体の不存在下におけるcAMP合成の半値最大刺激をもたらす量で添加されることを特徴とし、分析すべきADMに結合する(単数若しくは複数の)非中和分子が、分析すべき中和抗体を用いて得られるcAMP合成の最大低減を得るのに必要である量より10倍多い量で加えられたときであっても、ADMに結合する(単数若しくは複数の)前述の分子によるcAMPの低減が、80%以下の程度までしか起こらないことを特徴とする。
−用量反応曲線が、ADMを用いて前述のヒト組換型アドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで作成される。
−半最大(half-maximal)cAMP刺激のADM濃度が計算され得る。
−一定の半最大cAMPを刺激ADM濃度にて、用量反応曲線(最大100μg/mlの終濃度)が、それぞれADM安定化抗体、アドレノメデュリン安定化抗体フラグメント又はアドレノメデュリン安定化非Ig足場によって作成される。
配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
及び/又は
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含む抗体重鎖(H鎖)を含んで成り、及び/又は以下の抗体軽鎖(L鎖):
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
及び/又は
配列番号:6
FQGSHIPYT
をさらに含んで成ることを特徴とする。
配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成る群から選択された少なくとも1つのCDRを含むことを特徴とし、且つ、その軽鎖が、以下の:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る群から選択された少なくとも1つのCDRを含むことを特徴とする。
配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成ることを特徴とし、且つ、その軽鎖が、以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成ることを特徴とする。
配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成り、且つ、前記軽鎖が以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載のADM抗体又はアドレノメデュリン抗体フラグメント。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成り、且つ、前記軽鎖が以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載のADM抗体又はアドレノメデュリン抗体フラグメント。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
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配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
の少なくとも1つを含んで成り、及び/又は前記軽鎖が以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
の少なくとも1つを含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載のADM抗体又はアドレノメデュリン抗体フラグメント。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
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配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成り、且つ、前記軽鎖が以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載のADM抗体又はアドレノメデュリン抗体フラグメント。
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配列番号:1
GYTFSRYW
配列番号:2
ILPGSGST
配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成り、且つ、前記軽鎖が以下の配列:
配列番号:4
QSIVYSNGNTY
配列番号:5
RVS
配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載のADM抗体又はアドレノメデュリン抗体フラグメント。
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抗体の作製とそれらの親和定数の測定
いくつかのヒト及びマウスの抗体を作り出し、そして、それらの親和定数を測定した(表1及び2を参照のこと)。
そのペプチドのウシ血清アルブミン(BSA)へのコンジュゲーションのための(選択されたADM配列内にシステインが存在していなければ)追加のN末端システイン残基を伴う、免疫化のためのペプチドを合成した、表1を参照のこと、(JPT Technologies, Berlin, Germany)。そのペプチドを、Sulfolinkカップリングゲル(Perbio-science, Bonn, Germany)を使用することによってBSAに共有結合により連結した。カップリング手順を、Perbioのマニュアルに従って実施した。
Balb/cマウスを、0日目と14日目に100μgのペプチド−BSA−コンジュゲート(100μlの完全フロイントアジュバント中に乳化させた)を用いて、そして、21日目と28日目に(100μlの不完全フロイントアジュバンド中の)50μgを用いて免疫した。融合実験を実施する3日前に、動物に、1回の腹腔内注射及び1回の静脈内注射として投与される、100μlの生理食塩水中に溶解した50μgの前記コンジュゲートを与えた。
抗体を、標準的な抗体製造法(Marx et al, Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997)によって作製し、そして、プロテインAを介して精製した。抗体純度は、SDSゲル電気泳動分析に基づき、>95%であった。
ヒト抗体を、以下の手順に従ってファージディスプレイによって作製した:
