JPH0295260A - ＨＢｓ抗原測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＨＢｓ抗原の測定試薬、更に詳細には、補体
依存性り？ンーム膜損傷反応を利用した簡単な操作によ
ってＨＢｓ抗原を測定することのできるＨＢｓ抗原測定
試薬に関する。

〔従来の技術およびその課題〕

Ｂ型肝炎は、血清肝炎ともよばれ、潜伏期は通′＄−６
週間から６ケ月間で、本疾患はＡ型肝炎よシもより重症
な症状を伴う。Ｂ型肝炎は、その後、いくつかの臨床経
過をとシうるが、多くの患者は、慢性肝炎に発展し、そ
して少数の患者は致死的な肝壊死まで進展する。

かなシの数の患者は症状的には回復するが、しかし、血
液中には、Ｂ型肝炎の血清学的なマーカーを保持し続け
、潜在的に感染性を持っていると考えられる。これらの
慢性Ｂ型肝炎保菌者は、輸血のだめの血液を準備する際
に、かならずチエツクされなければならない。

Ｂ型肝炎ウィルスの検査方法には、従来、寒天ゲル免疫
拡散法、カウンター免疫電気泳動法、補体結合法、逆受
身凝集法、固相放射免疫測定法（ＲＩＡ　）、酵素免疫
測定法（ＥＩＡ）などが知られている。しかし、寒天ゲ
ル免疫拡散法、カウンター免疫電気泳動法は操作が煩雑
であり、測定時間もかかり、感度も比較的低い。また補
体結合法は、やはり操作が煩雑で、感度も低い。逆受身
凝集法は、安定した抗体被覆赤血球を用意することに問
題があシ、試薬価格も高い。ＲＩＡ、ＥＩＡは、感度の
点では、寒天グル免疫拡散の２，０００−１ｏ、ｏ　ｏ
　ｏ倍にもなるが、試薬価格が高く、ＲＩＡでは、放射
性元素を用いるため、特別な放射性元素処理施設が必要
となるという欠点があった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、補体依存性り？ンーム膜損傷反応を利用すれば、ＲＩ
Ａ　、　　ＥＩＡと同じ感度で、しかもこれらに必要な
り／Ｆ分離を要することなくホモゾニアス系での測定が
可能なことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はリン脂質及びコレステロールを主要
構成成分とするリポソームの表面に架橋剤を介して抗Ｈ
Ｂｉ抗体を固定し、かつ該り？ソーム内に親水性標識物
質を封入したことを特徴とするＨＢｓ抗原測定試薬を提
供するものである。

本発明において、す？ンームはリン脂質及びコレステロ
ールを主要構成成分とするものであれば、従来使用され
ている倒れのものでもよいが、リン脂質とコレステロー
ルのモル比が１：１前後であるとき、安定なり？ソーム
が得られる。また、リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原
子数が１２〜１８であることが好ましく、更には偶数で
あるのがより好ましい。

す？ソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、す？ソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０”−
３Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルゲキシルフル
オレセインのような螢光性化合物：す？ンーム外で酸化
反応により発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作
用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をも
たらすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テト
ラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性
化合物：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ　）のような補酵素類：メチルピオログンを初めとす
るラジカル化合物などが望ましい。

す？ソームの表面に固定化される抗ＨＢｓ抗体としては
モノクローナル抗体が好ましく、特に異なるエピトープ
を認識するモノクローナル抗体（ａｄ、ｍｙ、ｗ、ｒ　
　）を２種以上組合せて使用すれば広範囲のＨＢｓ抗原
を測定することができる。

本発明のＨＢｓ抗原測定試薬は、例えば次の方法で製造
される。

まず、リン脂質とコレステロールをフラスコに入れ、溶
媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する
。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定
の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし標識物
質封入り？ソームを得る。

一方、抗ＨＢｓ抗体と架橋剤とを緩簀液中で反応させて
架橋基を導入し、しかる後、必要であれば、該架橋基を
還元する試薬（例えばジチオスレイトール：　ＤＴＴ　
）と更に反応させ、修飾抗体を得る。

最後に、標識物質封入り？ソームと修飾抗体とを緩衝液
中で反応せしめることにより、本発明の抗ＨＢｓ抗体感
作り？ソームが得られる。

このようにするとき、ＨＢｇ抗原測定試薬は、通常、標
識物質を内包し、表面に固定化烙れた抗ＨＢｓ抗体を担
持したマイクロカｆセルとして得られる。

上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−スク
シンイミジル３−（２−１？リゾルゾチオ）ｆロビオネ
ー）　（５ＰＤＰ　）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−
スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセ
テ＋＋−）　（ＳＭＰＡ　）、Ｎ−スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（５ＭＰ
Ｐ　）、Ｎ　−（γ−マレイミドグチリルオキシ）スク
シンイミド（ＧＭＢＳ　）及びＮ−（ε−７レイミトカ
ノロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ８）が挙げら
れる。

