CN110167962A - 用于干预和治疗需要的患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架 - Google Patents

用于干预和治疗需要的患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架 Download PDF

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Abstract

本发明的主题内容是一种抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其用于在需要的患者中干预和治疗充血。

Description

用于干预和治疗需要的患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM) 抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架
技术领域
本发明的主题内容是一种用于干预和治疗需要的患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架。
背景技术
肾上腺髓质素(ADM)这种肽在1993年首次被描述(Kitamura等，1993.Biochem Biophys Res Comm192(2):553-560)为一种包含52个氨基酸的新的降血压肽，其已从人嗜铬细胞瘤细胞系分离(SEQ ID No.：20)。在同一年，编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA和该前体肽的完整氨基酸序列也被描述。所述前体肽尤其是在N-末端包含21个氨基酸的信号序列，被称为“肾上腺髓质素前肽原”(pre-proADM)。在本说明书中，具体指定的所有氨基酸位置通常涉及所述包含185个氨基酸的pre-proADM。肾上腺髓质素(ADM)是一种包含52个氨基酸的肽(SEQ ID NO：20)并且包含pre-proADM的第95至第146位氨基酸，它通过蛋白水解切割从pre-proADM形成。到目前为止，实质上从pre-proADM的切割形成的肽片段中只有几个片段已被更精确地研究，特别是生理活性肽ADM和“PAMP”，后者是跟在pre-proADM中信号肽的第21个氨基酸之后包含20个氨基酸(22-41)的肽。ADM在1993年的发现和表征引发了密集的研究活动，其结果已被概述在各种不同的综述文章中，在本说明书的上下文中，可以具体参考在发行物“Peptides”中找到的具体专注于ADM的文章(Takahashi 2001.Peptides 22:1691；Eto 2001.Peptides 22:1693-1711)。另一份综述是Hinson等，2000(Hinson等， 2000.Endocrine Reviews 21(2):138-167)。在到目前为止的科学研究中，尤其已发现ADM可以被当作多功能调控肽。其以被甘氨酸延伸的无活性形式释放到循环中(Kitamura等， 1998.Biochem Biophys Res Commun 244(2):551-555)。也存在特异性针对ADM并且可能也调节ADM的效应的结合蛋白(Pio等，2001.The Journal of Biological Chemistry 276 (15):12292-12300)。ADM以及PAMP的在迄今为止的研究中最为重要的生理效应，是影响血压的效应。
因此，ADM是一种有效的血管舒张剂，并因此可以将所述降血压效应与ADM的C-末端部分中的特定肽区段相关联。此外已发现，上面提到的从pre-proADM形成的生理活性肽PAMP同样表现出降血压效应，尽管它似乎具有不同于ADM的作用机制(除了上面提到的综述文章Eto等，2001和Hinson等，2000之外，也参见Kuwasaki等，1997.FEBS Lett 414(1):105- 110；Kuwasaki等，1999.Ann.Clin.Biochem.36:622-628；Tsuruda等，2001 Life Sci.69 (2):239-245和EP-A2 0 622458)。此外还已发现，可以在循环和其他生物液体中测量的ADM的浓度，在许多病理状态下显著高于在健康对照对象中发现的浓度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾脏疾病、高血压障碍、糖尿病、处于急性休克期和处于脓毒症和脓毒性休克中的患者的ADM水平显著提高，尽管程度不同。在某些所述病理状态下PAMP浓度也提高，但血浆水平相对于ADM较低(Eto 2001.Peptides 22:1693-1711)。已报道，在脓毒症中观察到ADM异常高的浓度，并且在脓毒性休克中浓度最高(Eto 2001.Peptides 22:1693-1711； Hirata等，Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453； Ehlenz等，1997.Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162；Tomoda等，2001.Peptides 22:1783-1794；Ueda等，1999.Am.J.Respir.Crit.Care Med.160:132-136和Wang等， 2001.Peptides 22:1835-1840)。
在患有心力衰竭的患者中ADM的血浆浓度升高，并且与疾病严重性相关(Hirayama 等，1999.J Endocrinol 160:297–303；Yu等，2001.Heart 86:155–160)。高的血浆ADM在这些对象中是独立的负面预后指示物(Poyner等，2002.Pharmacol Rev 54:233–246)。
在几项研究中探究了MR-proADM(SEQ ID No.：33)在心力衰竭中的作用。在BACH研究中(Maisel等，2010.J.Am.Coll.Cardiol.55:2062–2076)，MR-proADM对90天死亡具有强有力的预后性，增添了超越利尿钠肽的预后价值。来自于PRIDE研究的后续数据(Shah等， 2012.Eur.Heart J.33:2197–2205)巩固了MR-proADM的预后作用；在患者中，对于1年死亡率来说，MR-proADM具有最好的曲线下面积(AUC)。类似地，在患有慢性心力衰竭(CHF)的患者中MR-proADM的水平与疾病严重性强烈相关，并且所述肽的水平升高与随访的12个月死亡的风险提高强烈相关(van Haehling等，2010.European Journal of Heart Failure 12:484–491；Adlbrecht等，2009.European Journal of Heart Failure 11:361–366)。
在患有急性失代偿性心力衰竭的患者中，在治疗期间对MR-proADM进行了调查(Boyer等，2012.Congest Heart Fail 18(2):91-97)；在急性治疗期间MR-proADM水平倾向于提高的患者具有与持久充血相关的发现。在治疗后12-24小时的时间段中，MR-proADM升高的患者具有增加的外周水肿。Kaiser等，测量了具有单室心的患者中的MR-proADM(Kaiser等，2014.Europ J Heart Failure 16:1082-1088)。在具有Fontan循环衰竭(表现出腹水和外周水肿)的患者中的水平与没有Fontan衰竭的患者相比明显更高。此外，Eisenhut推测引起肾上腺髓质素水平降低的治疗是否可以在肺炎和脓毒症中降低肺泡水肿的严重性和程度(Eisenhut 2006.Crit Care 10:418)。
在本领域中还已知一种在生物液体中鉴定肾上腺髓质素免疫反应性的方法，用于诊断目的，特别是在脓毒症诊断、心脏诊断和癌症诊断的范围内。根据所述发明，特别是使用免疫测定法测量了含有完整肾上腺髓质素前肽原的氨基酸(45-92)的肾上腺髓质素前肽的中央区部分肽(SEQ ID No.33)，所述免疫测定法使用特异性识别mid-proADM序列的至少一种标记的抗体来工作(WO2004/090546)。
WO2004/097423描述了针对肾上腺髓质素的抗体用于心血管疾病的诊断、预后和治疗的用途。在本领域中也描述了通过阻断ADM受体来治疗疾病(例如WO2006/027147、PCT/EP2005/012844)。所述疾病可以是脓毒症、脓毒性休克、心血管疾病、感染、皮肤疾病、内分泌疾病、代谢疾病、胃肠疾病、癌症、炎症、血液系统疾病、呼吸系统疾病、肌肉骨骼疾病、神经疾病、泌尿系统疾病。
对于脓毒症的早期阶段来说，已报道ADM改善心脏功能和肝、脾、肾和小肠中的血液供应。抗ADM中和抗体在脓毒症的早期阶段中中和上述效应(Wang等，2001.Peptides 22: 1835-1840)。
对于其他疾病来说，ADM的阻断可能在一定程度上是有益的。然而，如果ADM被完全中和，它也可能是有害的，因为一定量的ADM可能为几种生物功能所需。在许多报告中强调，ADM的给药在某些疾病中可能是有益的。与此相反，在其他报告中报道了ADM当在某些病症中给药时是危及生命的。
WO2013/072510描述了一种非中和性抗ADM抗体，其用于治疗患者的严重慢性或急性疾病或急性病症，用于降低所述患者的死亡风险。
WO2013/072511描述了一种非中和性抗ADM抗体，其用于治疗患者的慢性或急性疾病或急性病症，用于预防或减轻器官功能障碍或器官衰竭。
WO2013/072512描述了一种非中和性抗ADM抗体，其是提高肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半保留时间)的ADM稳定化抗体。这种ADM稳定化抗体将ADM的生物活性阻断到低于80％。
WO2013/072513描述了一种非中和性抗ADM抗体，其用于治疗患者的急性疾病或病症，用于使循环稳定。
WO2013/072514描述了一种非中和性抗ADM抗体，其用于在患有慢性或急性疾病或急性病症的患者中调节流体平衡。
发明内容
根据本发明，已发现抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架的给药可用于干预和治疗需要的患者的充血。
在整个本说明书中，根据本发明的“抗体”或“抗体片段”或“非Ig支架”能够结合ADM，因此针对ADM，并且因此可以被称为“抗ADM抗体”、“抗ADM抗体片段”或“抗ADM非Ig支架”。
与例如利尿剂的给药相比，抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架的给药的优点是肾脏保护作用。所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架对肾脏无害，因此在这一方面预期没有副作用。
根据本发明，抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架的给药优选为系统性施用。
在特定实施方式中，所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架可以被给药到具有可能引起充血的血管屏障功能障碍或内皮功能障碍的患者。
血管屏障功能障碍或内皮功能障碍是内皮(血管的内衬)的系统性病理状态，并且可以被宽泛地定义为由内皮产生的(或作用于内皮的)血管舒张和血管收缩物质之间的失衡(Deanfield等，2005.J Hypertens 23(1):7–17)。内皮细胞的正常功能包括介导血凝、血小板粘附、免疫功能和控制血管内和血管外空间的体积和电解质含量。内皮是内衬整个心血管系统并调控许多过程包括血管紧张度,血栓形成,血管生成和炎症的细胞单层。已显示内皮细胞在表型上是动态的，并且对各种不同的局部和系统性刺激做出响应，能够在静态和活化状态之间转变(Colombo等，2015.Curr Heart Fail Rep.12(3):215–222)。近年中，新兴的研究证实内皮功能障碍是心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化和充血性心力衰竭的主要贡献者(Gutierrez等，2013.European Heart Journal 34:3175–3181)。内皮严密控制流体从循环到周围组织的交换，并且这种屏障的功能障碍引起不受控制的流体外渗，可能引起充血和/或水肿。水肿(例如肺水肿)的常见特点是对水和低分子量溶质的通透性提高(Rocker等，1987.Thorax 42:620-23)。
内皮功能障碍可能由几种疾病过程引起和/或对几种疾病过程有贡献，正如在高血压、高胆固醇血症、糖尿病或脓毒性休克中发生的。内皮功能障碍是引起冠状动脉疾病和其他动脉硬化疾病的主要病理生理机制。
从在脓毒症/脓毒性休克模型中的临床前实验可知，抗ADM抗体的给药引起血浆bio-ADM浓度的提高(实施例8，图9)，并且这与存活率提高相符(Struck等，2013.Intensive Care Med Exp 1(1):22)。据认为，隐含在这种效应之下的机制如下：所述抗体在i.v.给药时，由于它的尺寸而不能跨过内皮屏障进入间隙，而是保留在血液循环中。相反，作为小肽的ADM可以自由地扩散跨过所述内皮屏障。因此，所述抗体当以超过内源ADM的极大摩尔过量给药时，事实上结合了血浆中的所有ADM，并且作为达到结合平衡的简单结果，导致ADM从间隙易位到血液循环。位于间隙的ADM可以结合到血管平滑肌细胞并诱导松弛，引起血管舒张。这被所述抗体的给药降低。另一方面，血浆中的ADM结合到内皮细胞并由此稳定化或甚至恢复血管完整性。因此，当作为给药所述抗体的结果血浆ADM水平提高时，这种功能被强化，所述抗体是非中和性抗体。最后，所述抗体与ADM的结合减少了ADM的蛋白水解衰减。
令人吃惊的是，我们已在PROTECT研究(实施例6)和BIOSTAT研究(实施例7)中观察到，在患有心力衰竭的对象中bio-ADM浓度随着充血的存在和严重性而提高，尽管他们使用利尿剂治疗。因此，这些患者中bio-ADM的提高是身体对组织充血的反调控。然而，所述自然提高不足以有效地实现这种反调控。在脓毒症中也发生组织充血。实施例5、9和10证实了在脓毒症动物模型中抗ADM抗体的给药引起受损的血管完整性的恢复。由于在脓毒症和心力衰竭两种组织充血的平行机制，本领域专业人员可以相信，与在脓毒症/脓毒性休克中相似，抗ADM抗体的给药在治疗心力衰竭中的充血中必定是有益的。
在特定实施方式中，所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架可以被给药到患者，在伴随诊断方法的帮助下用于充血的干预和治疗。
肾上腺髓质素前肽或其至少5个氨基酸的片段可用作充血的早期替代标志物，从而指导充血的治疗和干预，其包括：
·确定从所述对象获得的体液中肾上腺髓质素前肽或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
a)将所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平与所述对象中的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的高水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平与所述对象中充血的治疗或干预和治疗的需求或成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的治疗或干预和治疗的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的治疗或干预和治疗的需求，或
c)将所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平与充血的治疗或干预和治疗后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的高水平预测了充血的治疗或干预和治疗后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了充血的治疗或干预和治疗后充血的减轻，或
d)将所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平与充血的治疗或干预和治疗后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的高水平指示充血的治疗或干预和治疗后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示充血的治疗或干预和治疗后充血的减轻，或
e)将所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的高水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前肽或片段选自根据SEQ ID No.31的肾上腺髓质素前肽，或根据SEQ ID No.：32的PAMP，或根据SEQ ID No.：33的MR-proADM，或根据SEQ ID No.：20的ADM-NH2或根据SEQ ID No.：34的ADM-Gly，或根据SEQ ID No.：35的CT-proADM。
这种方法被详细描述在欧洲专利申请EP16199092和EP16178725中，并通过参考并入本文。在上述诊断方法中提到的治疗和干预是所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架的给药。
充血严重性、充血程度、充血度、充血等级等，在整个本申请中同义使用。
成熟ADM、bio-ADM和ADM-NH2在整个本申请中同义使用，并且是根据SEQ ID No.：20的分子。
在急性心力衰竭和心力衰竭的背景中，特别是在患有急性心力衰竭的对象和/或患有表现出恶化征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象中，肾上腺髓质素前肽或其片段是充血的早期、定量且准确的替代物。在急性心力衰竭或心力衰竭的背景中充血的早期且准确的替代物意味着它们的浓度和/或免疫反应性水平反映了充血程度。
如果所述肾上腺髓质素前肽或其片段的水平高于一定阈值水平，则给药所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗ADM抗体片段，或结合到ADM的抗ADM非Ig支架作为充血的治疗或干预。
这意味着在本发明的主题内容的特定实施方式中，所述抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架用于在患者中干预和治疗充血，其中从所述患者获取的体液样品表现出高于一定阈值的提高水平的proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段。因此，使用所述proADM和/或片段的诊断方法用作伴随诊断方法。