投薬を受けていないヒト抗体遺伝子ライブラリHAL7/8を、アドレノメデュリンペプチドに対する、遺伝子組み換え一本鎖F可変ドメイン(scFv)の分離に使用する。抗体遺伝子ライブラリーを、2個の異なったスペーサーを介してアドレノメデュリンペプチド配列に連結されたビオチンタグを含むペプチドの使用を含むパンニングストラテジーを用いてスクリーニングした。非特異性結合抗原とストレプトアビジン結合抗原とを使用したパンニング段階の混合を、非特異的バインダーのバックグラウンドを最小にするのに使用した。パンニングの第三段階からの溶解ファージを、モノクローナルscFv発現性E.コリ(E. coli)株の作製に使用した。これらのクローン株の培養からの上清を、抗原ELISA試験にそのまま使用した(Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rulker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schutte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dubel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schutte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dubel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625もまた参照のこと)。
アドレノメデュリンに対する抗体の親和性を測定するために、固定化抗体へのアドレノメデュリンの結合に関する動態を、Biacore2000システム(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)を使用した無標識表面プラズモン共鳴法によって測定した。抗体の可逆的固定化を、製造業者の取扱説明書に従って高密度でCM5センサー表面に共有結合させた抗マウスFc抗体を使用して実施した(マウス抗体捕獲キット;GE Healthcare)(Lorenz et al.,“ Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy“; Antimicrob Agents Chemother. 2011 January; 55(1): 165-173)。
Fab及びF(ab)2フラグメントの作製を、マウス完全長抗体NT−Mの酵素分解によっておこなった。抗体NT−Mを、a)ペプシンベースのF(ab)2調製キット(Pierce44988)及びb)パパインベースのFab調製キット(Pierce44985)を使用して消化した。フラグメント化手順を、供給業者によって提供された取扱説明書に従って実施した。消化は、F(ab)2フラグメント化の場合、37℃にて8時間実施した。Fabフラグメント化消化を、それぞれ16時間実施した。
固定化パパインを、0.5mlの消化バッファーで樹脂を洗浄し、そして、5000xgにて1分間、カラムを遠心分離することによって平衡化した。そのバッファーをその後、捨てた。脱塩カラムを、保管溶液を除去し、消化バッファーでそれを洗浄し、その都度その後に1000xgにて2分間それを遠心分離することによって調製した。0.5mlの調製IgGサンプルを、平衡化した固定化パパインの入ったスピンカラムチューブに加えた。消化反応のインキュベーション時間は、37℃の卓上ロッカーにより16時間おこなった。カラムを、5000×gにて1分間遠心分離して、固定化パパインと消化産物を分離した。その後、樹脂を、0.5mlのPBSで洗浄し、そして、5000×gにて1分間遠心分離した。洗浄画分を、総サンプル体積が1.0mlである消化抗体に加えた。NAb Protein A Columnを、室温にてPBS及びIgG溶出バッファーで平衡化した。カラムを、1分間遠心分離して、保管溶液(0.02%のアジ化ナトリウム含有)を除去し、2mlのPBSを加えることによって平衡化し、1分間再び遠心分離し、そして流し出して捨てた。サンプルは、カラムに適用し、転倒によって再懸濁させた。インキュベーションを、転倒混合しながら室温にて10分間おこなった。カラムを1分間遠心分離して、Fabフラグメントが流れ出るのを防いだ。(引用文献:Coulter, A. and Harris, R. (1983). J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner I. et al. (2010) {alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signaling. Cancer Res. 70, 277-87.; Kaufmann B. et al. (2010) Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS. 107, 18950-5.; Chen X. et al. (2010) Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin αxβ2. PNAS. 107, 14727-32.; Uysal H. et al. (2009) Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthitis. J. Exp. Med. 206, 449-62.; Thomas G. M. et al. (2009) Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo. J. Exp. Med. 206, 1913-27.; Kong F. et al. (2009) Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. J. Cell Biol. 185, 1275-84)。
固定化ペプシンを、0.5mlの消化バッファーで樹脂を洗浄し、そして、5000xgにて1分間、カラムを遠心分離することによって平衡化した。そのバッファーをその後、捨てた。脱塩カラムを、保管溶液を除去し、消化バッファーでそれを洗浄し、その都度その後に1000xgにて2分間それを遠心分離することによって調製した。0.5mlの調製IgGサンプルを、平衡化した固定化ペプシンの入ったスピンカラムチューブに加えた。消化反応のインキュベーション時間は、37℃の卓上ロッカーにより16時間おこなった。カラムを、5000×gにて1分間遠心分離して、固定化パパインと消化産物を分離した。その後、樹脂を、0.5mLのPBSで洗浄し、そして、5000×gにて1分間遠心分離した。洗浄画分を、総サンプル体積が1.0mlである消化抗体に加えた。NAb Protein A Columnを、室温にてPBS及びIgG溶出バッファーで平衡化した。カラムを、1分間遠心分離して、保管溶液(0.02%のアジ化ナトリウム含有)を除去し、2mLのPBSを加えることによって平衡化し、1分間再び遠心分離し、そして流し出して捨てた。サンプルは、カラムに適用し、転倒によって再懸濁させた。インキュベーションを、転倒混合しながら室温にて10分間おこなった。カラムを1分間遠心分離して、Fabフラグメントが流れ出るのを防いだ。