ES2729710T3 - Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la prevención o la reducción de una disfunción orgánica o una insuficiencia orgánica en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda - Google Patents
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la prevención o la reducción de una disfunción orgánica o una insuficiencia orgánica en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda Download PDFInfo
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Abstract
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o una afección aguda para la prevención o la reducción de disfunción orgánica o la prevención de insuficiencia orgánica en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID nº 23), y en el que dicho órgano se selecciona de entre el grupo que comprende corazón, riñón, hígado, pulmones, páncreas, intestino delgado y bazo, y en el que dicha enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas como por ejemplo insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque tal como por ejemplo choque séptico y disfunción orgánica, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismo, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la prevención o la reducción de una disfunción orgánica o una insuficiencia orgánica en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
Campo de la invención
La presente invención se encuentra comprendida dentro del campo de un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, para la prevención o la reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica.
La materia objeto de la invención es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a la adrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM de unión a la adrenomedulina, para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda en un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda, o una afección aguda, para la prevención o la reducción de disfunción orgánica o la prevención de la insuficiencia orgánica en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos (aa) dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFq Gl RSFGCRFGTC (SEC ID n° 23), y en el que dicho órgano se selecciona de entre el grupo que comprende corazón, riñón, hígado, pulmones, páncreas, intestino delgado y bazo, y en el que dicha enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque, tal como, por ejemplo, el choque séptico, y la disfunción orgánica, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia.
Antecedentes
El péptido adrenomedulina (ADM) fue descrito por primera vez en 1993 (Kitamura K. et al., “Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 192(2), páginas 553 a 560, 1993) como nuevo péptido hipotensor que comprende 52 aminoácidos, que ha sido aislado a partir de un feocromocitoma humano, SEC ID n° 21. En el mismo año, asimismo se describió ADNc codificante de un péptido precursor que comprendía 185 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos completa de este péptido precursor. El péptido precursor, que comprende, entre otros, una secuencia de señal de 21 aminoácidos en el extremo N-terminal, se denomina “preproadrenomedulina” (pre-proADM). En la presente descripción, todas las posiciones aminoácidas especificadas habitualmente se refieren al pre-proADM que comprende los 185 aminoácidos. El péptido adrenomedulina (ADM) es un péptido que comprende 52 aminoácidos (SEC ID n° 21) y que comprende los aminoácidos 95 a 146 de pre-proADM, a partir del cual se forma mediante corte proteolítico. Hasta el momento, sólo se han caracterizado con más exactitud sustancialmente únicamente unos cuantos fragmentos de los fragmentos peptídicos formados en el corte de pre-proADM, en particular los péptidos fisiológicamente activos adrenomedulina (ADM) y “PAMP”, un péptido que comprende 20 aminoácidos (22-41) que sigue a los 21 aminoácidos del péptido de señal en pre-proADM. La identificación y caracterización de ADM en 1993 promovió una intensa actividad investigadora, los resultados de la cual se han resumido en diversos artículos de revisión, en el contexto de la presente descripción, se hace referencia en particular a los artículos en un número de “Peptides” dedicado a ADN, en particular (Editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, vol. 22, página 1691, 2001) y (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001). Otra revisión es Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol. 21(2), pp. 138-167, 2000. En las investigaciones científicas hasta el momento, se ha encontrado, entre otros, que la ADM puede considerarse un péptido regulador polifuncional. Se libera a la circulación en una forma inactiva extendida por glicina (Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 244(2), páginas 551 a 555, 1998. sólo el resumen). Asimismo existe una proteína de unión (Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, vol. 276(15), páginas 12292 a 12300, 2001) que es específica de ADM y probablemente de manera similar modula el efecto de ADM. Dichos efectos fisiológicos de ADM, así como de PAMP, que son de importancia primordial en las investigaciones actuales son los efectos de influencia sobre la presión sanguínea.
Por lo tanto, la ADM es un vasodilatador eficaz y, de esta manera, resulta posible asociar el efecto hipotensor a segmentos peptídicos particulares en la parte C-terminal de la ADM. Se ha encontrado además que el péptido fisiológicamente activo adicional anteriormente mencionado PAMP, formado a partir de pre-proADM de manera similar muestra un efecto hipotensor, aunque aparentemente presenta un mecanismo de acción diferente del de la ADM (ver, además de los artículos de revisión anteriormente indicados (Eto, T., "A review of the biological
properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001) e (Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, vol. 21(2), páginas 138 a 167, 2000), asimismo (Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett, Vol. 414(1), páginas 105 a 110, 1997, únicamente el resumen) (Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., vol. 36 (Pt. 5), páginas 622 a 628, 1999, sólo el resumen) o (Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., vol. 69(2), páginas 239 a 245, 2001, sólo el resumen) y el documento n° EP-A20 622 458). Se ha encontrado además que las concentraciones de ADM que pueden medirse en la circulación y en otros líquidos biológicos en varios estados patológicos, se encuentran a niveles superiores a las concentraciones que se observan en las personas de control sanas. De esta manera, el nivel de ADM en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensivos, diabetes mellitus, en la etapa aguda de choque y en la sepsis y el choque séptico, se encuentran significativamente incrementadas, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP asimismo se encuentran incrementadas en algunos de dichos estados patológicos, aunque los niveles plasmáticos son inferiores a los de ADM ((Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, página 1702, 2001). Se conoce además que las concentraciones inusualmente elevadas de ADM se observan en la sepsis, y las concentraciones más altas, en el choque séptico (ver (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, vol. 22, páginas 1693 a 1711, 2001) y (Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 81(4), páginas 1449 a 1453, 1996), (Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp Clin Endocrinol Diabetes, Vol. 105, página 156 a 162, 1997), (Tomoda, Y., et al., "Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides, vol. 22, páginas 1783 a 1794, 2001), (Ueda, S., et al., "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 160, páginas 132 a 136, 1999) y (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, vol. 22, páginas 1835 a 1840, 2001).
En la técnica se conoce además un método para identificar la inmunorreactividad de la adrenomedulina en líquidos biológicos con fines diagnósticos y, en particular dentro del alcance del diagnóstico de la sepsis, del diagnóstico cardiaco y del diagnóstico del cáncer. Según la invención, se mide el péptido parcial de la región intermedia de la proadrenomedulina, que contiene los aminoácidos (45-92) de la preproadrenomedulina completa, en particular con un inmunoensayo que funciona con por lo menos un anticuerpo marcado que reconoce específicamente una secuencia de la parte intermedia de proADM (documento WO 2004/090546).
El documento WO-A1 2004/097423 describe la utilización de un anticuerpo contra la adrenomedulina para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento de trastornos cardiovasculares. Del tratamiento del glioblastoma en un modelo de xenoinjerto tumoral mediante un anticuerpo policlonal generado contra la adrenomedulina ya se ha informado (L'Houcine, O., "Neutralization of adrenomedullin inhibits the growth of human glioblastoma cell lines in vitro and suppresses tumor xenograft growth in vivo", American Journal of Pathology; Vol. 160, n° 4, páginas 1279 1292, 2002). Además, el tratamiento de las ratas obesas diabéticas con el anticuerpo monoclonal antiadrenomedulina MoAb-G6 (Martinez, A., "Is Adrenomedullin a Causal Agent in Some Cases of Type 2 Diabetes?", Peptides, Vol. 20, n° 12, páginas 1471 a 1478, 1999). El tratamiento de enfermedades mediante el bloqueo del receptor de ADM asimismo se encuentra descrito en la técnica (por ejemplo, en los documentos WO-A1 2006/027147 y WO-A1 2007/062676); dichas enfermedades pueden ser sepsis, choque séptico, enfermedades cardiovasculares, infecciones, enfermedades dermatológicas, enfermedades endocrinológicas, enfermedades metabólicas, enfermedades gastroenterológicas, cáncer, inflamación, enfermedades hematológicas, enfermedades respiratorias, enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades neurológicas y enfermedades urológicas.
Se informa para la etapa temprana de la sepsis de que la ADM mejora la función cardiaca y el suministro sanguíneo al hígado, bazo, riñón e intestino delgado. Los anticuerpos neutralizadores de ADM neutralizan los efectos anteriormente indicados durante la etapa temprana de la sepsis (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, vol. 22, páginas 1835 a 1840, 2001; Wang, P., et al., "The Pivotal role of adrenomedullin in producing hyperdynamic circulation during early stage of sepsis", Archives of Surgery, vol. 133, páginas 1298 a 1304, 1998).
En la última etapa de la sepsis, la etapa hipodinámica de la sepsis, la ADM constituye un factor de riesgo que está fuertemente asociado a la mortalidad de los pacientes en choque séptico. (Schütz et al., "Circulating Precursor levels of endothelin-1 and adrenomedullin, two endothelium-derived, counteracting substances, in sepsis", Endothelium, 14:345-351, 2007). Los métodos para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes críticamente enfermos, por ejemplo en las etapas muy tardías de la sepsis, y la utilización de endotelina y agonistas de endotelina con actividad vasoconstrictora para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de
pacientes críticamente enfermos se ha descrito en el documento WO-A1 2007/062676. Se describe adicionalmente en el documento WO-A1 2007/062676 la utilización, en lugar de endotelina y/o agonistas de endotelina, o en combinación con la misma, de antagonistas de adrenomedulina, es decir, moléculas que evitan o atenúan la acción vasodilatadora de la adrenomedulina, por ejemplo mediante el bloqueo de sus receptores relevantes, o sustancias que evitan la unión de la adrenomedulina a su receptor (por ejemplo, ligantes específicos tales como, por ejemplo, anticuerpos de unión a la adrenomedulina y que bloquean sus sitios de unión a receptor; “neutralización inmunológica”). Tal utilización, o utilización combinada, incluyendo una utilización separada posterior o anterior, se ha descrito en determinados casos que resulta deseable, por ejemplo para mejorar el éxito terapéutico, o para evitar estrés fisiológico indeseable o efectos secundarios. De esta manera, se informa de que los anticuerpos de ADM neutralizantes pueden utilizarse para el tratamiento de sepsis en la etapa tardía de la sepsis.
La administración de ADM en combinación con la proteína 1 de unión a ADM se ha descrito en la técnica para el tratamiento de la sepsis y el choque séptico. Se supone que el tratamiento de animales sépticos con ADM y proteína 1 de unión a ADM evita la transición a la etapa tardía de la sepsis. Debe indicarse que en un organismo vivo la proteína de unión a ADM (factor H del complemento) se encuentra presente en la circulación de dicho organismo a altas concentraciones (Pio et al., Identification, characterization, and physiological actions of factor H as an Adrenomedullin binding Protein present in Human Plasma; Microscopy Res. and Technique, 55:23-27 (2002) y Martinez et al., Mapping of the Adrenomedullin-Binding domains in Human Complement factor H; Hypertens. Res. Vol. 26, supl., S56-59, 2003).
Según la invención, la proteína 1 de unión a ADM asimismo puede denominarse proteína 1 de unión a ADM (factor H del complemento).
La prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica resulta muy importante durante el tratamiento del paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, especialmente una enfermedad o condición potencialmente letal.
Descripción de la invención
La materia objeto de la invención es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a la adrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM de unión a la adrenomedulina, para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o una afección aguda, para la prevención o la reducción de disfunción orgánica o la prevención de la insuficiencia orgánica en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID n° 23), y en el que dicho órgano se selecciona de entre el grupo que comprende corazón, riñón, hígado, pulmones, páncreas, intestino delgado y bazo, y en el que dicha enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque, tal como, por ejemplo, el choque séptico, y la disfunción orgánica, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia. En una forma de realización preferida, la materia objeto de la invención se refiere a la prevención o reducción de la disfunción renal o insuficiencia renal, o de la disfunción hepática o insuficiencia hepática. El anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM puede ser administrable en cualquier punto del tiempo antes de producirse la disfunción o insuficiencia o después de producirse la disfunción o insuficiencia.
La expresión “disfunción orgánica” denota una afección o un estado de salud en el que el órgano no realiza su función esperada. La expresión “insuficiencia orgánica” denota una disfunción orgánica en tal medida que no puede mantenerse la homeostasis normal sin intervención clínica externa.
En contraste, la función orgánica representa la función esperada del órgano respectivo dentro de rangos fisiológicos. El experto en la materia conoce la función respectiva de cada órgano durante el examen médico. Por lo tanto, a continuación únicamente se proporciona información básica con respecto a órganos particulares comprendidos dentro del alcance de la invención.
El corazón es un órgano muscular con cámaras que bombea la sangre recibida de las venas hacia las arterias. De esta manera, el corazón mantiene el flujo de sangre por el sistema circulatorio completo para suministrar oxígeno al cuerpo.
Los riñones son un par de órganos que funcionan manteniendo un equilibrio adecuado de agua y electrolitos; regulan la concentración ácido-base y además filtran la sangre eliminando residuos metabólicos, que posteriormente son excretados en forma de orina.
El hígado es un órgano grande que secreta bilis y es activo en la formación de determinadas proteínas sanguíneas
y en el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas.
Los pulmones funcionan eliminando el dióxido de carbono de la sangre y suministrándole oxígeno.
El páncreas secreta jugo pancreático al duodeno, e insulina, glucagón y somatostina al torrente sanguíneo.
El intestino delgado es una parte del tracto digestivo en la que se completa prácticamente el proceso de la digestión. Es estrecho y tortuoso y consiste en tres partes: el duodeno, el yeyuno y el íleo.
El bazo desempeña un papel importante con respecto a los eritrocitos (los glóbulos rojos) y el sistema inmunitario. Específicamente, el bazo elimina los glóbulos rojos viejos y mantiene una reserva de sangre en caso de choque hemorrágico, reciclando además el hierro. Además, metaboliza la hemoglobina eliminada de los eritrocitos senescentes. La parte de globina de la hemoglobina es degradada a sus aminoácidos constitutivos y la parte heme es metabolizada a bilirrubina, que posteriormente es transportada hasta el hígado para su eliminación. Además, el bazo sintetiza anticuerpos en su pulpa blanca y elimina las bacterias recubiertas de anticuerpos junto con células sanguíneas recubiertas de anticuerpos mediante la circulación de la sangre y en los ganglios linfáticos.
Debe enfatizarse que el anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) proporcionado o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM están destinados según la presente invención a la aplicación con fines preventivos o de reducción de la disfunción orgánica y insuficiencia orgánica y, de esta manera, no se están destinados necesariamente a ningún método de tratamiento primario o tratamiento de primera línea de la enfermedad crónica o aguda o una afección aguda misma, que por lo tanto puede denominarse enfermedad o enfermedades subyacentes. Ello significa que la presente invención no proporciona una terapia de cicatrización/curación de, por ejemplo, infecciones, cáncer o tumores situados en el órgano respectivo, sino de resucitación del órgano respectivo a la función fisiológica. De acuerdo con lo anterior, la utilización del anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda comprendida dentro del alcance de la invención, se relaciona con cualquier tipo de insuficiencia orgánica, o función orgánica defectuosa en forma de un suceso agudo.
Específicamente, según la invención debe apreciarse que, en el caso de cualquier disfunción orgánica o insuficiencia orgánica del páncreas que se deba, por ejemplo, a diabetes mellitus, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM proporcionados en la presente memoria no están destinados al tratamiento de primera línea de la diabetes, sino a resucitar la función fisiológica del páncreas.
Específicamente, según la invención, debe apreciarse que, en el caso de cualquier disfunción orgánica o insuficiencia orgánica de, por ejemplo, páncreas, pulmón, hígado, riñón, bazo, intestino delgado o corazón que se debe a tumores cancerosos o cáncer, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM proporcionados en la presente memoria no están destinados al tratamiento de primera línea de tumores cancerosos o cáncer en el órgano respectivo, sino a resucitar la función fisiológica del órgano respectivo.
El grupo o grupos de pacientes a los que hace referencia la presente invención pueden definirse tal como se explica a continuación.
A continuación, se mencionan criterios clínicos para los órganos respectivos con tendencia a disfunción o insuficiencia y, de esta manera, representan el grupo o grupos de pacientes que sufren de una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda según la invención.
Los criterios se orientan a partir de la puntuación clínica SOFA.
El sistema SOFA se creó en una reunión de consenso de la Sociedad Europea de Medicina Intensiva en 1994 y revisada adicionalmente en 1996.
SOFA es una puntuación de disfunción/insuficiencia de seis órganos que mide diariamente el fallo de múltiples órganos. Se puntúa cada órgano de 0 (normal) a 4 (máxima anormalidad), proporcionando una puntuación diaria de 0 a 24 puntos. El objetivo de la puntuación SOFA es crear una puntuación simple, fiable y continua para el personal clínico.
La evaluación secuencial de la disfunción orgánica durante los primeros días en la unidad de cuidados intensivos (UCI) o de admisión hospitalaria es un buen indicador de pronóstico. Tanto la puntuación SOFA media como la máxima son predictores particularmente útiles de resultado.
Referencias de la puntuación SOFA
1. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. The Sequential Organ Failure Assessment score for predicting outcome in patients with severe sepsis and evidence of hypoperfusion at the time of emergency department presentation. Crit. Care Med. mayo de 2009; 37(5):1649-54.
2. Ferreira FL, Bota DP, Bross A, Mélot C, Vincent JL. Serial evaluation of the SOFA score to predict outcome in critically ill patients. JAMA 10 de octubre de 2001, 10;286(14): 1754-8.
3. Vincent JL, Moreno R, Takala J, Willatts S, De Mendonga A, Bruining H, Reinhart CK, Suter PM, Thijs LG. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med. jul. 1996; 22(7):707-10.