在所述诊方法的特定实施方式中，所述proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段选自：
SEQ ID No.31(proADM)：164个氨基酸(preproADM的第22-185位)
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSPEDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRRRRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID No.32(肾上腺髓质素前肽N-20端肽，PAMP)：preproADM的22-41为氨基酸
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID No.33(中段肾上腺髓质素前肽，MR-proADM)：preproADM的第45-92位氨基酸
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID No.20(成熟肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化ADM；bio-ADM)：第95-146位氨基酸-CONH2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-CONH2
SEQ ID No.34(肾上腺髓质素1-52-Gly(ADM 1-52-Gly))：preproADM的第95-147位氨基酸
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID No.35(C-末端肾上腺髓质素前肽，CT-proADM)：preproADM的148-185位氨基酸
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
在所述诊断方法的特定实施方式中，所述proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段选自成熟ADM-NH2(SEQ ID No.20)、ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.34)、MR-proADM(SEQ IDNo.33)和CT-proADM(SEQ ID No.35)。
在所述诊断方法的特定实施方式中，确定成熟ADM-NH2(SEQ ID No.20)和/或ADM1-52-Gly(SEQ ID No.34)的免疫反应性水平或MR-proADM(SEQ ID No.33)的免疫反应性水平或CT-proADM(SEQ ID No.35)的免疫反应性水平，并将其与所述患者对治疗或干预的需求相关联，其中如果所述对象的体液中成熟ADM-NH2(SEQ ID No.20)和/或ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.34)的免疫反应性水平或MR-proADM(SEQ ID No.33)的免疫反应性水平或CT-proADM(SEQ ID No.35)的免疫反应性水平高于阈值，则所述患者被鉴定为具有这种需求。
在所述诊断方法的特定实施方式中，使用选自下述的至少一种结合剂来确定proADM和/或其片段的水平：结合到成熟ADM-NH2(SEQ ID No.20)和/或ADM1-52-Gly(SEQID No.34)的序列内包含的区域的结合剂，和结合到成熟ADM-NH2(SEQ ID No.20)和/或ADM1-52-Gly(SEQ ID No.34)的序列内包含的区域的第二结合剂。
在所述诊断方法的特定实施方式中，使用选自下述的至少一种结合剂来确定proADM和/或其片段的水平：结合到MR-proADM(SEQ ID No.33)的序列内包含的区域的结合剂，和结合到MR-proADM(SEQ ID No.33)的序列内包含的区域的第二结合剂。
在所述诊断方法的特定实施方式中，使用选自下述的至少一种结合剂来确定proADM和/或其片段的水平：结合到CT-proADM(SEQ ID No.35)的序列内包含的区域的结合剂，和结合到CT-proADM(SEQ ID No.35)的序列内包含的区域的第二结合剂。
在本发明的诊断方法的特定实施方式中，主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述片段可以选自根据SEQ ID No.：33的MR-proADM或根据SEQ ID No.：20的成熟ADM-NH2。
本发明的诊断方法的主题内容是一种根据所述诊断方法的方法，其中使用肾上腺髓质素前肽或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定肾上腺髓质素前肽或其至少5个氨基酸的片段的水平。
本发明的诊断方法的主题内容是一种根据所述诊断方法的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前肽或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig支架。
在一个特定实施方式中，根据本发明的体液是血液样品。血液样品可以选自全血、血清和血浆。在所述诊断方法的特定实施方式中，所述样品选自人柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA血浆。
在本发明的特定实施方式中，所述抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架用于在根据本发明的任何实施方式的患者中干预和治疗充血，其中所述患者对利尿剂具有耐药性或者是利尿剂治疗的无应答者。
本发明的另一个特定实施方式涉及所述抗肾上腺髓质素抗体，或抗肾上腺髓质素抗体片段，或抗ADM非Ig支架，其用于在需要的患者中干预和治疗充血，其中所述抗ADM抗体，或抗ADM片段，或抗ADM非Ig支架结合到肾上腺髓质素的N-末端部分(aa 1-21)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.22)
并且其中所述患者对利尿剂具有耐药性或者是利尿剂治疗的无应答者。
术语“利尿剂耐药性”通常被定义为尽管自由使用利尿剂，但不能减少细胞外流体体积(Ravnan等，2002.CHF 8:80-85)。Epstein等将利尿剂耐药性定义为在每日两次给药160-mg口服呋喃苯胺酸药剂的72小时内不能排泄至少90mmol钠(Epstein等，1977.Curr Ther Res.21:656-667)。
对利尿药的适应性和利尿剂耐药性可能由相似的机制引起。利尿剂适应性可以被分类为在利尿作用期间发生的适应性、在短期内引起钠潴留(引起“利尿剂后NaCl潴留”)的适应性和长期增加钠潴留的适应性(“制动现象”)。肾脏适应于长期利尿剂治疗的方式是：首先，在利尿作用位点下游的肾单位区段在利尿剂给药期间由于递送的NaCl载量增加而增加NaCl再吸收。其次，当肾小管中的利尿剂浓度下降时，肾小管起到保留Na的作用，直至给药下一剂利尿剂。第三，所述利尿剂增加肾的NaCl排泄的能力随时间下降，这是由细胞外流体体积的减损和肾小管本身的结构和功能变化两者引起的效应。这些适应性都提高NaCl再吸收速率并钝化利尿剂疗法的有效性。对于综述，参见Ellison 1999.Semin Nephrol.19 (6):581-97和De Bruyne 2003.Postgrad Med J 79:268–271。
尽管难以定量，但据认为在具有充血性HF的三位患者中有一位发生利尿剂耐药性。心力衰竭代表了在其中观察到利尿剂耐药性的最常见的临床情境。在轻度充血性HF中，只要肾功能被保留，通常不会遇到利尿剂耐药性。然而，在中度和重度充血性HF患者中，利尿剂耐药性更频繁地发生，并且通常变成临床难题(Brater 1985.Drugs 30:427-443； Taylor 2000 Cardiol Rev.8:104-114)。
在所述诊断方法的特定实施方式中，将一种测定法用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的成熟ADM-NH2，并且为<70pg/ml，优选地<40pg/ml，更优选地<10pg/ml。上述浓度可以作为阈值用于根据本发明的方法。
在所述诊断方法的特定实施方式中，将一种测定法用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的MR-proADM，并且为<0.5nmol/L，优选地<0.4nmol/L，更优选地<0.2nmol/L。上述浓度可以作为阈值用于根据本发明的方法。
在所述诊断方法的特定实施方式中，将一种测定法用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的CT-proADM，并且为<100pmol/L，优选地<75pmol/L，更优选地<50pmol/L。上述浓度可以作为阈值用于根据本发明的方法。
在所述诊断方法的特定实施方式中，所述结合剂对proADM和/或其片段表现出至少107M-1、优选地108M-1的结合亲和性，优选的亲和性高于109M-1，最优选地高于1010M-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过使用较高的化合物剂量来补偿较低的亲和性，并且这种措施不导致超出本发明的范围。
为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来确定肾上腺髓质素与固定化抗体的结合的动力学。抗体的可逆固定化使用按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体来进行(Lorenz等，2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):165–173)。
在所述诊断方法的特定实施方式中，所述结合剂选自结合到proADM和/或其片段的抗体或抗体片段或非Ig支架。
在所述诊断方法的特定实施方式中，使用一种测定法来确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中这种测定法是夹心测定法，优选为全自动测定法。
在本发明的一个实施方式中，它可以是所谓的POC(护理点)测试，这是一种测试技术，其允许在患者附近在不到1小时内进行测试而不需全自动测定系统。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。
在所述诊断方法的一个实施方式中，这种测定法是使用任何种类的检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的夹心免疫测定法，优选为全自动测定法。在所述诊断方法的一个实施方式中，这种测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere
各种不同的免疫测定法是已知的，并且可用于本发明的测定法和方法，它们包括：放射免疫测定法(“RIA”)，均相酶倍增免疫测定法(“EMIT”)，酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)，酶蛋白再激活免疫测定法(“ARIS”)，试纸条免疫测定法和免疫层析测定法。
在所述诊断方法的特定实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者被标记，以便被检测。
本发明的主题内容是一种用于干预和治疗患者充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
本发明的主题内容是一种用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)和心力衰竭，特别是急性心力衰竭。
心力衰竭(HF)是在心脏的结构或功能的问题损害它供应充足血流以满足身体需要时发生的一种心脏病症。它可以引起大量各种不同症状，特别是静息时或运动期间呼吸短促(SOB)、流体潴留的迹象例如肺充血或踝关肿胀以及静息时心脏的结构或功能异常的客观证据。
心力衰竭是以由心脏功能障碍引起的一组症状和征兆为特征的临床综合征。它在发达国家是发病和死亡的主要原因之一，流行率为1-2％。心力衰竭可以被分组为慢性HF和急性HF。具有慢性HF的患者可以被分组为稳定的慢性HF、慢性HF的恶化的征兆和症状和慢性HF的急性失代偿。急性心力衰竭(AHF)被定义为心力衰竭的征兆和症状的快速发作，导致需要紧急治疗或住院治疗。AHF可以表现为急性新发HF(在以前没有心脏功能障碍的患者中AHF的新发生)或慢性HF的急性失代偿。AHF在年龄超过65岁的成年人中是住院治疗的主导原因。尽管在过去几十年中主要与治疗进步相关，慢性心力衰竭患者的预后显著改善，但在患者因失代偿性心力衰竭住院治疗后，短期和长期结果两者仍然非常不良。接近25％的因AHF住院治疗的患者在出院的30天内需要重新入院，而<50％的患者在住院治疗后存活超过5年。除了显著降低受影响患者的存活期和生命质量之外，AHF对卫生保健系统的财政负担也是巨大的。在美国，仅在2012年心力衰竭护理的总开支据估计就有310亿美元，大部分该开支与院内护理相关。由于人口老化，预测该开支在2030年将增加到空前的700亿美元。
心力衰竭包含广范围的患者，从具有通常被认为是≥50％的正常左心室射血分数(LVEF)、也被称为具有保留的EF的HF(HFpEF)的患者，到具有通常被认为是<40％的降低的LVEF、也被称为具有降低的EF的HF(HFrEF)的患者。具有40–49％范围内的LVEF的患者代表了“灰色区域”，其被定义为具有中间范围的EF的HF(HFmrEF)(Ponikowski等， 2016.European Heart Journal 18(8):891-975)。
在入院背景中AHF治疗的主要目标是充血的减轻(除去简单放置的过量的细胞内和细胞外流体)和充血的症状和征兆的缓解。利尿剂仍然是AHF中主要的充血减轻疗法，并且几乎所有住院治疗患者都接受这类药物。提高心输出量和降低充盈压力的其他类别的药物如强心剂和血管舒张剂，在所选的患者组中提供。在某些患者，特别是对利尿剂疗法没有足够应答的患者中，也可以考虑超滤。
尽管患者(通常)对利尿剂疗法响应良好，但显著比例的患者在出院时没有获得足够水平的充血减轻和等容积状态(即充血残留)。这主要与下述所述相关，即当前用于充血的临床评估的方法并不恰当。存在一致的证据表明在出院期间存在充血残留与出院后更糟的结果、特别是重新入院相关。因此，对可以便于做出关于获得的充血减轻水平和出院时间的恰当性的客观且最佳决定的更准确且可靠的充血替代物，存在着巨大的尚未满足的需求。
在本发明的特定情况下，所述对象是具有心力衰竭的对象。在本发明的另一种特定情况下，所述对象是具有急性心力衰竭的对象和/或具有表现出恶化征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象。在本发明的一种特定情况下，所述对象具有急性心力衰竭，其是新发AHF或急性失代偿性HF。在本发明的另一种特定情况下，所述对象具有急性失代偿性慢性HF或慢性心力衰竭的恶化的征兆/症状。在本发明的一种特定情况下，所述对象具有急性心力衰竭特别是新发AHF。
术语“急性”用于意味着快速发作并且描述加重或失代偿性心力衰竭，是指其中患者可以被表征为具有心力衰竭的征兆和症状的变化，导致需要紧急治疗或住院治疗的发作。
术语“慢性”是指长的持续时间。慢性心力衰竭是长期病症，通常通过症状的治疗保持稳定(稳定的慢性HF)。
稳定的慢性HF的特征在于：
1.心脏存在损害其供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
2.不存在容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的深度抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者不需要紧急治疗或疗法调整，并且不需要住院治疗。
具有恶化的征兆和症状的慢性HF的特征在于：
1.心脏存在损害其供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
2.容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的深度抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者不需要紧急治疗并且不需要住院治疗，但需要疗法调整。
慢性心力衰竭也可能失代偿(被称为急性失代偿性心力衰竭或急性失代偿性慢性心力衰竭)，其最通常是来自于并发疾病(例如肺炎)、心肌梗塞、心律失常、不受控制的高血压或患者未能维持流体限制、饮食或药物的结果。在治疗后，具有急性失代偿性慢性HF的患者可能返回到稳定的慢性代偿性状态(稳定的慢性HF)。
新发急性HF和急性失代偿性慢性HF的特征在于：
1.心脏存在损害其供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
2.容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的深度抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者需要紧急治疗或疗法调整，并且需要住院治疗。
上述作为新发AHF或急性失代偿性HF的急性心力衰竭或急性失代偿性慢性HF或慢性心力衰竭的恶化的征兆/症状的定义与Voors等，European Journal of Heart Failure (2016),18,716-726相一致。
肾功能的恶化在急性和慢性心力衰竭(HF)背景中是常见的，进来被描述为“心肾综合征”。肾充血(RC)已变得越来越多地被认为是心肾综合征的潜在贡献者，并且已提出充分控制充血并同时改善/保护肾功能作为HF中患者管理的中心目标(Aronson 2012.Expert Rev Cardiovasc Ther 10:177–189)。
HF中的充血被定义为高的左心室舒张压并伴有HF的征兆和症状例如呼吸困难、罗音和/或水肿。这些与充血相关的征兆和症状是HF相关的住院治疗的主要原因。
尽管充血(和相关征兆/症状)的缓解和等容积状态的达成仍然是住院AHF治疗的主要目标，但对于充血的评估来说不存在标准的算法或临床工具。当前关于充血的临床评估的实践以征兆和症状为中心。身体检查发现例如颈静脉压(JVP)升高、外周水肿、端坐呼吸、S3心音和肝肿大或胸部X-射线发现如心脏肥大和间质性/肺泡水肿，被用作充血的替代物。必须指出，除了仔细进行的JVP评估之外，这些参数对检测充血的预测价值是适度至温和的。对于获得用于充血的可靠且准确的替代标志物，存在着巨大的尚未满足的需求。对于以定量和定性方式确定、预测、评估和/或监测充血和充血减轻，存在着巨大且尚未满足的需求。对于确定、预测、评估和/或监测充血程度、即充血的等级，存在着需求。