(引用文献:Mariani, M., et al. (1991). A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab´)2 suitable for clinical use from mouse IgG1. Mol.Immunol. 28: 69-77.;Beale, D. (1987). Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp Comp Immunol 11:287-96.; Ellerson, J.R., et al. (1972). A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity. FEBS Letters 24(3):318-22.; Kerbel, R.S. and Elliot, B.E. (1983). Detection of Fc receptors. Meth Enzymol 93:113-147.; Kulkarni, P.N., et al. (1985). Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab´)2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4.; Lamoyi, E. (1986). Preparation of F(ab´)2 Fragments from mouse IgG of various subclasses. Meth Enzymol 121:652-663.; Parham, P., et al. (1982). Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens. J Immunol Meth 53:133-73.; Raychaudhuri, G., et al. (1985). Human IgG1 and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines. Mol Immunol 22(9):1009-19.; Rousseaux, J., et al. (1980). The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain an pepsin. Mol Immunol 17:469-82.; Rousseaux, J., et al. (1983). Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab´)2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J Immunol Meth 64:141-6.; Wilson, K.M., et al. (1991). Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate. J Immunol Meth 138:111-9)。
抗体フラグメントを、CDRグラフト法(Jones, P. T., Dear, P. H., Foote, J., Neuberger, M. S., and Winter, G. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525)によってヒト化した。
全RNA抽出:全RNAを、Qiagenキットを使用してNT−Hハイブリドーマから抽出した。
PCR条件:逆転写:50℃、30分;最初のPCR活性化:95℃、15分間。
サイクル:94℃、25秒間;54℃、30秒間;72℃、30秒間を20サイクル;最終伸長:72℃、10分間。
半応物の準備:2xPCRミックス10μl;プライマーセット2μl;第一段階のPCR産物8μl;全容積20μl;Hybridoma Antibody Cloning Report。
PCRが終わった後に、PCR反応サンプルをアガロースゲルで泳動して、増幅したDNAフラグメントを可視化する。ネスト化RT−PCRによって増幅した15個超のクローンDNAフラグメントの配列決定後に、数個のマウス抗体重鎖及び軽鎖を、クローン化したが、正しいように思われる。タンパク質配列アラインメント及びCDR分析で、1本の重鎖と1本の軽鎖を同定する。相同ヒトフレームワーク配列とのアラインメント後に、得られた可変重鎖のヒト化配列は、次のものであった:図6を参照のこと(可変重鎖内の26、40、及び55位のアミノ酸及び可変軽鎖内の40位のアミノ酸が結合特性に重要なので、それらはマウス起源に先祖返りし得る。得られた候補を以下に示す)(Padlan, E. A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28, 489-498.; Harris, L. and Bajorath, J. (1995) Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: Comparison of V gene subgroups. Protein Sci. 4, 306-310)
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抗ADM生理活性に対する選択抗ADM抗体の効果
ADM生理活性に対する選択ADM抗体の効果を、ヒト組換型アドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイ(Adrenomedullin Bioassay)で試験した。
ヒト組換型アドレノメデュリン受容体cAMP機能性アッセイ(Adrenomedullin Bioassay)におけるヒト又はマウスアドレノメデュリン標的抗体の試験
細胞株:CHO−K1
受容体:アドレノメデュリン(CRLR+RAMP3)
受容体の細胞株受入番号:CRLR:U17473;RAMP3:AJ001016
試験に先立ち、抗生物質不含培地で培養した、ヒト組換型アドレノメズリン受容体を発現するCHO−K1細胞(FAST−027C)を、PBS−EDTA(5mMのEDTA)でのゆるやかなフラッシングによって剥がし、遠心分離によって回収し、そして、アッセイバッファー(KRH:5mMのKCl、1.25mMのMgSO4、124mMのNaCl、25mMのHEPES、13.3mMのグルコース、1.25mMのKH2PO4、1.45mMのCaCl2、0.5g/lのBSA)中に再懸濁した。
拮抗物質試験(96ウェル):
拮抗物質試験のために、6μlの標準作動物質(ヒト(5.63nM)又はマウス(0.67nM)アドレノメデュリン)を、異なった拮抗物質希釈率にて6μlの試験サンプル;又は6μlのバッファーと混合した。室温にて60分間のインキュベーション後に、12μlの細胞(2,500細胞/ウェル)を加えた。そのプレートを室温にて30分間インキュベートした。溶解バッファー添加後に、製造業者の明細書に従って、Cis-Bio International製のHTRFキット(cat n°62AM2 PEB)を用いて、DeltaFのパーセンテージを推測する。hADM22−52を、標準拮抗物質として使用した。