En una forma de realización específica, el grupo de pacientes de acuerdo con la invención presenta como umbral inferior por lo menos una puntuación SOFA, siendo de 1 para uno de los criterios clínicos de respiración, hepático, coagulación, cardiovascular o SNC, o renal el día de admisión en el hospital o unidad de cuidados intensivos (UCI). De esta manera, dicho grupo de pacientes requiere intervención terapéutica según la invención y, de esta manera, requiere prevención o reducción de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes según la invención presenta como umbral inferior por lo menos dos puntuaciones SOFA, siendo de 1 cada una de ellas para los criterios clínicos de respiración y/o hepático, y/o coagulación y/o cardiovascular, y/o SNC, y/o renal el día de la admisión en el hospital o unidad de cuidados intensivos (UCI). De esta manera, dicho grupo de pacientes requiere intervención terapéutica según la invención y, de esta manera, requiere prevención o reducción de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes según la invención presenta como umbral inferior por lo menos dos puntuaciones SOFA, siendo de 1 cada una de ellas para los criterios clínicos de respiración y/o hepático, y/o coagulación y/o cardiovascular, y/o SNC, y/o renal el día de la admisión en el hospital o unidad de cuidados intensivos (UCI). De esta manera, dicho grupo de pacientes requiere intervención terapéutica según la invención y, de esta manera, requiere prevención o reducción de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes según la invención presenta como umbral inferior por lo menos cuatro puntuaciones SOFA, siendo de 1 cada una de ellas para los criterios clínicos de respiración y/o hepático, y/o coagulación y/o cardiovascular, y/o SNC, y/o renal el día de la admisión en el hospital o unidad de cuidados intensivos (UCI). De esta manera, dicho grupo de pacientes requiere intervención terapéutica según la invención y, de esta manera, requiere prevención o reducción de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes que requiere prevención o reducción de la disfunción orgánica renal o insuficiencia orgánica renal según la invención presenta una puntuación SOFA renal de por lo menos 1, o de 2, o de 3 o de 4.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes que requiere prevención o reducción de la disfunción orgánica hepática o insuficiencia orgánica hepático según la invención presenta una puntuación SOFA hepática de por lo menos 1, o de 2, o de 3 o de 4.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes que requiere prevención o reducción de la disfunción
orgánica cardiaca o insuficiencia orgánica cardiaco según la invención presenta una puntuación SOFA cardiaca de por lo menos 1, o de 2, o de 3 o de 4.
En otra forma de realización específica, el grupo de pacientes que requiere prevención o reducción de la disfunción orgánica pulmonar o insuficiencia orgánica pulmonar según la invención presenta una puntuación SOFA pulmonar de por lo menos 1, o de 2, o de 3 o de 4.
Con independencia de la puntuación inicial, generalmente un incremento de la puntuación SOFA durante las primeras 48 horas en la UCI o en el hospital predice una tasa de mortalidad de por lo menos 50%.
De esta manera, en otra forma de realización específica, el grupo de paciente que requiere intervención terapéutica para disfunción/insuficiencia orgánica según la invención se caracteriza por que presenta por lo menos una puntuación SOFA incrementada dentro de las 48 horas iniciales tras la administración en el hospital o UCI.
Grupo de pacientes - disfunción/fallo renal
A continuación, dichos criterios clínicos indican el grupo o grupos de pacientes para disfunción/insuficiencia renal:
• pacientes en riesgo de disfunción/insuficiencia renal: reducción de GFR >25%, creatinina sérica incrementada 1,5 veces o producción de orina <0,5 ml/kg/h durante 6 horas.
• Pacientes con lesión renal actual: reducción de GFR >50%, duplicación de la creatinina o de la producción de orina <0,5 ml/kg/h durante 12 horas.
• Pacientes con insuficiencia renal: reducción de GFR >75%, triplicación de la creatinina o creatinina >355 pmoles/l (con una elevación >44) (>4 mg/dl) o producción de orina inferior a 0,3 ml/kg/h durante 24 horas.
• Pacientes con pérdida de la función renal: lesión renal aguda (LRA) persistente o pérdida completa de la función renal durante más de 4 semanas.
• Enfermedad renal de estadio terminal: pérdida completa de función renal durante más de 3 meses.
Grupo de pacientes - disfunción/insuficiencia hepática
El grupo de pacientes de disfunción/insuficiencia hepática se caracteriza por un umbral inferior de bilirrubina >1,2 mg/dl, preferentemente >1,9 mg/dl, más preferentemente >5,9 mg/dl.
Agotamiento de oxígeno
El experto en la materia conoce que la sepsis se asocia a disfunción mitocondrial, que inevitablemente conduce al deterioro del consumo de oxígeno y finalmente al fallo multiorgánico inducido por sepsis.
Esto resulta especialmente cierto para tensiones de oxígeno tisular elevadas en pacientes sépticos, lo que sugiere una capacidad reducida de los órganos de utilizar el oxígeno. Debido a que la producción de ATP mediante la fosforilación oxidativa mitocondrial explica más de 90% del consumo total de oxígeno, la disfunción mitocondrial puede resultar directamente en la insuficiencia orgánica, posiblemente debido al óxido nítrico, que es conocido que inhibe la respiración mitocondrial in vitro y que se produce en exceso en la sepsis.
Por lo tanto, en una forma de realización muy específica de la invención, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM están particularmente destinados a ser utilizados en métodos de prevención para disfunción e insuficiencia orgánica en pacientes de SIRS, sepsis, sepsis severa, choque y choque séptico.
El agotamiento de oxígeno asimismo puede estar causado por sucesos isquémicos tales como, por ejemplo, la cirugía de baipás.
El anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM asimismo puede administrarse preventivamente antes de que el paciente muestre ningún signo de disfunción o fallo de un órgano. Este podría ser el caso si el paciente sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, donde pueden esperarse problemas de disfunción o insuficiencia, por ejemplo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos y intoxicación. El anticuerpo anti-ADM, el fragmento de anticuerpo anti-ADM o el andamiaje no Ig
anti-ADM asimismo pueden administrarse preventiva o terapéuticamente antes, durante o después de quimioterapia. Lo mismo se aplica a cirugías en las que pueden producirse daños isquémicos en determinados órganos, lo que puede resultar en disfunción o insuficiencia de un órgano. El término “preventivamente” se refiere a antes de producirse un daño orgánico y “terapéuticamente” se refiere a que ya se ha producido un daño orgánico. Especialmente útil es el anticuerpo, fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de disfunción o insuficiencia orgánica durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
La enfermedad crónica o aguda, o las afecciones agudas pueden seleccionarse de entre el grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), o sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
A continuación, se describen criterios clínicos para SIRS, sepsis, sepsis severa y choque séptico.
1) Respuesta inflamatoria sistémica del huésped (SIRS) caracterizada por como mínimo dos de los síntomas siguientes:
• pacientes que muestran hipotensión (presión arterial media <65 mmHg)
• nivel elevado de lactato en suero, siendo >4 mmoles/l
• glucosa sanguínea >7,7 mmoles/l (en ausencia de diabetes)
• presión venosa central no comprendida en el intervalo de 8 a 12 mmHg
• producción de orina <0,5 ml x kg-1 x h-1
• saturación venosa central de oxígeno (vena cava superior) <70% o venosa mixta <65%
• frecuencia cardiaca >90 latidos/min
• temperatura <36°C o >38°C
• tasa respiratoria >20/min
• recuento leucocitario <4 o >12x109/l (leucocitos); >10% neutrófilos inmaduros
2) Sepsis
Después de, como mínimo, dos de los síntomas mencionados en 1) y adicionalmente una sospecha clínica de nueva infección, que son:
• tos/esputo/dolor torácico
• dolor abdominal/distensión/diarrea
• infección de la línea
• endocarditis
• disuria
• cefalea con rigidez del cuello
• celulitis/herida/infección de articulación
• microbiología positiva para cualquier infección
3) Sepsis severa
En el caso de que se manifieste sepsis en el paciente y, adicionalmente, se tenga una sospecha clínica de cualquier disfunción orgánica:
• presión sanguínea sistólica <90/media; <65 mmHg
• lactato > 2 mmoles/l
• bilirrubina >34 pmoles/l
• producción de orina < 0,5 ml/kg/h durante 2 h
• creatinina > 177 pmoles/l
• plaquetas < 100x109/l
• SpO2 > 90% a menos que se proporcione O2
4) Choque séptico
Se manifiesta por lo menos un signo de disfunción de órgano terminal tal como se ha mencionado en 3). Se indica choque séptico en el caso de hipotensión refractaria que no responde al tratamiento y la administración intravenosa de líquidos por sí sola resulta insuficiente para evitar la hipotensión de la presión sanguínea del paciente; asimismo indicado para la administración de un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención.
De esta manera, la enfermedad crónica o aguda, o las afecciones agudas, respectivamente, se seleccionan de entre el grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), o sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
En una forma de realización de la presente invención, el paciente no sufre SIRS, una infección severa, sepsis, o choque, tal como, por ejemplo, choque séptico. Dicha infección severa se refiere a, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis severa y choque, tal como, por ejemplo, choque séptico. A este respecto, una sepsis severa se caracteriza porque la sepsis se manifiesta en dicho paciente y, adicionalmente, se tiene una sospecha clínica de disfunción de cualquier órgano, siendo:
• presión sanguínea sistólica < 90/media; < 65 mmHg
• lactato > 2 mmoles/l
• bilirrubina >34 pmoles/l
• producción de orina < 0,5 ml/kg/h durante 2 h
• creatinina >177 pmoles/l
• plaquetas < 100x109/l
• SpO2 > 90% a menos que se proporcione O2
En otra forma de realización específica, dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, no es sepsis, sepsis severa o no es SIRS o no es choque, o choque séptico.
En otra forma de realización, dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, no es sepsis.
En otra forma de realización, dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende meningitis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia.
Debe enfatizarse que el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM proporcionados en la presente memoria no están destinados a métodos de tratamiento de primera línea de enfermedades asociadas a ningún órgano, tales como nefrolitos, cáncer renal, nefritis, cirrosis hepática, hígado graso, cáncer hepático o, por ejemplo, hepatitis. El anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM según la invención están destinados a la utilización para prevenir o resolver un mal funcionamiento de la función fisiológica del órgano respectivo.
El efecto protector del órgano del anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM, de esta manera, sustenta la terapia primaria de dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda. En el caso de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, como una infección severa, SIRS, sepsis o similar, la terapia primaria sería, por ejemplo, la administración de antibióticos. El anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM protegería el órgano y ayudaría a evitar el agravamiento de la condición crítica de dicho paciente hasta que tenga efecto, por ejemplo, la administración de antibiótico. Tal como se ha mencionado anteriormente, el anticuerpo anti-ADM, el fragmento de anticuerpo anti-ADM o el andamiaje no Ig anti-ADM puede administrarse de una manera preventiva o de una manera terapéutica; es decir, con el fin de evitar problemas de disfunción o insuficiencia o con el fin de reducir la disfunción orgánica en el caso de encontrarse presentes en dicho paciente problemas de disfunción.
En otra forma de realización específica de la invención, la expresión “el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM pueden administrarse de una manera preventiva o de una manera terapéutica” denota la utilización de administración sistémica en el paciente.
En una forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM debe utilizarse en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, en el que dicha combinación está destinada a la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, para proteger un órgano de dicho paciente.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en terapia de un paciente que requiere del tratamiento con un agente vasopresor, por ejemplo, de la administración de catecolamina.
Además, en una forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM debe utilizarse en combinación con líquidos administrados por vía intravenosa, en el que dicha combinación está destinada a la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, para la protección de los órganos de dicho paciente. Debe enfatizarse que dichos líquidos que deben administrarse por vía intravenosa se administran por vía sistémica.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que sufre una enfermedad o afección crónica o aguda, que requiere de la protección de sus órganos se caracteriza por la necesidad de dicho paciente de obtener líquidos intravenosos.
Debe indicarse que, según la invención, administración de líquidos está en el significado de administración sistémica de líquidos.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de un paciente que requiere de líquidos intravenosos. Incluso con la restauración de una presión sanguínea adecuada y salida cardiaca normal o supranormal, pueden persistir los signos de hipoperfusión de los tejidos. Con frecuencia se denomina “choque distributivo” y puede estar relacionado con la mala distribución y flujo sanguíneo al nivel regional o microvascular y/o a una incapacidad celular de utilizar el oxígeno a pesar de que el suministro de oxígeno sea el adecuado. Resulta clínicamente importante que se identifique la hipoperfusión de los tejidos, a pesar de que aparentemente existan presiones sanguíneas “normales”, y deberían desencadenar una intervención rápida. Según la presente invención, dicha intervención es la administración de un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, destinado a la prevención o reducción de la disfunción orgánica.
Un anticuerpo según la presente invención es una proteína que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que se unen específicamente a un antígeno. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD), epsilón (IgE) y mu (IgM), así como la multitud de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa generalmente presentan una longitud de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa generalmente presentan una longitud de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos. Las cadenas ligeras están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2-terminal (de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. Las cadenas pesadas están codificadas de manera similar por un gen de región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos de longitud) y uno de los otros genes de región constante.
La unidad estructural básica de un anticuerpo es generalmente un tetrámero que consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, en los que cada par presenta una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen a un antígeno, y las regiones constantes median en funciones efectoras. Las inmunoglobulinas asimismo existen en una diversidad de otras formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y (Fab')2, así como anticuerpos híbridos bifuncionales y cadenas sencillas (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105,1987; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2a ed., 1984; Hunkapiller y Hood, Nature 323:15-16,1986). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una región marco interrumpida por tres regiones hipervariables, asimismo denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) (ver Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Tal como se ha indicado anteriormente, los CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Un complejo inmunológico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano, o fragmento de anticuerpo funcional, específicamente unido al antígeno.
Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos los genes de cadena ligera y pesada de los cuales se han construido típicamente mediante ingeniería genética, a partir de genes de región variable y constante de inmunoglobulina
pertenecientes a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico terapéutico es, de esta manera, una proteína híbrida compuesta del dominio variable o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio constante o efector de un anticuerpo humano, aunque pueden utilizarse otras especies de mamífero, o la región variable puede producirse mediante técnicas moleculares. Los métodos de generación de anticuerpos quiméricos son bien conocidos de la técnica, por ejemplo, ver la patente US n° 5.807.715. Una inmunoglobulina “humanizada” es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (tal como un ratón, rata o sintético). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina “donante” y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina “aceptora”. En una forma de realización, todas las CDR procedente de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes aunque, si están presentes, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, por lo menos aproximadamente 85-90%, tal como aproximadamente 95% o más, idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente los CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede presentar un número limitado de sustituciones por aminoácidos obtenidos del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden presentar sustituciones conservadoras adicionales de aminoácidos que no presentan sustancialmente ningún efecto sobre la unión de antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Son sustituciones conservadoras ejemplificativas, gly, ala, val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Pueden construirse inmunoglobulinas humanizados mediante ingeniería genética (por ejemplo, ver la patente US n° 5.585.089). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en el que los genes de cadena ligera y pesada son de origen humano. Pueden generarse anticuerpos humanos utilizando métodos conocidos en la técnica. Pueden producirse anticuerpos humanos mediante la inmortalización de una célula B humana que secreta el anticuerpo de interés. La inmortalización puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante infección de VEB o mediante la fusión de una célula B humana con un mieloma o célula de hibridoma para producir una célula de trioma. Asimismo pueden producirse anticuerpos humanos mediante métodos de expresión fágica (ver, por ejemplo, Dower et al., publicación de patente PCT n° WO 91/17271; McCafferty et al., publicación de patente PCT n° WO 2/001047; y Winter, publicación de patente PCT n° WO92/20791), o seleccionarse de una biblioteca combinatorial de anticuerpos monoclonales (ver el sitio de internet de Morphosys). Asimismo pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la utilización de animales transgénicos portadores de un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ver Lonberg et al., publicación de patente PCT n° WO 93/12227; y Kucherlapati, publicación de patente PCT n° WO 91/10741).
De esta manera, el anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina pueden presentar los formatos conocidos de la técnica. Son ejemplos los anticuerpos humanos, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos con injerto de CDR. En una forma de realización preferida, los anticuerpos según la presente invención son anticuerpos producidos recombinantemente tales como, por ejemplo, IgG, una inmunoglobulina de longitud completa típica, o fragmentos de anticuerpo que contienen por lo menos el dominio variable F de cadena pesada y/o ligera, tal como, por ejemplo, anticuerpos acoplados químicamente (fragmento de unión a antígeno), incluyendo, aunque sin limitación, fragmentos Fab, incluyendo minicuerpos Fab, anticuerpos Fab de cadena sencilla, anticuerpos Fab monovalentes con etiquetas epítopo, por ejemplo, Fab-V5Sx2; Fab bivalente (minianticuerpo) dimerizado con el dominio CH3; Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo, formado mediante multimerización con ayuda de un dominio heterólogo, por ejemplo, mediante dimerización de dominios dHLX, por ejemplo, Fab-dHLX-FSx2, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multivalentes multimerizados y/o multiespecíficos, diacuerpos bivalentes y/o biespecíficos, BITE® (acoplador biespecífico de células T), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo, de una clase diferente de G; anticuerpos de dominio único, por ejemplo, nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camélido o de pez, y numerosos otros.
Además, en una forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM es monoespecífico. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM monoespecífico se refiere a que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región específica que comprende por lo menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana.
El anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM monoespecífico son anticuerpos antiadrenomedulina (ADM) o fragmentos de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiajes no Ig anti-ADM la totalidad de los cuales presenta afinidad para el mismo antígeno.
En otra forma de realización de la invención, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM es monoespecífico.
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico o fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina monoespecífico o andamiaje no Ig anti-ADM monoespecífico se refiere a que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región específica que comprende por lo menos 4 aminoácidos dentro de la ADM diana.
En otra forma de realización especial, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo que se une a ADM es un anticuerpo monoespecífico. El término “monoespecífico” se refiere a que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una región específica que comprende por lo menos 5 aminoácidos dentro de la ADM diana.
En otra forma de realización especial y preferida, el anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo que se une a ADM es un anticuerpo monoespecífico. El término “monoespecífico” se refiere a que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una región específica que comprende por lo menos 4 aminoácidos dentro de la ADM diana.
Los anticuerpos o fragmentos monoespecíficos son anticuerpos o fragmentos la totalidad de los cuales presenta afinidad para el mismo antígeno. Los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos, pero asimismo pueden producirse anticuerpos monoespecíficos por otros medios diferentes de su producción por una célula germinal común.
Además de los anticuerpos anti-ADM, es bien conocido en la técnica que otros andamiajes de biopolímero acomplejan una molécula diana y se han utilizado para la generación de biopolímeros altamente específicos de diana. Son ejemplos, aptámeros, spiegélmeros, anticalinas y conotoxinas. A título ilustrativo de formatos de anticuerpo, ver la figura 1a, 1b y 1c.
En una forma de realización preferida el formato de anticuerpo anti-ADM se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión de scFv-Fc. En otra forma de realización preferida, el formato de anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugados de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como los fragmentos PEGilados. Uno de los formatos más preferidos es el formato scFab.