对于本发明来说，充血程度也可以表述为充血的严重性等级，并且以如下所述进行确定。然而，本领域技术人员了解，充血程度可以用其他评分或替代物表述，例如由Ambrosy等人使用的评分(Ambrosy等，2013.European Heart Journal 34(11):835-843)。
正如上文解释的，充血可以许多不同方式分类。本领域技术人员了解，充血程度可以通过其他评分或替代物表述。临床分类可以基于床边身体检查，以便检测充血(存在和不存在对应于“湿”和“干”)和/或外周低灌注(存在和不存在对应于“冷”和“暖”)的临床症状/征兆的存在(对于综述，参见Ponikowski等，2016.Eur Heart J.ehw128))。这些选项的组合鉴定了4个组：暖湿(灌注良好且充血)——最通常存在的；冷湿(低灌注且充血)；冷干(低灌注而没有充血)；和暖干(代偿性的灌注良好而没有充血)。这种分类可能有助于在初始阶段指导治疗并带有预后信息。
通常，AHF的症状和征兆反映出流体超负荷(肺充血和/或外周水肿)，或者不太经常的情况下，反映出心输出量降低和外周低灌注。胸部X-射线可能是诊断AHF的有用测试。肺静脉充血、胸膜积液、间质或肺泡水肿和心脏肥大是AHF的最特异的发现，尽管在高达20％的具有AHF的患者中胸部X-射线近似正常。
充血(左侧)的症状/征兆被定义为端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难、肺罗音(双侧)、外周水肿(双侧)。充血(右侧)的症状/征兆被定义为颈静脉扩张、外周水肿(双侧)、充血性肝肿大、肝颈静脉回流、腹水、肠充血的症状(对于综述，参见Ponikowski等，2016.Eur Heart J.ehw128中的表12.2)。
水肿是由间质流体体积的异常膨胀引起的流体在细胞间组织中的积累。间质与血管内空间之间的流体受跨过毛细血管的毛细血管静水压梯度和胶体渗透压梯度调节(Trayes等，2013.Am Fam Physician 88(2):102-110)。当局部或系统条件破坏这种平衡，导致毛细血管静水压提高、血浆体积增加、血浆胶体渗透压降低(低白蛋白血症)、毛细血管渗透性提高或淋巴回流受阻时，发生流体积累。
在临床上，水肿表现为肿胀：间质流体的量由流体内稳态的平衡决定，并且流体进入间隙的分泌的增加或流体移除的受损可以引起水肿。在心力衰竭中发生静水压的升高。推广到整个身体的水肿的病因可以引起多种器官中和外周的水肿。例如，严重心力衰竭可以引起肺水肿、胸膜积液、腹水和外周水肿。
肺水肿是肺的气室和实质中的流体积累。它导致气体交换受损，并且可能引起呼吸衰竭。它是由心脏左心室不能从肺循环充分移除血液(“心源性肺水肿”)或肺实质或肺的血管系统的损伤(“非心源性肺水肿”)造成的(Ware和Matthay 2005.N.Engl.J.Med.353 (26):2788–96)。治疗聚焦于三个方面：首先改善呼吸功能，其次治疗潜在的病因，第三避免对肺的进一步伤害。肺水肿、特别是急性肺水肿，可以引起致命的呼吸窘迫或由缺氧造成的心搏骤停。它是充血性心力衰竭的基本特点。
肺水肿的压倒性症状是呼吸困难，但是也可能包括咳血(通常可见为粉色、泡沫样痰)、多汗、焦虑和皮肤苍白。呼吸短促可以表现为端坐呼吸(由于无法呼吸造成的不能平躺)和/或阵发性睡眠性呼吸困难(在夜间严重的突发性呼吸暂停的发作)。这些是由左心室衰竭造成的慢性肺水肿的常见表现症状。肺水肿的发生可能伴有“流体超负荷”的症状和征兆；这是用于描述左心室衰竭在身体其余部分上的表象的非特异性术语，并且包括外周水肿(腿的肿胀，通常为“产生凹陷”类型的肿胀，其中当被按压时皮肤缓慢恢复正常)、颈静脉压升高和肝肿大，其中肝脏增大并且可能脆弱或甚至脉动。其他征兆包括听诊时的吸气结束爆裂音(在深呼吸结束时听到的声音)和第三心音的存在。
正如前面强调的，临床替代物对于充血的检测具有低于最佳的预测价值。在所谓的PROTECT研究中(O`Connor等，2012 European Journal of Heart Failure 14:605– 612)，将充血的三种最强临床替代物(即JVP、外周水肿和端坐呼吸)合并以提高准确性，并使用下面呈现的方案开发了一种复合临床充血评分(CCS)：
然后将这三种参数中每一者的评分相加，以获得复合充血评分，其范围为0至8。
然后利用下述算法对充血严重性进行分级：
CCS＝0,无临床充血
CCS 1-3，轻度临床充血
CCS 4-5，中度临床充血
CCS≥6，重度临床充血
影响肾脏结构和功能的病症，取决于它们的持续时间可以被认为是急性或慢性的(慢性肾病(CKD)、急性肾病(AKD)或急性肾损伤(AKI))。
AKD的特征在于短于3个月的结构性肾损伤和也存在于AKI中的功能性判据，或短于3个月的GFR小于60ml/min每1.73m2，或短于3个月的GFR降低>35％或血清肌酸酐(SCr)提高>50％(Kidney International Supplements,Vol.2,Issue 1,March 2012,pp.19-36)。
AKI是大量急性肾脏疾病和障碍(AKD)中的一种，并且可以伴有或不伴有其他急性或慢性肾脏疾病和障碍发生。
AKI被定义为肾功能降低，包括GFR降低和肾衰竭。用于AKI的诊断和AKI的严重性阶段的判据是基于SCr和尿排出量的变化。在AKI中，不需要结构性判据(但是可能存在)，但发现在7天内血清肌酸酐(SCr)提高50％或提高0.3mg/dl(26.5μmol/l)或少尿。AKD可能发生在具有创伤、中风、脓毒症、SIRS、脓毒性休克、急性心肌梗塞(MI)、MI后、局部和系统性细菌和病毒感染、自体免疫疾病、烧伤患者、手术患者、癌症、肝病、肺病的患者中，以及在接受肾毒素例如环孢霉素、抗生素包括氨基糖苷类抗生素，和抗癌药物例如顺铂的患者中。
肾衰竭是AKI的一个阶段，并被定义为GFR<15ml/min，每1.73m2身体表面积，或需要肾替代疗法(RRT)。
CKD的特征在于＞3个月内肾小球滤过率(GFR)<60ml/min每1.73m2和＞3个月的肾损伤(Kidney International Supplements,2013；Vol.3:19-62)。
细胞外容积的长期扩张是构成晚期肾病(ESRD)的综合征组的最常见和历史悠久的紊乱之一。轻度至中度的容积扩张在ESRD中可能未被检测到或被忽视，但这些患者中显著的流体超负荷最终是需要在这些患者中进行住院治疗和外透析的医疗紧急事件。肺充血和充血性心力衰竭两者在ESRD中是常见的(Zoccali等，2013 Blood Purif 36:184–191)。
肝脏疾病(也被称为肝病)是肝脏的一种类型的损伤或疾病。肝脏疾病可能通过几种机制发生。常见形式的肝脏疾病是由例如肝炎病毒引起的病毒感染。肝硬化是在由于各种不同原因包括病毒性肝炎、酒精过度消费和引起慢性肝衰竭的其他形式的肝中毒造成的死亡的肝细胞的位置中纤维组织的形成。
充血性肝病是指归因于在右侧心力衰竭或提高中央静脉压的任何病因、包括严重肺高血压的背景中产生的被动肝充血的各种慢性肝损伤(Shah和Sass 2015.Liver Res Open J.1(1):1-10)。在表现出急性失代偿性HF的患者中心肝功能障碍是常见的，并且心肝综合征与心肾综合征享有某些共同的病理生理机制，例如静脉充血的增加(Nikolaou等， 2013.European Heart Journal 34:742–749)。末期肝病引起深度的水和盐潴留。尽管大多数这种流体潴留表现在腹腔中作为腹水，但在较晚阶段外周水肿可能变得显著，特别是在存在严重的低白蛋白血症时(Cho和Atwood 2002.Am J Med.113:580–586)。
根据本发明，患者的充血的干预或治疗可以与现有技术的治疗相组合。根据现有技术状态的充血的治疗或干预可以选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤，特别是利尿剂。
此外，在本发明的一个实施方式中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体，或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架是单特异性的。
单特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体，或单特异性抗肾上腺髓质素抗体片段，或单特异性抗ADM非Ig支架意味着所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到所述靶ADM内一个涵盖至少5个氨基酸的特定区域。单特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体，或单特异性抗肾上腺髓质素抗体片段，或单特异性抗ADM非Ig支架是都对同一抗原具有亲和性的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架。
在另一个特定且优选的实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架分别是单特异性抗体、抗体片段或非Ig支架，其中单特异性意味着所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到所述靶ADM内一个涵盖至少4个氨基酸的特定区域。根据本发明的单特异性抗体或片段或非Ig支架是都对同一抗原具有亲和性的抗体或片段或非Ig支架。单克隆抗体是单特异性的，但单特异性抗体也可以通过从普通生殖细胞生产它们之外的其他手段来生产。
所述抗ADM抗体，或结合到ADM的抗体片段，或结合到ADM的非Ig支架可以是非中和性抗ADM抗体或结合到ADM的抗体片段或结合到ADM的非Ig支架。
在特定实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是非中和性抗体、片段或非Ig支架。中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断接近100％、至少超过90％、优选地至少超过95％。
相反，非中和性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断少于100％、优选地少于95％、优选地少于90％、更优选地少于80％、甚至更优选地少于50％。这意味着ADM的生物活性被降低少于100％、95％或更少但不是更多、90％或更少但不是更多、80％或更少但不是更多、50％或更少但不是更多。这意味着被结合到所述非中和性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架的ADM的残留生物活性将高于0％，优选地高于5％，优选地高于10％，更优选地高于20％，更优选地高于50％。
在这种情形中，将ADM的生物活性阻断少于80％的分子，所述分子是具有“非中和性抗ADM活性”的抗体或抗体片段或非Ig支架，在这里为简单起见合称为“非中和性”抗ADM抗体、抗体片段或非Ig支架，其被定义为：
-结合到ADM的一种或多种分子，其在添加到表达有功能的由CRLR(降钙素受体样受体)和RAMP3(受体活性修饰蛋白3)构成的人重组ADM受体的真核细胞系的培养物之后，减少通过平行添加的人合成ADM肽的作用而由所述细胞系产生的cAMP的量，其中所述添加的人合成ADM，以在不存在所述待分析的非中和性抗体的情况下引起cAMP合成的半最大刺激的量添加，其中由所述结合到ADM的分子引起的cAMP的减少以不超过80％的程度发生，即使在所述待分析的结合到ADM的非中和性分子以比获得使用所述待分析的非中和性抗体可获得的cAMP合成的最大减少所需的量高10倍的量添加时。
同样的定义适用于其他范围：95％，90％，50％等。
本发明的抗体或片段是包括基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽，特异性结合抗原的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链通常为约25kDa或长度为214个氨基酸。
全长免疫球蛋白重链通常为约50kDa或长度为446个氨基酸。轻链由位于NH2末端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和位于COOH末端的κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其余恒定区基因之一编码。
抗体的基本结构单元通常是由同样的两对免疫球蛋白链构成的四聚体，每对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区结合到抗原，并且恒定区介导效应功能。免疫球蛋白也以各种不同的其他形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂合抗体和单链(例如Lanzavecchia等，1987.Eur.J.Immunol.17:105；Huston等， 1988.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883；Bird等，1988.Science 242:423-426； Hood等，1984,Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.；Hunkapille和Hood 1986.Nature323: 15-16)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被三个超变区、也被称为互补决定区(CDR)打断的构架区(参见Sequences of Proteins of Immunological Interest,E.Kabat等，1983, U.S.Department of Health and Human Services)。正如上面指出的，CDR主要负责结合到抗原的表位。免疫复合物是与所述抗原特异性结合的抗体例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或功能性抗体片段。
嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，可以将来自于小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接到人恒定区段例如κ和γ1或γ3。因此，在一个实例中，治疗性嵌合抗体是由来自于小鼠抗体的可变或抗原结合结构域与来自于人抗体的恒定或效应结构域构成的杂合蛋白质，尽管也可以使用其他哺乳动物物种，或者可变区可以通过分子技术产生。制造嵌合抗体的方法在本领域中是公知的，例如参见美国专利5,807,715。“人源化”免疫球蛋白是包含人构架区和来自于非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。所述提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，所述提供构架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方式中，在人源化免疫球蛋白中，所有的CDR都来自于供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果它们存在的话，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上同一性，即同一性为至少约85-90％，例如约95％或更高。因此，可能除了CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本上同一。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合到相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可能具有从供体构架获取的有限数目的氨基酸替换。人源化或其他单克隆抗体可以具有基本上不影响抗原结合或其他免疫球蛋白功能的其他保守氨基酸替换。示例性的保守替换是例如：gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程手段来构建(例如参见美国专利5,585,089)。人抗体是其中轻链和重链基因是人来源的抗体。人抗体可以使用本领域中已知的方法产生。人抗体可以通过对分泌目标抗体的人B细胞进行永生化来生产。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人抗体也可以通过噬菌体展示方法来生产(参见例如WO91/17271； WO92/001047；WO92/20791)，或者从人组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网站)。人抗体也可以使用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见WO93/12227；WO 91/10741)。
因此，所述抗ADM抗体可以具有本领域中已知的格式。实例是人抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在优选实施方式中，本发明的抗体是重组生产的抗体例如IgG、典型的全长免疫球蛋白或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段，例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的二价Fab(微抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化、例如通过dHLX结构域的二聚化形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab’)2片段，scFv片段，多聚化的多价和/或多特异性scFv片段，二价和/或双特异性双体，(双特异性T-细胞衔接物)，三功能抗体，多价抗体，例如来自于G之外的其他类别的；单结构域抗体，例如源自于骆驼或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体，等等。
除了抗ADM抗体之外，在本领域中公知其他生物聚合物支架与靶分子复合，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、镜像异构适体(spiegelmer)、anticalin和芋螺毒素。对于抗体格式的说明，请参见图1a、1b和1c。
在优选实施方式中，所述抗ADM抗体格式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体格式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物可利用性优化的偶联物，例如PEG化的片段。一种最优选的格式是scFab格式。