抗h−ADM抗体(NT−H、MR−H、CT−H)を、以下の最終抗体濃度:100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/mlにて、5.63nMのヒトADM1−52の存在下、ヒト組換型アドレノメズリン受容体(FAST−027C)cAMP機能性アッセイにいて拮抗物質活性についてした。
抗m−ADM抗体(NT−M、MR−M、CT−M)を、以下の最終抗体濃度:100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/mlにて、0.67nMのマウスADM1−50の存在下、ヒト組換型アドレノメズリン受容体(FAST−027C)cAMP機能性アッセイにいて拮抗物質活性についてした。データを、相対的阻害対拮抗物質濃度でプロットした(図3a〜3lを参照のこと)。個々の抗体による最大阻害を、表3中に示す。
抗ADM抗体によるhADMの安定化に関するデータ
ヒトADM抗体によるヒトADMの安定化効果を、hADM免疫学的アッセイを使用して試験した。
使用される技術は、アクリジニウムエステル標識化に基づいたサンドイッチコートチューブ発光イムノアッセイであった。
250mmol/LのNaCl、2g/LのTriton X−100、50g/Lのウシ血清アルブミン、20タブ/Lのプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics AG、Switzerland)中のhADM(BACHEM AG、Switzerland)の希釈物を使用して、アッセイを較正した。
標識CT−H(200μl)を加えた後に、50μlのサンプル(又は較正物質)をコートチューブ内にピペットで計り入れ、そのチューブを4℃にて4時間インキュベートした。非結合トレーサーを、洗浄液(20mMのPBS、pH7.4、0.1%のTriton X−100)で5回(各1ml)洗浄することによって除去した。
ヒトADMを、ヒトクエン酸血漿中に希釈し(終濃度10nM)、24℃にてインキュベートした。選択した時点にて、−20℃にて冷凍することによって、hADMの分解を止めた。インキュベーションを、NT−H(100μg/ml)の不存在及び存在下で実施した。残存しているhADMを、先に記載したhADM免疫学的アッセイを使用して定量化した。
敗血症の死亡率(早期処置)
動物モデル
12〜15週齢の雄C57Bl/6マウス(Charles River Laboratories, Germany)を試験に使用した。腹膜炎を、軽いイソフルラン麻酔下で外科的に引き起こした。切開を、腹腔の左上象限(盲腸の正常な位置)に作った。盲腸を露出させ、そして、きつい結紮を小腸の付着点の遠位に縫合して盲腸の周りに配置した。24ゲージの針で1カ所の刺創を盲腸に作り、そして、少量の盲腸内容物をその損傷から絞り出した。盲腸を腹腔内に戻し、そして、腹壁切除部位を閉じた。最後に、動物を、食物と水が自由摂取できるケージに戻した。500μlの生理的食塩水を、水分補給として皮下に与えた。
化合物(NT−M、MR−M、CT−M)の適用と投薬量
マウスを、CLP直後に処置した(早期治療)。CLPとは、盲腸結紮及び穿刺(CLP)の略語である。
3つの化合物を、ビヒクルに対して、及び対照化合物処置に対して試験した。各群には、BUN(血清血中尿素窒素試験)測定のために1日後の採血のための5匹のマウスを含む。各群あたり更なに10匹のマウスを、4日間の期間にわたって経過観察した。
群 処置(10μl/g体重) 投与量/経過観察:
1 NT−M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
2 MR−M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
3 CT−M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
4 非特異的マウスIgG、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
5 対照−PBS、10μl/g体重 4日間にわたり生存
腎機能に関する血中尿素窒素(BUN)濃度を、ベースラインとCLP後1日目に計測した。血液サンプルを、軽いエーテル麻酔下で毛細管を用いて海綿静脈洞から採取した。測定を、AU 400 Olympus Multianalyserを使用して実施した。4日死亡率を、表4中に示した。平均BUN濃度を、表5中に示した。
動物モデル
12〜15週齢の雄C57Bl/6マウス(Charles River Laboratories, Germany)を試験に使用した。腹膜炎を、軽いイソフルラン麻酔下で外科的に引き起こした。切開を、腹腔の左上象限(盲腸の正常な位置)に作った。盲腸を露出させ、そして、きつい結紮を小腸の付着点の遠位に縫合して盲腸の周りに配置した。24ゲージの針で1カ所の刺創を盲腸に作り、そして、少量の盲腸内容物をその損傷から絞り出した。盲腸を腹腔内に戻し、そして、腹壁切除部位を閉じた。最後に、動物を、食物と水が自由摂取できるケージに戻した。500μlの生理的食塩水を、水分補給として皮下に与えた。
マウスを、CLP直後に処置した(早期治療)。CLPとは、盲腸結紮及び穿刺(CLP)の略語である。
化合物(NT−M FAB2)の適用と投薬量
NT−M FAB2を、ビヒクルに対して、及び対照化合物処置に対して試験した。処置を、敗血症の完全な発生後、すなわち、CLPの6時間後に実施した(後期処置)。各群には、4匹のマウスが含まれ、4日間の期間にわたって経過観察した。
群 処置(10μl/g体重) 投与量/経過観察:
1 NT−M、FAB2 0.2mg/ml 4日間にわたり生存
2 対照:非特異的マウスIgG、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
3 ビヒクル:−PBS 10μl/g体重 4日間にわたり生存
抗生物質処置及びカテコールアミンによる血液循環安定化、並びに体液平衡の調整に対するCLP動物における抗ADM抗体の増分による効果。
動物モデル