Los andamiajes no Ig pueden ser andamiajes de proteínas y pueden utilizarse como miméticos de anticuerpos, ya que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los andamiajes no Ig pueden seleccionarse de entre el grupo que comprende andamiajes no Ig basados en tetranectina (por ejemplo, descritos en el documento US 2010/0028995), andamiajes de fibronectina (por ejemplo, descritos en la patente EP 1266 025; andamiajes basados en lipocalina (por ejemplo descritos en el documento WO 2011/154420); andamiajes de ubiquitina (por ejemplo descritos en el documento WO 2011/073214), andamiajes de transferencia (por ejemplo descritos en el documento US 2004/0023334), andamiajes de proteína A (por ejemplo descritos en la patente EP 2231860), andamiajes basados en repetición de anquirina (por ejemplo descritos en el documento WO 2010/060748), andamiajes microproteínas, preferentemente de microproteínas que forman un nudo de cistinas) (por ejemplo, descritos en la patente EP 2314308), andamiajes basados en el dominio Fyn-SH3 (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/023685), andamiajes basados en dominio EGFR-A (por ejemplo descritos en el documento WO 2005/040229) y andamiajes basados en dominio Kunitz (por ejemplo descritos en la patente EP 1941867).
En una forma de realización de la invención, pueden producirse anticuerpos anti-ADM según la presente invención de la manera siguiente:
se inmunizó un ratón Balb/c con 100 |jg de conjugado de ADM-péptido (antígeno)-BSA los días 0 y 14 (emulsionados en 100 j l de adyuvante completo de Freund) y 50 jg los días 21 y 28 (en 100 j l de adyuvante incompleto de Freund). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 jg del conjugado disueltos en 100 j l de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos procedentes del ratón inmunizado y células de la estirpe celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron mediante el cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y suplemento HAT). Tras dos semanas, se sustituyó el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno al medio de cultivo celular normal.
Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a cribado primario para anticuerpos Ig específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos con resultado positivo en el ensayo se transfirieron a placas de 24 pocillos para la propagación. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron utilizando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (ver asimismo Lane R.D. 1985). A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler, B. et al. (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibodymediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res. 28: 11-15, 2012).
Los anticuerpos pueden producirse mediante expresión fágica según el procedimiento siguiente:
Las bibliotecas génicas de anticuerpos no sensibilizados humanos HAL7/8 se utilizaron para el aislamiento de dominios variables F de cadena sencilla recombinantes (scFv) contra el péptido adrenomedulina. Las bibliotecas génicas de anticuerpo se cribaron con una estrategia de reconocimiento y selección (“panning”) que comprende la utilización de péptidos que contienen una etiqueta de biotina unida mediante dos espaciadores diferentes a la secuencia del péptido adrenomedulina. Se utilizó una mezcla de rondas de reconocimiento y selección utilizando antígeno unido no específicamente y antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de reconocimiento y selección se han utilizado para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monoclonal. El sobrenadante del cultivo de estas cepas clonales se ha utilizado directamente para un ensayo de ELISA de antígenos (ver asimismo Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I. Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).
La humanización de anticuerpos murinos puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento siguiente:
para la humanización de un anticuerpo de origen murino, la secuencia de anticuerpo se analiza para la interacción estructural de las regiones marco (FR) con las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y el antígeno. Basándose en el modelado estructural, se seleccionó una FR de origen humano y se trasplantaron las secuencias de CDR murinas en la FR humana. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR o FR para recuperar interacciones estructurales, las cuales pueden anularse mediante el intercambio de especie de las secuencias de FR. Esta recuperación de interacciones estructurales puede conseguirse mediante un enfoque aleatorio, utilizando bibliotecas de expresión fágica o mediante un enfoque dirigido que se guíe por el modelado molecular (ver Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 1 de enero de 2008; 13:1619-33).
En una forma de realización preferida, el formato de anticuerpo de ADM se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión de scFv-Fc. En otra forma de realización preferida, el formato de anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugados de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como los fragmentos PEGilados. Uno de los formatos más preferidos es el formato scFab.
En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, el fragmento de anticuerpo anti-ADM o el andamiaje no Ig anti-ADM es un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 5 aminoácidos de longitud completa contenido en la ADM.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 4 aminoácidos de longitud completa contenido en la ADM.
En una forma de realización preferida de la presente invención, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se une a una región de ADM que se sitúa en la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina (ver la figura 2).
En otra forma de realización preferida, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM reconoce y se une al extremo N-terminal (aa 1) de la adrenomedulina. Extremo N-terminal se refiere a que el aminoácido 1 que es “Y” en la SEC ID n° 21 o n° 23 es obligatorio para la unión. El anticuerpo, fragmento o andamiaje no se uniría a adrenomedulina extendida por el extremo N-terminal o modificada por el extremo N-terminal o degradada por el extremo N-terminal.
El anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina según la invención se proporciona para la utilización en terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, respectivamente, y se une a una región de por lo menos 4, o de por lo menos 5 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura:
SEC ID n° 23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.
En otra forma de realización específica según la invención, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti
ADM o andamiaje no Ig anti-ADM proporcionado en la presente memoria no se une a la parte C-terminal de la ADM, es decir, los aa 43-52 de ADM (SEC ID n° 25)
PRSKISPQGY-NH2
(SEC ID n° 25).
En una forma de realización específica, resulta preferido utilizar un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención, en la que dicho anticuerpo antiadrenomedulina, dicho fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig es un anticuerpo estabilizador de ADM, un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina que potencia la semivida (ti/2; tiempo de semirretención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
La semivida (tiempo de semirretención) de ADM puede determinarse en plasma humano en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM, un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente, utilizando un inmunoensayo para la cuantificación de la ADM.
Pueden llevarse a cabo las etapas siguientes:
• la ADM puede diluirse en plasma citrato humano en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM, de un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o de un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente, y puede incubarse a 24°C.
• Se recogieron alícuotas en puntos temporales seleccionados (por ejemplo, dentro de las 24 horas) y la degradación de la ADM puede detenerse en dichas alícuotas mediante congelación a -20°C.
• La cantidad de ADM puede determinarse mediante un inmunoensayo de ADMh directamente, en el caso de que el ensayo seleccionado no esté influido por el anticuerpo estabilizador. Alternativamente, la alícuota puede tratarse con agentes desnaturalizantes (como HCl) y, tras clarificar la muestra (por ejemplo, mediante centrifugación) el pH puede neutralizarse y cuantificarse la ADM mediante un inmunoensayo de ADM. Alternativamente, pueden utilizarse tecnologías no de inmunoensayo (por ejemplo, RP-HPLC) para la cuantificación de la ADM.
• La semivida de la ADM se calculó para la ADM incubada en ausencia y en presencia de un anticuerpo estabilizador de ADM o un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente.
• La potenciación de la semivida se calcula para la ADM estabilizada en comparación con ADM que ha sido incubada en ausencia de un anticuerpo estabilizador de ADN, un fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina.
Un incremento de dos veces de la semivida de ADM es una potenciación de la semivida de 100%.
Se define semivida (tiempo de semirretención) como el periodo que requiere la concentración de un compuesto químico o fármaco específico para caer hasta la mitad de su concentración de línea base en el líquido especificado o sangre.
Un ensayo que puede utilizarse para la determinación de la semivida (tiempo de semirretención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma se describe en el ejemplo 3.
Para algunas enfermedades, el bloqueo de la ADM puede resultar beneficioso en cierto grado. Sin embargo, asimismo puede resultar perjudicial neutralizar totalmente la ADM, ya que puede requerirse una determinada cantidad de ADM para varias funciones fisiológicas. En muchos informes se ha enfatizado que la administración de ADM puede resultar beneficiosa en determinadas enfermedades. En contraste con lo anterior, en otros informes se ha informado de que la ADM puede resultar potencialmente letal al administrarla bajo determinadas condiciones.
En una forma de realización específica, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM es un anticuerpo, fragmento o andamiaje no Ig no neutralizador. Un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM neutralizador bloquearía la bioactividad de ADM hasta prácticamente 100%, hasta por lo menos más de 90%, preferentemente hasta por lo menos más de 95%.
En contraste, un anticuerpo anti-ADM no neutralizador, un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 100%, preferentemente a menos de 95%,
preferentemente a menos de 90%, más preferentemente a menos de 80% y todavía más preferentemente a menos de 50%. Lo anterior significa que la bioactividad residual de ADM unido al anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM no neutralizador sería superior a 0%, preferentemente superior a 5%, preferentemente superior a 10%, más preferentemente superior a 20%, más preferentemente superior a 50%.
En el presente contexto, una o más moléculas, sean de un anticuerpo, o de un fragmento de anticuerpo o de un andamiaje no Ig con “actividad anti-ADM no neutralizadora”, denominadas en conjunto en la presente memoria por simplicidad anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig “no neutralizador”, que, por ejemplo, bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80% se define como:
• una molécula o moléculas de unión a ADM, que con la adición a un cultivo de una estirpe celular eucariótica que expresa un receptor de ADM recombinante humano funcional compuesto de RTRC (receptor de tipo receptor de calcitonina) y RAMP3 (proteína 3 modificadora de la actividad de receptor) reduce la cantidad de cAMP producida por la estirpe celular mediante la acción de péptido ADM sintético humano añadido en paralelo, en el que dicha ADM sintética humana se añade en una cantidad que, en ausencia del anticuerpo no neutralizador que debe analizarse, conduce a una estimulación semimáxima de la síntesis de cAMP, en la que la reducción del nivel de cAMP por la unión de dicha molécula o moléculas a ADM tiene lugar en una medida que no es superior a 80%, ni siquiera al añadir la molécula o moléculas no neutralizadoras de unión a ADM en una cantidad que es 10 veces superior a la cantidad que se requiere para obtener la reducción máxima de la síntesis de cAMP obtenible con el anticuerpo no neutralizador que debe analizarse.
La misma definición se aplica a los demás intervalos, 95%, 90%, 50%, etc.
En una forma de realización específica según la presente invención, se utiliza un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50% (de los valores de línea base). Lo anterior significa que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig según la invención bloquean la bioactividad de la ADM a no más de 80% o a no más de 50%, respectivamente. En consecuencia, ello implica la presencia de por lo menos 20% de bioactividad de ADM residual o por lo menos 50% de bioactividad de ADM residual al utilizar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig según la invención. Se entiende que dicho bloqueo limitado de la bioactividad de ADM se produce incluso a una concentración en exceso del anticuerpo, fragmento o andamiaje, es decir un exceso del anticuerpo, fragmento o andamiaje en relación a la ADM. Dicho bloqueo limitado es una propiedad intrínseca del ligante de ADM mismo. Lo anterior implica que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje presenta una inhibición máxima de 80% o 50%, respectivamente. En una forma de realización preferida, dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM, bloquearía la bioactividad de ADM hasta por lo menos 5%. En consecuencia, lo anterior implica que se encuentra presente una bioactividad de ADM residual de aproximadamente 95%.
La bioactividad se define como el efecto que produce una sustancia sobre un organismo, tejido, órgano o unidad funcional viva, in vivo o in vitro (por ejemplo en un ensayo) después de su interacción. En el caso de la bioactividad de ADM, lo anterior puede ser el efecto de la ADM en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humana. De esta manera, según la presente invención, la bioactividad se define mediante un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina. Las etapas siguientes pueden llevarse a cabo con el fin de determinar la bioactividad de ADM en tal ensayo.
• Se generan curvas de dosis-respuesta con ADM en dicho ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humana.
• Puede calcularse la concentración de ADM de estimulación semimáxima de cAMP.
• Se generan curvas de dosis-respuesta a concentraciones de ADM estimuladoras de cAMP semimáxima constante (hasta 100 pg/ml, concentración final) con un anticuerpo estabilizador de ADM, fragmento de anticuerpo estabilizador de adrenomedulina o un andamiaje no Ig estabilizador de adrenomedulina, respectivamente.
Una inhibición máxima en dicho bioensayo de ADM de 50% significa que dicho anticuerpo anti-ADM, dicho fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o dicho andamiaje no Ig anti-ADM, respectivamente, bloquea la bioactividad a 50% de los valores de línea base. Una inhibición máxima en dicho bioensayo de ADM de 80% significa que dicho anticuerpo anti-ADM, dicho fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o dicho andamiaje no Ig antiadrenomedulina, respectivamente, bloquea la bioactividad a 80%. Esto es en el sentido de bloqueo de la bioactividad de ADM a no más de 80%. Lo anterior significa que sigue presente aproximadamente 20% de actividad residual de la ADM.
Sin embargo, en la presente memoria y en el contexto anterior, la expresión “bloquea la bioactividad de ADM” en
relación a los anticuerpos anti-ADM, fragmentos de anticuerpo anti-ADM y andamiajes no Ig anti-ADM dados a conocer en la presente memoria debe entenderse como una mera reducción de la bioactividad de ADM de 100% a 20% de la bioactividad de ADM remanente como máximo, preferentemente reduciendo la bioactividad de ADM de 100% a 50% de la bioactividad de ADM remanente, aunque en cualquier caso existe bioactividad de ADM remanente que puede determinarse tal como se ha detallado anteriormente.
La bioactividad de ADM puede determinarse en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina) según el ejemplo 2.
En una forma de realización preferida, se utiliza un anticuerpo anti-ADM modulador o un fragmento de anticuerpo anti-ADM modulador en el tratamiento de la sepsis. Un anticuerpo anti-ADM modulador o un fragmento de anticuerpo anti-ADM modulador potencia la bioactividad de ADM en la etapa temprana de la sepsis y reduce los efectos perjudiciales de la ADM en la etapa tardía de la sepsis. Un anticuerpo anti-ADM “modulador” o un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador es un anticuerpo que potencia la semivida (t-i/2, tiempo de semirretención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos al 10%, preferentemente por lo menos al 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%, y bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
En una forma de realización preferida, un anticuerpo anti-ADM modulador, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o un andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador se utiliza en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, para la estabilización de la circulación, en particular para la estabilización de la circulación sistémica.
Tal anticuerpo modulador, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador puede resultar especialmente útil en el tratamiento de la sepsis. Un anticuerpo modulador, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador potencia la bioactividad de la ADM en la etapa temprana de la sepsis y reduce los efectos perjudiciales de la ADM en la etapa tardía de la sepsis.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo antiadrenomedulina, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 5 aminoácidos de longitud completa contenido en la ADM, preferentemente en la ADM humana.
En una forma de realización más preferida, el anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina se dirige y puede unirse a un epítopo de por lo menos 4 aminoácidos de longitud completa contenido en la ADM, preferentemente en la ADM humana.
Un anticuerpo anti-ADM “modulador”, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig que potencia la semivida (t-i/2, tiempo de semirretención) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%, y bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50% y en el que dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM bloquearía la bioactividad de la ADM a por lo menos 5%. Estos valores relacionados con la semivida y el bloqueo de la bioactividad deben entenderse en relación a los ensayos anteriormente mencionados a fin de determinar estos valores. Esto se refiere al sentido de bloquear la ADM no más de 80% o no más de 50%, respectivamente.
Dicho anticuerpo antiadrenomedulina modulador, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina modulador o andamiaje no Ig antiadrenomedulina modulador ofrece la ventaja de que se facilita la dosificación de la administración. La combinación de bloqueo parcial o reducción parcial de la bioactividad de la adrenomedulina e incremento de la semivida in vivo (incremento de la bioactividad de la adrenomedulina) conduce a una simplicidad beneficiosa de la administración del anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina. En una situación de exceso de adrenomedulina endógena (estimulación máxima, etapa de sepsis tardía, choque, etapa hipodinámica), el efecto de reducción de la actividad es el impacto principal del anticuerpo, fragmento o andamiaje, limitando el efecto (negativo) de la adrenomedulina. En el caso de concentraciones de adrenomedulina endógenas bajas o normales, el efecto biológico del anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM es una combinación de reducción (o bloqueo parcial) e incremento de la semivida de la adrenomedulina. En el caso de que el efecto de semivida sea más fuerte que el efecto de bloqueo neto, la actividad biológica de la adrenomedulina endógena resulta beneficiosamente incrementada en las etapas tempranas de la sepsis (baja adrenomedulina, etapa hiperdinámica). De esta manera, el anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig antiadrenomedulina no neutralizador y modulador actúa como un tampón de la bioactividad de la ADM con el fin de mantener la bioactividad de la ADM dentro de un determinado intervalo fisiológico.
De esta manera, la administración del anticuerpo/fragmento/andamiaje en, por ejemplo, la sepsis, puede seleccionarse de una concentración excesiva, debido a que ambas etapas de sepsis (temprana y tardía) se
benefician del tratamiento de exceso de anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM en el caso de un efecto modulador. Medios excesivos: La concentración de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM es superior a la concentración de la adrenomedulina endógena durante la etapa tardía (choque) de, por ejemplo, la sepsis. Lo anterior significa, en el caso de un anticuerpo modulador, fragmento modulador o andamiaje modulador, la dosificación en la sepsis puede ser la siguiente:
la concentración de adrenomedulina en el choque séptico es de 226+/-66 fmoles/ml (Nishio et al., "Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxation of vascular tone in patients with septic shock", Crit. Care Med. 1997, 25(6):953-7), la concentración equimolar de anticuerpo, fragmento o andamiaje es de 42,5 |jg/l de sangre (respecto a 6 l de volumen de sangre / 80 kg de peso corporal) 3,2 jg/kg de peso corporal. Exceso se refiere a por lo menos el doble (media) de la concentración de adrenomedulina de choque séptico, por lo menos >3 jg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal, preferentemente por lo menos 6,4 jg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal. Preferentemente >10 jg/kg, más preferentemente >20 jg/kg, todavía más preferentemente >100 jg/kg de anticuerpo antiadrenomedulina, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM/kg de peso corporal.
Lo anterior asimismo puede aplicarse a otras condiciones severas y agudas aparte del choque séptico.
En una forma de realización específica de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM es un anticuerpo humano o humanizado o derivado del mismo. En una forma de realización específica, se injertan uno o más CDR (murinos) en un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo.
La materia objeto de la presente invención en un aspecto es un anticuerpo con injertación de CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la a Dm , en el que el anticuerpo con injertación de CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una cadena pesada (cadena H) de anticuerpo, que comprende
SEC ID n° 1
GYTFSRYW
SEC ID n° 2
ILPGSGST
y/o
SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y/o comprende además una cadena ligera (cadena L) de anticuerpo que comprende:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY
SEC ID n° 5
RVS
y/o
SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización específica de la invención, la materia objeto de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a la ADM o a un fragmento de anticuerpo del mismo, en el que la cadena pesada comprende por lo menos una CDR seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW
SEC ID n° 2
ILPGSGST
SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende por lo menos una CDR seleccionada de entre el grupo que comprende: SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización más específica de la invención, la materia objeto de la invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a la ADM humana o a un fragmento de anticuerpo de la misma, en el que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
En una forma de realización muy específica, el anticuerpo anti-ADM presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende: SEC ID n° 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.
El anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención muestra una afinidad para la ADM humana de manera que la constante de afinidad es superior a 1°'7 M, preferentemente DE 1°'8 M, la afinidad preferente es superior a 1°'9 M, más preferentemente es superior a 1°'1° M. El experto en la materia conoce que puede considerarse que compensa una afinidad inferior mediante la aplicación de una dosis más alta de compuestos y esta medida no conduciría a apartarse del alcance de la invención. Las constantes de afinidad puedes determinarse según el método descrito en el ejemplo 1.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza para reducir el riesgo de mortalidad durante dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda de un paciente.
La enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, según la presente invención es una enfermedad o afección seleccionada de entre el grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares aguda y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, arteriesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños por quimioterapia. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las etapas tardías de la sepsis.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se utiliza para reducir el riesgo de mortalidad durante dicha enfermedad crónica o aguda de un paciente, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico, y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal. Especialmente útil es el anticuerpo o fragmento o andamiaje según la presente invención para la reducción del riesgo de mortalidad durante la sepsis y el choque séptico, es decir, las
etapas tardías de la sepsis.
En una forma de realización preferida, se utiliza un anticuerpo modulador o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina modulador en el tratamiento de la sepsis. Un anticuerpo modulador potencia la bioactividad de la ADM en la etapa temprana de la sepsis y reduce los efectos perjudiciales de la ADM en la etapa tardía de la sepsis. Un anticuerpo “modulador” o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina es un anticuerpo que potencia la t-i/2, tiempo de semirretención de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%, y bloquea la bioactividad de la ADM menos de 80%, preferentemente menos de 50%.
En una forma de realización, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según la presente invención, en la que dicho paciente es un paciente de UCI. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM se utiliza en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según la presente invención, en el que dicho paciente se encuentra críticamente enfermo. La expresión “críticamente enfermo” se refiere a que el paciente presenta una enfermedad o estado en el que la muerte resulta posible o inminente.
El objeto de la presente invención es además un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, según la presente invención, en la que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje debe utilizarse en combinación con proteína de unión a ADM. La proteína de unión a ADM asimismo se encuentra naturalmente presente en la circulación de dicho paciente.
Debe enfatizarse que la expresión proteína de unión a ADM asimismo se refiere a la proteína 1 de unión a ADM (factor del complemento H), que sin embargo no es un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM no neutralizador y modulador según la invención.
El objeto de la presente invención es además un anticuerpo anti-ADM, un fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, según la presente invención, en la que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje debe utilizarse en combinación con principios activos adicionales.
La materia objeto de la invención asimismo es un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM para la utilización en combinación con un medicamento primario, en el que dicha combinación está destinada a la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en dicho paciente.
La expresión “medicamento primario se refiere a un medicamento que actúa contra la causa primaria de dicha enfermedad o afección; dicho medicamento primario pueden ser antibióticos en el caso de infecciones.
En una forma de realización específica de las combinaciones anteriormente mencionadas, dichas combinaciones deben utilizarse en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, en el que dicha combinación adicional está destinada a la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad o afección crónica o aguda, para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en dicho paciente.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda, o una afección crónica, que necesita de prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en dicho paciente, se caracteriza por la necesidad del paciente de obtener la administración de vasopresores, por ejemplo, la administración de catecolamina.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM que debe utilizarse en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales para la utilización en la terapia de un paciente que necesita el tratamiento de vasopresores, por ejemplo, el tratamiento de catecolamina.
En una forma de realización específica de las combinaciones anteriormente mencionadas, dichas combinaciones deben utilizarse en combinación con líquidos administrados por vía intravenosa, en el que dicha combinación está destinada a la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad o afección crónica o aguda, para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica en dicho paciente.
En una forma de realización de la invención, dicho paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, que requiere de la prevención o reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica en dicho paciente, se caracteriza por la necesidad del paciente de obtener líquidos intravenosos.
La materia objeto de la invención en una forma de realización específica es, de esta manera, un anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o un andamiaje no Ig anti-ADM en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales para la utilización en la terapia de un paciente que necesita de líquidos intravenosos.
Según la invención, la proteína 1 de unión a ADM asimismo puede denominarse proteína 1 de unión a ADM (factor H del complemento).
En una forma de realización específica de la invención, el anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina se proporciona para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje no es proteína 1 de unión a ADM (factor del complemento H).
Debe enfatizarse que la expresión proteína de unión a ADM asimismo se refiere a la proteína 1 de unión a ADM (factor del complemento H), que, sin embargo, no es un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM no neutralizador y modulador según la invención.
Dicho anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomoedulina o andamiaje no Ig anti-ADM o combinaciones de los mismos con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales, puede utilizarse en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o con líquidos administrados por vía intravenosa para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en dicho paciente.
La materia objeto de la invención asimismo es un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo antiadrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM según la presente invención que debe utilizarse en combinación con anticuerpos de TNF-alfa. Los anticuerpos de TNF-alfa se encuentran disponibles comercialmente para el tratamiento de los pacientes.
El objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según la presente invención. El objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
Dicha formulación farmacéutica puede administrarse por vía intramuscular. Dicha formulación farmacéutica puede administrarse por vía intravascular. Dicha formulación farmacéutica puede administrarse mediante infusión. En otra forma de realización, el objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado seco para la reconstitución antes de la utilización.
En otra forma de realización, el objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
En otra forma de realización, el objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
En otra forma de realización, el objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
En otra forma de realización el objeto de la presente invención es, además, una formulación farmacéutica según la presente invención, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Debe enfatizarse que la formulación farmacéutica según la invención según se administre por vía intramuscular, intravascular o mediante infusión, se administra preferentemente por vía sistémica en un paciente para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda. Por lo tanto, en otra forma de realización de la presente invención, la formulación farmacéutica según la presente invención debe administrarse por vía sistémica en un paciente para la prevención o reducción de disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda.
En otra forma de realización específica y preferida de la presente invención, la formulación farmacéutica según la presente invención debe administrarse por vía sistémica mediante infusión en un paciente para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica en un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a
continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
2. Anticuerpo de ADM, o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo estabilizador de ADM o fragmento de anticuerpo estabilizador de ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho paciente es un paciente de UCI.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma por lo menos en 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
10. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
13. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
15. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda de un paciente para la regulación del equilibrio de líquidos.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de DAM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda según la reivindicación 1 o 2 para la prevención o reducción del edema en dicho paciente.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo estabilizador de ADM o fragmento estabilizador de ADM o andamiaje no Ig estabilizador de ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención t-io) de la adrenomedulina en suero ,sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de AM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW
SEC ID n° 2
ILPGSGST
SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY
SEC ID n° 5
RVS
SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada
de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL
PGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGF
DYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WN S G ALTS G VHTFP A VLQS S GLYSLS S V VT VP S S S LGTQT YICN VNHKP SNTK
VDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTYPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
S WNSGALTS G VHTFP AVLQS SGLYSLS SVVTVP S S SLGT QT YICN VNHKP SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY
RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTK
LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
GNSQES VTEQD SKDSTYSLS STLTLSKAD YEKHKYYACE VTHQGLS SP VTKSF
NRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLÍY
RV SNRDSGVPDRFS GSGS GTDFTLKISRVE AED VGVYY CFQGSHIP YTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIP YTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC
Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho paciente es un paciente de UCI.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador que potencia la semivida (tiempo de semirretención, t i /2) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos en 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la utilización en combinación con catecolamina y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 12, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
20. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
21. Formulación farmacéutica según la reivindicación 20, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la estabilización de la circulación.
2. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo estabilizador de ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo de ADM modulador o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina modulador que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal.
10. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
13. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
15. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se
administra mediante infusión.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de a Dm para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente para la estabilización de la circulación.
2. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reduce la necesidad de vasopresor, por ejemplo, la necesidad de catecolamina, de dicho paciente.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
5. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
7. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo de a Dm , un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje modulador que potencia la semivida (tiempo de semirretención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma en por lo menos 10%, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY
SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
Q VQ LQ Q SG AELM KPG ASVKISC KATG YTFSR YW IEW VKQ R PG H G LEW IG EIL
PGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGF
DYW GQGTTLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLYKDYFPEPVTVS
W NSG ALTS G VHTFP A VLQS S G LY S LS S W T VP S S S LG T Q TY IC N VN H KP SNTK
V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRI
LPG S G STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FD YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG C LVKD YFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSC KASG YTFSR YW IEW VR Q APG Q G LEW M G R I
LPG S G STN YA Q KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FD YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG C LVKD YFPEPVTV
S WNS G ALTS G VHTFP A VLQ S S GLY S LS S V VT VP S S S LGT QTYICN VNHKP SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKATG YTFSRYW ISW VRQ APG Q G LEW M G EI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FD YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTV
S WNS GALTS G VHTFP A V LQ S SGL Y S LS S V VTVP S S SLGT Q TYIC N V N H K P SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKATG YTFSRYW IEW VRQ APG Q G LEW M G EI
LPG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SW N SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICN VNH KPSN T
KVDKRVEPKHHHHHH
SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY
RV SNRFSGVPDRFSGS GS GTDFTLKISRVEAEDLGVYY CFQGSHIP YTF GGGTK
LEIKRT V A AP S VFIFPP S DEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S
GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF
NRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEYTHQGLSSPVTKS
FNRGEC
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la utilización en combinación con catecolamina y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 10, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en el tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y/o en el que dicho anticuerpo bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
2. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en el tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador de la ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
3. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento según la reivindicación 3 se une al extremo N-terminal de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente 100%.
6. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, choque séptico, diabetes, cáncer, insuficiencia cardíaca, choque, insuficiencia orgánica, disfunción renal, desequilibrio agudo de líquidos y presión sanguínea baja.
8. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad es choque séptico o sepsis.
9. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento regula el equilibrio de líquidos de dicho paciente.
10. Anticuerpo de adrenomedulina o fragmento de anticuerpo de adrenomeedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento utilizado para la prevención de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
11. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento se utiliza para la prevención de la disfunción renal o la insuficiencia renal.
12. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo o fragmento se utiliza para estabilizar la circulación.
13. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente.
14. Anticuerpo de DAM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente.
15. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho anticuerpo o fragmento puede administrarse a una dosis de por lo menos 3 pg/kg de peso corporal.
16. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o andamiaje es un anticuerpo no neutralizador.
2. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de la ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y/o en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
3. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador de la ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención, t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente 100%, y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
4. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de DAM, en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o andamiaje según la reivindicación 3 se une al extremo N-terminal de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, dicho fragmento o dicho andamiaje es un anticuerpo o fragmento estabilizador de ADM que potencia el tiempo de semirretención, t-i/2, de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente 100%.
7. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización como sustancia farmacéutica activa.
8. Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, en la que dicha enfermedad o afección se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática, quemaduras, cirugía o traumatismos.
9. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, en la que dicha enfermedad es choque séptico o sepsis.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo, en el que la cadena pesada comprende por lo menos una de las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y/o en la que la cadena ligera comprende por lo menos una de las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
11. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL
PG SG STN YNEKFKG KATITADTSSN TAYM Q LSSLTSED SAVYYCTEG YEYD G F
D Y W G Q G TTLTV S S ASTKGP S VFPL APS SKSTSGGT A A L G C L V K D YFPEP V T V S
W NSGALTS G VHTFP A V L Q S S G LY S LS S W T VP S S S LG TQ TY IC N V N H KP SNTK
V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLYQSGAEVKKPGSSYKVSCKASGYTFSRYWISWYRQAPGQGLEWMGRI
LPG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
S W N S G ALTS G VHTFP A V L Q S S GLYS LS S W T VP S S S LG T Q TY IC N VN H KP SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKASG YTFSR YW IEW VR Q APG Q G LEW M G R I
LPGSGSTN Y AQKF QGRVTIT ADESTST AYMELS SLRSEDTA VYY CTEGYEYDG
FD Y W G O G TTYTY S S ASTKGP SYFPLAPS SKSTSGGT A A LG C XVKD YFPEP V T V
SW N SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICN VNH KPSN T
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
Q V Q L V Q S GAE V K K P GS S V K V S C K A TG YTF SRYWIS W VR Q AP GQGLE W M G E I
LPGS G S TN Y AQ K FQ G R VTITAD E STSTAY M E LS SLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FD Y W GQGTT V T V S S ASTKGP S VFPLAP S S KSTS G G TA A L G C L V K D YFPEP V T V
SW N SG A LTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYIC N VN H KPSN T
K V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKATG YTFSRYW IEW VRQ APG Q G LEW M G EI
LPG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLR SED TAVYYC TEG YEYD G
FD Y W GQGTT V T V S S ASTKGP SVFPLAPS SKSTSGGT A A LG C L V K D YFPEP V T V
SW N SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYIC N VN IIKPSN T
K V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQ TPLSLPVSLG DQ ATISC R SSQ SIVYSNG NTYLEW YLQ KPG Q SPKLLIY
R VSNRFS G VPDRF S GS GS G TD FTLKIS R VE A E D LG VYYCFQGSHIP YTFG G G TK
LE IK R TV AAP SVFIFP P S D E Q LK S G TA S W C LLN N FY P R E A K V Q W K V D N A LQ S
G N SQ ESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ G LSSPVTKSF
NRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVM TQ SPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNW FQQRPG QSPRRLIY
R V SNRDSGVPDRFSGSGS G TD FTLKISR VE AED V G V Y Y CFQGSHIP YTF GQGT
K LE IK R T V A A P S V F IF P P S D E Q LK S G T A S W C LLN N F Y P R E A K V Q W K V D N A LQ
SG NSQ ESVTEQ DSKD STYSLSSTLTLSKAD YEKH KVYAC EVTH Q G LSSPVTKS
FNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVM TQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEW FQ QRPGQ SPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHTPYTFGQGT
K L E IK R T V A AP S VFIFPPSDEQLKSGT AS W C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A LQ
SG NSQ ESVTEQ DSKD STYSLSSTLTLSKAD YEKH KVYAC EVTH Q G LSSPVTKS
FNRGEC
Anticuerpo de adrenomedulina, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la regulación del equilibrio de líquidos en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda.
Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 10, en el que el órgano es riñón o hígado.
Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig
de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la estabilización de la circulación en un paciente que presenta una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
16. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda en un paciente según la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo o fragmento reduce la necesidad de catecolamina de dicho paciente.
17. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina.
18. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la utilización en combinación con la administración de líquidos por vía intravenosa.
19. Anticuerpo de adrenomedulina, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la utilización en combinación con un anticuerpo de TNF-alfa.
20. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la utilización en un tratamiento de un paciente que necesita del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento puede administrarse en una dosis de por lo menos 3 pg/kg de peso corporal.
21. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 0.
22. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la utilización en un tratamiento de una enfermedad crónica o aguda, o afección crónica.
23. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig según la reivindicación 2 2 , en el que dicha enfermedad es sepsis.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda severa de un paciente para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente.
2. Anticuerpo de ADM, o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1 ) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100 %.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca, choque y disfunción renal.
8. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho paciente es un paciente de UCI.
9. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en el que el riesgo de mortalidad se reduce evitando sucesos adversos, en el que los últimos se seleccionan de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, choque séptico, insuficiencia orgánica, insuficiencia renal, desequilibrio de líquidos y presión arterial baja.
10. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en el que dicho anticuerpo o fragmento es para la utilización en combinación de proteína de unión a ADM.
11. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
13. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
15. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
En la presente memoria se dan a conocer además aspectos adicionales de la descripción tal como se explica a continuación:
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en terapia de una enfermedad severa crónica o aguda o afección aguda de un paciente para la reducción del riesgo de mortalidad de dicho paciente, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
2. Anticuerpo de ADM, o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1 2 1 ) de la adrenomedulina.
4. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención t-io) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10 %, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
7. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o un andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 , en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, tales como, por ejemplo, meningitis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis; otras enfermedades, tales como diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis; choque, tal como, por ejemplo, choque séptico y disfunción orgánica, tal como, por ejemplo, disfunción renal, disfunción hepática; quemaduras, cirugía y traumatismos.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, una infección severa, sepsis, choque, por ejemplo, choque séptico.
9. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en la que dicho paciente es un paciente de UCI. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el riesgo de mortalidad se reduce mediante la prevención de un suceso adverso, en el que este último se selecciona de entre el grupo que comprende SIRS, sepsis, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca aguda, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular; insuficiencia orgánica, tal como, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia hepática, desequilibrio de líquidos y baja presión arterial.
10. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
12. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 0 , en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL
PGSGSTNYNEKFKGKATIT ADTS SNT AYMQLS SLTSEDS AVYY CTEGYEYDGF
D YWGQGTTLTV S S ASTKGP S VFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTV S
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK
VDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
S WNS G ALTSG VHTFP A VLQ S S GL Y S LS S V VT VP S S S LGTQT YICN VNHKP SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEI
LPGSGSTN Y AQKF QGRVTIT ADESTSTAYMELS S LRSEDTAVYY CTEG YEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
S WN S G ALTS G VHTFP A VLQ S S GLYS LS S W T V P S S SLGTQT YICN VNHKP SNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEI
LPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDG
FDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY
RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTK
LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF
NRGEC SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIY
RVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGT
KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVYCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQES VTEQD SKDSTYSLS STLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKS
FNRGEC
13. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 2 , para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una combinación según la reivindicación 10 , para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo, fragmento o andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
21. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina en preferentemente la ADM humana.
22. Anticuerpo, fragmento o andamiaje según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa 1) de la adrenomedulina.
Se explican a continuación aspectos adicionales de la descripción.
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina, para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, para la prevención de la disfunción orgánica o insuficiencia orgánica.
2. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda según la reivindicación 1 , en el que dicho órgano es el riñón.
3. Anticuerpo de ADM, o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según la reivindicación 1, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab) 2 y proteína de fusión scFv-Fc.
4. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
5. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento estabilizador de la ADM que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100 %.
7. Anticuerpo de ADM o un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que dicho anticuerpo bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
8. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca y choque.
9. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en el que dicho paciente es un paciente de UCI.
10. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento modulador que potencia el tiempo de semirretención t-i/2 de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10 %, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
11. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0.
12. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
13. Formulación farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
14. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
15. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Se explican a continuación aspectos adicionales de la descripción.