非Ig支架可以是蛋白质支架，并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合到配体或抗原。非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架(例如在US 2010/0028995中描述的)、纤连蛋白支架(例如在EP 1 266 025中描述的)、基于脂钙蛋白的支架(例如在WO 2011/ 154420中描述的)、遍在蛋白支架(例如在WO 2011/073214中描述的)、转铁蛋白支架(例如在US 2004/0023334中描述的)、蛋白A支架(例如在EP 2 231 860中描述的)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中描述的)、微型蛋白(优选为形成半胱氨酸结的微型蛋白)支架(例如在EP 2314308中描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/ 023685中描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1 941 867中描述的)。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗ADM抗体可以如实施例1中所概述的，通过合成作为抗原的ADM片段来生产。随后，使用下面描述的方法或本领域中已知的其他方法来鉴定所述片段的结合剂。
鼠抗体的人源化可以按照下述程序来进行：
为了将鼠来源的抗体人源化，分析所述抗体序列以了解构架区(FR)与互补决定区(CDR)和抗原的结构相互作用。在结构建模的基础上选择适合的人来源的FR，并将鼠CDR序列移植到所述人FR中。可以在所述CDR或FR的氨基酸序列中引入变异，以重新获得被FR序列的物种切换废除的结构相互作用。这种结构相互作用的恢复可以使用噬菌体展示文库通过随机方法或通过由分子建模指导的定向方法来实现(Almagro和Fransson 2008.Humanization of antibodies.Front Biosci.2008Jan 1；13:1619-33)。
在优选实施方式中，所述ADM抗体格式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体格式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物可利用性优化的偶联物，例如PEG化的片段。一种最优选的格式是scFab格式。
在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是全长抗体、抗体片段或非Ig支架。
在优选实施方式中，所述抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架针对并且可以结合到ADM中包含的长度为至少5个氨基酸的表位。
在更优选实施方式中，所述抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架针对并且可以结合到ADM中包含的长度为至少4个氨基酸的表位。
在本发明的一个特定实施方式中，所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架被提供用于治疗或预防患者的急性疾病或急性病症，其中所述抗体或片段或支架不是ADM结合蛋白-1(补体因子H)。
在本发明的一个特定实施方式中，所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架被提供用于治疗或预防患者的急性疾病或急性病症，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到成熟人ADM的第1-42氨基酸序列内优选地至少4个或至少5个氨基酸的区域：
SEQ ID No.：23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA。
在本发明的一个特定实施方式中，所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架被提供用于治疗或预防患者的急性疾病或急性病症，其中所述抗体或片段或支架结合到成熟人ADM的第1-21氨基酸序列内优选地至少4个或至少5个氨基酸的区域：
SEQ ID No.：22
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC。
在本发明的优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架结合到位于肾上腺髓质素的N-末端部分(第1-21位氨基酸)中的ADM的区域或表位。
在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合到肾上腺髓质素的第1-14位氨基酸(SEQ ID No.：25)内的区域或表位，这意味着肾上腺髓质素的N-末端部分(第1-14氨基酸)。在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合到肾上腺髓质素的第1-10位氨基酸(SEQ ID No.：26)内的区域或表位，这意味着肾上腺髓质素的N-末端部分(第1-10位氨基酸)。
ADM的第1-14位氨基酸
YRQSMNNFQGLRSF(SEQ ID No.：25)
ADM的第1-10位氨基酸
YRQSMNNFQG(SEQ ID No.：26)
在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合到肾上腺髓质素的第1-6位氨基酸(SEQ ID No.：27)内的区域或表位，这意味着肾上腺髓质素的N-末端部分(aa 1-6)。如上所陈述的，所述区域或表位优选地包含至少4个或至少5个氨基酸的长度。
ADM的第1-6位氨基酸
YRQSMN(SEQ ID No.：27)
在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合到肾上腺髓质素的N-末端的末端(第1位氨基酸)。N-末端的末端意味着第1位氨基酸，其是SEQ ID No.20、22或23的“Y”；对于抗体结合来说是强制性的。所述抗体或片段或支架将既不结合N-末端延伸或N-末端修饰的肾上腺髓质素，也不结合N-末端降解的肾上腺髓质素。在另一个优选实施方式中，这意味着所述抗ADM-抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架仅仅结合到成熟ADM序列内的区域，如果ADM的N-末端的末端是游离的话。在所述实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或非Ig支架将不结合到成熟ADM序列内的区域，如果所述序列例如被包含在pro-ADM内的话。
为了清晰起见，用于ADM的特定区域的括号内的数字如“N-末端部分(第1-21位氨基酸)”被本领域技术人员理解为ADM的N-末端部分由成熟ADM序列的第1-21位氨基酸构成。
在根据本发明的另一个特定实施方式中，本文提供的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架不结合到ADM的C-末端部分，即ADM的第43-52位氨基酸。
(SEQ ID No.：24)
PRSKISPQGY-NH2
在一个特定实施方式中，优选地使用本发明的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗肾上腺髓质素抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或非Ig支架导致血清、血液、血浆中的ADM水平或ADM免疫反应性提高至少10％、优选地至少50％、更优选地>50％、最优选地>100％。
在一个特定实施方式中，优选地使用根据本发明的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗肾上腺髓质素抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或非Ig支架是ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架，其将血清、血液、血浆中肾上腺髓质素的半衰期(t1/2；半保留时间)增加至少10％、优选地至少50％、更优选地>50％、最优选地>100％。
ADM的半衰期(半保留时间)可以在人血清、血液或血浆中，在分别不存在和存在ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架的情况下，使用用于ADM定量的免疫测定法来确定。
可以进行下述步骤：
-可以将ADM在分别不存在和存在ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架的情况下在人柠檬酸盐血浆中稀释，并且可以在24℃下温浴。
-在所选时间点(例如在24小时内)获取等分试样，并且可以通过在-20℃下冷冻来停止所述等分试样中ADM的降解。
-如果所选的测定法不受所述稳定化抗体影响，可以通过hADM免疫测定法直接确定ADM的量。或者，可以将所述等分试样用变性剂(如HCl)处理，并在澄清所述样品(例如通过离心)后，可以将pH中和，并通过ADM免疫测定法定量ADM。或者，可以将非免疫测定技术(例如RP-HPLC)用于ADM定量。
-对于在分别不存在和存在ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架的情况下温浴的ADM，计算ADM的半衰期。
-计算稳定化的ADM与在不存在ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架的情况下温浴的ADM相比半衰期的增加。
ADM的半衰期的两倍的提高是半衰期增加100％。
半衰期(半保留时间)被定义为在指定流体或血液中指定化学品或药物的浓度降低到它的基线浓度的一半所花费的时间长度。
可用于确定肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(半保留时间)的测定法，描述在实施例3中。
在优选实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是非中和性抗体、片段或支架。中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断几乎100％，至少超过90％，优选地至少超过95％。换句话说，这意味着所述非中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断少于100％，优选地少于95％，优选地少于90％。在其中所述非中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断少于95％的实施方式中，将ADM的生物活性阻断超过95％的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将在所述实施方式的范围之外。在一个实施方式中，这意味着所述生物活性被降低95％或更少但不是更多，优选地90％或更少、更优选地80％或更少、更优选地50％或更少但不是更多。
在本发明的一个实施方式中，所述非中和性抗体是结合到成熟人ADM的第1-42位氨基酸序列(SEQ ID No.：23)内、优选地成熟人ADM的第1-32位氨基酸序列(SEQ ID No.：28)内的至少5个氨基酸的区域的抗体，或结合到成熟鼠ADM的第1-40位氨基酸序列(SEQ IDNo.：29)内、优选地成熟鼠ADM的第1-31位氨基酸序列(SEQ ID No.：30)内的至少5个氨基酸的区域的抗体。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述非中和性抗体是结合到成熟人ADM的第1-42位氨基酸序列(SEQ ID No.：23)内、优选地成熟人ADM的第1-32位氨基酸序列(SEQ IDNo.：28)内的至少4个氨基酸的区域的抗体，或结合到成熟鼠ADM的第1-40位氨基酸序列(SEQ ID No.：29)内、优选地成熟鼠ADM的第1-31位氨基酸序列(SEQ ID No.：30)内的至少4个氨基酸的区域的抗体。
成熟人ADM的第1-32位氨基酸：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ(SEQ ID No.：28)
成熟鼠ADM的第1-40位氨基酸
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA(SEQ ID No.：29)
成熟鼠ADM的第1-31位氨基酸
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL(SEQ ID No.：30)
在根据本发明的特定实施方式中，使用一种非中和性抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig支架，其中所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段将ADM的生物活性阻断少于80％，优选地少于50％(基线值的)。必须理解，所述ADM的生物活性的有限阻断(意味着生物活性的降低)，即使在所述抗体、片段或支架的过量浓度下，意味着所述抗体、片段或支架相对于ADM过量的情况下，也发生。所述有限阻断是所述特定实施方式中所述ADM结合剂本身的固有性质。这意味着所述抗体、片段或支架分别具有80％或50％的最大抑制。在优选实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架阻断ADM的生物活性/降低ADM的生物活性至少5％。上面的陈述分别意味着仍然存在大约20％或50％或甚至95％的残留ADM生物活性。
因此，根据本发明，所述提供的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段和抗ADM非Ig支架不中和相应的ADM生物活性。
所述生物活性被定义为物质在体内或体外(例如在测定法中)，在其相互作用后对活生物体或组织或器官或功能性单元呈现的效应。在ADM生物活性的情况下，这可能是ADM在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法中的效应。因此，根据本发明，生物活性通过肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法来定义。为了在这种测定法中确定ADM的生物活性，可以进行下述步骤：
-在所述人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法中使用ADM进行剂量响应曲线。
-可以计算半最大cAMP刺激的ADM浓度。
-在恒定的半最大cAMP刺激ADM浓度下，分别通过ADM稳定化抗体或肾上腺髓质素稳定化抗体片段或肾上腺髓质素稳定化非Ig支架进行剂量响应曲线(最高100μg/ml的终浓度)。
所述ADM生物测定法中50％的最大抑制意味着所述抗ADM抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗肾上腺髓质素非Ig支架分别将ADM的生物活性阻断到基线值的50％。所述ADM生物测定法中80％的最大抑制意味着所述抗ADM抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗肾上腺髓质素非Ig支架分别将ADM的生物活性阻断到80％。这是在阻断ADM的生物活性不超过80％的意义之内。这意味着仍存在大约20％的残留ADM生物活性。
然而，通过本说明书并且在上文中，对于本文中公开的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段和抗ADM非Ig支架来说，表述“阻断ADM的生物活性”应该被理解为最多只是将ADM的生物活性从100％降低到20％的残留ADM生物活性，优选地将ADM生物活性从100％降低到50％的残留ADM生物活性；但在任何情况下均有可以如上详述确定的ADM生物活性残留。
所述ADM的生物活性可以按照实施例2，在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法(肾上腺髓质素生物测定法)中确定。
在优选实施方式中，将调节性抗体或调节性抗肾上腺髓质素抗体片段或调节性抗肾上腺髓质素非Ig支架用于治疗或预防患者的慢性或急性疾病或急性病症，以使循环稳定，特别是使系统循环稳定。
“调节性”抗ADM抗体或调节性抗肾上腺髓质素抗体片段或调节性抗肾上腺髓质素非Ig支架，是将肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半保留时间)增加至少10％、优选地至少50％、更优选地>50％、最优选地>100％，并且将ADM的生物活性阻断至少于80％、优选地少于50％的抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或非Ig支架，并且所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断至至少5％。这些值涉及半衰期和生物活性的阻断，必须与前面提到的测定法相结合理解，以便确定这些值。这在分别将ADM的生物活性阻断不超过80％或不超过50％的意义之内。
这种调节性抗ADM抗体或调节性抗肾上腺髓质素抗体片段或调节性抗肾上腺髓质素非Ig支架提供了便于给药的定量的优点。部分阻断或部分降低肾上腺髓质素的生物活性与增加体内半衰期(提高肾上腺髓质素的生物活性)的组合，导致抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig支架用量的有益简化。在内源肾上腺髓质素过量的情况下(最大刺激、脓毒症晚期、休克、衰弱期)，活性降低效应是所述抗体或片段或支架的主要影响，限制了肾上腺髓质素的(负面)效应。在低或正常的内源肾上腺髓质素浓度的情况下，抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架的生物效应是降低(通过部分阻断)和通过增加肾上腺髓质素半衰期的提高的组合。因此，所述非中和性和调节性抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig支架起到类似ADM生物活性的缓冲剂的作用，以便保持ADM的生物活性在一定的生理范围之内。
在本发明的特定实施方式中，所述抗体是单克隆抗体或其片段。在本发明的一个实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段是人或人源化抗体或从其衍生的片段。在一个特定实施方式中，将一个或多个(鼠)CDR移植到人抗体或抗体片段中。