この試験では、雄C57Bl/6マウス(8〜12週、22〜30g)を利用した。盲腸結紮及び穿刺(CLP)によって引き起こした複数菌による敗血症を、敗血症性ショックを試験するためにモデルとして使用した((Albuszies G, et al: Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med 2005;33:2332-8), (Albuszies G, et al: The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock. Intensive Care Med 2007;33:1094-101), (Barth E, et al: Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock. Crit Care Med 2006;34:307-13), (Baumgart K, et al: Effect of SOD-1 over-expression on myocardial function during resuscitated murine septic shock. Intensive Care Med 2009;35:344-9),
(Baumgart K, et al: Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med 2010;38:588-95), (Simkova V, et al: The effect of SOD-1 over-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock. Shock 2008;30:578-84), (Wagner F, et al.: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock, im Druck), (Wagner F, et al: Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma: a prospective, randomized controlled trial. Crit Care 2011, submittes for publication))。
早期処置
CLPの外科手術及び切開の縫合直後、試験物質抗体NT−Mを、体重1kgあたり2mgの用量の陰茎静脈への注射により、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に500μg/mlの濃度で適用した(投与体積88〜120μl)(5匹の動物)。
完全な敗血症発生後に、すなわち、CLPの外科手術の15.5時間後に、動物を先に記載のとおり麻酔し、そして、NT−Mを、体重1kgあたり2mgの用量の陰茎静脈への注射により、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に500μg/mlの濃度で適用した(投与体積88〜120μl)(3匹の動物)。
集中治療観察下におけるマウス敗血症性ショックモデル:
3、5、及び6匹の動物がいる3つの群を観察した。群1(5匹の動物)には、抗体NT−Mを、CLPの15.5時間後に与え、群2には、CLPの外科手術直後に、抗体NT−Mを与え、そして、群3には、対応する量のPBSを与えた(4μl/g)。(複数菌による敗血症を発現させるように)CLP後の16時間のインキュベーション後、実験を、集中医療治療レジメンに匹敵する観察及び介入をしながら続けた。そのため、動物の計量後に、CLP外科手術の部分に記載したように麻酔した(後期処置動物を除いて、処置前に麻酔した)。体温を、実験の残りの期間、37〜38℃に維持した。気管開口及び挿管後に、呼吸を実験動物用肺人工呼吸器Flexivent(登録商標)(Emka Technologies, FiO2 0,5, PEEP 10 H2O, VT 8μl/g, I:E 1:1,5, AF 70-140 温度による)によって観察し、そして補助した。
以下のパラメーターを計測し、そして、分析した:ノルアドレナリンの総消費(μg NA/g)、ノルアドレナリンの消費速度(μg NA/g/h)、実験中に採取した尿の全容積、実験終了時のクレアチニン濃度(μg/mL)及び平均クレアチニンクリアランス(μL/分)。
蘇生法の早期でも4日間にわたる累積的なものでも、より有益な体液平衡は、敗血症性ショックの高い死亡リスクに関係している。体液平衡の制御は、敗血症に罹患している患者の疾患の経過に最も重要な点である(s. Boyd et al, 2011)。重大な疾患の患者の体液平衡の制御は、集中治療薬の大きな課題として残っている。表8から分かるように、NT−M抗体でのCLP(実験手順は「動物モデル」を参照のこと)後のマウスの処置は、排出される尿の全容積の増加につながる。分泌された尿は、無処置マウスと比較してNT−M−処置動物では約3倍高かった。有益な処置効果は、早期処置及び後期処置で与えられた。体液平衡も同様に、早期処置でも後期処置でも、約20〜30%改善した。これにより、データは、ADM抗体の使用、特にNT ADM抗体の使用は、患者の体液平衡を調整するのに好ましいのことを示している(表8並びに図8及び9を参照のこと)。
急性腎不全症だけに罹患している患者の間の45パーセントの死亡率と比較して、急性腎不全と敗血症の組み合わせは、70パーセントの死亡率に関連している(Schrier and Wang, “Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis”; The New England Journal of Medicine; 351:159-69; 2004)。クレアチニン濃度とクレアチニンクリアランスは、腎臓の機能(機能障害)を観察するための標準的な検査室パラメーターである(Jacob, “Acute Renal Failure”, Indian J. Anaesth.; 47 (5): 367-372; 2003)。先に記載した動物実験(早期処置)からのクレアチニン及びクレアチニンクリアランスデータを表9に示す。
腎臓機能:
対照及び早期処置動物の肝臓組織を、ホモジナイズし、そして、溶解バッファー中で溶解した。細胞抽出物の調製のために、細胞を、再懸濁し、氷上で溶解し、そして、遠心分離した。上清(タンパク質抽出物)を−80℃にて保存した。B細胞の核内因子κ軽鎖遺伝子エンハンサ(NF−κB)の活性化を、電気泳動の移動度シフトアッセイ(EMSA)1,2を使用して先に記載のとおり測定した。細胞抽出物(10μg)を、ポリ−デオキシ−イノシン−デオキシ−シチジル酸(ポリ−dI−dC)及びNFκB(HIVκB部位)(5’GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA−3’)を含む32P標識した二本鎖オリゴヌクレオチド(Biomers, Ulm, Germany)と一緒に氷上でインキュベートした。複合体を、未変性ポリアクリルアミドゲルにより分離し、乾燥させ、そして、X線フィルムに感光させた。蛍光物質画像装置とイメージアナライザソフトウェア(AIDA Image Analyzer; Raytest)を使用して、デンシトメトリーによって放射能標識したNF−κBを定量化した。個々のゲルの比較のために、それぞれのバンドの強度を、外科機器の使用及びCLPを受けなかった同時に泳動した対照動物のものに関連させる。そのため、EMSAデータを、対照値に対する倍数増加として表す。統計:すべてのデータは、2つの群の相違を、対応のないサンプルのマン−ホイットニー順位和検定で分析したとの別段の明記がない限り、中央値(範囲)として示される。結果:NT−Mで処置した動物は、ビヒクル動物(2.92(2.50〜3.81))(p<0.001)と比較して、有意に減弱した肝臓組織NF−κB活性化(2.27(1.97〜2.53))を示した(図10を参照のこと)。
1. Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35(4):396-402
2. Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71(6):1659-67
抗体NT−Mの生体内における副作用測定
12〜15週齢の雄C57Bl/6マウス(Charles River Laboratories, Germany)を試験に使用した。6匹のマウスを、NT−Mの用量(10μl/g体重)、0.2mg/mlで処置した。対照として、6匹のマウスを、PBS(10μl/gの体重)で処置した。生存と身体的状態を14日間観察した。死亡率は、両群において0であり、NT−Mと対照群の間に身体的状態の相違点はなかった。
ゲンタマイシン誘発性腎毒性
非敗血症性急性腎臓傷害モデルを確立し、そしてそれは、ゲンタマイシンによって誘発される腎毒性を利用する(Chiu PJS. Models used to assess renal functions. Drug Develop Res 32:247-255, 1994.)。このモデルを、抗アドレノメデュリン抗体を用いた処置が腎臓機能を改善するかどうかをアッセイするのに使用した。
実験を、以下のとおり実施した:
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / SCr (mg/ml)
UNaV (μEq/24 h) = UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)
24時間のNAG及びNGALの尿排泄を、同様に計算した。
FENa (%) =100 x [UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (μEq/ml) X CCr (ml/24 h)
先に記載したマウスCLPモデルにおいて、腎臓機能に関するいくつかのパラメーターに対する抗アドレノメデュリン抗体NT−Mでの処置の効果を調査した。
クレアチニン、尿素、及び好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)
血中NGAL濃度を、市販のELISA(マウスNGAL、RUO 042, BioPorto Diagnostics A/S, Denmark, Gentofte)を使用して計測した。尿素とクレアチニン濃度を、内部標準として2H3−クレアチニン(CDN isotopes, Pointe-Claire, QU, Canada)及びメチル尿素(FlukaChemikalien, Buchs, Switzerland)を使用した、キャピラリーカラム(Optima-5MS, Macherey-Nagel, Duren, Germany)ガスクロマトグラフィー/質量分析システム(Agilent 5890/5970, Boblingen, Germany)で計測した。アセトニトリルでの除タンパク、遠心分離、及び乾燥するまで蒸発乾固させた後に、上清を、ギ酸中で再構成し、そして、弱陰イオン交換カラム(WCX、Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)で抽出した。アセトニトリルに加えて、N,O−ビス(トリメチルシリル)トリフルオロ酢酸アミド及びN−(tert−ブチルジメチルシリル)−N−メチルトリフルオロアセトアミドは、それぞれ尿素tert−ブチル−ジメチルシリル−及びクレアチニントリメチルシリル−誘導体の形成を可能にする。イオンm/z231と245、及びm/z329と332を、それぞれ尿素とクレアチニン分析物、及び内部標準に関して観察した。尿排出量、並びに血漿及び尿クレアチニン濃度から、クレアチニンクリアランスを、標準式を使用して計算した。
−80℃にて保存した腎臓を、PBS中、ホモジナイザにより粉砕し、そして、全細胞溶解液(100mMのTris pH7、6;500mMのNaCl;6mMのEDTA;6mMのEGTA;1%のTriton−X−100;0、5%のNP 40;10%のグリセロール;プロテアーゼ阻害剤(β−グリセロールリン酸 2mM;DTT 4mM;ロイペプチン(Leupeptine) 20μM;オルトバナジウム酸ナトリウム 0.2mM))の2倍濃縮バッファーで溶解し、それに続いて遠心分離した。全細胞溶解液を、上清から得;細胞レムナントから成るペレットを捨てた。タンパク質量を、市販のタンパク質分析(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて決定し、そして、最終的なタンパク質濃度が4μg/lになるように光度測定を調整した。多重分析やEMSA分析のサンプルを、EMSAバッファー(10mMのHepes;50mMのKCl、10%のグリセロール;0、1mMのEDTA;1mMのDTT)で1:1に希釈し、イムノブロットのためのサンプルを、2倍のサンプルバッファー(2%のSDS;125mMのTris−HCl(25℃にてpH6、8);10%のグリセロール;50mMのDTT;0.01%のブロモフェノールブルー)で1:1に希釈した。
先に記載したマウスCLPモデルにおいて、肝臓に対する抗アドレノメデュリン抗体NT−Mを用いた処置の効果を調査した。
先に記載したマウスCLPモデルにおいて、血液循環(血漿)中の数種類のサイトカイン及びケモキネシンに対する、抗アドレノメデュリン抗体NT−Mを用いた処置の効果を調査した。
腫瘍壊死因子(TNF−α)、インターロイキン(IL)−6、単球走化性タンパク質(MCP)−1、及び角化細胞由来ケモカイン(KC)濃度の血漿レベルを、マウスマルチプレックスサイトカインキット(Bio-Plex Pro Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, CA)を使用して測定し、そのアッセイを、製造業者の取扱説明書を用いてBio-plex懸濁液アレイシステムを使用して実施した(Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; and Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667もまた参照のこと)。要するに、適当なサイトカイン標準とサンプルを、フィルタープレートに加えた。サンプルを、蛍光標識マイクロビーズに化学的に取り付けた抗体と一緒にインキュベートした。その後、あらかじめ混合しておいた検出抗体を、各ウェルに加え、それに続いて、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを加えた。次に、ビーズを再懸濁し、そして、サイトカイン反応混合物を、Bio-Plexタンパク質配列リーダーを使用して定量化した。データを、自動処理させ、組換サイトカイン標準から作成される検量線を使用してBio-Plex Manager Software 4.1によって分析した。アッセイの検出限界を下回るレベルを、統計的な目的のためにゼロに設定した。