1. Anticuerpo de adrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, de un paciente, para la prevención o reducción de la disfunción orgánica, o para la prevención de la insuficiencia orgánica en dicho paciente.
2. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una enfermedad aguda según la reivindicación 1 , en el que dicho órgano es riñón o hígado.
3. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM es un anticuerpo de ADN no neutralizador, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina no neutralizador o un andamiaje no Ig de ADM no neutralizador.
4. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el formato del anticuerpo se selecciona de entre el grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento (Fab)2 y proteína de fusión scFv-Fc.
5. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de la adrenomedulina.
6. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de la adrenomedulina.
7. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que potencia la semivida (tiempo de semirretención t1/2) de la adrenomedulina en suero, sangre o plasma en por lo menos 10 %, preferentemente en por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
8. Anticuerpo de ADM, un fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
9. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM, para la utilización en la terapia de una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en el que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardiaca y choque.
10. Anticuerpo de ADM o fragmento de anticuerpo de adrenomedulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o fragmento de anticuerpo de la misma, en la que la cadena pesada comprende las secuencias: SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
11. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a ADM o un fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 10 , en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL
PG SG STNYNEKFKG KATITADTSSN TAYM Q LSSLTSED SAVYYCTEG YEYD G F
DYW G Q G TTLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTVS
W N S G ALTSG V H TFPA VLQ SS G LYSLSS W TVP SS SLG TQ TYIC N VN H KPS N TK
VD K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 8 (AM-VH1)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKYSCKASG YTFSR YW ISW VR Q APG Q G LEW M G R I
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SW NSG ALTSG VHTFPAVLQ SSG LYSLSSVVTVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNT
K V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSC KASG YTFSR YW IEW VR Q APG Q G LEW M G R I
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FD Y W GQGTT V T V S S ASTKGPS VFPLAP S SKSTSGGT A A L G C L V K D YFPEP V T V
S W N S G ALTS G VHTFP A V L Q S S G LYS LS S W T VP S S SLGTQT Y IC N V N H K P SNT
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Q V Q LV Q SG AEVKKPG SSVKVSC KATG YTFSR YW ISW VR Q APG Q G LEW M G EI
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FD YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG C LVKD YFP EPV TV
S WNS G ALTSG VH TFP AVLQ S SGLYSLS S VVTVPS S SLG TQ TYIC N V N H K P SNT
K V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKATG YTFSRYW IEW VRQ APG Q G LEW M G EI
LPG SGSTNYAQKF Q G R VTIT ADESTSTAYM ELS S LR S E D T A V Y Y CTEG YEYDG
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K V D K R V E P K H H H H H H SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
D VLLSQ TPLSLPVSLG D Q ATISC R SSQ SIVYSN G N TYLEW YLQ KPG Q SPKLLIY
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LE IK R TV A A P S V F IFP P S D E Q LK S G TA S W C LLN N F Y P R E A K V Q W K V D N A LQ S
G N SQ ESVTEQ D SKD STYSLSSTLTLSKAD YEKH KVYAC EVTH Q G LSSPVTKSF
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KLEIKR TVAA P S V FIFP P S D E Q LK S G TA S V V C LLN N FY P R E A K V Q W K V D N A LQ
SG NSQ ESVTEQ DSKD STYSLSSTLTLSKAD YEKH KVYAC EVTH Q G LSSPVTKS
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FNRGEC
12. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje modulador que potencia la semivida (tiempo de semirretención, t1/2) de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM a menos de 80%, preferentemente a menos de 50%.
13. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 2 , para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo de ADM, fragmento de anticuerpo de adrenomedulina o andamiaje no Ig de ADM para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una combinación según la reivindicación 13, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica según la reivindicación 18, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
Se explican a continuación formas de realización preferidas adicionales comprendidas dentro del alcance de la presente invención:
1. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a la adrenomedulina, para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda, o una afección aguda, para la prevención o la reducción de disfunción orgánica o la prevención de insuficiencia orgánica, en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID n° 23),
y en la que dicho órgano se selecciona de entre el grupo que comprende corazón, riñón, hígado, pulmones, páncreas, intestino delgado y bazo,
y en la que dicha enfermedad crónica o aguda, o afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque, tal como, por ejemplo, choque séptico, y disfunción orgánica, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismos, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia.
2. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según la reivindicación 1 , en el que dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig es monoespecífico.
3. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje muestra una afinidad de unión para ADM de por lo menos 10' 7 M, en el que dicha afinidad de unión se determina según el ejemplo 1.
4. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad agua o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje no es el factor H del complemento de la proteína -1 de unión a ADM.
5. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad agua o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal, aa 1, de la adrenomedulina madura.
6. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento o dicho andamiaje es un anticuerpo, fragmento o andamiaje estabilizador de la ADM que potencia la semivida, tiempo de semirretención t-i/2, de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10 %, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50% y todavía más preferentemente >100%.
7. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de la ADM no más de 80%, preferentemente no más de 50%, en el que la bioactividad de la ADM se determina en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante según el ejemplo 2.
8. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho paciente sufre una enfermedad que se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardíaca y choque.
9. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en el que dicha enfermedad no es SIRS, sepsis o choque séptico.
10. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a la ADM o a un fragmento de la misma, en el que la cadena pesada comprende las secuencias:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW
SEC ID n° 2
ILPGSGST
SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias:
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY
SEC ID n° 5
RVS
SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico humano o fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente según la reivindicación 1 0 , en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
Q V QLQQS G AELMKPG AS VKIS CKATG YTF SRYWIE WVKQRP GHGLEWIGEILP
GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD
YW GQGTTLTV S S ASTKGP S VFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTVS WN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPKHHHHHH
SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRÍL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YW GQGTTVTVSS ASTKGPS VFPLAP S SKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTV S WN
S G ALTS G VHTFP A VLQS S GL YS LS S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVDKR
VEPKHHHHHH
SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSR.YWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVT VP S S SLGTQTYICN VNHKP SNTKVDKR
VEPKHHHHHH
SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTT VTV S S ASTKGP S VFPLAP S SKSTS GGTAALGCLVKD YFPEP VTVS WN
SGALTSGVHTFP A VLQS SGLYSLS S VVT VPS S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPKHHHHHH
SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C) DVLLSQTPLSLPVSLGDQATÍSCRSSQSrVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE
IKRTVAAP S VFIFPPSDEQLKS GT AS W C LLN N F YPREAKV QWKVDNALQS GN S
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR
VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRD
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSV
FIFPP SDEQLKSGTAS VV CLLNNF YPREAKV Q WKVDNALQ SGN S QES VTEQD SKDSTY S
LS STLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC.
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en el que dicho anticuerpo, fragmento o andamiaje es un anticuerpo modulador, fragmento modulador o andamiaje modulador que potencia la semivida, tiempo de semirretención t12, de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM no más de 80%, preferentemente no más de 50%, en el caso de que la bioactividad de la ADM se determine en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humano según el ejemplo 2.
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 2 , para la utilización en combinación con vasopresores, por ejemplo, catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM), fragmento de anticuerpo anti-ADM de unión a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM de unión a adrenomedulina para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la utilización en combinación con proteína de unión a ADM y/o principios activos adicionales. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ADM, fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje no Ig anti-ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la utilización en la terapia de una enfermedad agua o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Formulación farmacéutica para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o agua, o una afección aguda, según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda, según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
21. Formulación farmacéutica para la utilización según las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica debe administrarse por vía sistémica en un paciente para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica en dicho paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda.
22. Formulación farmacéutica para la utilización según las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica debe administrarse por vía sistémica mediante infusión en un paciente para la prevención o reducción de la disfunción orgánica o la insuficiencia orgánica en dicho paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda, o una afección aguda.
Ejemplos
Debe enfatizarse que los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y andamiajes no Ig de la parte de ejemplos según la invención se unen a la a Dm y, de esta manera, deberían considerarse anticuerpos/fragmentos de anticuerpo/andamiajes no Ig anti-ADM.
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos y determinación de sus constantes de afinidad
Se produjeron varios anticuerpos humanos y murinos y se determinaron sus constantes de afinidad (ver las tablas 1 y 2 ).
Péptidos/conjugados para la inmunización:
Se sintetizaron péptidos para la inmunización; ver la tabla 1 (JPT Technologies, Berlin, Alemania) con una cisteína N-terminal adicional (en caso de no encontrarse presente cisteína dentro de la secuencia de ADM seleccionada) para la conjugación de los péptidos a albúmina de suero bovino (BSA). Los péptidos se unieron covalentemente a BSA mediante la utilización del gel de acoplamiento Sulfolink (Perbio-Science, Bonn, Alemania). El procedimiento de acoplamiento se llevó a cabo según el manual de Perbio.
Se generaron los anticuerpos murinos siguiendo el método a continuación:
se inmunizó un ratón Balb/c con 100 |jg de conjugado de péptido-BSA los días 0 y 14 (emulsionados en 100 j l de adyuvante completo de Freund) y 50 jg los días 21 y 28 (en 100 j l de adyuvante incompleto de Freund). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 jg del conjugado disueltos en 100 j l de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos procedentes del ratón inmunizado y células de la estirpe celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras el lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron mediante el cultivo en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 20% y suplemento HAT). Tras dos semanas, se sustituyó el medio HAT por medio HT durante tres pases, seguido del retorno al medio de cultivo celular normal.
Los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a cribado primario para anticuerpos IgG específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos con resultado positivo en el ensayo se transfirieron a placas de 24 pocillos para la propagación. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron utilizando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos (ver asimismo Lane R.D., "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody
secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibodymediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).
Producción de anticuerpos monoclonales de ratón:
Se produjeron los anticuerpos mediante métodos estándares de producción de anticuerpos (Marx et al, Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997) y se purificaron mediante proteína A. Las purezas de anticuerpos eran >95% según el análisis de electroforesis en gel de SDS.
Anticuerpos humanos
Se produjeron anticuerpos humanos mediante expresión fágica siguiendo el procedimiento a continuación:
Las bibliotecas génicas de anticuerpos no sensibilizados humanos HAL7/8 se utilizaron para el aislamiento de dominios variables F de cadena sencilla recombinantes (scFv) contra el péptido adrenomedulina. Las bibliotecas génicas de anticuerpo se cribaron con una estrategia de reconocimiento y selección que comprende la utilización de péptidos que contienen una etiqueta de biotina unida mediante dos espaciadores diferentes a la secuencia del péptido adrenomedulina. Se utilizó una mezcla de rondas de reconocimiento y selección utilizando antígeno unido no específicamente y antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de reconocimieto y selección se han utilizado para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monoclonal. El sobrenadante del cultivo de estas cepas clonales se ha utilizado directamente para un ensayo de ELISA de antígenos (ver asimismo Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).
Se seleccionaron los clones positivos basándose en una señal positiva en el ELISA para el antígeno y negativa en las placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina. Para una caracterización adicional, el marco de lectura abierto de scFv se clonó en el plásmido de expresión pOPE107 (Hust et al., J. Biotechn. 2011) capturado del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados y se purificó medinate una cromatografía de exclusión por tamaño.
Constantes de afinidad
Para determinar la afinidad de los anticuerpos para la adrenomedulina, se determinó la cinética de la unión de la adrenomedulina al anticuerpo inmovilizado mediante resonancia del plasmón superficial sin marcaje utilizando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania). Se llevó a cabo la inmovilización reversible de los anticuerpos utilizando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente a alta densidad con la superficie de un sensor CM5 siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare). (Lorenz et al.," Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy"; Antimicrob Agents Chemother.
55(1): 165-173, enero de 2011).
Se generaron los anticuerpos monoclonales contra las regiones de ADM ilustradas a continuación de la ADM humana y murina, respectivamente. La tabla a continuación representa una selección de los anticuerpos obtenidos utilizados en experimentos adicionales. La selección se basó en la región diana:
Tabla 1:
A continuación, se proporciona una lista de los anticuerpos monoclonales adicionales obtenidos: Lista de anticuerpos anti-ADM
Tabla 2:
Generación de fragmentos de anticuerpos mediante digestión enzimática:
La generación de fragmentos Fab y F(ab)2 se llevó a cabo mediante digestión enzimática del anticuerpo de longitud completa murino NT-M. El anticuerpo NT-M se digirió utilizando: a) el kit de preparación de F(ab)2 a base de pepsina (Pierce 44988) y b) el kit de preparación de Fab a base de papaína (Pierce 44985). Los procedimientos de fragmentación se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones proporcionadas por el proveedor. La digestión se llevó a cabo en el caso de la fragmentación de F(ab)2 durante 8 h a 37°C. La digestión de fragmentación de Fab se llevó a cabo durante 16 h, respectivamente.
Procedimiento para la generación y purificación de Fab:
La papaína inmovilizada se equilibró mediante lavado de la resina con 0,5 ml de tampón de digestión y se centrifugó la columna a 5.000xg durante 1 minuto. Después se descartó el tampón. La columna de desalado se preparó mediante eliminación de la disolución de almacenamiento y lavado de la misma con tampón de digestión, centrifugándola posteriormente cada vez a 1.000xg durante 2 minutos. Se añadieron 0,5 ml de la muestra de IgG preparada al tubo de la columna de centrifugación que contenía la papaína imovilizada equilibrada. La incubación de la reacción de digestión se llevó a cabo durante 16 h en un agitador basculante de laboratorio a 37°C. La columna se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto para separar el digerido de la papaína inmovilizada. Después, la resina se lavó con 0,5 ml de PBS y se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto. La fracción de lavado se añadió al anticuerpo digerido de manera que el volumen total de la muestra era de 1,0 ml. La columna de NAb-proteína A se equilibró con PBS y tampón de elución de IgG a temperatura ambiente. La columna se centrifugó durante 1 minuto para eliminar la disolución de almacenamiento (contiene azida sódica al 0 ,0 2 %) y se equilibró mediante la adición de 2 ml de PBS; se centrifugó nuevamente durante 1 minuto y se descartó el eluido. La muestra se aplicó a la columna y se resuspendió mediante inversión. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente con mezcla vertical durante 10 minutos. La columna se centrifugó durante 1 minuto, guardando el eluido con los fragmentos Fab.
(Referencias: Coulter, A. y Harris, R. (1983). J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner I. et al. (2010) {alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signalling. Cancer Res. 70, 277-87.; Kaufmann B. et al. (2010) Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS. 107, 18950-5.; Chen X. et al. (2010) Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin axp2. PNAS. 107, 14727-32.; Uysal H. et al. (2009) Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthritis. J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas G. M. et al. (2009) Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo. J. Exp. Med. 206, 1913-27.; Kong F. et al. (2009) Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand, J. Cell Biol. 185, 1275-84).
Procedimiento para la generación y purificación de fragmentos F(ab')?:
La pepsina inmovilizada se equilibró mediante lavado de la resina con 0,5 ml de tampón de digestión y se centrifugó la columna a 5.000xg durante 1 minuto. Después se descartó el tampón. La columna de desalado se preparó mediante eliminación de la disolución de almacenamiento y lavado de la misma con tampón de digestión, centrifugándola posteriormente cada vez a 1.000xg durante 2 minutos. Se añadieron 0,5 ml de la muestra de IgG preparada al tubo de la columna de centrifugación que contenía la pepsina imovilizada equilibrada. La incubación de la reacción de digestión se llevó a cabo durante 16 h en un agitador basculante de laboratorio a 37°C. La columna se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto para separar el digerido de la papaína inmovilizada. Después, la resina se lavó con 0,5 ml de PBS y se centrifugó a 5.000xg durante 1 minuto. La fracción de lavado se añadió al anticuerpo digerido de manera que el volumen total de la muestra era de 1,0 ml. La columna de NAb-proteína A se equilibró con PBS y tampón de elución de IgG a temperatura ambiente. La columna se centrifugó durante 1 minuto para eliminar la disolución de almacenamiento (contenía azida sódica al 0 ,0 2 %) y se equilibró mediante la adición de 2 ml de PBS; se centrifugó nuevamente durante 1 minuto y se descartó el eluido. La muestra se aplicó a la columna y se resuspendió mediante inversión. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente con mezcla vertical durante 10 minutos. La columna se centrifugó durante 1 minuto, guardando el eluido con los fragmentos Fab.
(Referencias: Mariani, M., et al. 1991). A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgG1. Mol. Immunol. 28: 69-77.; Beale, D. (1987). Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp. Comp. Immunol. 11:287-96.; Ellerson, J.R., et al. 1972). A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity. FEBS Letters 24(3):318-22.; Kerbel, R.S. and Elliot, B.E. 1983). Detection of Fc receptors. Meth. Enzymol. 93:113-147.; Kulkarni, P.N., et al. 1985). Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab')2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo. Cancer Immunol. Immunotherapy 19:211-4.; Lamovi, E. (1986). Preparación de fragmentos F(ab')2 de IgG de ratón de diversas subclases. Meth Enzymol 121:652-663.; Parham, P., et al. 1982). Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens. J Immunol Meth 53:133-73.; Raychaudhuri, G., et al. 1985). Human IgG1 and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines. Mol Immunol 22(9):1009-19.; Rousseaux, J., et al. 1980). The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain an pepsin. Mol Immunol 17:469-82.; Rousseaux, J., et al. 1983). Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J Immunol Meth 64:141-6.; Wilson, K.M., et al. 1991). Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate. J Immunol Meth 138:111-9).
Humanización de fragmento de anticuerpo NT-H
El fragmento de anticuerpo se humanizó mediante el método de injertación de CDR (Jones, P. T., Dear, P. H.,
Foote, J., Neuberger, M. S. y Winter, G. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321,522-525).
Se llevaron a cabo las etapas siguientes para conseguir la secuencia humanizada:
Extracción de ARN total: Se extrajo el ARN total a partir de los hibridomas de NT-H utilizando el kit de Qiagen. RT-PCR de primera ronda: Se utilizó el kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (n° de cat. 210210). Se llevó a cabo la RT-PCR con juegos de cebadores específicos para las cadenas pesada y ligera. Para cada muestra de ARN, se prepararon 12 reacciones de RT-PCR individuales de cadena pesada y 11 de cadena ligera, utilizando mezclas de cebadores directos degenerados que cubrían las secuencias líder de las regiones variables. Los cebadores inversos se encuentran situados en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. No se introdujeron sitios de restricción en los cebadores.