在一种情况下，本发明的主题内容是一种结合到ADM的人CDR移植抗体或其抗体片段，其中所述人CDR移植抗体或其抗体片段包含含有下述序列的抗体重链(H链)：
SEQ ID No.：1
GYTFSRYW
SEQ ID No.：2
ILPGSGST
和/或
SEQ ID No.：3
TEGYEYDGFDY
和/或还包含含有下述序列的抗体轻链(L链)：
SEQ ID No.：4
QSIVYSNGNTY
序列“RVS”(不是序列表的一部分)：
RVS
和/或
SEQ ID No.：5
FQGSHIPYT。
在本发明的一个特定实施方式中，本发明的主题内容是一种结合到ADM的人单克隆抗体或其结合到ADM的抗体片段，其中所述重链包含选自下述序列的至少一个CDR：
SEQ ID No.：1
GYTFSRYW
SEQ ID No.：2
ILPGSGST
SEQ ID No.：3
TEGYEYDGFDY
并且其中所述轻链包含选自下述序列的至少一个CDR：
SEQ ID No.：4
QSIVYSNGNTY
序列“RVS”(不是序列表的一部分)：
RVS
SEQ ID No.：5
FQGSHIPYT。
在本发明的更特定实施方式中，本发明的主题内容是一种结合到ADM的人单克隆抗体或其结合到ADM的抗体片段，其中所述重链包含下述序列：
SEQ ID No.：1
GYTFSRYW
SEQ ID No.：2
ILPGSGST
SEQ ID No.：3
TEGYEYDGFDY
并且其中所述轻链包含下述序列：
SEQ ID No.：4
QSIVYSNGNTY
序列“RVS”(不是序列表的一部分)：
RVS
SEQ ID No.：5
FQGSHIPYT。
在非常特定的实施方式中，所述抗ADM抗体具有选自下述的序列：SEQ ID No.6，7，8，9，10，11，12和13。
根据本发明的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架对人ADM表现出一定亲和性，使其亲和常数大于10-7M、优选地大于10-8M，优选的亲和性大于10-9M，最优选地高于10-10M。本领域技术人员了解，可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和性，并且这种措施不将导致超出本发明的范围。所述亲和常数可以按照实施例1中描述的方法来确定。
本发明的主题内容是一种结合到ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其用于干预和治疗本发明的患者的充血，其中所述抗体或片段包含选自下述的序列：
SEQ ID NO：6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：8(AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：9(AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：10(AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本发明的主题内容是一种用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其包含根据本发明的抗体或片段或支架。
本发明的主题内容是一种用于干预和治疗的患者的充血的药物制剂，其包含根据本发明的抗体或片段或支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选为即用型溶液。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥状态。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂肌肉内给药。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂血管内给药。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂通过输注给药。
本发明的主题内容是一种根据本发明的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经系统性给药。
下述实施方式是本发明的主题：
1.一种抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其用于在需要的患者中干预和治疗充血。
2.根据条目1的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
3.根据条目1或2的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，和心力衰竭、特别是急性心力衰竭。
4.根据条目1至3任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是单特异性的。
5.根据条目1至4任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架对ADM表现出至少10-7M的结合亲和性。
6.根据条目1至5任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合到以下成熟人ADM的第1-42位氨基酸序列内的优选地至少4个或至少5个氨基酸的区域：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
(SEQ ID No.：23)。
7.根据条目1至6任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架结合到肾上腺髓质素的N-末端部分(第1-21位氨基酸)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(SEQ ID No.22)。
8.根据条目1至7任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架识别并结合到肾上腺髓质素的N-末端的末端(第1位氨基酸)。
9.根据条目1至8任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其特征在于所述抗体、抗体片段或非Ig支架不结合到具有ADM的第43-52位氨基酸序列的ADM的C-末端部分：
PRSKISPQGY-NH2
(SEQ ID NO：24)。
10.根据条目1至9任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架阻断ADM的不超过80％、优选地不超过50％的生物活性。
11.根据条目1至10任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者是ICU患者。
12.根据条目1至11任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合到ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述重链包含下述序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中所述轻链包含下述序列：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
序列“RVS”(不是序列表的一部分)：
RVS
SEQ ID NO：5
FQGSHIPYT。
13.根据条目12的用于干预和治疗患者的充血的结合到ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自下述的序列：
SEQ ID NO：6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：7(AM-VH1)
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SEQ ID NO：8(AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：9(AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：10(AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
14.根据条目1-13任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架，其中从所述患者获取的体液样品表现出高于一定阈值的提高水平的proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段。
15.根据条目1-14任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架，其中所述患者对利尿剂具有耐药性或者是利尿剂治疗的无应答者。
16.一种用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其包含根据条目1至15任一项的抗体或片段或支架。
17.一种用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其包含根据条目1至16任一项的抗体或片段或支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
18.根据条目16或17的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选为即用型溶液。
19.根据条目18的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥状态。
20.根据条目18至19任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给药。
21.根据条目18至19任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给药。
22.根据条目21的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂通过输注给药。
23.根据条目18至22任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经系统性给药。
实施例
应该强调，根据本发明的实施例部分的抗体、抗体片段和非Ig支架结合到ADM，因此应该被当作是抗ADM抗体/抗体片段/非Ig支架。
实施例1
抗体的产生以及它们的亲和常数的确定
产生了几种人和鼠抗体并确定了它们的亲和常数(参见表1和2)。
用于免疫接种的肽/偶联物：
合成了用于免疫接种的肽，参见表1(JPT Technologies,Berlin,Germany)，其具有附加的N-末端半胱氨酸(如果在所选ADM序列内不存在半胱氨酸的话)残基用于将所述肽偶联到牛血清白蛋白(BSA)。使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽共价连接到BSA。所述偶联程序按照Perbio的手册来进行。
鼠抗体按照下述方法来产生：
将Balb/c小鼠在第0和14天用100μg肽-BSA偶联物(乳化在100μl弗氏完全佐中)并在第21和28天用50μg(在100μl弗氏不完全佐剂中)免疫接种。在进行融合实验之前三天，所述动物接受溶解在100μl盐水中的50μg所述偶联物，作为一次腹膜内和一次静脉内注射提供。
将来自于被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞用1ml50％聚乙二醇在37℃下融合30s。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[增补有20％胎牛血清和HAT增补物的RPMI1640培养基]中生长来选择杂交克隆。两周后，将所述HAT培养基用HT培养基更换进行三次传代，然后返回到正常细胞培养基。
在融合后三周对细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体进行初筛。将测试为阳性的微量培养物转移到24孔板进行繁殖。在重新测试后，将使用有限稀释技术将所选的培养物进行克隆和再克隆，并确定同种型(也参见Lane,R.D.1985.J.Immunol.Meth.81:223- 228；Ziegler等，1996.Horm.Metab.Res.28:11-15)。
小鼠单克隆抗体生产：
抗体通过标准的抗体生产方法来生产(Marx等，1997.Monoclonal Antibody Production,ATLA 25,121)并通过蛋白A纯化。在SDS凝胶电泳分析的基础上，所述抗体纯度为>95％。
人抗体：
人抗体按照下述程序利用噬菌体展示来生产：
使用人天然抗体基因文库HAL7/8来分离针对肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变结构域(scFv)。所述抗体基因文库使用淘选策略进行筛选，包括使用含有通过两种不同间隔物连接到肾上腺髓质素肽序列的生物素标签的肽。将使用非特异性结合的抗原和链亲和素结合的抗原的淘选轮的混合物用于最小化非特异性结合剂的背景。将从第三轮淘选洗脱的噬菌体用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌菌株。将来自于这些克隆菌株的培养的上清液直接用于抗原ELISA测试(也参见Hust等，2011.JournalofBiotechnology152,159–170； Schütte等，2009.PLoS One 4,e6625)。
在对抗原的阳性ELISA信号和对链亲和素包被的微量滴定板阴性的基础上选择阳性克隆。为了进一步表征，将scFv的开放阅读框克隆到表达质粒pOPE107中(Hust等， J.Biotechn.2011)，通过固定化的金属离子亲和层析从培养上清液捕获，并通过孔径排阻层析进行纯化。
亲和常数：
为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振确定肾上腺髓质素与固定化的抗体的结合动力学。抗体的可逆固定化使用按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体来进行(Lorenz等，2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):165–173)。
分别针对下面描绘的人和鼠ADM的ADM区产生单克隆抗体。下面表代表了在进一步实验中使用的所获得抗体的选择。选择是基于靶区域：
表1：
下面是进一步获得的单克隆抗体的名单：
表2：
通过酶消化产生抗体片段：
Fab和F(ab)2片段的产生通过鼠全长抗体NT-M的酶消化来进行。将抗体NT-M用a)基于胃蛋白酶的F(ab)2制备试剂盒(Pierce 44988)和b)基于木瓜蛋白酶的Fab制备试剂盒(Pierce 44985)消化。片段化程序按照供应商提供的说明书进行。在F(ab)2片段化的情况下消化在37℃进行8小时。Fab片段化消化相应地进行16h。
用于Fab的产生和纯化的程序：
通过用0.5ml消化缓冲液清洗树脂并将柱以5000x g离心1分钟，将固定化的木瓜蛋白酶平衡。随后舍弃缓冲液。脱盐柱通过移除储存溶液并将它用消化缓冲液清洗，随后每次将它以1000x g离心2分钟来制备。将0.5ml制备的IgG样品添加到含有平衡过的固定化木瓜蛋白酶的旋转柱管。消化反应的温浴时间在台式摇床上在37℃进行16h。将柱以5000×g离心1分钟，以将消化液与固定化的木瓜蛋白酶分离开。随后将树脂用0.5ml PBS清洗并以5000×g离心1分钟。将清洗级分添加到消化过的抗体，总样品体积为1.0ml。将NAb蛋白A柱用PBS和IgG洗脱缓冲液在室温平衡。将柱离心1分钟以除去储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2ml PBS来平衡，再次离心1分钟，并将穿流液舍弃。将样品施加到柱并通过翻转重悬浮。温育在室温和上下颠倒混合下进行10分钟。将柱离心1分钟，保存含有Fab片段的穿流液。(参考文献：Coulter和Harris 1983.J.Immunol.Meth.59,199-203.；Lindner等， 2010.Cancer Res.70,277-87；Kaufmann等，2010.PNAS.107,18950-5.；Chen等， 2010.PNAS.107,14727-32；Uysal等，2009J.Exp.Med.206,449-62；Thomas等， 2009.J.Exp.Med.206,1913-27；Kong等，2009J.Cell Biol.185,1275-840)。
用于F(ab′)2片段的产生和纯化的程序：
通过用0.5ml消化缓冲液清洗树脂并将柱以5000x g离心1分钟，将固定化的胃蛋白酶平衡。随后舍弃缓冲液。脱盐柱通过移除储存溶液并将它用消化缓冲液清洗，随后每次将它以1000x g离心2分钟来制备。将0.5ml制备的IgG样品添加到含有平衡过的固定化胃蛋白酶的旋转柱管。消化反应的温浴时间在台式摇床上在37℃进行16h。将柱以5000×g离心1分钟，以将消化液与固定化的胃蛋白酶分离开。随后将树脂用0.5ml PBS清洗并以5000×g离心1分钟。将清洗级分添加到消化过的抗体，总样品体积为1.0ml。将NAb蛋白A柱用PBS和IgG洗脱缓冲液在室温平衡。将柱离心1分钟以除去储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2ml PBS来平衡，再次离心1分钟，并将穿流液舍弃。将样品施加到柱并通过翻转重悬浮。温育在室温和上下颠倒混合下进行10分钟。将柱离心1分钟，保存含有F(ab′)2片段的穿流液。(参考文献：Mariani等，1991.Mol.Immunol.28:69-77；Beale 1987.Exp Comp Immunol 11:287-96；Ellerson等，1972.FEBS Letters 24(3):318-22；Kerbel和Elliot 1983.Meth Enzymol 93:113-147；Kulkarni等，1985.Cancer Immunol Immunotherapy 19: 211-4；Lamoyi 1986.Meth Enzymol 121:652-663；Parham等，1982.J Immunol Meth 53: 133-73；Raychaudhuri等，1985.Mol Immunol 22(9):1009-19；Rousseaux等，1980.Mol Immunol 17:469-82；Rousseaux等，1983.J Immunol Meth 64:141-6；Wilson等，1991.J Immunol Meth 138:111-9)。
NT-H-抗体片段人源化：