虚血/再潅流誘発性急性腎傷害
急性腎傷害が虚血/再潅流によって引き起こされる他の非敗血症性急性腎臓傷害モデルを確立した(Nakamoto M, Shapiro JI, Shanley PF, Chan L, and Schrier RW. In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure. J ClinInvest 80:698-705, 1987., Chintala MS, Bernardino V, and Chiu PJS. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemia-reperfusion in anesthetized rats. J PharmacolExpTher 271:1203-1208, 1994)。このモデルを使用して、抗アドレノメデュリン抗体を用いた処置が腎臓機能を改善できるかどうか評価した。
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / PCr (mg/ml)
24時間のナトリウム(Na+)の尿排泄を、以下のとおり計算した:
UNaV (μEq/24 h) = UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)
Na+(FENa)の分画排泄率、又は最終的な尿中に排出された濾過ナトリウムのパーセンテージは、尿細管Na+再吸収作用の尺度である。それを以下のとおり計算した:
FENa (%) =100 x [UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (μEq/ml) X CCr (ml/24 h)
血中尿素窒素(BUN)は、ビヒクル群において強い増大を示し(0h:17.49mg/dL、24h:98.85mg/dL、48h:109.84mg/dL、72h:、91.88mg/dL)、そして、NT−M処置ではあまりはっきりしなかった(0h:16.33mg/dL、24h:84.2mg/dL、48h:82.61mg/dL、72h:64.54mg/dL)(図22)。
Claims (29)
- 体液平衡の調整用の医薬組成物であって、抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、アドレノメデュリンに結合する抗ADM抗体フラグメント又はアドレノメデュリンに結合する抗ADM非Ig足場を含み、ここで当該抗体又は抗体フラグメント又は非Ig足場は、成熟ヒトADMのaa1〜21の配列(配列番号23)内の少なくとも4のアミノ酸の領域に結合し、急性疾患又は急性病態を患う患者の治療において使用される、前記医薬組成物。
- 前記患者が、体液平衡を調整することを必要としている患者である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記患者の水腫を予防又は軽減するための、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場が、単一特異性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、ADMに対して少なくとも10-7Mの結合親和性を示すことを特徴とし、ここで当該結合親和性がBiacor2000システムを使用した無標識表面プラズモン共鳴法によって決定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント、又は足場が、ADM結合タンパク質1(補体因子H)ではない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場が、成熟ヒトADMのaa1−21から成る配列:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(配列番号:23)
の中の少なくとも4個又は5個のアミノ酸の領域に結合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - 前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、成熟ヒトADMのN末端端部、つまり、第1アミノ酸を含むエピトープを認識及び結合し、且つ、前記抗体、フラグメント又は足場が、N末端伸長アドレノメデュリンにも、N末端修飾アドレノメデュリンにも、N末端分解アドレノメデュリンにも結合しない、請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を少なくとも10%延長するADM安定化抗体、ADM安定化抗体フラグメント又はADM安定化非Ig足場である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を少なくとも50%延長するADM安定化抗体、ADM安定化抗体フラグメント又はADM安定化非Ig足場である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を>100%延長するADM安定化抗体、ADM安定化抗体フラグメント又はADM安定化非Ig足場である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、循環ADMの生理活性を80%以下しか阻害せず、ここでADMの生物活性が、ヒト組換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで決定される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、循環ADMの生理活性を50%以下しか阻害せず、ここでADMの生物活性が、ヒト組換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで決定される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、SIRS、敗血症、糖尿病、癌、心不全、ショック及び腎機能障害を含んで成る群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、ADMに結合する抗体又はフラグメントであって、前記重鎖が配列:
