CN109716136A - 肾上腺髓质素用于评估急性心力衰竭患者的充血 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e)评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物。

Description

肾上腺髓质素用于评估急性心力衰竭患者的充血
本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的测量被用作充血的早期替代标记物。
心力衰竭(HF)是一种心脏病症，其在与心脏的结构或功能相关的问题损害它供应充足的血流以满足身体需要的能力时发生。它可以引起大量各种不同的症状，特别是静息时或运动期间呼吸短促(SOB)、液体潴留的征兆例如肺充血或踝关节肿胀以及静息时心脏的结构或功能异常的客观证据。
心力衰竭是一种以由心功能障碍引起的一组症状和征兆为特征的临床综合征。它在发达国家是发病和死亡的主要原因之一，流行率为1-2％。心力衰竭可以被分组成慢性HF和急性HF。患有慢性HF的患者可以被分组成稳定的慢性HF、慢性HF的逐渐恶化的征兆和症状以及慢性HF的急性失代偿。急性心力衰竭(AHF)被定义为心力衰竭的征兆和症状的快速发作，导致需要紧急治疗或住院治疗。AHF可以表现为急性初发HF(在以前没有心功能障碍的患者中新发作的AHF)或慢性HF的急性失代偿。在年龄超过65岁的成年人中，AHF是住院治疗的主导原因。尽管在过去几十年中主要与治疗进步相关，慢性心力衰竭患者的预后显著改进，但一旦患者因失代偿性心力衰竭而住院治疗，短期和长期结果两者仍非常不良。接近25％的因AHF而住院治疗的患者在出院的30天内需要重新住院，而<50％的患者在住院治疗后存活超过5年。除了显著降低受影响的患者的存活率和生命质量之外，AHF对卫生保健系统的财政负担是巨大的。在2012年，据估计仅在美国心力衰竭护理的总费用就达到310亿美元，这些费用大部分与医院中的护理相关。由于人口老化，这一费用计划在2030年提高到前所未有的700亿美元。
心力衰竭包含大范围的患者，从具有通常被认为是≥50％的正常的左心室射血分数(LVEF)、也被称为具有保留EF的HF(HFpEF)的患者，到具有通常被认为是<40％的降低的LVEF、也被称为具有降低的EF的HF(HFrEF)的患者。具有40–49％范围内的LVEF的患者代表“灰色区域”，其被定义为具有中档EF的HF(HFmrEF)(Ponikowski等，2016.European Heart Journal 18(8):891-975)。
在住院情景中，AHF治疗的主要目的是充血的减轻(简单地说除去过量的细胞内和细胞外流体)和充血的症状和征兆的缓解。利尿剂仍然是AHF中主打的充血减轻疗法，几乎所有的住院治疗患者接受这类药物。增加心输出量并降低充盈压的其他类型的药物如强心剂和血管舒张剂，在所选的患者组中给药。在某些患者中也可以考虑超滤，特别是在对利尿剂疗法没有足够响应的患者中。
尽管患者(通常)对利尿剂疗法响应良好，但显著比例的患者在出院时没有获得足够水平的充血减轻和正常血容积状态(即充血残留)。这主要与充血的临床评估的现行方法不适当这一事实相关。存在一致的证据表明在出院期间充血残留的存在与出院后预后不良、特别是重新住院相关。因此，对于可以促进关于获得的充血减轻水平的充分性和出院时间做出客观和最佳决定的充血的更加准确和可靠的替代物，存在着巨大的未满足的需求。
肾上腺髓质素(ADM)这种肽在Kitamura等人的文献(Kitamura等， 1993.Biochemical and Biophysical Research Communications 192(2):553-560)中被首次描述为一种从人类嗜铬细胞瘤分离的包含52个氨基酸的新的降血压肽。同一年中，也描述了为包含185个氨基酸的前体肽编码的cDNA和该前体肽的完整氨基酸序列。所述尤其是在N-端包含21个氨基酸的信号序列的前体肽，被称为“肾上腺髓质素前肽原”(pre-proADM)。Pre-proADM包含185个氨基酸。成熟的ADM-NH2被显示在SEQ ID No.4中，ADM-Gly被显示在SEQ No.5中。
所述成熟的肾上腺髓质素肽是一种酰胺化肽(ADM-NH2)，其包含52个氨基酸(SEQID No:4)并包含pre-proADM的95至146位氨基酸，它从pre-proADM通过蛋白水解切割形成。到目前为止，在pre-proADM的切割中形成的肽片段中实质上只有几种片段已被更精确地表征，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，后者是包含跟随在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸之后的20个氨基酸(22-41)的肽。此外，对于ADM和PAMP两者来说，发现并且更详细调查了具有生理活性的子片段。在1993年ADM的发现和表征引发了密集的研究活动和大量出版物，其结果最近已在各种不同的综述文章中概述，在本说明书的上下文中，具体可以参考文章Takahashi 2001.Peptides 22:1691；Eto等，2001.Peptides 22:1693-1711 和Hinson等，2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167。
在迄今为止的科学调查中，尤其已发现ADM可以被当作多功能调控肽。它部分地以被甘氨酸延伸的无活性形式释放到循环中(Kitamura等，1998.Biochem.Biophys.Res.Com mun.244(2):551-555)。还存在特异性针对ADM并可能同样调节ADM的效应的结合蛋白(Pio 等，2001.The Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300)。
在迄今为止的调查中首要的ADM以及PAMP的生理效应是影响血压的效应。因此，ADM是一种有效的血管舒张剂。
此外还发现，上面提到的从pre-proADM形成的另一种生理活性肽PAMP同样表现出降血压效应，尽管它似乎具有与ADM不同的作用机制(Eto等，2001.Peptides 22:1693- 1711；Hinson等，2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167；Kuwasako等，1997.FEBS Lett 414(1):105-110；Kuwasaki等，1999.Ann.Clin.Biochem.36:622-628；Tsuruda等， 2001.Life Sci.69(2):239-245；Kangawa等，EP 0 622 458)。
此外，已发现可以在循环和其他生物流体中测量的ADM的浓度，在许多病理状态下显著高于在健康对照人群中发现的浓度。因此，在患有充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾病、高血压疾病、糖尿病的患者中，在休克的急性阶段中和在脓毒症和脓毒性休克中，ADM水平显著提高，尽管程度不同。在某些所述病理状态下PAMP浓度也提高，但血浆水平相对于ADM降低(Eto等，2001.Peptides 22:1693-1711)。
此外，已知在脓毒症或脓毒性休克中观察到异常高浓度的ADM(Eto等， 2001.Peptides 22:1693-1711；Hirata等，1996.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453；Ehlenz等，1997.Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162；Tomoda等，2001.Peptides 22:1783-1794；Ueda等， 1999Am.J.Respir.Crit.Care Med.160:132-136；Wang等，2001.Peptides 22:1835-1840)。所述发现与典型的血液动力学变化相关，所述变化已知在患有脓毒症和其他严重综合征例如SIRS的患者中是疾病进程的典型现象。肾上腺髓质素在脓毒症发生期间(Wang,Shock 1998,10(5):383-384；Wang等，1998.Archives of surgery 133(12):1298-1304)和大量急性和慢性疾病中(Parlapiano等，1999.European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61；Hinson等，2000 Endocrine Reviews 21(2):138- 167)发挥关键作用。
描述了几种方法用于测量ADM的循环水平：直接测量ADM或通过确定它的同源前体肽的更稳定的片段间接地测量ADM。最近发表了一种方法，其描述了一种测量循环成熟ADM的测定法(Marino等，2014.Crit Care 18:R34)。
已描述了定量源自于ADM前体的片段的其他方法，例如测量MR-proADM(Morgenthaler等，2005.Clin Chem 51(10):1823-9)、PAMP(Washimine等，1994.Biochem Biophys Res Commun 202(2):1081-7)和CT-proADM(EP 2 111 552)。一种用于在全自动系统上测量血浆中MR-proADM的商品化均相时间分辨荧光免疫测定法是可用的(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR，BRAHMS GmbH，Hennigsdorf，Germany)(Caruhel等，2009.Clin Biochem 42(7-8):725-8)。由于这些肽以化学定量比例从同一前体产生，因此它们的血浆水平在一定程度上相关。
在患有心力衰竭的患者中ADM的血浆浓度升高并与疾病严重性相关(Hirayama等， 1999.J Endocrinol 160:297–303；Yu等，2001.Heart 86:155–160)。在这些对象中高的血浆ADM是独立的不良预后指示物(Poyner等，2002.Pharmacol Rev 54:233–246)。
在几项研究中探索了MR-proADM在心力衰竭中的作用。在BACH研究中(Maisel等， 2010.J.Am.Coll.Cardiol.55:2062–2076)，MR-proADM强有力地预后90天时的死亡，在利尿钠肽之外增添了预后价值。随后的来自于PRIDE研究的数据(Shah等，2012.Eur.Heart J.33:2197–2205)巩固了MR-proADM的潜在预后作用；在患者中对于1年死亡率来说，MR-proADM具有最好的曲线下面积(AUG)。同样地，在患有慢性心力衰竭(CHF)的患者中MR-proADM的水平与疾病严重性强烈相关，并且所述肽的高水平与跟踪12个月时提高的死亡风险强烈相关(van Haehling等，2010.European Journal of Heart Failure 12:484–491； Adlbrecht等，2009.European Journal of Heart Failure 11:361–366)。
在患有急性失代偿性心力衰竭的患者中，在治疗期间对MR-proADM进行调查(Boyer等，2012.Congest Heart Fail 18(2):91-97)：在急性疗法期间MR-proADM水平倾向于提高的患者具有与持久充血相关的发现。在疗法后12-24小时时间段内，MR-proADM升高的患者具有增加的外周性水肿。Kaiser等测量了具有单室心脏的患者中的MR-proADM(Kaiser等，2014.Europ J Heart Failure 16:1082-1088)。具有Fontan循环故障的患者(表现出腹水和外周性水肿)中的水平与没有Fontan故障的患者相比明显更高。此外，Eisenhut思考了引起肾上腺髓质素水平降低的治疗是否可以在肺炎和败血症中降低肺泡水肿的严重性和程度(Eisenhut 2006.Crit Care 10:418)。
令人吃惊的是，已发现，根据本发明，在心力衰竭或急性心力衰竭的情景中，特别是在患有是新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象中或在患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象中，肾上腺髓质素前体或其片段是充血的早期和准确的替代物。
本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
●确定从所述对象获得的体液中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
a)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血的疗法或干预的需求或成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
d)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
充血的严重性、充血程度、充血的程度、充血的等级等，在整个本申请中同义使用。
成熟ADM、bio-ADM和ADM-NH2在整个本申请中同义使用，并且是根据SEQ ID No.:4的分子。
在患有急性心力衰竭的对象和/或具有表现出逐渐恶化的征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象中充血的疗法或干预，可以选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤，特别是利尿剂。
在急性心力衰竭和心力衰竭的情景中，特别是在患有急性心力衰竭的对象和/或患有表现出逐渐恶化的征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象中，肾上腺髓质素前体或其片段是充血的早期、定量和准确的替代物。在急性心力衰竭或心力衰竭的情景中充血的早期和准确替代物意味着它们的浓度和/或免疫反应性水平反映出充血程度，特别是实际充血程度。