Configuración de reacción: 5x tampón de RT-PCR QIAGEN® OneStep, 5,0 pl, mezcla de dNTP (que contenía 10 mM de cada dNTP), 0,8 pl; juego de cebadores, 0,5 pl; mezcla de enzimas de RT-PCR QIAGe N® OneStep, 0,8 pl; ARN molde, 2,0 pl; agua libre de ARNasa hasta 20,0 pl; volumen total: 20,0 pl.
Condición de PCR: Transcripción inversa: 50°C, 30 min; activación de PCR inicial: 95°C, 15 min
Ciclado: 20 ciclos de 94°C, 25 s; 54°C, 30 s; 72°C, 30 s; Extensión final: 72°C, 10 min
PCR semianidada de segunda ronda: Los productos de RT-PCR procedentes de las reacciones de primera ronda se amplificaron adicionalmente en la pCr de segunda ronda. Se configuraron 12 reacciones de RT-PCR individuales de cadena pesada y 11 de cadena ligera, utilizando juegos de cebadores semianidados específicos para las regiones variables de anticuerpo.
Configuración de reacción: 2x mezcla de PCR, 10 pl; juego de cebadores, 2 pl; producto de PCR de primera ronda, 8 pl; volumen total, 20 pl; informe de clonación de hibridoma de anticuerpo.
Condición de PCR: desnaturalización inicial de 5 min a 95°C; 25 ciclos de 95°C durante 25 s, 57°C durante 30 s, 6 8 °C durante 30 s; extensión final: 10 min a 6 8 °C.
Tras finalizar la PCR, se aplicaron muestras de reacción de PCR a gel de agarosa para visualizar los fragmentos de ADN amplificados. Tras secuenciar más de 15 fragmentos de ADN clonados amplificados mediante RT-PCR anidada, se habían clonado varias cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo de ratón y aparentemente eran correctos. La alineación de secuencias de proteína y el análisis de CDR identificó una cadena pesada y una cadena ligera. Tras la alineación con secuencias de marco humanas homólogas, la secuencia humanizada resultante para la cadena pesada variable era la siguiente: ver la figura 6. Debido a que los aminoácidos en las posiciones 2 6 , 40 y 55 en la cadena pesada variable y el aminoácido en la posición 40 de la cadena ligera variable son críticos para las propiedades de unión, pueden revertirse al original murino. Los candidatos resultantes se ilustran posteriormente. (Padlan, E. A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28, 489-498.; Harris, L. and Bajorath, J. (1995) Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: Comparison of V gene subgroups. Protein Sci. 4, 306-310.).
Anotación para las secuencias de fragmentos de anticuerpos (SEC ID n° 7-14): en negrita y subrayados se señalan las CDR 1,2, 3 organizadas cronológicamente; en cursiva se señalan las regiones constantes; las regiones bisagra se subrayan con letras en negrita y la etiqueta de histidina, en letras en negrita y cursiva; la mutación puntual de marco presenta un fondo de letras grises.
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSG
STNYNEKFKGKATITADTS SNTA YMQLSSLTSEDSA VYYC TE G YE YD G F D Y WGOGTTLT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEP VTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQS
SGLYSLSSW TVPSSSLG TQ TYIG N VN H K PSN TKVD KRVEPKH H H H H H SEC ID n° 8 (AM-VH1)
QV QLVQS G AE VKKPGS S VKVSCKASGYTFSRYW IS WVROAPGOGLEWMGRILPG S
G S T N YAQKFQGUCVTYTADESTSTAYMELSSLRSEDTA VYYC T E G Y E Y D G F D Y WGOGTTV
TVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAAL GCL VKD YFPEP VTVS WNSGAL TSG VHTFPA
VLQ
SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
Q VQLVQS GAE VKKPGS SVKV SCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGS
GSTNY AQKF QGRVTIT ADESTSTA YMELSSLRSEDTA VYYCTEGYEYDGFDYWGOGTTV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEP VTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQ
SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICN VN H KPSN TKVD KRVEYKH H H H H H
SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
QV QLVQS GAE VKKPGS SVKV SCKATGYTFSRYWIS WVRQAPGQGLEWMGEILPGS
GSTNYAQKFOGRVTIT ADESTSTA YMELSSLRSEDTA VYYC T E G Y E Y D G F D Y W GOGTTV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQ
SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICN VN H KPSN TKVD KRVEPKH H H H H H
SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYW IEWVRQAPGQGLEWMGEILPGS
GSTNY AQKF QGRVTIT ADESTSTA YMELSSLRSEDTA VYYCTEGYEYDGFDYWGOGTTV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA.LGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQ
SSGL YSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKR V E YK H H H H H H
SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLOKPGOSPKLLIYRVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFOGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVA
APS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNN FYPRE AKV Q WKVDNALQSGN SQES VTEQDS
KDSTYSLS STLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGOSPRRLIYRVSN
RDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGOGTKLEIKRTVA
APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSOSIVYSNGNTYLEWFOORPGOSPRRLIYRVSN
RDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGOGTKLEIKRTVA
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ejemplo 2
Efecto de anticuerpos anti-ADM seleccionados sobre la bioactividad anti-ADM
El efecto de los anticuerpos de ADM seleccionados sobre la bioactividad de la ADM se sometió a ensayo en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina).
Ensayo de anticuerpos con diana en adrenomedulina humana o de ratón en ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humana (bioensayo de adrenomedulina)
Materiales:
Estirpe celular: CHO-K1
Receptor: Adrenomedulina (CRLR RAMP3)
Estirpe celular de número de acceso de receptor: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016
Las células CHO-K1 que expresan receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) antes del ensayo en medios sin antibiótico se desprendieron mediante enjuague suave con PBS-EDTA (EDTA 5 mM), recuperadas mediante centrifugación y resuspendidas en tampón de ensayo (KRH: KCl 5 mM, MgSO4 1,25 mM, NaCl 124 mM, HEPES 25 mM, glucosa 13,3 mM, KH2PO4 1,25 mM, CaCh 1.45 mM, BSA 0,5 g/l).
Se representaron curvas de respuesta a dosis en paralelo con los agonistas de referencia (ADMh o ADMm).
Ensayo de antagonistas (96 pocillos):
Para el ensayo de antagonistas, se mezclaron 6 pl del agonista de referencia (adrenomedulina humana (5,63 nM) o de ratón (0,67 nM)) con 6 pl de las muestras de ensayo a diferentes diluciones de agonista, o con 6 pl de tampón. Tras la incubación durante 60 min a temperatura ambiente, se añadieron 12 pl de células (2.500 células/pocillo). Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la adición del tampón de lisis, se estimó el porcentaje de DeltaF, según la especificación del fabricante, con el kit HTRF de Cis-Bio International (n° de cat.
62AM2 PEB). Se utilizó ADMh 22-52 como antagonista de referencia.
Ensayo de AMPc-HTRF de anticuerpos
Los anticuerpos anti-ADMh (NT-H, MR-H, CT-H) se sometieron a ensayo para la actividad antagonista en ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) en presencia de ADM 1 52 humana 5,63 nM a las concentraciones de anticuerpo finales siguientes: 100 pg/ml, 20 pg/ml, 4 pg/ml, 0,8 pg/ml y 0,16 pg/ml.
Los anticuerpos anti-ADMm (NT-M, MR-M y CT-M) se sometieron a ensayo para la actividad antagonista en ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humana (FAST-027C) en presencia de ADM 1 50 de ratón 0,67 nM a las concentraciones de anticuerpo finales siguientes: 100 pg/ml, 20 pg/ml, 4 pg/ml, 0,8 pg/ml y 0,16 pg/ml. Datos representados: inhibición relativa vs. concentración de antagonista (ver las figs. 3a a 3l). La inhibición máxima por el anticuerpo individual se proporciona en la tabla 3.
Tabla 3:
Ejemplo 3
Datos de estabilización de ADMh por el anticuerpo anti-ADM
El efecto estabilizador de la ADM humana por anticuerpos de ADM humana se sometió a ensayo utilizando un inmunoensayo de ADMh.
Inmunoensayo de cuantificación de la adrenomedulina humana
La tecnología utilizada era un inmunoensayo de luminiscencia de tubo recubierto en sándwich, basado en el mareaje con éster de acridinio.
Compuesto marcado (trazador): se mezclaron 100 |jg de CT-H (100 j l) (1 mg/ml en PBS, pH 7,4, AdrenoMed AG, Alemania) con 10 j l de NHS-éster de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (patente n° EP 0353971) y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. CT-H marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). El CT-H purificado se diluyó en (fosfato de potasio 300 mmoles/l, NaCl 100 mmoles/l, Na-EDTA 10 mmoles/l, albúmina de suero bovino 5 g/l, pH 7,0). La concentración final era de aprox. 800.000 unidades lumínicas relativas (ULR) de compuesto marcado (aprox. 20 ng de anticuerpo marcado) por cada 200 jl. Se midió la quimioluminiscencia del éster de acridinio mediante la utilización de un AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Fase sólida: Se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con MR-H (AdrenoMed AG, Alemania) (1,5 jg de MR-H/0,3 ml, NaCl 50 mmoles/l, Tris/HCl 50 mmoles/l, pH 7,8). Tras el bloqueo con albúmina de suero bovino al 5%, los tubos se lavaron con PBS, pH 7,4, y se secaron al vacío.
Calibración:
El ensayo se calibró utilizando diluciones de Hadm (Bachem AG, Suiza) en NaCl 250 mmoles/l, Triton X-1002 g/l, albúmina de suero bovino 50 g/l, 20 tabs/l de cóctel de inhibidor de proteasas (Roche Diagnostics AG, Suiza). Inmunoensayo de ADMh:
Se pipetearon 50 j l de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, tras añadir CT-H marcado (200 jl); los tubos se incubaron durante 4 h a 4°C. El trazador no unido se eliminó mediante lavado 5 veces (cada vez, 1 ml) con disolución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%).
Se midió la quimioluminiscencia unida a tubo mediante la utilización de LB 953
La figura 4 representa una curva de dosis de ADMh/señal típica. Y una curva de dosis de ADMh/señal en presencia de 100 jg/m l de anticuerpo NT-H.
NT-H no afectó al inmunoensayo de ADMh descrito.
Estabilidad de la adrenomedulina humana:
Se diluyó ADM humana en plasma citrato humano (concentración final: 10 nM) y se incubó a 24°C. En puntos temporales seleccionados, se detuvo la degradación de la ADMh mediante congelación a -20°C. La incubación se llevó a cabo en ausencia y en presencia de NT-H (100 jg/ml). La ADMh restante se cuantificó mediante la utilización del inmunoensayo de ADMh descrito anteriormente.
La figura 5 representa la estabilidad de la ADMh en plasma (citrato) humano en ausencia y en presencia de anticuerpo NT-H. La semivida de la ADMh sola era de 7,8 h y en presencia de NT-H, la semivida era de 18,3 h (estabilidad 2,3 veces más elevada).
Ejemplo 4
Mortalidad por sepsis (tratamiento precoz)
Modelo animal
Para el estudio se utilizaron ratones C57B1/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). La peritonitis se indujo quirúrgicamente bajo anestesia suave de isoflurano. Se realizaron incisiones en el cuadrante superior izquierdo de la cavidad peritoneal (localización normal del ciego). Se expuso el ciego y se realizó una ligadura fuerte en torno al ciego con suturas distales respecto a la inserción del intestino delgado. Se realizó una herida de punción con una aguja de calibre 24 en el ciego y extrajeron pequeñas cantidades de contenido cecal a través de la herida. Se reintrodujo el ciego en la cavidad peritoneal y se cerró el sitio de laparatomía. Finalmente, los animales fueron devueltos a sus jaulas con libre acceso a alimentos y agua. Se administraron 500 j l de disolución salina s.c. como reemplazo de líquidos.
Aplicación y dosis del compuesto (NT-M, MR-M, CT-M)
Los ratones fueron tratados inmediatamente después de la CLP (tratamiento temprano). CLP es la abreviatura de ligación y punción cecal.
Grupos de estudio
Se sometieron a ensayo tres compuestos frente a tratamiento con vehículo y frente a tratamiento con compuesto de control. Cada grupo contenía 5 ratones para la extracción de sangre tras 1 día para la determinación de BUN (ensayo de nitrógeno de urea de suero sanguíneo). Se realizó un seguimiento de diez ratones adicionales en cada grupo durante un periodo de 4 días. Grupo de tratamiento (10 pl/g de peso corporal) dosis/seguimiento:
1 NT-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
2 MR-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
3 CT-M, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
4 IgG no específica de ratón, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
5 control - PBS, 10 pl/g de peso corporal supervivencia durante 4 días
Química clínica
Se midieron las concentraciones de nitrógeno en urea sanguínea (BUN) para la función renal en la línea base y el día 1 tras la CLP. Se obtuvieron muestras de sangre del seno cavernoso con un capilar bajo anestesia suave con éter. Las mediciones se llevaron a cabo mediante la utilización de un multianalizador Olympus AU 400. La mortalidad a 4 días se proporciona en la tabla 4. Las concentraciones medias de BUN se proporcionan en la tabla 5.
Tabla 4:
Tabla 5:
Puede observarse en la tabla 4 que el anticuerpo NT-M redujo la mortalidad considerablemente. Tras 4 días, 70% de los ratones sobrevivió al tratarlos con anticuerpo NT-M. Al tratarlos con anticuerpo MR-M, el 30% de los animales sobrevivió y al tratarlos con anticuerpo CT-M, el 10% de los animales sobrevivió tras 4 días. En contraste con lo anterior, todos los ratones estaban muertos tras 4 días al tratarlos con IgG de ratón no específico. Se obtuvo el mismo resultado en el grupo de control, en que se había administrado PBS (disolución salina tamponada con fosfato) en los ratones.
Se utilizó el ensayo de nitrógeno de urea sanguínea o BUN para evaluar la función renal, a fin de ayudar a diagnosticar la enfermedad renal y para monitorizar los pacientes con disfunción o insuficiencia renal aguda o crónica. Los resultados del ensayo de S-BUN revelaron que el anticuerpo NT-M era el más eficaz en la protección del riñón.
Mortalidad por sepsis (tratamiento tardío)
Modelo animal
Para el estudio se utilizaron ratones C57B1/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). La peritonitis se indujo quirúrgicamente bajo anestesia suave de isoflurano. Se realizaron incisiones en el cuadrante superior izquierdo de la cavidad peritoneal (localización normal del ciego). Se expuso el ciego y se realizó una ligadura fuerte en torno al ciego con suturas distales respecto a la inserción del intestino delgado. Se realizó una herida de punción con una aguja de calibre 24 en el ciego y extrajeron pequeñas cantidades de contenido cecal a través de la herida. Se reintrodujo el ciego en la cavidad peritoneal y se cerró el sitio de laparatomía. Finalmente, los animales fueron devueltos a sus jaulas con libre acceso a alimentos y agua. Se administraron 500 pl de disolución salina s.c. como reemplazo de líquidos.
Aplicación y dosis del compuesto (FAB2 NT-M)
Se sometió a ensayo FAB2 NT-M frente a: tratamiento con vehículo y frente a tratamiento con compuesto de control. El tratamiento se llevó a cabo tras el desarrollo total de sepsis, 6 horas después de CLP (tratamiento tardío). Cada grupo contenía 4 ratones y se realizó un seguimiento durante un periodo de 4 días.
Grupo de tratamiento (10 pl/g de peso corporal) dosis/seguimiento:
Grupos de estudio
1 NT-M, FAB20,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
2 control: IIgG no específica de ratón, 0,2 mg/ml supervivencia durante 4 días
3 vehículo: - PBS 10 pl/g de peso corporal supervivencia durante 4 días
Tabla 6 :
Puede apreciarse en la tabla 6 que el anticuerpo FAB2 NT-M redujo la mortalidad considerablemente. Tras 4 días, el 75% de los ratones sobrevivió al tratarlos con anticuerpo FAB2 NT-M. En contraste con lo anterior, todos los ratones estaban muertos tras 4 días al tratarlos con IgG de ratón no específico. Se obtuvo el mismo resultado en el grupo de control, en que se había administrado PBS (disolución salina tamponada con fosfato) en los ratones.
Ejemplo 5
Efecto progresivo del anticuerpo anti-ADM en animales CLP sumado al tratamiento antibiótico y estabilización de la circulación con catecolaminas, así como la regulación del equilibrio de líquidos
Modelo animal
En el presente estudio, se utilizaron ratones C57B1/6 (8 a 12 semanas, 22 a 30 g). Se utilizó una sepsis polimicrobiana mediante ligación y punción cecal (CLP) como modelo para el estudio del choque séptico (Albuszies G. et al., Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med 2005;33:2332-8), (Albuszies G, et al: The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock. Intensive Care Med 2007;33:1094-101), (Barth E, et al: Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock. Crit Care Med 2006;34:307-13), (Baumgart K, et al: Effect of SOD-1 over-expression on myocardial function during resuscitated murine septic shock. Intensive Care Med 2009;35:344-9), (Baumgart K, et al: Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med 2010;38:588-95), (Simkova V, et al: The effect of SOD-1 overexpression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock. Shock 2008;30:578-84), (Wagner F, et al.: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011, 35(4):396-402), (Wagner F, et al: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J. Trauma. 2011; 71(6):1659-67).
Tras pesarlos, los ratones fueron anestesiados mediante la inyección intraperitoneal de 120 pg/g de quetamina, 1,25 pg/g de midazolam y 0,25 pg/g de fentanilo. Durante el procedimiento quirúrgico, se mantuvo la temperatura corporal a 37-38°C. Se llevó a cabo una sección en la línea abdominal de 1 cm para obtener acceso al ciego. A continuación, se ligó el ciego con sutura de seda 3-0 próximo a la base y se aplicó una única punción con una aguja de calibre 18. Se reintrodujo el ciego y se cerró nuevamente la incisión (sutura 4-0). Para la compensación de la pérdida perioperatoria de líquidos, se inyectaron por vía subcutánea en la dermis dorsal 0,5 ml de disolución de Ringer lactato con 1 pg/g de buprenorfina como analgésico. Para la antibiosis, los ratones recibieron Ceftriaxon 30 pg/g y clindamicina 30 pg/g por vía subcutánea en las extremidades inferiores.
Tras la cirugía de CLP, los animales se mantuvieron en un ambiente suficientemente calefactado, con agua y alimentos ad libitum.
Se garantizó la cobertura de las necesidades de líquidos mediante una inyección subcutánea dorsal con 0,5 ml de disolución de Ringer lactato con 4 pg/g de glucosa y buprenorfina 1 pg/g, que se aplicaron en un ciclo de 8 horas, tras anestesia a corto plazo de isoflurano. Además, se mantuvo la antibiosis mediante inyecciones subcutáneas de Ceftriaxon 30 pg/g y clindamicina 30 pg/g en las extremidades inferiores.