このようにして調製したＨＢ３抗原測定試薬を用いて被
検体中のＨＢｓ抗原を測定するには、被検体中に該試薬
及び補体を加え、抗原−抗体と補体との結合反応を引き
起こさせる。すると、かかる反応量に比例してり破ンー
ム内から標識物質が放出されてくる。次いで、この標識
物質に応じた分析方法（例えば、標識物質が螢光物質で
あれば、螢光分析法）により定量を行ない、例えば、予
め作成した検量線によシ、試料中の抗原の量を測定する
ことができる。

この測定操作において使用する補体は、格別限定されず
、通常はモルモット血清が用いられるが、ウサギ、マウ
ス、ヒト等の血清を使用してもよい。

〔発明の効果〕

斜上の如く、本発明のＨＢｓ抗原測定試薬を使用すれば
、簡単な操作で、ＥＩＡ％　ＲＩＡと同等又はそれ以上
の測定感度をもって被検体中のＨＢｓ抗原を正確に測定
することができる。

また本発明のＨＢｓ抗原測定試薬は抗Ｈ１ｔｓ抗体感作
り？ンーム懸濁液１　ｍ　（１ｒａＭ脂質濃度）で約２
万検体の測定が可能であるので極めて安価である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

参考例１（抗ＨＢｓモノクローナル抗体の製造）ヒトＨ
Ｂｓ抗原陽性血清から精製したａｄｗ、ａｙ型抗原をＢ
ＡＬＢ　／　ｃマウスに免疫し、その牌細胞とマウスミ
エローマ細胞株Ｎ５−１と細胞融合して、ヒトＨＢｓ抗
原に対するモノクローナル抗体を得た。このようにして
得られた抗体は型別抗原との反応性からそれぞれ抗ａｄ
、抗ａｙ抗体と判明した。このようにして得られた抗体
のうち、本発明に用いることのできる抗体は、三種類で
あった。抗体は、イオンクロマトグラフィーにより精製
した後、サブクラスと凝集法（ＰＨＡ）により、力価が
決定された。

サグクラス　　力価（ＰＨＡ） ■　抗ａｙモノクローナル抗体　　ＩｇＧ、　　　　４
００，０００■　抗ａｄモノクローナル抗体　　ｒｇｃ
ｌ　　　１．ｏｏｏ、ｏｏ。

■　抗ａｄモノクローナル抗体　　ＩｇＧ、　　　　２
００，０００実施例１ （１）　　リポソームの調製 ゾノＱルミトイルホスファチゾルコリン（ＤＰＰＣ）　
１　／Ｊｎ＋０１　、　　コレステロール（Ｃｈｏｌ　
）１μｍｏｌおよびゾテオビリゾル化ゾ、ｅルミトイル
ホスファチゾルエタノールアミン（ＤＴＰＤＰＰＥ　）
　０．０４　μｎ＋ｏｌ　ｆナシ型フラスコにとす、脂
質を溶解していたクロロホルムをエバーレータ−で留去
した。芒らに、−時間真空デジケータ−で乾燥後、ナシ
型フラスコに０．２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ
）２００μｔを入れ、激しく振とうし、ナシ型フラスコ
のガラス壁土の脂質薄膜をはがしてＣＦ封入り？ソーム
を調製した。未封入のＣＦは、０．０１Ｍヘペス緩衝液
（０，１５Ｍ　ＮａＣｔ含有；ｐＨ７，５）で遠心洗浄
を三回行なって分離した。

１）　　抗ＨＢｓモノクローナル抗体のリポソームへの
感作 ０．０１Ｍヘペス緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎ＆Ｃｔ含有ｚ
　ｐＨ７，５）に透析した、参考例１の■及び■のモノ
クローナル抗体１■／　ｙｔｌを７５０μｊｆつ混合し
たものに、３０　ｍＭ　５ＰＤＰエタノール溶液５μｌ
を添加し、室温で３０分間反応させた。引き続き、過剰
の５ＰＤＰを除去するために、０、１　Ｍ酢酸緩衝液（
０，１５Ｍ　ＮａＣ１；　ｐＨ４，５）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５でグル濾過した。ゲル濾過により
得られたタン／Ｑり分画に、ＤＴＴ　７．７１１ｆｉを
添加し、室温で３０分間反応させた後、α０１Ｍヘベス
緩衝液で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５でグ
ル濾過し、過剰のＤＴＴとタン、ｅりを分離した。

こうして得られたタンノＱり分画１　ａｔに、（１）で
調製したり？ソームペレソトを加え、６−１０℃で１８
〜２４時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。

その後、リポソーム懸濁液を遠心洗浄し、未反応のタン
）Ｑりを分離した後、０．１％Ｎ　ａ　Ｎ３含有ゼラチ
ンペロナール緩衝液（ｐＨ７４）１ｄに再懸濁した。

（１ｉ）抗ＨＢｓモノクローナル抗体感作りｌＬ′ソー
ムを用いたＨＢ畠抗原の測定 ９６大のマイクロプレート（住友ベークライト製）を用
いて測定を行なった。希釈には、すべて０．５　ｍＭ　
ＭｇＣ２２と０．１５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む什 ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ　）を用いた。