在整个本说明书中，所述对象是患有急性心力衰竭的对象和/或患有表现出逐渐恶化的征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象。在本发明的一种特定情况下，所述对象具有急性心力衰竭，其是新发AHF或急性失代偿性HF。在本发明的另一种特定情况下，所述对象具有急性失代偿性慢性HF或慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状。在本发明的一种特定情况下，所述对象具有急性心力衰竭，特别是新发AHF。
术语“急性”被用于意指快速发作并描述加重或失代偿的心力衰竭，是指其中患者可以被表征为具有心力衰竭征兆和症状的改变，导致需要紧急治疗或住院治疗的发作期。
术语“慢性”是指持续时间长。慢性心力衰竭是一种长期病症，通常通过症状的治疗保持稳定(稳定的慢性HF)。
稳定的慢性HF的特征在于：
(i)存在损害心脏供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
(ii)不存在容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的显著抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者不需要紧急治疗或疗法调整并且不需要住院治疗。
具有逐渐恶化的征兆和症状的慢性HF的特征在于：
(i)存在损害心脏供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
(ii)存在容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的显著抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者不需要紧急治疗并且不需要住院治疗，但需要疗法调整。
慢性心力衰竭也可能失代偿(被称为急性失代偿性心力衰竭或急性失代偿性慢性心力衰竭)，这最通常是来自于间发疾病(例如肺炎)、心肌梗塞、心律失常、未控制的高血压或患者未能维持流体限制、饮食或药物的结果。在治疗后，具有急性失代偿性慢性HF的患者可能返回到稳定的慢性代偿性状态(稳定的慢性HF)。
新发急性HF和急性失代偿性慢性HF的特征在于：
(i)存在损害心脏供应充足血流以满足身体需要的能力的结构或功能故障，
(ii)存在容量超负荷(表现为肺和/或系统性充血)和/或心输出量的显著抑制(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，
然而所述患者需要紧急治疗或疗法调整，并且需要住院治疗。
上述是新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭或慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的定义，与Voors等，European Journal of HeartFailure(2016),18,716–726相一致。
HF中的充血被定义为高的左心室舒张压并伴有HF的征兆或症状例如呼吸困难、罗音和/或水肿。这些与充血相关的征兆和症状是与HF相关的住院治疗的主要原因。
尽管充血(和相关征兆/症状)的缓解和正常血容积状态的达成仍然是住院AHF疗法的主要目标，但没有标准的算法或临床工具用于评估充血。当前关于充血的临床评估的做法围绕着征兆和症状进行。身体检查发现例如升高的颈静脉压(JVP)、外周性水肿、端坐呼吸、S3心音和肝肿大或胸部X-射线发现如心脏肥大和间隙/肺泡水肿，被用作充血的替代物。必须指出，除了仔细地进行的JVP评估之外，这些参数用于检测充血的预测价值是低度到中度的。对获得充血的可靠且准确的替代标记物存在着高度未满足的需求。对以定量和定性方式确定、预测、评估和/或监测充血和充血的减轻，存在着高的和未满足的医疗需求。对确定、预测、评估和/或监测充血程度、即充血的等级，存在着需求。
因此，正如在本发明中详细描述的，在本发明的所有实施方式中，通过使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物，本发明的方法能够：
a)定量和定性诊断对象的充血，和评估或监测对象的充血程度，
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有急性心力衰竭的对象和/或患有表现出逐渐恶化的征兆的心力衰竭的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象。
具体来说，在本发明的所有实施方式中，本发明的方法能够定量和定性诊断对象的充血并评估或监测对象的充血程度，其中所述对象患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭，或者其中所述对象患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状，并且其中如本发明中详细描述的，使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物。具体来说，所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ IDNo.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM，优选为根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ IDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly，更优选为根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
具体来说，在本发明的所有实施方式中，本发明的方法能够预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的疗法或干预，其中所述对象患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭，或者其中所述对象患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状，并且其中如本发明中详细描述的，使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物。具体来说，所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQID No.:6的CT-proADM，优选为根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly，更优选为根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
具体来说，在本发明的所有实施方式中，本发明的方法能够预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，其中所述对象患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭，或者其中所述对象患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状，并且其中如本发明中详细描述的，使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物。具体来说，所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM，优选为根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ IDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly，更优选为根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
具体来说，在本发明的所有实施方式中，本发明的方法能够评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，其中所述对象患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭，或者其中所述对象患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状，并且其中如本发明中详细描述的，使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物。具体来说，所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM，优选为根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ IDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly，更优选为根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
具体来说，在本发明的所有实施方式中，本发明的方法能够评估对象的出院决定，其中所述对象患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭，或者其中所述对象患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状，并且其中如本发明中详细描述的，使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物。具体来说，所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ IDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM，优选为根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ IDNo.:5的ADM-Gly，更优选为根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
对于本发明来说，充血程度可以被表示成充血严重性等级并且如下文所述来确定。然而，本领域技术人员了解，充血程度可以通过其他评分或替代物来表示，例如由Ambrosy等人使用的评分(Ambrosy等，2013.European Heart Journal 34(11):835-843)。
正如前面强调的，临床替代物对充血的检测具有低于最佳的预测价值。在对本发明中示出的实施例之一(PROTECT研究)的分析中，我们组合了充血的三种最强的临床替代物(即JVP、外周性水肿和端坐呼吸)以提高准确性，并开发了一种使用下面陈述的方案的复合临床充血评分(CCS)：
参数 0 1 2 3
外周性水肿 0 踝 膝下方 膝上方
端坐呼吸 0个靠枕 1个靠枕 2个靠枕 3个靠枕
JVP <6cm 6-10cm >10cm -
然后将对这三个参数中每一个的评分相加，获得在0至8范围内的复合充血评分。
然后使用下述算法对充血严重性分级：
CCS＝0，无临床充血
CCS 1-3，轻度临床充血
CCS 4-5，中度临床充血
CCS≥6，重度临床充血
在本发明中示出的另一个实施例(BIOSTAT研究)的分析中，我们通过外周性水肿水平(以严重性逐渐增加的顺序：无，踝，膝下方，膝上方)描述了充血等级。尽管PROTECT是在世界范围内选择的具有急性失代偿性心力衰竭、在关于rolofylline与安慰剂相比的效果的随机对照临床试验中登记的患者群体，但BIOSTAT-CHF由具有逐渐恶化的心力衰竭的征兆和/或症状的2个欧洲患者组群构成，大约2/3住院治疗，1/3在门诊中见到。
正如上文解释的，充血可以以许多不同方式分类。本领域技术人员了解，充血程度可以用其他评分或替代物表示。临床分类可以基于床边身体检查，以便检测充血的临床症状/征兆(如果存在或不存在，分别为“湿”或“干”)和/或外周低灌注(如果存在或不存在，分别为“冷”或“暖”)的存在(对于综述，参见Ponikowski等，2016.Eur Heart J.ehw128)。这些选项的组合鉴定到4个组：暖湿(灌注良好并充血)——最通常存在的；冷湿(低灌注并充血)；冷干(低灌注并且没有充血)；和暖干(代偿性，灌注良好并且没有充血)。这种分类可能有助于在初始阶段指导疗法并带有预后信息。
通常，AHF的症状和征兆反映出流体超载(肺充血和/或外周性水肿)或在较少情况下心输出量降低并伴有外周低灌注。胸部X-射线可能是用于AHF诊断的有用测试。肺静脉充血、胸腔积液、间隙或肺泡水肿和心脏肥大是AHF的最特异性的发现，尽管在高达20％的患有AHF的患者中胸部X-射线是几乎正常的。
充血(左侧)的症状/征兆被定义为端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难、肺罗音(双侧)、外周性水肿(双侧)。充血(右侧)的症状/征兆被定义为颈静脉扩张、外周性水肿(双侧)、充血性肝肿大、肝颈静脉回流、腹水、肠充血的症状(对于综述，参见Ponikowski等， 2016.Eur Heart J.ehw128中的表12.2)。
水肿是流体在细胞间组织中的积累，其由间隙流体容积的异常扩大引起。间隙与血管内空间之间的流体受到跨过毛细血管的毛细血管静水压梯度和胶体渗透压梯度调控(Trayes等，2013.Am Fam Physician 88(2):102-110)。当局部或系统性病症破坏这种平衡，导致毛细血管静水压升高、血浆容积增加、血浆胶体渗透压降低(低白蛋白血症)、毛细血管渗透性提高或淋巴管阻塞时，发生流体的积累。
在临床上，水肿表现为肿胀：间隙液的量由体液稳态的平衡决定，流体向间隙的分泌增加或流体移除受损可以引起水肿。在心力衰竭中出现静水压升高。对整个身体通用的水肿原因可以引起多个器官和外周中的水肿。例如，严重心力衰竭可以引起肺水肿、胸腔积液、腹水和外周性水肿。