CDR1:配列番号:1
GYTFSRYW
CDR2:配列番号:2
ILPGSGST
CDR3:配列番号:3
TEGYEYDGFDY
を含んで成り、そして、前記軽鎖が配列:
CDR1:配列番号:4
QSIVYSNGNTY
CDR2:配列番号:5
RVS
CDR3:配列番号:6
FQGSHIPYT
を含んで成る、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - 前記抗体又はフラグメントが、VH領域として、以下の配列:
配列番号:7(AM−VH−C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
配列番号:8(AM−VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
配列番号:9(AM−VH2−E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
配列番号:10(AM−VH3−T26−E55)又は
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
配列番号:11(AM−VH4−T26−E40−E55)を含み、VL領域として、以下の配列:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
配列番号:12(AM−VL−C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
配列番号:13(AM−VL1)又は
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:14(AM−VL2−E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含んで成る、請求項15に記載の医薬組成物。 - ADMの生物活性を、ヒト組換えアドレノメデュリン受容体発現CHO−K1細胞において、hADM22−52を標準拮抗物質として用いたヒト組換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで測定した場合に、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を少なくとも10%延長し、且つ、ADMの生理活性を80%以下しか阻害しない調節抗体、調節フラグメント又は調節足場であり、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、成熟ヒトADMのaa1−21から成る配列:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(配列番号:23)
の中の少なくとも4個又は5個のアミノ酸の領域に結合する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - ADMの生物活性を、ヒト組換えアドレノメデュリン受容体発現CHO−K1細胞において、hADM22−52を標準拮抗物質として用いたヒト組換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで測定した場合に、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を少なくとも50%延長し、且つ、ADMの生理活性を80%以下しか阻害しない調節抗体、調節フラグメント又は調節足場であり、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、成熟ヒトADMのaa1−21から成る配列:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(配列番号:23)
の中の少なくとも4個又は5個のアミノ酸の領域に結合する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - ADMの生物活性を、ヒト組換えアドレノメデュリン受容体発現CHO−K1細胞において、hADM22−52を標準拮抗物質として用いたヒト組換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイで測定した場合に、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、血清、血液、血漿中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2半減滞留時間)を>100%延長し、且つ、ADMの生理活性を80%以下しか阻害しない調節抗体、調節フラグメント又は調節足場であり、前記抗体、抗体フラグメント又は足場が、成熟ヒトADMのaa1−21から成る配列:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(配列番号:23)
の中の少なくとも4個又は5個のアミノ酸の領域に結合する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - ADMの生理活性を50%以下しか阻害しない、請求項17〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場が、ADMのC末端部分、つまり、ADMのaa43−52(配列番号:25):
PRSKISPQGY-NH2
(配列番号:25)
に結合しないことを特徴とする、請求項1〜20のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - カテコールアミン及び/又は静脈内に投与される輸液と組み合わせて使用される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ADM結合タンパク質及び/又は更なる有効成分と組み合わせて使用される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、前記急性疾患又は急性病態に対する一次治療方法として使用されないことを特徴とする、請求項1〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の医薬組成物を含む、急性疾患又は急性病態を患う患者の体液平衡の調整用の医薬製剤。
- 前記医薬製剤が、溶液である、請求項25に記載の医薬製剤。
- 前記医薬製剤が、すぐに使用できる溶液である、請求項26に記載の医薬製剤。
- 前記医薬製剤が、凍結乾燥状態にある、請求項25に記載の医薬製剤。
- 前記医薬製剤が、全身的に体液平衡を調整するために患者に投与されるが、但し、該患者が体液平衡を調整する必要があることを条件とする、請求項25〜28のいずれか一項に記載の医薬製剤。
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