抗体片段通过CDR移植方法进行人源化(Jones等，1986.Nature 321,522–525)。
执行下述步骤以获得人源化序列：
总RNA提取：使用Qiagen试剂盒从NT-H杂交瘤提取总RNA。
第一轮RT-PCR：使用OneStep RT-PCR试剂盒(目录号210210)。使用特异性针对重链和轻链的引物组进行RT-PCR。对于每个RNA样品，使用覆盖可变区的前导序列的简并正向引物混合物建立12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区中。在引物中没有工程化设计限制性位点。
反应设置：5xOneStep RT-PCR缓冲液5.0μl，dNTP混合物(含有10mM每种dNTP)0.8μl，引物组0.5μl，OneStep RT-PCR酶混合物0.8μl，模板RNA 2.0μl，添加无RNase水至20.0μl，总体积20.0μl。PCR条件：反转录：50℃，30min；初始PCR激活：95℃，15min；循环：94℃，25sec；54℃，30sec；72℃，30sec的循环共20个；最终延伸：72℃，10min。第二轮半巢式PCR：将来自于第一轮反应的RT-PCR产物在第二轮PCR中进一步扩增。使用特异性针对抗体可变区的半巢式引物组建立12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。
反应设置：2x PCR混合物10μl；引物组2μl；第一轮PCR产物8μl；总体积20μl；杂交瘤抗体克隆报告：PCR条件：95℃初始变性5min；95℃25sec，57℃30sec，68℃30sec的循环共25个；最终延伸为68℃10min。
在PCR完成后，将PCR反应样品在琼脂糖凝胶上运行，以可视化扩增的DNA片段。在对通过巢式RT-PCR扩增的超过15个克隆的DNA片段测序后，几个小鼠抗体重链和轻链被克隆并显示正确。蛋白质序列比对和CDR分析鉴定到一条重链和一条轻链。在与同源的人构架序列比对后，得到的可变重链的人源化序列如下：参见图5。由于在可变重链中第26、40和55位上的氨基酸和在可变轻链中第40位上的氨基酸对于结合性质来说是关键的，因此可以将它们恢复到鼠起源的。得到的候选物描绘如下。(Padlan 1991.Mol.Immunol.28,489–498； Harris和Bajorath.1995.Protein Sci.4,306–310)。
抗体片段序列(SEQ ID No.：7-14)的注释：粗体和下划线是按顺序排列的CDR 1、2、3；斜体是恒定区；铰链区用粗体字母强调，组氨酸标签用粗体和斜体字母强调；构架点突变具有灰色字母背景。
SEQ ID No.：6(AM-VH-C)
SEQ ID No.：7(AM-VH1)
SEQ ID No.：8(AM-VH2-E40)
SEQ ID No.：9(AM-VH3-T26-E55)
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：10(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID No.：11(AM-VL-C)
SEQ ID No.：12(AM-VL1)
SEQ ID No.：13(AM-VL2-E40)
实施例2
所选抗ADM抗体对抗ADM生物活性的影响
在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法(肾上腺髓质素生物测定法)中试验所选ADM抗体对ADM生物活性的影响。
在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能性测定法(肾上腺髓质素生物测定法)中靶向人或小鼠肾上腺髓质素的抗体的测试
材料：
细胞系：CHO-K1
受体：肾上腺髓质素(CRLR+RAMP3)
受体细胞系登记号：CRLR：U17473；RAMP3：AJ001016
通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)轻柔冲洗将在试验之前生长在不含抗生素的培养基中的表达人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)的CHO-K1细胞拆离，通过离心回收，并重悬浮在测定缓冲液(KRH：5mM KCl，1.25mM MgSO4，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH2PO4，1.45mM CaCl2，0.5g/l BSA)中。
与参比激动剂(hADM或mADM)平行地进行剂量响应曲线。
拮抗剂试验(96孔)：
对于拮抗剂试验来说，将6μl参比激动剂(人(5.63nM)或小鼠(0.67nM)肾上腺髓质素)与6μl试验样品在不同的拮抗剂稀释度下混合；或者与6μl缓冲液混合。在室温下温育60min后，添加12μl细胞(2,500细胞/孔)。将板在室温下温浴30min。在添加裂解缓冲液后，使用来自于Cis-Bio International的HTRF试剂盒(目录号62AM2 PEB)，按照制造商的说明书估算DeltaF的百分率，使用hADM 22-52作为参比拮抗剂。
抗体试验cAMP-HTRF测定法
在人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)cAMP功能性测定法中，在5.63nM人ADM1-52存在下试验抗h-ADM抗体(NT-H、MR-H、CT-H)的拮抗剂活性，试验中使用了下述终抗体浓度：100μg/ml，20μg/ml，4μg/ml，0.8μg/ml，0.16μg/ml。
在人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)cAMP功能性测定法中，在0.67nM小鼠ADM1-50存在下试验抗m-ADM抗体(NT-M、MR-M、CT-M)的拮抗剂活性，试验中使用了下述终抗体浓度：100μg/ml，20μg/ml，4μg/ml，0.8μg/ml，0.16μg/ml。将相对抑制针对拮抗剂浓度的数据进行作图(参见图2a至2l)。由各个抗体引起的最大抑制在表3中给出。
表3：
抗体 ADM生物活性(ADM生物活性)的最大抑制(％)
NT-H 38
MR-H 73
CT-H 100
NT-M FAB 26
NT-M FAB2 28
NT-M 45
MR-M 66
CT-M 100
非特异性小鼠IgG 0
实施例3
通过抗ADM抗体稳定化hADM的数据
使用hADM免疫测定法测试人ADM抗体对人ADM的稳定化效应。
用于人肾上腺髓质素的定量的免疫测定法
使用的技术是基于吖啶酯标记的夹心包被管发光免疫测定法。
标记的化合物(示踪剂)：
将100μg(100μl)CT-H(1mg/ml，在PBS，pH 7.4中，AdrenoMed AG Germany)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml，在乙腈中，InVent GmbH,Germany)(EP 0353971)混合，并在室温下温浴20min。标记的CT-H在SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC进行纯化。将纯化的CT-H在(300mmol/L磷酸钾，100mmol/L NaCl，10mmol/L Na-EDTA，5g/L牛血清白蛋白，pH 7.0)中稀释。终浓度为每200μL约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。吖啶酯化学发光使用AutoLumat LB 953(BertholdTechnologies GmbH&Co.KG)来测量。
固相：
将聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)用MR-H(AdrenoMed AG,Germany)(1.5μg MR-H/0.3mL 100mmol/L NaCl，50mmol/L TRIS/HCl，pH7.8)包被(室温下18h)。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将管用pH 7.4的PBS清洗并真空干燥。
校准：
所述测定法使用hADM(BACHEM AG,Switzerland)在250mmol/L NaCl，2g/L TritonX-100，50g/L牛血清白蛋白，20片/L蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics AG,Switzerland)中的稀释液来校准。
hADM免疫测定法：
将50μl样品(或校准品)移液到包被的管中，在添加标记的CT-H(200μl)后，将管在4℃温浴4h。通过用清洗溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗5次(每次1ml)，除去未结合的示踪剂。
结合到管的化学发光使用LB 953来测量：
图3示出了典型的hADM剂量/信号曲线，以及在100μg/mL抗体NT-H存在下的hADM剂量信号曲线。NT-H不影响所描述的hADM免疫测定法。
人肾上腺髓质素的稳定性：
将人ADM在人柠檬酸盐血浆中稀释(终浓度为10nM)，并在24℃下温浴。在所选时间点，通过在-20℃下冷冻来停止hADM的降解。温浴在不存在和存在NT-H(100μg/ml)的情况下进行。剩余的hADM使用上述hADM免疫测定法来定量。
图4示出了在不存在和存在NT-H抗体的情况下hADM在人血浆(柠檬酸盐)中的稳定性。单独的hADM的半衰期为7.8h，在NT-H存在下所述半衰期为18.3h(2.3倍高的稳定性)。
实施例4
抗体NT-M的体内副作用确定
将12-15周龄雄性C57Bl/6小鼠(Charles River Laboratories,Germany)用于所述研究。6只小鼠用0.2mg/ml的(10μl/g体重)剂量的NT-M处理。作为对照，6只小鼠用(10μl/g体重)的PBS处理。存活率和身体状况被监测14天。在两个组中死亡率均为0，在NT-M和对照组之间没有身体状况的差异。
实施例5
NT-H的效能的剂量依赖性
在通过肾脏的免疫组织化学染色所确定的肾脏屏障功能障碍的基础上，在小鼠CLP模型中检查NT-H的效能的剂量依赖性。
将12-15周龄雄性C57Bl/6小鼠(Charles River Laboratories,Germany；n＝6/组，4组)用于所述研究。在少量异氟烷麻醉(和伴随着手术的力莫敌0.5mg/kg s.c.)下通过手术诱导腹膜炎。切口在腹腔的左上部分(盲肠的正常位置)中做出。将盲肠暴露出来并将紧密结扎置于盲肠周围，在小肠插入部分的远端缝合。使用24号针头在盲肠中制造一个穿刺伤，并通过伤口露出少量盲肠内含物。将盲肠重新放回到腹腔中，并将剖腹手术位点封闭。最后，将动物放回它们的笼子，使其自由取用食物和水。作为补液s.c.提供500μl盐水。在CLP和施用试验品后18小时，将动物处死并取出肾脏。
小鼠用介质和不同浓度的化合物处理。介质和化合物由赞助人作为“即用型”溶液，作为带有A、B、C和D标记的试管提供。在CLP之前5分钟，以0.1/2/20mg/kg体重的剂量，以5μl/g体重的体积，通过尾静脉注射进行单次静脉内注射。介质是pH 6.0的20mM His/HCl。
从18小时后的存活者进行末梢取血。通过末梢取血从每组3个另外的个体获得在CLP后6h抽取的500μl血液。最晚在取样后1h将EDTA血浆样品深冻。
用于免疫组织化学的肾脏处理：
小鼠通过放血处死，因此肾脏没有充满血液，并在随后立即取出肾脏。在解剖后将肾脏在矢状面中切开，产生完整的两半。将所述两半肾脏置于最低10X体积的10％福尔马林(4％中性缓冲的甲醛：Fischer 639 3113)中。将所述两半各自(未附连地)置于装有10％福尔马林的5ml杯子中，并且(在固定期间可以将样品邮寄给我们)在室温下固定6天(脱水和石蜡包埋过夜：dH20清洗2hrs，40％乙醇1hr，70％乙醇1hr 2X，80％乙醇1hr，90％乙醇1hr，100％乙醇1hr 2X，二甲苯40℃1.5hrs，二甲苯45℃1.5hrs，石蜡60℃1hr 3X，包埋在暗盒中)。将左肾在收到后立即剖开，用福尔马林固定6天并在石蜡中包埋。将5μm切片脱石蜡，暴露于HIER、10％山羊或驴血清、第一抗体(VEGF、Alb、Ang1)、抗兔或抗山羊IgG AP第二抗体，然后暴露于Dako REAL发色体，并用苏木精复染。将载玻片使用Axio Vision(rel.4.8)软件(Zeiss,Jena Germany)进行分析，并表示为红色的光密度测量和的平均值。染色的肾脏的关于白蛋白的光密度测量评估显示出试验的所有三种剂量都具有明显更低的血管外白蛋白积累，在20mg/kg剂量下效应略微更低(图6)。
已知VEGF提高内皮血管通透性，并因此充当肾脏屏障功能状态的支持性生物标志物。如图7中所示，在所有试验的剂量下存在明显更低的VEGF表达，没有任何剂量依赖性。
已知血管生成素1针对这种VEGF诱导的血浆渗漏提供保护，因此应该与VEGF表达水平成互反关系。这在图8中被显示为对于所有试验的剂量来说是显著的。
在本研究中，在小鼠中CLP诱导的腹膜炎模型中，评估了在手术之前5min i.v.提供的三种不同剂量的NT-H的效能。与安慰剂组相比，在所有试验的剂量下，NT-H显著提高脓毒症小鼠肾脏的血管完整性。NT-H在广泛的剂量范围内开拓有益的效应，在20mg/kg下具有效应较低的轻微趋势。
此外，本研究的结果表明NT-H抗体的应用，通过降低内皮血管通透性并因此防止或提供保护以免于血管流体外渗并最终防止或提供保护以免于充血和/或水肿，具有正面效应。
实施例6
PROTECT研究
研究群体和测量
本研究的细节已经公布(Massie等，2010.N Engl J Med.363:1419-1428.； Weatherleyfunctioned al.2010.J Card Fail.16:25-35.；Voors等，2011.J Am Coll Cardiol.57:1899-1907)。简单来说，包含2,033位肾功能受损(使用Cockcroft–Gault公式估算的肌酐清除率在20至80mL/min之间)的急性心力衰竭患者，并随机分入罗洛菲林(rolofylline)或安慰剂组。所述PROTECT研究的方案得到每个参与中心的伦理委员会批准，并从所有参加者获得书面知情同意书。
在PROTECT试验中包含的1572位住院治疗的AHF患者中，从在基线评估期间收集的血浆(所有可用的基线样品)测量Bio-ADM。PROTECT(表示“将选择性A1腺苷受体拮抗剂罗洛菲林用于具有急性失代偿性心力衰竭和容量超负荷的住院患者以评估对充血和肾功能的治疗效果的安慰剂对照的随机研究”)是一项多中心随机双盲试验，其在2033位因AHF住院的患者中将罗洛菲林与安慰剂进行比较。
研究结果
正如前文强调的，临床替代物对于充血的检测具有低于最佳的预测价值。在这项分析中，我们将充血的三种最强临床替代物(即JVP、外周水肿和端坐呼吸)合并以提高准确性，并使用下面呈现的方案开发了一种复合临床充血评分(CCS)：
参数 0 1 2 3
外周水肿 0 踝 低于膝 高于膝
端坐呼吸 0个枕头 1个枕头 2个枕头 3个枕头
JVP <6cm 6-10cm >10cm -
然后将这三种参数中每一者的评分相加，以获得复合充血评分，其范围为0至8。类似的方案以前被Ambrosy等人使用过(Ambrosy等，2013.European Heart Journal 34(11): 835-843)。
然后利用下述算法对充血严重性进行分级：
CCS＝0,无临床充血
CCS 1-3，轻度临床充血
CCS 4-5，中度临床充血
CCS≥6，重度临床充血
利尿剂应答被定义为每40mg利尿剂到第4天为止的体重减轻。
血液浓缩被编码为0(如果到第4天为止与基线相比血红蛋白水平降低或没有变化)或1(如果到第4天为止与基线相比血红蛋白水平提高)。
显著的充血残留被定义为到第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。
统计分析
基线临床特征和生物标志物包括bio-ADM通过基线时临床充血的严重性来概述(上面呈现的方案)。与基线时临床充血的严重性独立相关的基线因素使用多变量逻辑回归模型来确定(CCS变量被重新编码为使用两种水平的二元结果；0＝轻度/中度(CCS<6)和1＝重度(CCS≥6))。
基线bio-ADM水平与利尿剂应答(连续变量)之间的关联性使用线性回归分析来评估。对于血液浓缩和显著的充血残留结果来说，进行二元逻辑回归分析。多变量模型被用于评估bio-ADM水平与这些结果之间的调整过的关联性。
结果
在表4中，证实了bio-ADM浓度随着充血的严重性而提高。
表4：通过基线时临床充血的严重性分组的基线临床变量和生物标志物
此外，通过多变量逻辑回归证实了bio-ADM是充血严重性的独立预测物并且在所有其他可用的变量中是最强的(表5)。
表5：在多变量逻辑回归模型中与基线临床充血的严重性(重度相比于轻度/中度)独立相关的基线因素
整个模型的曲线下面积(AUC)为0.69，各个因素的AUC：bio-ADM＝0.66，BMI＝0.61，血清白蛋白＝0.58，既往HF住院＝0.54。
与基线时临床充血的严重性相关的基线临床变量或生物标志物非常少，bio-ADM似乎是到目前为止最强的。
此外，分析了bio-ADM是否将预测充血减轻。在表6中，证实了bio-ADM是到第7天为止显著的充血残留的独立预测物。
表6：基线bio-ADM水平与充血减轻的标志物之间的关联性
*被定义为到第7天为止复合充血评分>2
**对于包括端坐呼吸、JVP、外周水肿、PCI史、起搏器、ACEI/ARB使用、BMI、DBP、BUN、血细胞比容和BNP在内的基线变量进行调整
#对于基线临床充血评分进行调整(NB：在血液浓缩数据中存在～30％的缺失)
bio-ADM的基线水平独立地预测到第7天为止显著的充血残留。
正如为充血的标志物所预期的，bio-ADM浓度越高，疗法使用的利尿剂越多(表7和8)。
表7：在基线bio-ADM水平的三分位中，直至第7天或出院(如果更早的话)的总IV利尿剂剂量；PROTECT
表8：基线bio-ADM水平与直至第7天或出院(如果更早的话)的总IV利尿剂剂量之间的未调整和调整过的关联性；线性回归分析；PROTECT
*对年龄、收缩压、肌酐、血尿素氮(BUN)、白蛋白、钠、以前的HF住院、基线复合充血评分(CCS)和BNP进行调整；必须指出，在这个模型中，对于bio-ADM、基线CCS和肾功能来说关联性最强
在同一个样品集中也确定了MR-proADM。根据MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表9中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度的提高相关联。
表9：根据MR-proADM的三分位分组的基线特征
实施例7
BIOSTAT研究