肺水肿是流体在肺的空气空间和实质中的积累。它引起气体交换受损并可能造成呼吸衰竭。它由心脏左心室不能从肺循环充分移除血液(“心源性肺水肿”)或肺实质或肺的血管系统的损伤(“非心源性肺水肿”)而造成(Ware and Matthay 2005.N.Engl.J.Med.353 (26):2788–96)。治疗聚焦于3个方面：首先改善呼吸功能，其次治疗根本病因，第三避免肺的进一步损伤。肺水肿、特别是急性肺水肿，可以引起致死的呼吸窘迫或由缺氧造成的心搏骤停。它是充血性心力衰竭的主要特点。
肺水肿的最主要症状是呼吸困难，但是也可以包括咳血(通常可见为粉红色泡沫样痰)、多汗、焦虑和皮肤苍白。呼吸短促可以表现为端坐呼吸(由于无法呼吸不能平躺)和/或阵发性夜间呼吸困难(在夜间爆发突然的严重的呼吸困难)。这些是由左心室衰竭造成的慢性肺水肿的常见症状。肺水肿的发生可能伴有“流体超载”的症状和征兆；这是一种用于描述左心室衰竭在身体其余部分上的表象的非特异性术语，并包括外周性水肿(腿的肿胀，通常为“按压后凹陷”类型，其中皮肤在被按压后缓慢回复正常)、颈静脉压升高和肝肿大，其中肝脏膨大并可能柔软或甚至脉动。其他征兆包括听诊时末端吸气裂音(在深呼吸结束时听到的声音)和第三心音的存在。
在本发明中，证实了肾上腺髓质素前体或其片段与充血的严重性和水肿程度相关，预测充血的减轻和施用的利尿剂剂量。
在本发明的一个方面，充血残留被定义为到第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。
在本发明的一个方面，充血减轻单独或组合地通过下述三种当前现有技术的标记物中的任一者来定义：
●利尿剂响应：被定义为到第4天为止每40mg利尿剂剂量的体重减轻。
●血液浓缩：编码为0(如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平降低或不变的话)或1(如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平提高的话)。
●显著的充血残留：被定义为第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。
本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有急性心力衰竭的对象和/或患有心力衰竭并表现出逐渐恶化的征兆的对象和/或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
●使用至少一种结合剂确定从所述对象获得的体液中免疫反应性被分析物的水平，所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域；以及
a)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血的疗法或干预的需求或成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后对充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或
d)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
从实施例可以看出，肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2的基线水平，独立地预测了到例如第7天为止的显著的充血残留、到例如第4天为止的利尿剂响应和到例如第4天为止的血液浓缩。只有非常少的基线临床变量或生物标志物与基线时的充血严重性相关，并且肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2似乎到目前为止是最强的。肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQ IDNo.:4的ADM-NH2与基线时临床充血的严重性强烈相关，并独立地预测了到例如第7天为止显著的充血残留的存在。所述数据强烈地支持下述见解，即肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2是充血的可靠、定量和早期替代物。考虑到对用于评估AHF患者的充血、特别是确定出院前充血残留的存在的准确且可靠的工具存在巨大的尚未满足的需求，这是非常有吸引力的发现。根据本发明，这种肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2可用于确定出院前充血残留的存在。
本发明的主题内容是一种方法，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。
本发明的主题内容是一种方法，其中所述对象被分层为：
a)充血等级的组，或
b)对充血的疗法或干预的无应答者和/或应答者和/或不良应答者，或
c)在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。
本发明的主题内容是一种方法，其中所述对象被分层为不同患者组，其中一组包含需要疗法的患者，另一组包含不需要疗法的患者。
以前，除了其他标志物之外，标志物BNP和proBNP被当作充血标志物。令人吃惊的是，本发明的生物标志物肾上腺髓质素前体或相应的片段远远优于到目前为止被用作充血标志物的任何其他临床或生物化学参数。这已被例如Kremer等，European Journal ofHeart Failure(2017)19(Suppl S1)5-601显示，Kremer等人研究了一种代表生物活性肾上腺髓质素的生物标志物bio-ADM作为ADHF中充血的潜在标志物的潜在作用，并评估了在临床评估的充血上增添的预后价值。在1562位因ADHF入院的患者中，在基线、第2天和第7天评估了Bio-ADM。临床充血使用涵盖水肿、端坐呼吸和颈静脉扩张的复合临床充血评分(CCS)来评价。将它与其他临床和生物化学参数包括BNP进行比较。在大量临床和生物化学参数中，bio-ADM是临床评估的充血的最强预测物。基线bio-ADM水平而不是BNP水平，强烈且独立地与到第7天为止显著的充血残留的存在相关。在到第7天为止具有充血残留的患者中，bio-ADM水平仍然高，而BNP水平降低。在临床评估的充血之上，Bio-ADM而不是BNP，是60天心力衰竭重新住院治疗的强烈的独立预测物。因此，作者得出结论，Bio-ADM在患有ADHF的患者中升高，并且在因ADHF入院的患者中是有希望的(残留)充血的标志物。Bio-ADM是在出院后不久重新住院治疗的强烈且独立的预测物。
在本发明的特定实施方式中，所述proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段选自：
SEQ ID No.1(proADM)：164个氨基酸(preproADM的22–185)
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSPEDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRRRRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID No.2(肾上腺髓质素前体N-20末端肽，PAMP)：preproADM的22–41位氨基酸
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID No.3(肾上腺髓质素前体中段肽，MR-proADM)：preproADM的45–92位氨基酸
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID No.4(成熟肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化ADM；bio-ADM；hADM)：95–146位氨基酸-CONH2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-CONH2
SEQ ID No.5(肾上腺髓质素1-52-Gly(ADM 1-52-Gly))：preproADM的95–147位氨基酸
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID No.6(C-端肾上腺髓质素前体，CT-proADM)：preproADM的148–185位氨基酸
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
在本发明的特定实施方式中，所述proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段选自成熟ADM-NH2(SEQ ID No.4)、ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)、MR-proADM(SEQ ID No.3)和CT-proADM(SEQ ID No.6)。
在本发明的特定实施方式中，成熟ADM-NH2(SEQ ID No.4)和/或ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)的免疫反应性水平或MR-proADM(SEQ ID No.3)的免疫反应性水平或CT-proADM(SEQ ID No.6)的免疫反应性水平被确定，并与所述患者对疗法或干预的需求相关联，其中如果在所述对象的体液中成熟ADM-NH2(SEQ ID No.4)和/或ADM 1-52-Gly(SEQ IDNo.5)的免疫反应性水平或MR-proADM(SEQ ID No.3)的免疫反应性水平或CT-proADM(SEQID No.6)的免疫反应性水平高于阈值，则所述患者被鉴定为具有这种需求。
在本发明的特定实施方式中，proADM和/或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在成熟ADM-NH2(SEQ ID No.4)和/或ADM 1-52-Gly(SEQID No.5)的下述序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在成熟ADM-NH2(SEQ ID NO.4)和/或ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)的序列内的区域的第二种结合剂。
在本发明的特定实施方式中，proADM和/或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在MR-proADM(SEQ ID No.3)的序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在MR-proADM(SEQ ID No.3)的序列内的区域的第二种结合剂。
在本发明的特定实施方式中，pro-ADM和/或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在CT-proADM(SEQ ID No.6)的序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在CT-proADM(SEQ ID No.6)的序列内的区域的第二种结合剂。
在本发明的特定实施方式中，主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述片段可以选自根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用针对肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定。
本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
在一个特定实施方式中，根据本发明的体液是血液样品。血液样品可以选自全血、血清和血浆。在本发明的特定实施方式中，所述样品选自人类柠檬酸化血浆、肝素血浆和EDTA血浆。
本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一位患者中进行一次以上。
本发明的主题内容是一种方法，其中所述样品在入院时或出院前获取。
本发明的主题内容是一种符合本发明的方法，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和/或治疗性措施的响应。
本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中使用所述方法以便将所述对象分层为不同充血等级的组。
本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与患有急性心力衰竭或心力衰竭的对象中死亡或不利事件的风险相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。
在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的成熟ADM-NH2，并且<70pg/ml，优选地<40pg/ml，更优选地<10pg/ml。
在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的MR-proADM，并且<0.5nmol/L，优选地<0.4nmol/L，更优选地<0.2nmol/L。
在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的CT-proADM，并且<100pmol/L，优选地<75pmol/L，更优选地<50pmol/L。
在本发明的特定实施方式中，所述结合剂对proADM和/或其片段表现出至少107M-1、优选地108M-1的结合亲和性，优选的亲和性大于109M-1，最优选地大于1010M-1。本领域技术人员了解，可以考虑通过使用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和性，并且这种措施不导致超出本发明的范围之外。