４００倍希釈したり？ソーム液２５μｔに、非廿 勧化したＨＢ＋抗原陽性のヒト血清をＧＶＢ　　で希釈
し、２５μｔを加え、３７°Ｃで１時間反応した。その
後、適当に希釈した二次抗体２５μｔとモルモット補体
２５μｔを加え、更に、３７℃で１時間反応した。反応
はｊＯｒｎｂｌＥＤＴＡ含有ベロナール緩衝液（ｐＨ７
，５）を１００μを加えて停止した。ＨＢ−抗原量に依
存したＣＦ量は、マイクロプレート用螢光光度計ＭＴＰ
−３２（コロナ社）を用いて励起光４９０ｎｒｎ、螢光
５３０　ｎｒｎで測定した。

（ｉｖ）　　反応のタイムコース 逆受身凝集反応（Ｒ−ＰＨＡ　）で１６００倍のＨＢｓ
抗原陽性ヒト血清を１０〜３２０倍希釈し、二次抗体と
してウサギ抗ＨＢｓ抗体（ＭＢＬ社）を１００倍希釈し
たものを用いた。補体価は３単位で行なった。

アッセイの一次反応である抗原と抗体感作リポソームの
反゛応を１５〜１２０分まで追った。その後、二次抗体
と補体を加えた後の反応時間は、１時間に固定した。そ
の結果は、第１図に示すように、高濃度では６０分てほ
ぼ反応が終了していたが、低濃度では、６０分以降も反
応が徐々に進んでいることがわかった。これらの結果を
基に、反応時間は、次反応６０分とした。これは、検体
希釈３２０倍（Ｒ−ＰＨＡと同様に反応系全容量中での
希釈倍数に換算すると２５６０倍に当たる）におけるＣ
Ｆ　＋７１１−スがＨＢｓ抗原陰性検体のＣＦＩＪリー
ス％から求めたＨＢｓ陽性カットオフ値をうわまわった
からである。

（Ｖ）　　第１図の結果から求めた反応時間で、（ｉｉ
）に従ってＨＢｓ抗原の検量線を作成した（第２図）。

条件は次のとおりで行った。

標準血清：ＨＢ−抗原陽性検体（Ｒ−ＰＩ（Ａ１６００
升 倍）をＧＶＢ　で１０倍から３２０ 倍まで希釈した。

補体価：３単位 二次抗体：　ＭＢＬ社ウサつ抗ＨＢｓ抗体を１００倍希
釈したもの。

ＣＦリリース％：　１０％トライ　トンＸ−１００で遊
出したＣＦ量を１００％と し、ＨＢｓ抗原陽性血清を加え る代りに、２５０　ｕＬ　ｔＤ　ＧＶＢ＋を加えたとき
に得られるＣＦ遊 出量を０％として、計算で求 めた。

（ｖｌ）従来法との相関 Ｒ−ＰＨＡ法と本測定法との相関性を、ＨＢｍ陽性およ
び陰性の検体２５検体で調べ、その結果を第１表に示し
た。尚、本性によるＨＢｓ抗原価は、５％以上のＣＦ　
＋７１７−スが観測される最大希釈倍数（例えば検体希
釈が１６０倍であるならば、反応系の容量が２００μｔ
であシ、検体２５μｔは更に８倍希釈されることになる
ので最終的には、１２８０倍となる）で表わした。また
５％のカットオフは、ＨＢｓ陰性検体によるＣＦ遊出量
から決定された。水沫とＲ−ＰＨＡ法は、それぞれ検体
希釈８倍から始めた。

第１表かられかるように、Ｒ−ＰＨＡよ多本法の方が測
定感度が高く、陰性率では良い一致を見た。

第１表 以下余白 １）検体希釈８倍で５％以下のＣＦＩＪＩ／−スであっ
たことを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＢｓ抗原陽性ヒト血清の各希釈倍数における
本発明ＨＢｓ抗原測定試薬のタイムコースを示す図であ
り、第２図は本発明ＨＢｓ抗原測定試薬を用いてＨＢｓ
抗原を測定したときの検量線である。 ＣＦリリース（％） 以

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リン脂質及びコレステロールを主要構成成分とする
   リポソームの表面に架橋剤を介して抗ＨＢｓ抗体を固定
   し、かつ該リポソーム内に親水性標識物質を封入したこ
   とを特徴とするＨＢｓ抗原測定試薬。 ２、抗ＨＢｓ抗体が抗ＨＢｓモノクローナル抗体である
   請求項１記載のＨＢｓ抗原測定試薬。 ３、抗ＨＢｓモノクローナル抗体が、異なるエピトープ
   を認識する２種以上の抗ＨＢｓモノクローナル抗体であ
   る請求項２記載のＨＢｓ抗原測定試薬。