在BIOSTAT研究(慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究)中进行了其他分析。所述研究已被详细描述(WWW.BIOSTAT-CHF.EU；Voors等，2016.Eur J Heart Fail.Jun；18(6):716-26)。慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究(BIOSTAT-CHF)包含来自于11个欧洲国家的2516位具有心力衰竭的恶化征兆和/或症状的患者，他们被认为正接受非最优医学治疗。来自于苏格兰的另外1738位患者被包含在验证组群中。总的来说，两个患者组群匹配良好。大部分患者因急性心力衰竭入院治疗，其余的患者在门诊部表现出心力衰竭的恶化征兆和/或症状。大约一半的患者处于纽约心脏联合会III级，并且指标与验证组群相比分别由7％相比于34％的患者具有保留射血分数的心力衰竭。根据研究设计，所有患者使用利尿剂，但归因于两个组群的入选标准，患者未进行最优的、基于证据的医学治疗。在随访期，鼓励将剂量增加到指南推荐的剂量。
研究群体
患者满足下述入选标准：
·年龄≥18岁，具有新发或恶化的心力衰竭的症状，
·具有通过下述指标记录的心脏功能障碍的客观证据，
·左心室射血分数≤40％，或
·BNP和/或N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)的血浆浓度分别>400pg/mL或>2000pg/ml，
·在入选时使用口服或静脉内呋喃苯胺酸≥40mg/天或等效量治疗，
·以前未使用基于证据的疗法[血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂/血管紧张肽受体拮抗剂(ARB)和β-阻断剂]治疗或在入选时接受这些药物的≤50％的靶剂量，
·预期将由治疗医师开始或上调ACE抑制剂/ARB和/或β-阻断剂剂量。
患者作为住院患者或从门诊部征召。大约2/3是住院患者，1/3在门诊背景中发现。
在本发明中，对包含所述试验中包括的所有患者类型且基线时的生物标志物测量值可以获得的患者子集(n＝1806)进行了分析。
与PROTECT研究(实施例6)相似，在BIOSTAT研究中bio-ADM水平的提高也与水肿严重性的提高相关(表10)。
表10：通过外周水肿的严重性分组的基线临床变量和标准的生物标志物；BIOSTAT
在相同的样品集中也确定了MR-proADM。通过MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表11中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度提高相关联。
表11：通过MR-proADM的三分位分组的基线特征
实施例8
在健康人中NT-H的给药
所述研究在健康男性对象中作为随机双盲安慰剂对照研究进行，使用在3个连续组中作为静脉内(i.v.)输注给药的单升级剂量的NT-H抗体(第1组0,5mg/kg，第2组2mg/kg，第3组8mg/kg)，每个组8位健康男性对象(每组n＝6活性药剂，n＝2安慰剂)。
主要入选标准是书面知情同意书，年龄18-35岁，同意使用可靠的避孕方式并且BMI在18至30kg/m2之间。
对象在研究单位中通过在1小时时间段内缓慢输注来接受单剂i.v.NT-H抗体(0.5mg/kg；2mg/kg；8mg/kg)或安慰剂。
4个组中的基线ADM值没有差异。ADM值中位数在安慰剂组中为7.1pg/mL，在第一治疗组(0.5mg/kg)中为6.8pg/mL，第二治疗组(2mg/kg)中为5.5pg/mL，第三治疗组(8mg/mL)中为7.1pg/mL。
结果显示，在健康人个体中，在NT-H抗体给药后前1.5小时内ADM值快速提高，然后达到平台并缓慢降低(图9)。
实施例9
在脓毒症猪二次打击模型中NT-H抗体的给药
在猪中已确立的二次打击脓毒性休克模型(Simon TP等，Crit Care.2012 Jan 25；16(1):R16)被用于诱导心力衰竭并研究抗体NT-H对血液动力学和临床参数包括心功能的影响。
将16只雌性德国长白猪麻醉并用通气机通气(n＝16；平均值±标准偏差(SD)33±1.5kg体重(BW))，并遵照用于实验室动物护理的标准程序。本研究得到动物护理和使用的学术和当地委员会批准(Landesamt für Natur,Umwelt und VerbraucherschutzNordrhein-Westfalen,Germany,84-02.04.2015.A037)。
动物被预先给药阿扎哌隆(1-2mg/kg BW)和氯胺酮(10mg/kg BW)，并通过静脉内注射丙泊酚(1-2mg/kg BW)引起全身麻醉。将动物经口插管并仰卧位放置。使用丙泊酚和芬太尼的输注维持全身麻醉。选择压力控制模式通气为所述动物通气，使用0.5的吸入氧分数、1:1.5的吸入/呼出比例、设置到5cm H2O的PEEP和8-10ml/kg BW的潮气量。设定呼吸率以维持PaCO2为3.5–4.5kPa。使用加温毯将身体核心温度维持在高于37.5℃。将两个中央静脉导管插入到颈外静脉和股静脉中，并将动脉PICCO导管通过经皮穿刺插入到股动脉中。
在研究结束时，在动物仍处于深度麻醉状态下时，有兽医在场使用致死剂量的(Merial，Hallbergmoos，Germany)将它们安乐死。
在这个模型中，我们每kg/BW使用具有7-9×1011个菌落形成单位(CFU)的带有大肠杆菌的凝块来诱导脓毒性休克。
血液动力学测量：
所有血管内压力测量参考中胸水平，并且在呼气末获得值。连续记录心率、平均动脉压(MAP)、中央静脉压(CVP)和每搏量变异度(SVV)。心输出量(CO)使用经肺热稀释法测量(PICCO，Pulsion medical systems，Feldkirchen,Germany)。血管外肺水(EVLW)、胸腔内血容量(ITBV)和全心舒张末容量(GEDV)使用标准公式来计算。
实验流程：
在插管期间，动物接受10ml/kg BW/hr的平衡晶体溶液。失血性休克通过经股静脉导管对动物放血来诱导。将所述动物放血直至达到基线MAP的一半。将失血性休克维持45分钟，然后使用平衡晶体溶液进行体液复苏，以便恢复基线平均动脉压。在失血性休克后2小时，用在失血性休克期间收集的血液重新输血。作为第二次打击，使用在失血性休克后6小时置于腹腔中的带有大肠杆菌的凝块诱导脓毒症。将动物随机指派以接受肾上腺髓质素抗体或介质溶液。使用抗体或介质溶液的治疗在脓毒症诱导后立即开始。在30分钟时间段内输注2mg/kg BW的抗体/介质溶液。在诱导脓毒症后4小时，使用平衡晶体并根据需要使用去甲肾上腺素开始脓毒性休克的治疗。确定容量替代和血管加压剂的量以维持8-12mmHg的中央静脉压、高于65mmHg的平均动脉压和70％的中央静脉氧饱和度，正如由SurvivingSepsis Campaign所推荐的。脓毒症治疗继续进行8小时。在失血性休克之前、脓毒症诱导之前和脓毒症诱导后1、2、3、4、6、8、10和12小时，获得用于几种测量的EDTA血浆和血清样品，并储存在-80℃下直至测量。在假手术组的动物上不进行失血性和脓毒性休克，但除此之外，它们接受相同的治疗包括所有血管内导管、中位线剖腹手术并且不知情地施用抗体/介质溶液，并且与脓毒症动物中一样抽取血液样品。治疗和血样抽取的时间表示出在图10中。
正如预期的，在两个组中，在脓毒症诱导后ADM血浆浓度开始提高。这种提高被与脓毒症诱导一起的NT-H抗体的给药加速。尽管介质组在脓毒症诱导后1小时显示出提高到大约30pg/mL，但治疗组在同一时间点显示为265pg/mL。在施用NT-H抗体后3小时，治疗组达到大约1,100pg/mL的稳态，而介质组显示出ADM浓度的恒定提高，在实验结束时高达700pg/mL(图11)。NT-H抗体的施用也在假手术对照动物中诱导血浆ADM的提高。这类似于在健康人中看到的结果(实施例8)。
在为失血性休克放血的时间点将心率(HR)提高以便补偿容量的丧失，并在用晶体溶液和血液进行容量替代后返回到初始值。在脓毒症诱导后，将心率在第一个小时保持恒定在60-65min-1，随后开始提高，其中在介质组中与抗体治疗组相比提高的速率更高，最终值为125min-1(介质)相比于98min-1(治疗)(图12)。
心输出量(CO)描述了每单位时间被心脏、特别是被左或右心室泵出的血液的体积。CO值可以使用许多物理单位来表示，例如L/min。在本研究中，与介质组相比，在NT-H抗体治疗组中，心输出量明显更低(图13)。
与介质组相比，对于NT-H抗体治疗组来说为维持恒定的平均动脉压而需要的流体(图14和15)和去甲肾上腺素(图16)明显更少。重要的是，仅仅三分之一的NT-H治疗的动物变得休克(例如需要血管加压剂支持以维持靶MAP)，而所有介质对照都需要血管加压剂(图17)。在NT-H抗体治疗组与介质组之间尿排出量没有差异。在施用NT-H抗体后对流体的需求减少，特别是也考虑到对去甲肾上腺素的需求减少，证实了在NT-H抗体治疗组中较少的流体避开血液循环并且因此发生较少的充血。
血管阻力是指由除了肺血管之外的全部系统血管提供的对血液流动的阻力。系统性血管阻力(SVR)被用于血压、血流和心功能的计算。SVR，单位为dyn.s.cm-5，使用下述公式从其他测量值计算：
SVR＝80×(MAP-CVP)/CO
SVR提高以使动脉血管管路收紧，以试图维持血压。如图18中所示，在这个动物模型中，与介质组相比，在NT-H治疗组中系统血管阻力更高。
实施例10
在LPS诱导的大鼠内毒素血症中NT-H的给药
本研究的目的是调查在大鼠中，在LPS诱导的内毒素血症后HAM8101对肝脏和肾脏中血管通透性的影响。
将剂量为0.02、0.1、0.5和2.5mg的HAM8101/kg b.w.或PBS i.v.施用(单次快速浓注)到雄性Wistar大鼠(n＝8/组)(参见表12)。5分钟后，施用2.5或5mg LPS/kg b.w.以诱导内毒素血症(2.5mg LPS/kg组仅用于试验适合的LPS剂量并且不进一步评估)。在施用LPS和HAM8101后3、6和24小时获取血液样品。
在施用LPS溶液后24小时，通过尾静脉注射缓慢施用伊文思蓝，并在15分钟后将动物杀死并用肝素化盐水(50IU/mL)灌注。取出肾脏和肝脏，称重并切碎，并在进一步操作后确定组织中伊文思蓝的浓度(620nm处的光谱吸收)，其指示了血管通透性。此外，在灌注之前从膀胱收集尿液。
表12实验组和剂量
安慰剂(NaCl+LPS)组的rADM血浆浓度的时间过程显示出在LPS施用后的前6个小时内提高到140pg/mL的峰值血浆浓度，随后降低到24小时为64pg/mL。
在HAM8101治疗后，总rADM水平以剂量依赖性方式进一步提高，在LPS和HAM8101施用后3小时达到峰值rADM浓度，对于2.5mg/kg来说为550pg/mL，对于0.5mg/kg来说为270pg/mL。0.1和0.02mg/kg的较低剂量与LPS诱导的rADM提高相比没有显示出任何进一步提高(19A)。当将总rADM水平归一化到在相应时间点在安慰剂组中获得的水平时，在2.5和0.5mg/kg组中最大峰值处的水平分别提高5.3和2.7倍。这种与基线相比总血浆ADM浓度的提高，在健康动物(对于2.5mg/kg来说3倍)和脓毒症小鼠(2倍)中更高。0.1和0.02mg/kg的较低剂量没有显示出总rADM水平提高到超过使用单独的LPS获得的水平(19B)。
将大鼠用5mg/kg b.w的NaCl(健康，绿色)或LPS(安慰剂，红色)处理；在LPS施用之前5分钟，使用单次i.v.快速浓注，将大鼠进一步用不同剂量的NaCl(安慰剂，红色)或HAM8101(蓝色)处理。在LPS施用后3、6和24小时确定rADM的水平，并呈现为(A)平均值±SEM或(B)与相应时间点处的安慰剂组相比的诱导倍数。
在LPS激惹后，血管通透性显著提高。在0.1至2.5mg/kg HAM8101的剂量下用HAM8101处理后，肾脏中存在血管通透性的清楚且显著的降低(参见图20A)。在0.1mg/kg的剂量下，与0.5和甚至2.5mg/kg的剂量相比，通透性向正常健康状态的恢复明显更加有效(p<0.05)。需要在另外的研究中确认这种效应是否可靠。相反，在0.02mg/kg下几乎没有注意到对血管通透性的有益效应。肝脏中血管通透性的数据显示出可比较的趋势，但没有统计学显著性(参见图20B)。
将大鼠用5mg/kg b.w的NaCl(对照，绿色)或LPS(安慰剂，红色)处理；在LPS施用之前5分钟，使用单次i.v.快速浓注，将大鼠进一步用不同剂量的NaCl(安慰剂，红色)或HAM8101(蓝色)处理。在LPS激惹和处理后24小时，通过(A)肾脏和(B)肝脏组织中伊文思蓝浓度的确定来测量血管通透性。值作为平均值±SEM给出；<0.05的p-值被认为是统计学显著的。
总而言之，在这种大鼠内毒素血症模型中，始于0.1mg/kg的剂量的HAM8101的治疗在肾脏中导致血管通透性的显著恢复。对于肝脏来说观察到可比的效果，然而它在统计上不显著。尚不清楚这是真实的效应还是由使用的检测方法造成的。在高于0.1mg/kg的HAM8101剂量下注意到总血浆rADM水平的显著提高。
序列
SEQ ID No.：1
GYTFSRYW
SEQ ID No.：2
ILPGSGST
SEQ ID No.：3
TEGYEYDGFDY
SEQ ID No.：4
QSIVYSNGNTY
序列“RVS”(不是序列表的一部分)：
RVS
SEQ ID No.：5
FQGSHIPYT
SEQ ID No.：6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：8(AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：9(AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：10(AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID No.：11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.：12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.：13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.：14(人ADM 1-21)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID No.：15(人ADM 21-32)
CTVQKLAHQIYQ
SEQ ID No.：16(人ADM C-42-52)
CAPRSKISPQGY-CONH2
SEQ ID No.：17(鼠ADM第1-19位氨基酸)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
SEQ ID No.：18(鼠ADM第19-31位氨基酸)
CTFQKLAHQIYQ
SEQ ID No.：19(鼠ADM C-40-50)
CAPRNKISPQGY-CONH2
SEQ ID No.：20(成熟人肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化ADM；bio-ADM)：1-52位氨基酸或pro-ADM的95-146位氨基酸
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH2
SEQ ID No.：21(鼠ADM第1-50位氨基酸)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGY-CONH2
SEQ ID No.：22(人ADM的第1-21位氨基酸)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID No.：23(人ADM的第1-42位氨基酸)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
SEQ ID No.：24(人ADM的第43-52位氨基酸)
PRSKISPQGY-NH2
SEQ ID No.：25(人ADM的第1-14位氨基酸)
YRQSMNNFQGLRSF
SEQ ID No.：26(人ADM的第1-10位氨基酸)
YRQSMNNFQG
SEQ ID No.：27(人ADM的第1-6位氨基酸)
YRQSMN
SEQ ID No.：28(人ADM的第1-32位氨基酸)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ
SEQ ID No.：29(鼠ADM的第1-40位氨基酸)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA
SEQ ID No.：30(鼠ADM的第1-31位氨基酸)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL
SEQ ID No.：31(proADM：164个氨基酸(preproADM的第22-185位氨基酸))
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSPEDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRRRRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID No.：32(肾上腺髓质素前肽N-20末端肽；PAMP：preproADM的第22-41位氨基酸)
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID No.：33(中段肾上腺髓质素前肽，MR-proADM：preproADM的第45-92位氨基酸)
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID No.：34(肾上腺髓质素1-52-Gly(ADM 1-52-Gly)：preproADM的95-147位氨基酸)
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID No.：35(C-末端肾上腺髓质素前肽，CT-proADM：preproADM的148-185位氨基酸)
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
附图说明
图1a：
抗体格式的说明——Fv和scFv-变体。
图1b：
抗体格式的说明——异源融合和双功能抗体。
图1c：
抗体格式的说明——双价抗体和双特异性抗体。
图2：
a：人ADM的剂量响应曲线。最大cAMP刺激被调整到100％激活。
b：在5.63nM hADM存在下人ADM 22-52(ADM受体拮抗剂)的剂量/抑制曲线。
c：在5.63nM hADM存在下CT-H的剂量/抑制曲线。
d：在5.63nM hADM存在下MR-H的剂量/抑制曲线。
e：在5.63nM hADM存在下NT-H的剂量/抑制曲线。
f：小鼠ADM的剂量响应曲线。最大cAMP刺激被调整到100％激活。