为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来确定肾上腺髓质素结合到固定化抗体的动力学。使用按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare)以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体，进行抗体的可逆固定化(Lorenz等，2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):165–173)。
在本发明的特定实施方式中，所述结合剂选自结合到proADM和/或其片段的抗体或抗体片段或非Ig骨架。
在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中这种测定法是夹心测定法，优选为全自动测定法。
在本发明的一个实施方式中，它可以是所谓的POC测试(护理点)，这是一种测试技术，其允许在患者附近在不到1小时内进行测试，而不需全自动测定系统。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。
在本发明的一个实施方式中，这种测定法是使用任何种类的检测技术、包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的夹心免疫测定法，优选为全自动测定法。在本发明的一个实施方式中，这种测定法是酶标记夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：RocheAbbottSiemensBrahms Alere
各种不同的免疫测定法是已知的，并可用于本发明的测定法和方法，它们包括：放射免疫测定法(“RIA”)，均相酶多重免疫测定法(“EMIT”)，酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)，酶蛋白重新激活免疫测定法(“ARIS”)，试纸条免疫测定法和免疫层析测定法。
在本发明的特定实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者被标记以便被检测。
优选的检测方法包括各种不同形式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法和快速测试形式例如免疫层析条测试。
在优选实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。
所述测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争测定法。在一个实施方式中，所述测定法采取夹心测定法形式，这是一种非竞争性免疫测定法，其中将待检测和/或定量的分子结合到第一抗体并结合到第二抗体。所述第一抗体可以被结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或试纸条，并且所述第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性组成部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量结合到所述被分析物的标记的抗体的量。“夹心测定法”涉及的通用组成和程序是完善的，并且被专业技术人员公知(《免疫测定法手册》(The Immunoassay Handbook)，Ed.David Wild,Elsevier LTD, Oxford；3rd ed.(May 2005)；Hultschig等，2006.Curr Opin Chem Biol.10(1):4-10)。
在另一个实施方式中，所述测定法包含两种捕获分子，优选为抗体，两者都作为在液体反应混合物中的分散系存在，其中第一标记组分被附连到所述第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分被附连到所述第二捕获分子，使得在两种捕获分子结合到所述被分析物之后产生可测量的信号，其允许在包含所述样品的溶液中检测形成的夹心复合物。
在另一个实施方式中，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物，并与荧光染料或化学发光染料、特别是菁类型的染料相组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、菁染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst 33258、菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑类染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲川染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定法包括使用基于文献中为化学发光材料所描述的物理原理的染料(Kirk-Othmer，《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology),4th ed.1993.John Wiley&Sons,Vol.15:518-562，通过参考并入 本文，包括在第551-562页上的引用文献)。优选的化学发光染料是吖啶酯类。
当在本文中提到时，“测定法”或“诊断测定法”可以是在诊断学领域中使用的任何类型。这种测定法可以基于待检测的被分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。考虑到捕获分子与靶分子或目标分子之间的相互作用，亲和常数优选大于108M-1。
在本发明的情形中，“结合剂分子”是可用于从样品结合靶分子或目标分子、即被分析物(在本发明的情形中即ADM-NH2和/或proADM及其片段)的分子。因此，结合剂分子必须在空间和表面特点例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在两方面充分塑造，以特异性结合所述靶分子或目标分子。其中，所述结合可以例如由所述捕获分子与所述靶分子或目标分子之间的离子键、范德华键、π-π键、σ-π键、疏水键或氢键相互作用或上述相互作用中的两者或多者的组合来介导。在本发明的情形中，结合剂分子可以例如选自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子是抗体，包括其对靶分子或目标分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于可变链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。
化学发光标记物可以是吖啶酯标记物、甾类标记物包括异鲁米诺标记物等。
酶标记物可以是乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
在本发明的一个实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者与作为磁性粒子和聚苯乙烯表面的固相相结合。
在本发明的特定实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者与固相相结合。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆ADM-NH2来说，所述阈值在50至100pg/ml之间、优选地60至90pg/ml之间的阈值范围内，最优选地使用70pg/ml的阈值。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆MR-proADM来说，所述阈值在0.5至1.5nmol/L之间、优选地0.7至1nmol/L之间的阈值范围内，最优选地使用0.8nmol/L的阈值。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆CT-proADM来说，所述阈值在85至350pmol/L之间、优选地100至250pmol/L之间的阈值范围内，最优选地使用150pmol/L的阈值。
正如实施例中所概述的，本发明的ADM-NH2水平或proADM或其片段的水平，相应地使用所描述的ADM-NH2测定法(或相应地proADM或其片段的测定法)来确定。上面提到的阈值在其他测定法中可能不同，如果它们与在本发明中使用的测定法系统进行了不同校准的话。因此，上面提到的截止值应该在将校准的差异考虑在内后，相应地应用于这些不同校准的测定法。定量校准差异的一种可能性是通过使用两种方法测量样品中的相应生物标志物(例如bio-ADM)，将所讨论的测定法与本发明中使用的相应生物标志物测定法进行方法比较分析(关联)。另一种可能性是在所讨论的测定法具有足够的分析灵敏度的情况下使用这种测试来确定代表性正常群体的生物标志物水平中值，将结果与文献中描述的生物标志物水平中值进行比较，并在通过这种比较获得的差异的基础上重新计算校准。利用在本发明中使用的校准，测量了来自于正常(健康)对象的样品：血浆bio-ADM(成熟ADM-NH2)中值为24.7pg/ml，下限为11pg/ml，99百分位数为43pg/ml。或者，可以使用可商购的对照样品进行不同校准的调整(例如ICI Diagnostics,Berlin,Germany)。
使用Caruhel等人描述的用于MR-proADM检测的自动夹心荧光测定法(Caruhel等， 2009.Clin Biochem 42:725-8)，在正常(健康)对象中血浆MR-proADM浓度中值为0.41(四分位范围为0.23-0.64)nmol/L(Smith等，2009.Clin Chem 55:1593-1595)。
在正常健康对象(n＝200)中，血浆CT-proADM浓度中值为77.6pmol/L(最小值为46.6pmol/L，最大值为136.2pmol/L)，并且95百分位数为113.8pmol/L(EP 2 111 552 B1)。
在本发明的特定实施方式中，血浆ADM-NH2的阈值是正常健康群体的浓度中值的5倍、优选为浓度中值的4倍、更优选为浓度中值的3倍、最优选为浓度中值的2倍。
在本发明的特定实施方式中，血浆MR-proADM的阈值是正常健康群体的浓度中值的5倍、优选为浓度中值的4倍、更优选为浓度中值的3倍、最优选为浓度中值的2倍。
在本发明的特定实施方式中，血浆CT-proADM的阈值是正常健康群体的浓度中值的5倍、优选为浓度中值的4倍、更优选为浓度中值的3倍、最优选为浓度中值的2倍。
符合本发明的抗体是特异性结合抗原的蛋白质，其包括基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及多种的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链通常为约25Kd或长为214个氨基酸。全长免疫球蛋白重链通常为约50Kd或长为446个氨基酸。轻链由在NH2-端的可变区基因(长度约为110个氨基酸)和在COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。重链同样地由可变区基因(长度约为116个氨基酸)和其他恒定区基因之一编码。
抗体的基本结构单元通常是四聚体，其由相同的两对免疫球蛋白链构成，每对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区结合到抗原，并且恒定区介导效应功能。免疫球蛋白也以各种不同的其他形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2以及双功能杂合抗体和单链(例如Lanzavecchia等，1987.Eur.J.Immunol.17:105；Huston等，1988, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426；Hood 等，Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.,1984；Hunkapiller and Hood 1986.Nature 323:15-16)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被3个高变区、也被称为互补决定区(CDR)中断的构架区(参见《免疫相关的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services,1983)。正如上文提到的，CDR主要负责结合到抗原的表位。免疫复合物是特异性结合到抗原的抗体，例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体或有功能的抗体片段。
嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建而成的抗体。例如，可以将来自于小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接到人类恒定区段例如κ和γ1或γ3。因此，在一个实例中，治疗性嵌合抗体是由来自于小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自于人类抗体的恒定或效应结构域构成的杂合蛋白质，尽管可以使用其他哺乳动物物种，或者所述可变区可以通过分子技术来生产。制造嵌合抗体的方法在本领域中是公知的(例如参见美国专利号5,807,715)。“人源化”免疫球蛋白是包括人类构架区和来自于非人类(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。所述提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，所述提供构架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白中所有的CDR都来自于供体免疫球蛋白。恒定区不必须存在，但是如果它们存在的话，它们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上一致，即一致性为至少约85-90％，例如约95％或更高。因此，人源化免疫球蛋白可能除了CDR之外的所有部分，都与天然的人类免疫球蛋白序列的相应部分基本上一致。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合到相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可能具有从供体构架获取的有限数目的氨基酸替换。人源化或其他单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性的保守替换是例如gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程来构建(例如参见美国专利号5,585,089)。人类抗体是其中轻链和重链基因起源于人类的抗体。人类抗体可以使用本领域中已知的方法来产生。人类抗体可以通过将分泌目标抗体的人类B细胞永生化来生产。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人类抗体也可以通过噬菌体展示方法来生产(参见例如Dower等，PCT公开号WO91/17271；McCafferty等，PCT公开号 WO92/001047；和Winter,PCT公开号WO92/20791)或从人类组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网页)。人类抗体也可以通过使用带有人类免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见Lonberg等，PCT公开号WO93/12227；和Kucherlapati，PCT公开号WO91/10741)。