Administración de sustancias de ensayo
Tratamiento precoz
Inmediatamente después de la cirugía de CLP y el cierre de la incisión, se aplicó el anticuerpo sustancia de ensayo NT-M a una concentración de 500 pg/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección en la vena del pene a una dosis de 2 mg por kg de peso corporal (volumen de dosis: 88 a 120 pl) (5 animales).
Tratamiento tardío
Tras el desarrollo total de sepsis, 15,5 h después de la cirugía de CLP, los animales fueron anestesiados tal como se ha indicado anteriormente y se aplicó NT-M a una concentración de 500 pg/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección en la vena del pene a una dosis de 2 mg por kg de peso corporal (volumen de dosis: 88 a 120 pl) (3 animales).
El grupo de control (6 animales) recibió una cantidad correspondiente de la disolución de vehículo PBS sin anticuerpo (4 pl/g, 88 a 120 pl) inmediatamente después de la cirugía de CLP.
Grupos de estudio y diseño experimental
Modelo de choque séptico murino bajo monitorización de cuidados intensivos:
Se monitorizaron tres grupos con 3, 5 y 6 animales. El grupo 1 (5 animales) recibió el anticuerpo NT-M 15,5 h después de CLP; el grupo 2 recibió el anticuerpo NT-M inmediatamente después de la cirugía de CLP y el grupo 3 recibió una cantidad comparable de PBS (4 pl/g). Incubación de 16 horas post-CLP (para permitir el avance de la sepsis polimicrobiana); el experimento continuó con la monitorización e intervenciones comparables a un régimen de cuidados médicos intensivos. Por lo tanto, tras pesar los animales, se anestesiaron tal como se indica en la parte de cirugía de CLP (excepto los animales con tratamiento tardío, que se anestesiaron antes del tratamiento). Se mantuvo la temperatura corporal a 37-38°C durante el resto del experimento. Tras una traqueotomía e intubación, se monitorizó la respiración y se apoyó con un ventilador pulmonar para animales de laboratorio Flexivent®, (Emka Technologies, FiO2 0,5, PEEP 10 H2O, VT 8 (pl/g, I:E 1:1,5, AF 70-140 según la temperatura).
Se mantuvo la anestesia durante todo el experimento mediante canulación de la vena yugular externa derecha con una infusión continua de quetamina 30 pg/g x h y fentanilo 0,3 pg/g x h. Además, la arteria carótida común derecha se canuló para la monitorización continua del pulso cardíaco y la presión arterial media (PAM). La presión arterial media se mantuvo a PAM>65 mmHg mediante infusión intravenosa (vena yugular) de coloides (80 pl/g x h, Hextend®) y, en caso necesario, noradrenalina disuelta en coloides como vasopresor. Se extrajeron muestras de sangre (120 pl) por la arteria carótida canulada a las 0 y 4 horas para la determinación de la creatinina. Se realizó una punción en la vejiga y se recogió orina mediante un catéter vesicular. El experimento se terminó tras 6 horas o antes en el caso de que no pudiese mantenerse la PAM >65 mmHg (vena yugular) con la administración del vasopresor.
Parámetros medidos
Se midieron y analizaron los parámetros siguientes: consumo total de noradrenalina (pg NA/g), tasa de consumo de noradrenalina (pg NA/g/h), volumen total de orina recogida durante el experimento, concentración de creatinina (pg/ml) al final del experimento y lavado medio de creatinina (pl/min).
Tabla 7:
Se midió la necesidad de catecolamina tras la administración de IgG de ratón no específica en un total de 6 ratones como grupo de control; anticuerpo NT-murino en un grupo de 5 ratones inmediatamente después de CLP
(tratamiento precoz) o anticuerpo NT-murino en un grupo de 3 ratones 15,5 h después de CLP (tratamiento tardío).
La reducción de la necesidad de catecolamina es una medida de la estabilización de la circulación. De esta manera, los datos muestran que el anticuerpo de ADM, especialmente el anticuerpo NT-M, conduce a una considerable estabilización de la circulación y a una reducción considerable de la necesidad de catecolamina. Se obtuvo el efecto estabilizador de la circulación en el tratamiento precoz (inmediatamente después de CLP) y el tratamiento después del desarrollo total de sepsis (tratamiento tardío) (ver la figura 7).
Regulación del equilibrio de líquidos
Un equilibrio más positivo de líquidos tanto precozmente durante la resucitación y acumuladamente durante 4 días se asocia a un riesgo incrementado de mortalidad en el choque séptico. El control del equilibrio de líquidos es de la máxima importante para el curso de la enfermedad en pacientes que presentan sepsis (s. Boyd et al., 2011). El control del equilibrio de líquidos de los pacientes críticamente enfermos sigue constituyendo un reto sustancial en la medicina de cuidados intensivos. Tal como puede apreciarse en la tabla 8 , el tratamiento de los ratones tras CLP (ver los procedimientos experimentales en “Modelo animal”) con anticuerpo NT-M condujo a una potenciación del volumen total de orina excretada. La orina excretada era aprox. tres veces superior en los animales tratados con NT-M que en los ratones no tratados. Se obtuvo el efecto positivo del tratamiento en el tratamiento precoz y en el tratamiento tardío. Se mejoró el equilibrio de líquidos en aproximadamente 20% a 30% asimismo en ambos tratamientos, el precoz y el tardío. De esta manera, los datos muestran que la utilización del anticuerpo de ADM, especialmente la utilización del anticuerpo NT-ADM, resulta favorable para la regulación del equilibrio de líquidos en los pacientes (ver la tabla 8 y las figuras 8 y 9).
Tabla 8
Mejora de la función renal
La combinación de insuficiencia renal aguda y sepsis está asociada a una mortalidad de 70 por ciento en comparación con una mortalidad de 45 por ciento en pacientes con solo insuficiencia renal aguda. (Schrier and Wang, "Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis"; The New England Journal of Medicine; 351:159-69; 2004). La concentración de creatinina y el lavado de creatinina son parámetros de laboratorio estándares para la monitorización de la (dis)función renal (Jacob, "Acute Renal Failure", Indian J. Anaesth.; 47 (5): 367-372; 2003). Los datos de creatinina y lavado de creatinina del experimento animal anteriormente descrito (tratamiento precoz) se proporcionan en la tabla 9.
Tabla 9
En comparación con los animales sépticos de control, se redujo la concentración de creatinina en 42% y se mejoró el lavado de la creatinina en más de 100% como resultado del tratamiento de NT-M (Tabla 9). Los datos muestran que la administración de ADM-anticuerpo, especialmente de NT-M, conducen a una mejora de la función renal.
Mejora del estado de inflamación hepática
Se homogeneizó el tejido hepático de animales de control y tratados precozmente y se lisó en tampón de lisis. Para la preparación de extracto celular, las células se resuspendieron, se lisaron sobre hielo y se centrifugaron. El sobrenadante (extracto de proteínas) se almacenó a -80°C. Se determinó la activación del intensificador génico de factor nuclear de las cadenas ligeras kappa en células B (NF-kB) tal como se ha descrito anteriormente, utilizando un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)1,2. Se incubaron extractos celulares (10 |jg) sobre hielo con ácido poli-doxi-inosínico-desoxi-citidílico (poli-dl-dC) y oligonucleótido de doble cadena marcado con 32P (Biomers, Ulm, Alemania) que contenía NF-kB (HIV KBsite) (5'-GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA-3'). Se separaron los complejos en geles de poliacrilamida nativos, se secaron y se expusieron a películas
radiográficas. Se utilizó un Phosphorimager y software de análisis de imágenes (analizador de imágenes AIDA, Raytest) para cuantificar NF-kB marcado radioactivamente mediante densitometría. Para la comparación entre geles individuales, se relacionó la intensidad de cada banda con la de animales de control cargados simultáneamente que no habían sido sometidos a cirugía y CLP. Por lo tanto, los datos de EMSA se expresan como factor de incremento respecto a los valores de control. Estadísticas: todos los datos se presentan como medianas (intervalos), a menos que se indique lo contrario; se analizaron las diferencias entre los dos grupos con el ensayo de suma de rangos de MannWhitney para muestras no emparejadas. Resultados: Los animales tratados con NT-M presentaban una activación de n F-kB en el tejido hepático significativamente atenuada (2,27 (1,97 2,53)) en comparación con los animales administrados vehículo (2,92 (2,50-3,81)) (p<0,001) (ver la figura 10). Referencias:
1. Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35(4):396-402
2. Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J. Trauma 71(6):1659-67, 2011.
Ejemplo 6
Determinación de efectos secundarios in vivo del anticuerpo NT-M
Para el estudio se utilizaron ratones C57B1/6 macho de 12-15 semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania). Se trataron 6 ratones con una dosis (10 pl/g de peso corporal) de NT-M, 0,2 mg/ml. Como control, se trataron 6 ratones con PBS (10 pl/g de peso corporal). Se monitorizó durante 14 días la supervivencia y condición física. La mortalidad era 0 en ambos grupos; no se observaron diferencias de condición física entre el grupo de NT-M y el grupo de control.
Ejemplo 7
Nefrotoxicidad inducida por gentamicina
Se ha establecido un modelo de lesión renal aguda no séptica, que utiliza la nefrotoxicidad inducida con gentamicina (Chiu PJS. Models used to assess renal functions. Drug Develop Res 32:247-255, 1994.). Se utilizó este modelo para evaluar si el tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina podía mejorar la función renal. El experimento se llevó a cabo de la manera siguiente:
Se utilizaron grupos de 8 ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250 ± 20 g. Los animales fueron retados con gentamicina a razón de 120 mg/kg i.m. durante siete días consecutivos (grupos 1 y 2). Se inyectó por vía intravenosa compuesto de ensayo (anticuerpo antiadrenomedulina NT-M) y vehículo (disolución salina tamponada con fosfato) 5 min antes de la gentamicina el día 0, seguido de la inyección los días 2, 4 y 6. Se monitorizaron diariamente los pesos corporales y los signos clínicos. Se llevaron a cabo recolecciones de orina de veinticuatro horas (24) los días 0, 2 y 6. Los especímenes de orina se sometieron a ensayo para concentraciones de Na+, K+ y creatinina. Se recolectaron muestras de sangre para la química clínica los días 1 (antes de la gentamicina), 3 (antes de la gentamicina) y 7. Los analitos primarios que se monitorizaron para evaluar la función renal fueron los
electrolitos séricos (Na+ y K+), la creatinina y BUN. Se recolectaron muestras de plasma en tubos con EDTA (días 1 y 3: 100 pl; día 7: 120 pl). Se calculó el lavado de creatinina. El volumen de orina, electrolitos urinarios y creatinina se expresó como cantidad excretada por cada 100 g de peso corporal de animal. Todos los animales fueron sacrificados el día 7. Se pesaron los riñones.
Recolección de orina: los animales se introdujeron en jaulas individuales en donde se recolectó la orina durante 24 h los días 0, 2 y 6. Se midió el volumen de orina, y el nivel urinario de Na+, K+ y creatinina.
Se calculó el lavado de creatinina endógena de la manera siguiente:
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / SCr (mg/ml)
Se calculó la excreción urinaria de 24 h de sodio (Na+) de la manera siguiente:
UNaV (jiEq/24 h) = UNa (jiEq/ml) x V (ml/24 h)
se calculó de manera similar la excreción urinaria durante 24 h de NAG y NGAL
La excreción fraccionada de Na+ (FENa) o el porcentaje del sodio filtrado que se excreta en la orina final es una medida de la función de reabsorción tubular del Na+. Se calculó de la manera siguiente:
FENa (%) =100 x [UNa (qEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (qEq/ml) X C& (ml/24 h)
El tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina mejoró varias medidas de la función renal el día 7 en comparación con vehículo: creatinina sérica, 1,01 mg/dL (NT-M) vs 1,55 mg/dL (vehículo) (figura 11), BUN 32,08 mg/dl (NT-M) vs. 52,41 mg/dl (vehículo) (figura 12), el lavado de creatinina endógena, 934,43 ml/24 h (NT-M) vs.
613,34 ml/24 h (vehículo) (figura 13), secreción fraccionada de Na+, 0,98% (NT-M) vs. 1,75% (vehículo) (figura 14).
Ejemplo 8
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre varios parámetros de la función renal.
NT-M causó una diuresis y lavado de creatinina tres y dos veces más altas, respectivamente, resultando en última instancia en concentraciones en sangre más bajas de creatinina, urea y NGAL al final del experimento (ver la tabla 10). Además, las concentraciones de quimiocina derivada de queratinocitos (QQ) en el riñón se redujeron significativamente mediante el tratamiento con NT-M (figura 15).
Tabla 10: parámetros de función renal en animales tratados con vehículo (n=11) y con NT-M (n=9). Se midieron las concentraciones en sangre en muestras obtenidas al final del experimento. NGAL=lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo Todos los datos eran medianas (cuartiles)
Los experimentos se llevaron a cabo de la manera siguiente:
Creatinina, urea y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo (NGAL)
Se midieron las concentraciones de NGAL en sangre utilizando un ELIA comercial (NGAL de ratón, RUO 042, BioPorto Diagnostics A/S, Dinamarca, Gentofte). Se midieron las concentraciones de urea y creatinina con una columna capilar (Optima-5MS, Macherey-Nagel, Düren, Alemania), sistema de cromatografía de gases/espectrometría de masas (Agilent 5890/5970, Boblingen, Alemania) utilizando 2H3-creatinina (CDN isotopes, Pointe-Claire, QU, Canadá) y metil-urea (FlukaChemikalien, Buchs, Suiza) como estándares internos. Tras la desproteinización con acetonitrilo, centrifugación y evaporación hasta sequedad, se reconstituyó el sobrenadante en ácido fórmico y se extrajo por una columna de intercambio aniónico débil (WCX, Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). El acetonitrilo más N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida y N-(terc-butildimetilsilil)-Nmetiltrifluoroacetamida permitieron la formación de los derivados terc-butil-dimetilsililo y creatinín-trimetilsililo de urea, respectivamente. Se monitorizaron los iones m/z 231 y 245, y m/z 329 y 332 para los analitos urea y creatinina y los estándares internos, respectivamente. A partir de la producción de orina y las concentraciones plasmática y urinaria de creatinina, se calculó el lavado de creatinina utilizando la fórmula estándar.
Preparación de muestras
Los riñones, almacenados a -80°C, se fragmentaron con un homogeneizador en PBS y se lisaron con un tampón concentrado 2 veces para obtener un lisado de células completas (Tris 100 mM, pH 7,6; NaCl 500 mM; EDTA 6 mM; EGTA 6 mM; Triton-X-100 al 1%; NP 40 al 0,5%; glicerol al 10%; inhibidores de proteasas (p-glicerolfosfato 2 mM; DTT 4 mM; leupeptina 20 pM; ortovanadato de sodio 0,2 mM)) y posteriormente se centrifugaron. Se obtuvo el lisado de células completas a partir del sobrenadante; el sedimento que consistía en residuos celulares se descartó. Se determinó la cantidad de proteína fotométricamente utilizando un ensayo de proteínas disponible comercialmente (Bio-Rad, Hercules, CA) y los especímenes se ajustaron de manera que la concentración final de proteína fuese de 4 pg/pl. Las muestras para el análisis Multiplex y EMSA se diluyeron 1:1 con tampón EMSA (Hepes 10 mM; KCl 50 mM; glicerol al 10%; EDTA 0,1 mM; d Tt 1 mM), las muestras con inmunotransferencias 1:1 con tampón para muestras, 2 veces (SDS al 2%, Tris-HCl 125 mM (pH 6 ,8 a 25°C); glicerol al 10%; DTT 50 mM; azul de bromofenol al 0,01%).
Se determinaron los niveles de quimiocina derivados de queratinocitos (QQ) utilizando un kit de citocinas multiplex de ratón (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), el ensayo se llevó a cabo mediante la utilización del sistema de matriz por suspensión Bio-plex siguiendo las instrucciones del fabricante (ver asimismo Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl mW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667). Brevemente, se añadieron los estándares y muestras de citocinas apropiados a una placa de filtración. Las muestras se incubaron con anticuerpos unidos químicamente a microperlas marcadas fluorescentemente. Después, se añadieron a cada pocillo anticuerpos de detección premezclados y posteriormente se añadió estreptavidina-ficoeritrina. A continuación, las perlas se suspendieron y la mezcla de reacción de citocinas se cuantificó utilizando el lector de matrices de proteínas Bio-Plex. Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Los niveles inferiores al límite de detección de los ensayos se fijaron en cero con fines estadísticos.
Ejemplo 9
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre el hígado.
NT-M causó una reducción significativa de las concentraciones de quimiocinas (CQ) derivadas de queratinocitos en el hígado (figura 16).
La medición de quimiocinas derivadas de queratinocitos (QQ) se llevó a cabo análogamente al ejemplo 8 (riñón).
Ejemplo 10
En el modelo de CLP en ratones descrito anteriormente, se investigó el efecto del tratamiento con el anticuerpo antiadrenomedulina NT-M sobre varias citocinas y quimiocinesina en la circulación sanguínea (plasma).
Concentraciones de citocina y de quimiocina
Se determinaron los niveles plasmáticos de factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interleucina (IL)-6 , proteína quimioatrayante de monocitos (MCP)-1 y de quimiocinas derivadas de queratinocitos (QQ) utilizando un kit de citocinas multiplex de ratón (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), el ensayo se llevó a cabo mediante la utilización del sistema de matriz por suspensión Bio-plex siguiendo las instrucciones del fabricante (ver asimismo Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667).
Brevemente, se añadieron los estándares y muestras de citocinas apropiados a una placa de filtración. Las muestras se incubaron con anticuerpos unidos químicamente a microperlas marcadas fluorescentemente. Después, se añadieron a cada pocillo anticuerpos de detección premezclados y posteriormente se añadió estreptavidina-ficoeritrina. A continuación, las perlas se suspendieron y la mezcla de reacción de citocinas se cuantificó utilizando el lector de matrices de proteínas Bio-Plex. Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Los niveles inferiores al límite de detección de los ensayos se fijaron en cero con fines estadísticos.
Los niveles plasmáticos y concentraciones en tejido renal de factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interleucina (IL)-6 e IL-10, proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-1 y quimiocinas derivadas de queratinocitos (QQ) se determinaron utilizando un “kit de citocinas multiplex” disponible comercialmente (ensayo de citocinas Bio-Plex Pro Precision Pro, Bio-Rad, Hercules, CA), que permite recoger varios parámetros de una sola muestra. Las etapas de trabajo individuales se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante (ver asimismo Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; y Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667).