g：在0,67nM mADM存在下人ADM 22-52(ADM受体拮抗剂)的剂量/抑制曲线。
h：在0,67nM mADM存在下CT-M的剂量/抑制曲线。
i：在0,67nM mADM存在下MR-M的剂量/抑制曲线。
j：在0,67nM mADM存在下NT-M的剂量/抑制曲线。
k：示出了ADM被F(ab)2NT-M和Fab NT-M的抑制。
l：示出了ADM被F(ab)2NT-M和Fab NT-M的抑制。
图3：
该图示出了典型的hADM剂量/信号曲线和在100μg/mL抗体NT-H存在下hADM的剂量/信号曲线。
图4：
该图示出了在不存在和存在NT-H抗体的情况下，hADM在人血浆(柠檬酸盐)中的稳定性。
图5：
Fab与同源人构架序列的比对。
图6：
CLP和NT-M以不同剂量施用后18h血管外白蛋白的积累。
图7：
CLP和NT-M以不同剂量施用后18h VEGF的表达。
图8：
CLP和NT-M以不同剂量施用后18h血管生成素-1的表达。
图9：
在NT-H以不同剂量施用后直至60天健康人对象中的ADM浓度。
图10：
在二次打击猪模型中处理和血液样品抽取的时间表。
图11：
介质(正方形)和处理(点)组的ADM浓度(平均值和SEM)(对于相互作用来说p＝0.003；t＝7h至19h，多变量，时间*组)。
图12：
介质(正方形)和处理(点)组的心率(平均值和SEM)，对于相互作用来说p＝0.097(从t＝7h至t＝19h，多变量，时间*组)。
图13：
介质(正方形)和处理(点)组的心输出量(平均值和SEM)(t-检验：对于t＝9、10、11h来说p<0.05)。
图14：
介质(正方形)和处理(点)组的容量需求/施用(平均值和SEM)(在17h时的t-检验：p＝0.034；在19h时的t-检验：p＝0.045)。
图15：
介质(正方形)和处理(点)组的累积容量需求/施用(平均值和SEM)(对于19h时的t-检验来说p＝0.039；对于19h时的Mann-Whitney来说p＝0.036)。
图16：
介质(正方形)和处理(点)组的去甲肾上腺素需求/施用(平均值和SEM)。
图17：
介质(正方形)和处理(点)组的对血管加压剂支持的需要(在t＝19h时的Chi2检验：对于相互作用来说p＝0.014(t＝7h-19h，多变量，时间*组：0.019)。
图18：
介质(正方形)和处理(点)组的系统性血管阻力(平均值和SEM)(t-检验：15h：p＝0.069；17h：p＝0.037；19h：p＝0.066)。
图19：
LPS诱导的内毒素血症大鼠模型中的rADM浓度
图20：
内毒素血症大鼠模型中的血管通透性。
SEQUENCE LISTING
<110> AdrenoMed AG
<120> Anti-Adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment
or anti-ADM non-Ig scaffold for use in intervention and therapy ofcongestion in a patient in need thereof
<130> A75133WO
<150> EP16204847.4
<151> 2016-12-16
<150> EP16206305.1
<151> 2016-12-22
<150> EP17197176.5
<151> 2017-10-18
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> human
<400> 2
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> human
<400> 4
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> human
<400> 5
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 225
<212> PRT
<213> human
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210 215 220
His
225
<210> 7
<211> 225
<212> PRT
<213> human
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210 215 220
His
225
<210> 8
<211> 225
<212> PRT
<213> human
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210 215 220
His
225
<210> 9
<211> 225
<212> PRT
<213> human
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210 215 220
His
225
<210> 10
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<212> PRT
<213> human
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
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His
225
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<212> PRT
<213> human
<400> 11
Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
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<212> PRT
<213> human
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 219
<212> PRT
<213> human
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> human
<400> 14
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> human
<400> 15
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> human
<400> 16
Cys Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> murine
<400> 17
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> murine
<400> 18
Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> murine
<400> 19
Cys Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 52
<212> PRT
<213> human
<400> 20
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 21
<211> 50
<212> PRT
<213> murine
<400> 21
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35 40 45
Gly Tyr
50
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> human
<400> 22
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> human
<400> 23
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala
35 40
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> human
<400> 24
Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> human
<400> 25
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> human
<400> 26
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> human
<400> 27
Tyr Arg Gln Ser Met Asn
1 5
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> human
<400> 28
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
<210> 29
<211> 40
<212> PRT
<213> murine
<400> 29
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala
35 40
<210> 30
<211> 31
<212> PRT
<213> murine
<400> 30
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu
20 25 30
<210> 31
<211> 164
<212> PRT
<213> human
<400> 31
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg
35 40 45
Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro
50 55 60
Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn
65 70 75 80
Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val
85 90 95
Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
100 105 110
Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg
115 120 125
Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser
130 135 140
Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala
145 150 155 160
Pro His Phe Leu
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> human
<400> 32
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg
20
<210> 33
<211> 48
<212> PRT
<213> human
<400> 33
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35 40 45
<210> 34
<211> 53
<212> PRT
<213> human
<400> 34
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr Gly
50
<210> 35
<211> 76
<212> PRT
<213> human
<400> 35
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro His Phe Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala
35 40 45
Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
65 70 75
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> human
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (20)

1.一种抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其用于在需要的患者中干预和治疗充血，其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合到肾上腺髓质素的N-末端部分(第1-21位氨基酸)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.22)，
并且，其中所述患者对利尿剂有耐药性或者是利尿剂疗法的无应答者。
2.根据权利要求1的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
3.根据权利要求1或2的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)和心力衰竭、特别是急性心力衰竭。
4.根据权利要求1至3任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或抗体片段或非Ig支架是单特异性的。
5.根据权利要求1至4任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架对ADM表现出至少10-7M的结合亲和性。
6.根据权利要求1至5任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架识别并结合到肾上腺髓质素的N-末端的末端(第1位氨基酸)。
7.根据权利要求1至6任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合到肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合到肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，其特征在于所述抗体、抗体片段或非Ig支架不结合到具有ADM的第43-52位氨基酸序列的ADM的C-末端部分：
PRSKISPQGY-NH2
(SEQ ID NO：24)。
8.根据权利要求1至7任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗体或片段或支架阻断ADM不超过80％、优选地不超过50％的生物活性。
9.根据权利要求1至8任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述患者是ICU患者。
10.根据权利要求1至9任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合到ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述重链包含下述序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中所述轻链包含下述序列：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
序列：RVS
SEQ ID NO：5
FQGSHIPYT。
11.根据权利要求10的用于干预和治疗患者的充血的结合到ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自下述的序列：
SEQ ID NO：6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：8(AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：9(AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：10(AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO：11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
12.根据权利要求1至11任一项的用于干预和治疗患者的充血的抗ADM抗体或结合到ADM的抗ADM抗体片段或结合到ADM的抗ADM非Ig支架，其中从所述患者获取的体液样品表现出高于一定阈值的提高水平的proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段。
13.一种用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其包含根据权利要求1至12任一项的抗体或片段或支架。
14.一种用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其包含根据权利要求1至13任一项的抗体或片段或支架，其中所述患者具有选自下述的疾病或病症：充血性高血压，肿胀或水潴留(水肿)，心力衰竭特别是急性心力衰竭，肾脏或肝脏疾病。
15.根据权利要求13或14的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选为即用型溶液。
16.根据权利要求15的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂为冷冻干燥状态。
17.根据权利要求15至16任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给药。
18.根据权利要求15至16任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给药。
19.根据权利要求18的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给药。
20.根据权利要求15至19任一项的用于干预和治疗患者的充血的药物制剂，其中所述药物制剂经系统性给药。
CN201780077335.5A 2016-12-16 2017-12-18 用于干预和治疗需要的患者的充血的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架 Pending CN110167962A (zh)

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