因此，所述抗体可以具有本领域中已知的形式。实例是人类抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体。在优选实施方式中，符合本发明的抗体是重组生产的抗体例如IgG这种典型的全长免疫球蛋白，或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段例如化学偶联的抗体(结合抗原的片段)，包括但不限于：Fab-片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化所形成的，例如通过dHLX结构域的二聚化所形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段，scFv-片段，多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段，二价和/或双特异性双体抗体，(双特异性T-细胞衔接物)，三功能抗体，多价抗体例如来自于与G不同的类别；单域抗体，例如源自于骆驼或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体，以及大量其他抗体。
除了抗体之外，其他生物聚合物支架在本领域中被公知与靶分子复合，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、spiegelmer、anticalin和芋螺毒素。
在优选实施方式中，所述抗体的形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，所述抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物可利用性优化的偶联物例如PEG化片段。最优选的格式之一是scFab形式。
非Ig骨架可以是蛋白质支架并且可以被用作抗体模拟物，因为它们能够结合到配体或抗原。非Ig骨架可以选自基于四连接素的非Ig骨架(例如在US 2010/0028995中所描述的)、纤连蛋白骨架(例如在EP 1 266 025中所描述的)、基于脂钙蛋白的骨架(例如在WO 2011/154420中所描述的)、泛素骨架(例如在WO 2011/073214中所描述的)、转移骨架(例如在US 2004/0023334中所描述的)、蛋白A骨架(例如在EP 2 231 860中所描述的)、基于锚蛋白重复序列的骨架(例如在WO 2010/060748中所描述的)、微生物蛋白骨架(优选为形成胱氨酸结的微生物蛋白)(例如在EP 2 314 308中所描述的)、基于Fyn SH3结构域的骨架(例如在WO 2011/023685中所描述的)、基于EGFR-A结构域的骨架(例如在WO 2005/040229中所描述的)和基于Kunitz结构域的骨架(例如在EP 1941867中所描述的)。
在本发明的一个实施方式中，符合本发明的抗体可以如下所述生产：
将Balb/c小鼠用ADM免疫——在第0和14天使用100μg肽-BSA-偶联物(在100μl弗氏完全佐剂中乳化)，在第21和28天用50μg(在100μl弗氏不完全佐剂中)。在融合实验之前三天，所述动物接受溶解在100μl盐水中的50μg所述偶联物，采用一次腹膜内和一次静脉内注射提供。
将来自于被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下用1ml 50％聚乙二醇融合30s。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[增补有20％胎牛血清和HAT增补剂的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。在两周后，将所述HAT培养基用HT培养基替换用于三次传代，然后返回到正常细胞培养基。
在融合后三周，对细胞培养上清液进行抗原特异性IgG抗体的初筛。将被测试阳性的微量培养物转移到24孔板中用于繁殖。在再次测试后，使用有限稀释技术将所选的培养物克隆和再次克隆，并确定同种型(也参见Lane 1985.J.Immunol.Meth.81:223-228； Ziegler,B.等，1996 Horm.Metab.Res.28:11-15)。
抗体可以按照下述程序利用噬菌体展示来生产：
将人类天然抗体基因文库HAL7/8用于分离针对肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变结构域(scFv)。所述抗体基因文库使用淘选策略来筛选，包括使用含有通过两种不同间隔物连接到肾上腺髓质素肽序列的生物素标签的肽。将使用非特异性结合的抗原和链亲和素结合的抗原的多轮次淘选的混合物用于最小化非特异性结合剂的背景。将从第三轮淘选洗脱的噬菌体用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌菌株。来自于这些克隆菌株的培养的上清液被直接用于抗原ELISA试验(参见Hust等，2011.Journal of Biotechnology 152:159– 170；Schütte等，2009.PLoS One 4,e6625)。
鼠类抗体的人源化可以按照下述程序来进行：
为了将鼠来源的抗体人源化，对抗体序列进行分析，以分析带有互补决定区(CDR)的构架区(FR)与抗原的结构相互作用。在结构建模的基础上选择适合的人类来源的FR，并将鼠类CDR序列移植到所述人类FR中。可以引入CDR或FR的氨基酸序列的变化，以重新获得被FR序列的物种切换所消除的结构相互作用。这种结构相互作用的恢复可以通过使用噬菌体展示文库的随机方法或通过由分子建模指导的定向方法来实现(Almagro等，2008.Front Biosci.2008；13:1619-33)。
本发明的主题内容是一种符合本发明的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平来指导疗法或干预，其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平高于一定阈值则指示进行疗法或干预，并且其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平低于一定阈值则指示不进行疗法或干预。阈值和阈值范围在上文给出。
本发明的主题是下述实施方式：
1.一种方法，所述方法用于
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中使用肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段作为充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
●确定从所述对象获得的体液中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平；并且以及
a)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象中的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象中充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
d)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
2.一种方法，所述方法用于
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
●使用结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域的至少一种结合剂，确定从所述对象获得的体液中免疫反应性被分析物的水平；并且
a)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象中的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象中充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或
d)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
3.根据条目1或2的方法，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。
4.条目1至3任一项的方法，其中所述对象被分层为：
a)充血等级的组，或
b)对充血的疗法或干预的无应答者和/或应答者和/或不良应答者，或
c)在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。
5.根据条目1至4任一项的方法，其中所述片段可以选自根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
6.根据条目1至5任一项的方法，其中通过使用结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平。
7.根据条目6的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
8.根据前述条目任一项的方法，其中所述阈值在阈值范围内，所述阈值范围对于根据SEQ ID No.:4的血浆成熟ADM-NH2来说在50至100pg/ml之间，对于血浆MR-proADM来说在0.5至1.5nmol/L之间，对于血浆CT-proADM来说在85至350pmol/L之间。
9.根据条目1至8任一项的方法，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一位患者中进行一次以上。
10.根据条目1至9任一项的方法，其中所述样品在入院时或出院之前获取。
11.根据条目1至10任一项的方法，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和/或治疗性措施的响应。
12.根据条目1至11任一项的方法，其中所述方法是为了将所述对象分层至充血等级的组。
13.根据条目1至12任一项的方法，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平与对象的死亡或不利事件的风险相关联，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。
14.根据条目1至13任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来指导疗法或干预，其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平高于一定阈值则指示进行疗法或干预，并且其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平低于一定阈值则指示不进行疗法或干预。
15.根据条目1至14任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来确定对疗法或干预的需求。
16.根据条目1至15任一项的方法，其中所述干预或疗法选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤。
17.一种结合剂在制备试剂或药物或药剂盒中的用途，所述试剂或药物或药剂盒用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段，并且可以确定从所述对象获得的体液样品中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物；并且其中
a)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血，或
b)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对疗法或干预的需求，或
c)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
d)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
18.至少一种结合剂在制备试剂或药物或药剂盒中的用途，所述试剂或药物或药剂盒用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，其中所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域，并且可以确定从所述对象获得的体液样品中免疫反应性被分析物的水平，并且所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物；并且其中