Brevemente, se añadieron microesferas marcadas con fluorescencia (“perlas”) a una placa de 96 pocillos, seguido de dos etapas de lavado, la adición de estándares internas y la adición de muestras de homogenado de plasma y riñón. Durante la posterior incubación, las citocinas individuales se unieron a los anticuerpos fijados a las perlas de poliestireno. Tras la adición de los anticuerpos marcados con biotina específicos de citocina, que eran para la detección de las citocinas individuales, y un tiempo de incubación adicional, posteriormente se añadió estreptavidina marcada con ficoeritrina. Tras un tiempo de incubación adicional, a continuación las perlas se resuspendieron y las placas pudieron medirse con un citómetro de flujo específico (sistema de matriz por suspensión Bio-Plex, Bio-Rad, Hercules, CA). Los datos se procesaron automáticamente y se analizaron con el software Bio-Plex Manager 4.1 utilizando la curva estándar producida a partir de estándares de citocina recombinante. Para los niveles en plasma, la concentración se proporciona en pg * ml-1; la concentración de los homogenados de riñón se convirtió en la concentración de proteína apropiada y se proporciona en pg * mg_1 de proteína.
NT-M causó una reducción significativa de las concentraciones plasmáticas de IL- 6 (figura 17), IL-10 (figura 18), quimiocina derivada de queratinocitos (QQ) (figura 19), proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (figura 20) y TNF-alfa (figura 21).
Ejemplo 11
Lesión renal aguda inducida por isquemia/reperfusión
Se ha establecido otro modelo de lesión renal aguda no séptica en el que se induce una lesión renal aguda mediante isquemia/reperfusión (Nakamoto M, Shapiro JI, Shanley PF, Chan L y Schrier RW. In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure. J ClinInvest 80:698-705, 1987., Chintala MS, Bernardino V y Chiu PJS. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemiareperfusion in anesthetized rats. J PharmacolExpTher 271:1203-1208, 1994). Se utilizó este modelo para evaluar si el tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina podía mejorar la función renal.
El experimento se llevó a cabo de la manera siguiente:
Effecto de un NT-M sobre la lesión renal aguda inducida por isquemia/reperfusión en ratas
Diseño del estudio:
Observaciones clínicas: diariamente antes de la cirugía, después de la cirugía y durante el tratamiento.
Se utilizaron grupos de 8 ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250 a 280 g. Los animales se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y recibieron una dieta estándar con agua destilada ad libitum. Los animales recibieron suplementos de líquidos (NaCl al 0,9% y dextrosa al 5%/1:1 10 ml/kg p.o.). 30 min antes de la cirugía (día 0). Las ratas se anestesiaron con pentobarbital (50 mg/kg i.p.). Se expuso la cavidad abdominal mediante una incisión en la línea media, seguido de la administración intravenosa de heparina (100 U/kg, i.v.) y se ocluyeron ambas arterias renales durante 45 min mediante la utilización de pinzas vasculares. Inmediatamente después de la retirada de las pinzas renales, se observaron los riñones durante 1 min adicional para garantizar el cambio de color, indicando la reperfusión sanguínea. El compuesto de ensayo (NT-M) y el vehículo (disolución salina tamponada con fosfato) se inyectaron por vía intravenosa 5 min antes de la reperfusión, seguido de la inyección diaria los días 1 y 2.
Recolección de orina: Se inició la recolección de orina de 24 h sobre hielo a las 24 h antes de la isquemia/reperfusión el día -1 (-24 h a 0 h) y el día 0 (0-24 h), el día 1 (24-48 h) y el día 2 (48-72 h) después de la reperfusión.
Recolección de sangre: Se recolectaron 0,4 ml de sangre por la vena de la cola en tubos con EDTA a 0 h (antes de la cirugía I RI), 24 h (antes de vehículo o TA), 48 h (antes de vehículo o TA) y 72 h, para la determinación de la creatinina/Na+/K+ plasmática y BUN; se recolectaron 2 ml de sangre por la vena cava terminalmente.
Se introdujeron los animales en jaulas individuales en las que se recolectó la orina durante 24 h -1 (-24 h-0 h), el día 0 (0-24 h), el día 1 (24-48 h) y el día 2 (48-72 h) después de la reperfusión el día 0. Se midió el volumen de orina, y el nivel urinario de Na+, K+ y creatinina.
Se calculó el lavado de creatinina (CCr) de la manera siguiente:
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / PCr (mg/ml)
Se calculó la excreción urinaria de 24 h de sodio (Na+) de la manera siguiente:
UNaV ((o.Eq/24 h) = UNa (qEq/ml) x V (ml/24 h)
La excreción fraccionada de Na+ (FENa) o el porcentaje del sodio filtrado que se excreta en la orina final es una medida de la función de reabsorción tubular del Na+. Se calculó de la manera siguiente:
FENa (%) =100 x [UNa (qEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (qEq/ml) X CCr (ml/24 h)
El tratamiento con anticuerpo antiadrenomedulina mejoró varias medidas de la función renal:
el nitrógeno de urea en sangre (BUN) mostró un fuerte incremento en el grupo de vehículo (0 h: 17.49 mg/dl, 24 h: 98.85 mg/dl, 48 h: 109.84 mg/dl, 72 h: 91.88 mg/dl), que era menos pronunciado con el tratamiento de NT-M (0 h: 16.33 mg/dl, 24 h: 84.2 mg/dl, 48 h: 82.61 mg/dl, 72 h: 64.54 mg/dl) (figura 22).
La creatinina sérica se desarrolló de manera similar: Grupo de vehículo (0 h: 0.61 mg/dl. 24 h: 3.3 mg/dl, 48 h: 3.16 mg/dl, 72 h: 2.31 mg/dl); grupo de NT-M: (0 h: 0.59 mg/dl, 24 h: 2.96mg/dl, 48 h: 2.31 mg/dl, 72 h: 1.8 mg/dl) (figura 23).
El lavado de creatinina endógena cayó drásticamente el día uno y posteriormente mejoró en mayor medida en el grupo de NT-M que en el grupo de vehículo. Grupo de vehículo: (0 h: 65.17 ml/h, 24 h: 3.5 ml/h, 48 h: 12.61 ml/h, 72 h: 20.88 ml/h), grupo de NT-M: (0 h: 70.11 ml/h, 24 h: 5.84 ml/h, 48 h: 21.23 ml/h, 72 h: 26.61 ml/h) (figura 24).
Descripción de las figuras
Figura 1a:
Ilustración de formatos de anticuerpo: variantes de Fv y de scFv
F igu ra 1b:
Ilustración de formatos de anticuerpo: fusiones heterólogas y anticuerpos bifuncionales
Figura 1c:
Ilustración de formatos de anticuerpo: anticuerpos bivalentes y anticuerpos biespecíficos
Figura 2:
ADMh 1-52 (SEC ID n° 21)
ADMh 1-50 (SEC ID n° 22)
aa 1-21 de la ADM humana (SEC ID n° 23)
aa 1-42 de la ADM humana (SEC ID n° 24)
aa 43-52 de la ADM humana (SEC ID n° 25)
aa 1-14 de la ADM humana (Se C ID n° 26)
aa 1-10 de la ADM humana (SEC ID n° 27)
aa 1-6 de la ADM humana (Se C ID n° 28)
aa 1-32 de la ADM humana madura (SEC ID n° 29)
aa 1-40 de la ADM murina madura (Se C ID n° 30)
aa 1-31 de la ADM murina madura (SEC ID n° 31)
Figura 3:
a: curva de respuesta a dosis de la ADM humana. La estimulación máxima de AMPc se ajustó a una activación de 100%.
b: curva de dosis/inhibición de la ADM 22-52 humana (antagonista de receptor de ADM) en presencia de ADMh 5,63 nM.
c: curva de dosis/inhibición de CT-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
d: Curva de dosis/inhibición de MR-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
e: Curva de dosis/inhibición de NT-H en presencia de ADMh 5,63 nM.
f: curva de respuesta a dosis de la ADM de ratón. La estimulación máxima de AMPc se ajustó a una activación de 100%.
g: curva de dosis/inhibición de la ADM 22-52 humana (antagonista de receptor de ADM) en presencia de ADMm 0,67 nM.
h: curva de dosis/inhibición de CT-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
i: curva de dosis/inhibición de MR-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
j: curva de dosis/inhibición de NT-M en presencia de ADMh 0,67 nM.
k: muestra la inhibición de ADM por F(ab)2 NT-M y por Fab NT-M.
l: muestra la inhibición de ADM por F(ab)2 NT-M y por Fab NT-M.
Figura 4:
la presente figura representa una curva de dosis de ADMh/señal típica. Y una curva de dosis de ADMh/señal en presencia de 100 pg/ml de anticuerpo NT-H.
Figura 5:
la presente figura representa la estabilidad de la ADMh en plasma humano (citrato) en ausencia y en presencia de anticuerpo NT-H.
Figura 6:
alineación de Fab con las secuencias de marco humanas homólogas.
Figura 7:
la presente figura representa las necesidades de noradrenalina para el tratamiento precoz y tardío con NT-M.
F igu ra 8:
la presente figura representa la producción de orina tras el tratamiento precoz y tardío con NT-M.
Figura 9:
la presente figura representa el equilibrio de líquidos tras el tratamiento precoz y tardío con NT-M.
Figura 10:
activación en tejido hepático del intensificador génico de cadena ligera kappa de factor nuclear en células B (NF-kB) analizada mediante ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). # indica p<0,001 vs. vehículo.
Figura 11:
desarrollo de creatinina sérica con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 12:
desarrollo de nitrógeno de urea en sangre (NUS) con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 13:
desarrollo de lavado de creatinina endógena con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 14:
desarrollo de secreción fraccional de Na+ con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 15:
niveles de quimiocina (QC) derivada de queratinocitos determinados en relación a las proteínas renales totales extraídas. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 16:
niveles de quimiocina (QC) derivada de queratinocitos determinados en relación a las proteínas hepáticas totales extraídas. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 17:
niveles plasmáticos de IL-6. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 18:
niveles plasmáticos de IL-10. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 19:
niveles plasmáticos de quimiocinas (QC) derivadas de queratinocitos. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
Figura 20:
niveles plasmáticos de proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1). El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M.
F igu ra 21:
niveles plasmáticos de TNF-alfa. El diagrama de cajas blancas muestra los resultados obtenidos con vehículo; el diagrama de cajas grises muestra los resultados obtenidos tras el tratamiento con NT-M. Figura 22:
desarrollo de nitrógeno de urea en sangre (NUS) con el tiempo. Se muestran medias /- SEM Figura 23:
desarrollo de creatinina sérica con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Figura 24:
desarrollo de lavado de creatinina endógena con el tiempo. Se muestran medias /- SEM
Claims (22)
1. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a la adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o una afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o una afección aguda para la prevención o la reducción de disfunción orgánica o la prevención de insuficiencia orgánica en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig se une a una región de por lo menos 4 aminoácidos dentro de la secuencia de aa 1-21 de la ADM humana madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEC ID n° 23),
y en el que dicho órgano se selecciona de entre el grupo que comprende corazón, riñón, hígado, pulmones, páncreas, intestino delgado y bazo,
y en el que dicha enfermedad crónica o aguda o una afección aguda, respectivamente, se selecciona de entre el grupo que comprende infecciones severas, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, diabetes, cáncer, enfermedades vasculares agudas y crónicas como por ejemplo insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, ateroesclerosis, choque tal como por ejemplo choque séptico y disfunción orgánica, disfunción hepática, quemaduras, cirugía, traumatismo, intoxicación y daños inducidos por quimioterapia.
2. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad agua o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o una afección aguda según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o andamiaje no Ig es monoespecífico.
3. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje muestra una afinidad de unión por ADM de por lo menos 10'7 M, en el que dicha afinidad de unión se determina según el ejemplo 1.
4. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje no es la proteína-1 de unión a ADM, factor H del complemento.
5. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje reconoce y se une al extremo N-terminal, aa 1, de la adrenomedulina madura.
6. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento o dicho andamiaje es un anticuerpo o fragmento o andamiaje estabilizador de ADM que aumenta la semivida, el tiempo de semirretención t-i/2, de la adrenomedulina en suero, sangre, plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100%.
7. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje bloquea la bioactividad de la ADM no más de 80%, preferentemente no más de 50%, cuando se determina la bioactividad de la ADM en un ensayo funcional de AMPc de receptor de adrenomedulina recombinante humano según el ejemplo 2.
8. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho paciente sufre una enfermedad que se selecciona de entre el grupo que comprende sepsis, diabetes, cáncer, insuficiencia cardíaca y choque.
9. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad no es SIRS, sepsis o choque séptico.
10. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a la ADM o un fragmento de la misma en el que la cadena pesada comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 1
GYTFSRYW SEC ID n° 2
ILPGSGST SEC ID n° 3
TEGYEYDGFDY
y en el que la cadena ligera comprende las secuencias
SEC ID n° 4
QSIVYSNGNTY SEC ID n° 5
RVS SEC ID n° 6
FQGSHIPYT.
11. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) monoespecífico humano o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende:
SEC ID n° 7 (AM-VH-C)
Q V Q LQ Q SG AELM KPG ASVKISC KATG YTFSR YW IEW VKQ R PG H G LEW IG EILP
G S G STN YN EK FKG KATITAD TSSN TAYM Q LSSLTSED SAVYYC TEG YEYD G FD
YW G Q G TTLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTVSW N
SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSVVTVPSSSLG TQ TYIC N VN H KPSN TKVD KR
VE PK H H H H H H SEC ID n° 8 (AM-VH1)
Q V Q LVQ SG AEVKKPG SSVKVSCKASG YTFSR YW ISW VR Q APG Q G LEW M G R IL
PG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLRSED TAVYYC TEG YEYD G FD
YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTVSW N
S G ALTS GVHTFP A VLQS S G L YS LS S V V T VP S S SLGT QT Y IC N V N H K P SN TKV D KR
VE PK H H H H H H SEC ID n° 9 (AM-VH2-E40)
Q VQ LVQ SG AE VKKPGS S V K V S CKÁSG YTFSR YW IEW VRQ APG Q G LEW M G R IL
PG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLRSED TAVYYC TEG YEYD G FD
YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTVSW N
SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSVVTVPSSSLG TQ TYIC N VN H KPSN TKVD KR
V E PK H H H H H H
SEC ID n° 10 (AM-VH3-T26-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSC KATG YTFSR YW ISW VR Q APG Q G LEW M G EIL
PGSGSTN Y AQ KFQ G R YTITAD ESTST A Y M E L S SLRSEDT A V Y Y CTEGYE YDGFD
Y W G Q G TTV T V S S ASTKGP S VFPL AP S SKSTS GGT A ALG C L V K D YFPEP V T V S W N
SG ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSVVTVPSSSLG TQ TYIC N VN H KPSN TKVD KR
VE P K H H H H H H SEC ID n° 11 (AM-VH4-T26-E40-E55)
Q VQ LVQ SG AEVKKPG SSVKVSC KATG YTFSR YW IEW VR Q APG Q G LEW M G EIL
PG SG STN YAQ KFQ G R VTITAD ESTSTAYM ELSSLRSED TAVYYC TEG YEYD G FD
YW G Q G TTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSG G TAALG CLVKDYFPEPVTVSW N
SG ALTSGVHTFP A VLQSS GL Y SLS S VVTVPS S SLGTQT Y IC N V N H K P SN TKV D KR
VEPKHHHHHH SEC ID n° 12 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSN RFSG VPDRFSG SG SG TDFTLKISRVEAEDLG VYYCFQ G SHIPYTFG G G TKLE
IKRTVAAPSVFIFP PS D E Q LKSG TA SV VC LLN N FY PR EA KVQ W KV D N A LQ S G N S
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C SEC ID n° 13 (AM-VL1)
DVVM TQ SPLSLPVTLG Q PASISCRSSQ SIVYSNG NTYLNW FQ Q RPG Q SPRRLIYR
V SNRDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVE A E D V G V Y Y CFQGSHIP YTF G Q G TKL
E IKR TVAA PS VFIFPP SD EQ LKS G TAS VVC LLN N FYPR E AKV Q W K VD N ALQ SG N
SQ ESVTEQ D SKD STYSLSSTLTLSKAD YEKH KVYAC EVTH Q G LSSPVTKSFN R G
EC SEC ID n° 14 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRD
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
12. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo o fragmento o andamiaje es un anticuerpo o fragmento o andamiaje modulador que aumenta la semivida, el tiempo de semirretención t1/2, de la adrenomedulina en suero, sangre y plasma por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente >50%, todavía más preferentemente >100% y que bloquea la bioactividad de la ADM no más de 80%, preferentemente no más de 50%, cuando se determina la bioactividad de la ADM en un ensayo funcional de cAMP de receptor de adrenomedulina recombinante humano según el ejemplo 2.
13. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda
o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para ser utilizado en combinación con vasopresores, por ejemplo catecolamina, y/o líquidos administrados por vía intravenosa.
14. Anticuerpo antiadrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a adrenomedulina o andamiaje no Ig anti-ADM que se une a adrenomedulina para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para ser utilizado en combinación con una proteína de unión a ADM y/o otros principios activos.
15. Formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM o un andamiaje no Ig anti-ADM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la utilización en una terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Formulación farmacéutica para la utilización en la terapia de un paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda de un paciente según la reivindicación 15, en la que dicha formulación farmacéutica es una disolución, preferentemente una disolución lista para utilizar.
17. Formulación farmacéutica para la utilización en la terapia de una enfermedad aguda o afección aguda de un paciente que sufre una enfermedad crónica y/o aguda o afección aguda según la reivindicación 16, en la que dicha formulación farmacéutica se encuentra en un estado liofilizado.
18. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intramuscular.
19. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra por vía intravascular.
20. Formulación farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica se administra mediante infusión.
21. Formulación farmacéutica para la utilización según las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica debe administrarse por vía sistémica a un paciente para la prevención o reducción de una disfunción orgánica o una insuficiencia orgánica en dicho paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
22. Formulación farmacéutica para la utilización según las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha formulación farmacéutica debe administrarse por vía sistémica mediante infusión a un paciente para la prevención o reducción de una disfunción orgánica o una insuficiencia orgánica en dicho paciente que sufre una enfermedad crónica o aguda o una afección aguda.
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