a)所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血，或
b)所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对疗法或干预的需求，或
c)所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或
d)所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
19.根据条目17或18的用途，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。
20.根据条目17至19任一项的用途，其中所述对象被分层为：
a)充血等级的组，或
b)对充血的疗法或干预的无应答者和/或应答者和/或不良应答的组，或
c)在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。
21.根据条目17至20任一项的用途，其中所述片段可以选自根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2。
22.根据条目17至21任一项的用途，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
23.根据前述条目任一项的用途，其中所述阈值在阈值范围内，所述阈值范围对于根据SEQ ID No.:4的血浆ADM-NH2来说在50至100pg/ml之间，对于血浆MR-proADM来说在0.5至1.5nmol/L之间，对于血浆CT-proADM来说在85至350pmol/L之间。
24.根据条目17至23任一项的用途，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一个对象中进行一次以上。
25.根据条目17至24任一项的用途，其中所述样品在入院或出院时获取。
26.根据条目17至25任一项的用途，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和/或治疗性措施的响应。
27.根据条目17至26任一项的用途，其是为了将所述对象分层至充血等级的组。
28.根据条目17至27任一项的用途，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平与患有急性心力衰竭的对象的死亡或不利事件的风险相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。
29.根据条目17至28任一项的用途，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来指导疗法或干预，其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平高于一定阈值则指示进行疗法或干预，并且其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平低于一定阈值则指示不进行疗法或干预。
30.根据条目17至29任一项的用途，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来确定对疗法或干预的需求。
31.根据条目17至30任一项的用途，其中所述干预或疗法选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤。
32.一种药剂盒或试剂或药物，其用于
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中所述药剂盒或试剂或药物包含结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂，并且所述结合剂可以确定从所述对象获得的体液样品中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平；并且其中
a)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血，或
b)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对疗法或干预的需求，或
c)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
d)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
33.一种药剂盒或试剂或药物，其用于
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中所述药剂盒或试剂或药物包含结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域的至少一种结合剂，并且所述结合剂可以确定从所述对象获得的体液样品中免疫反应性被分析物的水平；并且其中
a)所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血，或
b)所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对疗法或干预的需求，或
c)所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或
d)所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
34.根据条目32或33的药剂盒或试剂或药物，其中所述片段可以选自根据SEQ IDNo.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的ADM-NH2。
35.根据条目32-34任一项的药剂盒或试剂或药物，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
36.根据条目32-35任一项的药剂盒或试剂或药物，其中所述阈值在阈值范围内，所述阈值范围对于根据SEQ ID No.:4的血浆ADM-NH2来说在50至100pg/ml之间，对于血浆MR-proADM来说在0.5至1.5nmol/L之间，对于血浆CT-proADM来说在85至350pmol/L之间。
附图说明
图1：
图1示出了典型的bio-ADM剂量/信号曲线和在100μg/mL抗体NT-H存在下的bio-ADM剂量信号曲线。
图2：
在具有不同充血等级的患者中bio-ADM的连续测量。
图3：
在出院时的利尿剂治疗与bio-ADM(入院)之间的相互作用的图示。对于bio-ADM低于或高于70pg/mL的患者分别进行的使用和不使用利尿剂的治疗的Kaplan-Meier图。在入院时具有高bio-ADM的患者中，利尿剂可能是最有益的。
假0：bio-ADM<70pg/mL，没有用利尿剂治疗
假1：bio-ADM<70pg/mL，用利尿剂治疗
真0：bio-ADM>70pg/mL，没有用利尿剂治疗
真1：bio-ADM>70pg/mL，用利尿剂治疗
图4：
具有显著充血的患者(CCS＝3)与没有或具有轻度充血的患者(CCS<3，p<0.001)相比的bio-ADM的箱线图。
图5：
具有显著充血的患者(CCS＝3)与没有或具有轻度充血的患者(CCS<3，p<0.01)相比的bio-ADM的箱线图。
实施例
实施例1
抗体的产生和它们的亲和常数的确定
我们开发了结合到bio-ADM的N-端(NT-ADM)、中段(MR-ADM)和C-端(CT-ADM)部分的小鼠单克隆抗体，并确定了它们的亲和常数(表1)。
用于免疫的肽
肽由JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin,Germany)供应。使用Sulfo-SMCC交联方法将肽偶联到BSA。交联程序按照制造商的说明书进行(Thermo Fisher/Pierce)。
鼠类抗体的产生
将Balb/c小鼠在第0和14天用100μg肽-BSA-偶联物(在100μl弗氏完全佐剂中乳化)免疫，并在第21和28天用50μg(在100μl弗氏不完全佐剂中)免疫。在进行融合实验之前三天，所述动物接受溶解在100μl盐水中的50μg所述偶联物，作为一次腹膜内和一次静脉内注射提供。
将来自于被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下用1ml50％聚乙二醇融合30s。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基(增补有20％胎牛血清和HAT增补剂的RPMI 1640培养基)中生长来选择杂交克隆。在两周后，将所述HAT培养基用HT培养基替换用于三次传代，然后返回到正常细胞培养基。
在融合后三周，对细胞培养上清液进行抗原特异性IgG抗体的初筛。将被测试阳性的微量培养物转移到24孔板中用于繁殖。在再次测试后，使用有限稀释技术将所选的培养物克隆和再次克隆，并确定同种型(Lane 1985.J.Immunol.Meth.81:223-228；Ziegler,B. 等，1996 Horm.Metab.Res.28:11-15)。
表1：
单克隆抗体生产
抗体通过标准的抗体生产技术(Marx等，1997，Monoclonal Antibody Production,ATLA 25,121)来生产并通过蛋白A进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度>95％。
亲和常数
为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来确定肾上腺髓质素结合到固定化抗体的动力学。使用按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare)以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体，进行抗体的可逆固定化。
标记程序(示踪剂)
将100μg(100μl)抗体(1mg/ml，在PBS中，pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml，在乙腈中，InVent GmbH,Germany)混合(EP 0 353 971)，并在室温温浴20min。标记的CT-H通过凝胶过滤HPLC在SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化。将所述纯化的标记的抗体在(300mmol/L磷酸钾，100mmol/L NaCl，10mmol/L Na-EDTA，5g/L牛血清白蛋白，pH 7.0)中稀释。终浓度为每200μL大约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。吖啶酯化学发光使用AutoLumat LB 953(Berthold TechnologiesGmbH&Co.KG)来测量。
固相
将聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)用抗体(1.5μg抗体/0.3mL 100mmol/L NaCl，50mmol/L TRIS/HCl，pH 7.8)包被(在室温下18h)。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将所述管用pH 7.4的PBS清洗并真空干燥。
校准物
将合成的人类ADM(hADM)(Bachem,Switzerland)用50mM Tris/HCl，250mM NaCl，0.2％Triton X-100，0.5％BSA，20片/L完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche AG)，pH 7.8，线性稀释。校准物在使用之前储存在-20℃下。
实施例2
产生高信噪比的抗体组合的确定
ADM免疫测定法
将50μl样品(或校准物)吸取到包被的管中，在添加标记的第二抗体(200μl)后，将管在室温下温浴2h。通过用清洗溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗5次(每次1ml)除去未结合的示踪剂。管结合的化学发光使用LB 953(Berthold TechnologiesGmbH&Co.KG)来测量。
所有抗体在夹心免疫测定法中作为包被的管和标记的抗体使用，并以下述变化形式组合(参见表2)。温浴按照hADM免疫测定法下所述来进行。结果以特异性信号(在10ng/mlADM下)/背景信号(不含ADM的样品)的比率给出。
表2：
信噪比 NT-ADM示踪剂 MR-ADM示踪剂 CT-ADM示踪剂
NT-ADM / 195 241
MR-ADM 204 / 904
CT-ADM 260 871 /
令人吃惊的是，我们发现MR-ADM和CT-ADM的组合是具有最高信噪比的组合。
随后，我们将这种抗体组合用于进一步调查以测量bio-ADM。我们使用抗MR-ADM抗体作为固相抗体并使用抗CT-ADM抗体作为标记的抗体。典型的剂量/信号曲线示出在图1中。所述测定法的分析灵敏度(10次运行的平均值，无ADM样品+2SD)为2pg ADM/ml。
实施例3
人类肾上腺髓质素的稳定性
将人类ADM在人类柠檬酸血浆中稀释(n＝5，终浓度为10ng ADM/ml)并在24℃下温浴。在所选的时间点，将等分试样在-20℃下冷冻。在样品融化后，立即使用上述hADM免疫测定法对hADM进行定量。
表3示出了在24℃下hADM在人类血浆中的稳定性。
令人吃惊的是，在夹心免疫测定法中使用抗体组合MR-ADM和CT-ADM，所述被分析物的分析前稳定性高(平均免疫反应性损失仅为0.9％/h)。相反，使用其他测定方法，报道的血浆半衰期仅为22min(Hinson等，2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167)。由于在医院日常中从取样到分析的时间少于2h，因此所使用的ADM检测方法适用于日常诊断。引人注目的是，不需向样品添加任何非常规添加剂(例如抑肽酶(Ohta等，1999.Clin Chem 45(2): 244-251))即可达到可接受的ADM免疫反应性稳定性。
实施例4
校准物制备的可重复性
我们发现了为ADM测定法制备校准物的结果的高度可变性(平均CV 8.5％，参见表4)。这可能是由hADM对塑料和玻璃表面的高吸附性造成的(Lewis等，1998.Clinical Chemistry 44(3):571-577)。通过添加去污剂(至多1％Triton X 100或1％Tween 20)、蛋白质(至多5％BSA)和高离子强度(至多1M NaCl)或其组合，这种影响仅仅略微减小。令人吃惊的是，如果向校准物稀释缓冲液添加过量的抗ADM抗体(10μg/ml)，ADM测定法校准物制备的回收率和可重复性被显著提高到制备间CV<1％(表4)。
幸运的是，N-端抗体的存在不影响由MR-和C-端抗体的组合产生的bio-ADM信号(图1)。
表4：
校准物的制备间可变性
如上所述制备了含有和不含10μg/ml NT-ADM抗体的ADM测定法校准物。从5次独立的制备给出了变动系数。校准物使用上述ADM测定法来测量(s/n-r＝信噪比)。对于所有后续研究来说，我们使用基于在作为增补剂的10μg/ml NT-ADM抗体和10μg/ml NT-ADM抗体存在下在示踪剂缓冲液中制备的校准物的ADM测定法。
实施例5
灵敏度
测定法灵敏度的目标是完全覆盖健康对象的ADM浓度。
健康对象中的Bio-ADM浓度
使用bio-ADM测定法对健康对象(n＝100，平均年龄56岁)进行测量。中值为24.7pg/ml，最小值为11pg/ml，99百分位数为43pg/ml。由于所述测定法的灵敏度为2pg/ml，因此使用所描述的bio-ADM测定法可以检测100％的所有健康对象。
使用商品化全自动均相时间分辨荧光免疫测定法来测量血浆中的MR-proADM(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR；BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)(Caruhel等， 2009.Clin Biochem.42(7-8):725-8)。
实施例6
(PROTECT)
研究群体和测量
本研究的详情已被发表(Massie等，2010.N Engl J Med.363:1419-1428； Weatherleyfunctioned al.2010.J Card Fail.16:25-35；Voors等，2011.J Am Coll Cardiol.57:1899-1907)。简而言之，2,033位肾功能受损(使用Cockcroft–Gault公式估算的肌酐清除率在20至80mL/min之间)的急性心力衰竭患者被包含并随机分配到rolofylline或安慰剂。PROTECT研究的方案得到每个参与中心的伦理委员会批准，并从所有参加者获得书面知情同意书。
使用由Sphingotec GmbH(Hennigsdorf,Germany)开发的免疫测定法，从在PROTECT试验中包含的1572位住院治疗的AHF患者中在基线评估期间收集的血浆(所有可用的基线样品)测量Bio-ADM。PROTECT(表示对具有急性失代偿性心力衰竭和容量超负荷的住院治疗患者进行的选择性A1腺苷受体拮抗剂Rolofylline的安慰剂对照的随机研究，用于评估对充血和肾功能的治疗效果)是一项多中心随机双盲试验，其在2033位因AHF而住院治疗的患者中将rolofylline与安慰剂进行比较。
研究结果
临床充血评分
正如前面强调的，临床替代物对充血的检测具有低于最佳的预测价值。在本分析中，我们组合了充血的三种最强的临床替代物(即JVP、外周性水肿和端坐呼吸)以提高准确性，并开发了一种使用下面陈述的方案的复合临床充血评分(CCS)：
参数 0 1 2 3
外周性水肿 0 踝 膝下方 膝上方
端坐呼吸 0个靠枕 1个靠枕 2个靠枕 3个靠枕
JVP <6cm 6-10cm >10cm -
然后将对这三个参数中每一个的评分相加，以获得在0至8范围内的复合充血评分。类似的方案以前被Ambrosy等人使用过(Ambrosy等，2013.European Heart Journal 34 (11):835-843)。
然后使用下述算法对充血严重性分级：
CCS＝0，无临床充血
CCS 1-3，轻度临床充血
CCS 4-5，中度临床充血
CCS≥6，重度临床充血
充血减轻的标志物
利尿剂响应：被定义为到第4天为止每40mg利尿剂剂量的体重减轻。
血液浓缩：编码为0(如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平降低或不变的话)或1(如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平提高的话)。
显著的充血残留：被定义为第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。
统计分析
通过基线时临床充血的严重性概述了基线临床特征和生物标志物包括bio-ADM(上面提呈的方案)。与基线时临床充血的严重性独立相关的基线因子使用多变量逻辑回归模型来确定(CCS变量被记录为具有两种水平的二元结果；0＝轻度/中度(CCS<6)，1＝重度(CCS≥6))。
基线bio-ADM水平与利尿剂响应(连续变量)之间的关联使用线性回归分析来评估。对血液浓缩和显著的充血残留结果进行二项逻辑回归分析。使用多变量模型来评估bio-ADM水平与这些结果之间的调整过的关联。
结果
在表5中，证实了bio-ADM浓度随着充血严重性而提高。
表5：按照基线时临床充血的严重性分类的基线临床变量和生物标志物
更进一步地，通过多变量逻辑回归证实了bio-ADM是充血严重性的独立预测物，并且在所有其他可用变量中最强(表6)。
表6：在多变量逻辑回归模型中与基线临床充血的严重性独立相关的基线因子(重度与轻度/中度相比)
整个模型的曲线下面积(AUC)＝0.69，各个AUC：bio-ADM＝0.66，BMI＝0.61，血清白蛋白＝0.58，HF后住院＝0.54
更进一步地，分析了bio-ADM是否将预测充血减轻。在表7中，证实了bio-ADM是到第7天为止显著的充血残留的独立预测物。
表7：基线bio-ADM水平与充血减轻的标志物之间的关联
*被定义为到第7天为止复合充血评分>2
**为包括端坐呼吸、JVP、外周性水肿、PCI史、起搏器、ACEI/ARB使用、BMI、DBP、BUN、血细胞比容和BNP的基线变量进行调整
#为基线临床充血评分进行调整(NB：在血液浓缩数据中存在～30％的缺失)
正如对充血的标志物所预期的，bio-ADM浓度越高，用于疗法的利尿剂越多(表8和9)。
表8：根据基线bio-ADM水平的三分位分组的直至第7天或出院(如果更早的话)的总IV利尿剂剂量；PROTECT
表9：基线bio-ADM水平与直至第7天或如果更早的话出院的总IV利尿剂剂量之间的未调整和调整过的关联性；线性回归分析；PROTECT
*对年龄、收缩压、肌酐、血尿素氮(BUN)、白蛋白、钠、HF后住院、基线复合充血评分(CCS)和BNP进行调整；必须指出，在这个模型中，bio-ADM、基线CCS和肾功能的关联性最强。
在同一样品集中，也对MR-proADM进行测定。根据MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表10中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度提高相关。
表10：根据MR-proADM的三分位分组的基线特征
实施例7
(BIOSTAT)
在BIOSTAT研究(对慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究)进行了另外的分析。所述研究已被详细描述(WWW.BIOSTAT-CHF.EU；Voors等，2016.Eur J Heart Fail.Jun；18 (6):716-26)。所述对慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究(BIOSTAT-CHF)包括来自于11个欧洲国家的2516位具有心力衰竭的逐渐恶化的征兆和/或症状的患者，他们被认为经历了次优的医学治疗。来自于苏格兰的另外1738位患者被包含在验证组群中。总的来说，两个患者组群匹配良好。大部分患者因急性心力衰竭而住院治疗，其他人在门诊表现出心力衰竭的逐渐恶化的征兆和/或症状。大约一半的患者属于纽约心脏联合会(New York HeartAssociation)III类，并且指数和验证组群相比有7％和34％的患者具有射血分数得以保持的心力衰竭。根据研究设计，所有患者均使用利尿剂，但由于两个组群的入选标准，患者没有经历最优的循证医学治疗。在跟进阶段中，鼓励使用高于指南推荐的剂量。
研究群体
患者满足下述入选标准：
●年龄≥18岁，具有新发或逐渐恶化的心力衰竭的症状，
●具有由下述指标记载的心功能障碍的客观证据
●左心室射血分数≤40％，或
●BNP和/或N-端脑利尿钠肽前体(NT-proBNP)的血浆浓度分别>400pg/mL或>2000pg/ml，
●在入选时使用≥40mg/天或当量的口服或静脉注射呋塞米治疗，
●以前没有用循证治疗[血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂(ARB)和β-阻断剂]或在入选时接受≤50％的这些药物的目标剂量，
●治疗医师期望开始使用ACE抑制剂/ARB和/或β-阻断剂或提高它们的剂量。
患者为住院患者或从门诊征召。大约2/3是住院患者，1/3在门诊找到。
在本发明中分析了包含所述试验中包括的所有患者类型的患者子集(n＝1806)，所述患者在基线时的生物标志物测量值可用。
与PROTECT研究(实施例6)相似，在BIOSTAT研究中，bio-ADM水平的提高也与水肿严重性的提高相关(表11)。
表11：按照外周性水肿的严重性分组的基线临床变量和标准的生物标志物；BIOSTAT
在同样的样品集中也测定了MR-proADM。按照MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表12中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度提高相关。
表12：按照MR-proADM的三分位分组的基线特征
实施例8
(PROTECT子群分析)
表13示出了PROTECT试验的根据左心室射血分数(LVEF)状态分组的关于bio-ADM水平与临床充血之间的关联的数据。由于基于射血分数的分类是当前在心力衰竭中使用的最相关的表型分型，因此将HFrEF与HFpEF子群相比进行了分析。在两个子群中bio-ADM水平与临床充血评分之间的关联是可比的。
表13：在PROTECT中根据射血分数状态分组的基线bio-ADM水平(对数变换的)与临床充血评分之间的关联性
1＝对于结果1来说对BMI、血清白蛋白和HF后住院进行调整
2＝对于结果2来说对包括端坐呼吸、JVP、外周性水肿、PCI史、起搏器、ACEI/ARB使用、BMI、舒张压、血尿素氮、血细胞比容和BNP的基线变量进行调整
*在对数变换的bio-ADM与作为连续变量被包含的左心室射血分数(LVEF)之间测试的相互作用
伴有射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)被定义为LVEF<40％，伴有射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)被定义为LVEF≥50％。
LVEF数据仅在763位患者中可用(在具有可用的基线bio-ADM测量值的1572位患者中)；他们之中545位具有HFrEF，102位具有HFpEF。
实施例9
在具有充血的患者中bio-ADM的连续测量(监测)(PROTECT研究)
从在后续评估期间在PROTECT试验中包含的住院AHF患者中收集的血浆(所有在第2天和第7天可获得的样品)中测量Bio-ADM，以监测bio-ADM水平随充血状态的变化。不同时间点时所有患者的bio-ADM水平中值概述在表14中。到第7天治疗成功(利用如上所解释的复合充血评分[CCS]，根据到第7天为止的充血状态来定义)为止，随时间分析Bio-ADM水平。
图2显示，到第7天为止具有显著的充血残留的患者具有高的bio-ADM基线水平，并且这些高的水平在7天的治疗过程后持续，而对于到第7天为止仅有轻度或没有充血的患者来说，到第7天为止观察到水平与基线相比降低。
实施例10
bio-ADM和MR-proADM对临床评估的充血的预测价值的比较性分析
a)PROTECT研究
在表15中，呈现了在PROTECT试验中，bio-ADM和MR-proADM就基线时临床充血的严重性和到第7天为止显著的充血残留的存在的预测而言的比较性分析。临床充血使用如前所述的复合充血评分(CCS)来评估。基线临床充血的严重性被分级为如果CCS<6则为轻度/中度，如果CCS≥6则为重度。然后在单变量和多变量二元逻辑回归模型中评估bio-ADM、MR-proADM水平与基线时临床充血的严重性之间的未调整和调整过的关联性。在包含了以20.0％的显著性水平与基线时临床充血的严重性单变量相关的变量的模型上进行后向选择之后，为多变量分析鉴定了包括体重指数、血清白蛋白、总胆固醇、BNP、心房纤颤史和HF后住院的基线多变量模型。为bio-ADM和MR-proADM计算曲线下面积(AUC)，以定量并比较所述两种生物标志物在轻度/中度与重度临床充血之间的辨别价值。
对于充血残留来说，使用在第7天评估的CCS。如果到第7天为止CCS≥3，则认为存在显著的充血残留。同样地，在单变量和多变量二元逻辑回归模型中评估bio-ADM、MR-proADM水平与到第7天为止显著的充血残留的存在之间的未调整和调整过的关联性。在包含了以20.0％的显著性水平与到第7天为止显著的充血残留的存在单变量相关的变量的模型上进行后向选择之后，为多变量分析鉴定了包括端坐呼吸、颈静脉压、外周性水肿、经皮介入史、起搏器、ACEI/ARB使用、BMI、舒张压、血尿素氮、血细胞比容和BNP的基线模型。计算AUC以定量并比较所述生物标志物对显著的充血残留的存在的辨别价值。
表15：在PROTECT中，基线bio-ADM和MR-proADM水平在预测基线时充血的严重性和到第7天为止显著的充血残留的存在中的比较性分析
*优势比应该根据Ln变换的bio-ADM和MR-proADM(未变换的)的标准偏差来解释
b)BIOSTAT研究
在表16中，呈现了在BIOSTAT中，在bio-ADM、MR-proADM水平与基线临床充血的严重性之间的关联性。临床充血利用了略微不同的CCS(与在PROTECT中所使用的相比)来评估，但将相似的统计方法用于分析。CCS使用水肿、端坐呼吸和颈静脉压来计算，但评分仅仅在0-5的范围内，正如在下表中呈现的：
参数 0 1 2 3
外周性水肿 0 踝 膝下方 膝上方
端坐呼吸 不存在 存在 - -
JVP 不升高 升高 - -
基线充血严重性被定义为如果CCS<2则为无/轻度(N＝709)，如果CCS≥2则为显著(N＝635)。利用二元逻辑回归模型来评估未调整和调整过的关联性。将与PROTECT中鉴定的相同的基线模型(包括BMI、血清白蛋白、总胆固醇、BNP、心房纤颤史和HF后住院)用于多变量调整。
表16：在BIOSTAT中，基线bio-ADM和MR-proADM水平在预测基线时充血的严重性中的比较性分析
实施例11
a)GREAT研究
研究群体
招募了来自于三个国家(英国、法国和瑞士)的参与的大学医院的急诊部的表现出急性呼吸困难的未选择的AHF患者的三个组群(n＝1075)。AHF根据欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology)的指南被定义为逐渐恶化或新发的呼吸短促并伴有肺或外周性水肿和颈静脉压升高的临床征兆，需要强化利尿剂和/或血管舒张剂治疗。入选不依赖于肾功能，尽管在已确立的肾替代疗法后具有终末期肾衰的患者被排除。这些研究遵守赫尔辛基宣言(declaration of Helsinki)并获得由相应的研究伦理委员会授予的伦理审批文件。所有患者提供书面知情同意书。
血浆取样
在签署知情同意书后，从横卧患者抽取静脉血并收集在含有EDTA作为抗凝剂的预冷管中。获得该入院样品的时间间隔是最长4小时(巴黎)、1小时(巴塞尔)和12小时(莱切斯特)。在分析之前血浆被单批储存在-80℃下。
结果
患者特征概述在表17中，生物标志物分布概述在表18中。在追踪的第一年中，299人死亡。一个组群(巴黎)没有关于重新住院治疗的原因的数据并且对于该终点来说被排除。其余的中心具有n＝861位患者的追踪数据，其中345位在一年内因心力衰竭(HF)死亡或重新住院治疗。
Bio-ADM与一年死亡(p<0.0001)和因HF的一年死亡或重新住院治疗(p<0.0001)相关，在单变量和多变量两种情况下都是如此(均为p<0.0001)。值得注意的是，bio-ADM与出院时提供的利尿剂治疗存在相互作用(p＝0.0001，表19和20和图3)。标准化的HR(对log10变换的bioADM的一个标准偏差(SD)进行标准化)对于bio-ADM来说为1.7(p<0.0001)，对于与利尿剂治疗的相互作用项来说为0.61(p<0.0001)。
表17：分析中包含的患者的患者特征
表18：分析中包含的患者在入院和出院时的生物标志物分布概述
χ<sup>2</sup> d.f. P
Bio-ADM(因子+高阶因子) 87.71 2 <0.0001
所有相互作用 13.08 1 0.0003
出院时利尿剂(因子+高阶因子) 96.29 2 <0.0001
所有相互作用 13.08 1 0.0003
Bio-ADM×出院时利尿剂(因子+高阶因子) 13.08 1 0.0003
合计 195.65 3 <0.0001
表19：对终点即入选后一年死亡的多变量cox回归分析的结果，包括了在出院时利尿剂治疗和bio-ADM的相互作用项。
表20：对终点即入选后一年因心力衰竭(HF)而死亡或重新住院治疗的多变量cox回归分析的结果，包括了在出院时利尿剂治疗和bio-ADM的相互作用项。
Bio-ADM也与临床充血相关。数据可以从莱切斯特和巴黎的中心获得(n＝1107)。临床充血评分组合了外周性水肿、端坐呼吸和颈静脉压>6cm的存在(各自为评分添加1点，参见表21)。在临床充血评分(CCS)为3的患者中Bio-ADM升高(n＝284，p<0.001，图4)。
表21：临床充血评分(CCS)的定义
CCS＝0 无充血
CCS＝1-2 轻度充血
CCS＝3 显著充血
实施例12
DiSomma研究
研究群体
这是一项在重症监护室进行的前瞻性、观察性试验。我们登记了来自于罗马Sant’Andrea医院的急诊室(ED)的因AHF入院的患者。在到达时收集临床和实验室数据包括临床充血评分(CCS：外周性水肿、颈静脉充盈和端坐呼吸)、利尿剂治疗和bio-ADM值，并对患者进行跟踪直至出院。所述研究得到罗马Sant’Andrea医院的伦理委员会批准。所有患者提供书面知情同意书。
血浆取样
用于ADM测量的血浆样品在入院时获得。
结果
征召了209位最终诊断为AHF的患者。从168位患者中获得了临床充血评分。患者特征概述在表17中。22.6％、38.1％、21.4％和17.9％的患者分别表现为具有0、1、2和3的CCS。与具有0-2之间的CCS的患者相比，在CCS为3的患者中(p＝0.01)和在腔静脉指数>1的患者中(p＝0.05)bio-ADM结果更高，表明bio-ADM在检测充血中的潜在作用，而其被认为是心力衰竭患者死亡和重新住院治疗的主要原因。此外，较高水平的bio-ADM与呋塞米治疗的增加和更高的医院中死亡的比率相关，这可能与充血的量相关(分别为p＝0.002和p<0.001)。
表22：患者特征
Bio-ADM也与临床充血相关。所述临床充血评分组合了外周性水肿、端坐呼吸和颈静脉压>6cm的存在(各自为评分添加1点)。在临床充血评分(CCS)为3的患者中Bio-ADM升高(n＝30，p<0.01，图5)。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg
35 40 45
Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro
50 55 60
Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn
65 70 75 80
Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val
85 90 95
Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
100 105 110
Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg
115 120 125
Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser
130 135 140
Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala
145 150 155 160
Pro His Phe Leu
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg
20
<210> 3
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35 40 45
<210> 4
<211> 52
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr - CONH2
50
<210> 5
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr Gly
50
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro His Phe Leu
35

Claims (16)

1.一种方法，所述方法用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
·确定从所述对象获得的体液中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
a)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
d)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自：根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
2.根据权利要求1的方法，所述方法用于：
a)诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或
b)预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或
c)预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
d)评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或
e)评估对象的出院决定，
其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆/症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，
所述方法包括：
·使用至少一种结合剂确定从所述对象获得的体液中免疫反应性被分析物的水平，所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域；以及
a)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或
b)将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或
c)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后对充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或
d)将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或
e)将所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，
其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自：根据SEQ ID No.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQ ID No.:2的PAMP或根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQ ID No.:5的ADM-Gly或根据SEQ ID No.:6的CT-proADM。
3.根据权利要求1至2任一项的方法，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述对象被分层为：
a)充血等级的组，或
b)对充血的疗法或干预的无应答者和/或应答者和/或不良应答者，或
c)在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中所述片段可以选自根据SEQ ID No.:3的MR-proADM或根据SEQ ID No.:4的成熟ADM-NH2。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中通过使用结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平。
7.根据权利要求6的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述阈值在阈值范围内，所述阈值范围对于根据SEQ ID No.:4的血浆成熟ADM-NH2来说在50至100pg/ml之间，对于血浆MR-proADM来说在0.5至1.5nmol/L之间，对于血浆CT-proADM来说在85至350pmol/L之间。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一位患者中进行一次以上。
10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所述样品在入院或出院时获取。
11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和/或治疗性措施的响应。
12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中所述方法是为了将所述对象分层至充血等级的组。
13.根据权利要求1至12任一项的方法，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平与患有急性心力衰竭的对象的死亡或不利事件的风险相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。
14.根据权利要求1至13任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来指导充血的疗法或干预，其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平高于一定阈值则指示进行疗法或干预，并且其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平低于一定阈值则指示不进行充血的疗法或干预。
15.根据权利要求1至14任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来确定对充血的疗法或干预的需求。
16.根据权利要求1至15任一项的方法，其中所述干预或疗法选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤。
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