JPS63101368A - 発光化合物および発光共役体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はイムノアッセイまたは核酸ハイブリッド形成ア
ッセイのような特異結合アッセイにおいて発光標識とし
て有用な新規のアクリジニウムエステルに関する。さら
に特に、多置換アリールアクリジニウムエステルが化学
発光イムノアッセイに使用するため意外にも安定な標識
であることを見出した。

（従来の技術とその間通点） 化学発光標識として不飽和アリールアクリジニウムエス
テルを使用することは、ジエー・ニス・ウッドヘッドら
のＧＢ２．００８，２４７Ｂに最初に開示され、次に欧
州特許出願ＥＰ８２．６３６号に開示された。しかし、
これらの化合物はアリールエステル成分の一部を構成す
るフェノキシリングのオルトの位置が何も置換されてい
なかった。不幸にも、ウッドヘッドの化合物はｐＨ７，
４の緩衝液で不安定であり、従って、市販品のアッセイ
として有用でなかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は新しい多置換アリールアクリジニウムエステル
およびこれらのエステルを用いる発光標識した共役体を
含む。これらの置換の結果として、本発明の化合物と共
役体は、ｐＨ７，４の緩衝液において意外な程、安定性
が良く、共役体として形成される場合、発光効率が３倍
に増加し、固相の特異結合アッセイに使用する場合、信
号体ノイズの比が２倍に改善される。

さらに特に、次に示す化合物は本発明の代表的なもので
ある。本発明は、次の構造を有する群から選ばれた多置
換アリールアクリジニウムエステルを含む発光化合物で
ある。

（式中のＲ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ま
たはアリール基であり；Ｒ２，Ｒ３，Ｒ３またはＲ７は
水素、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、アルコキ
シル、ニトロまたはハライド基であり；Ｒ４またはＲ８
はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アル
コキシル、アミノ、アミド、スルホンアミド、またはス
ルフィド基であり＋Ｒ６は次の置換体を示し、 Ｒ６−ｗ−Ｒ９−Ｒ１゜ Ｒ９は必須ではないが任意にアルキル、アリール。

またはアラルキル基であり、およびＲＩｌｌは次の群：
から選ばれ、ＸがＣＨ３ＳＯａ　−，０５Ｏ２Ｆ−。

ハライド、０５０２　ＣＦ３−．０５０２　Ｃ４Ｆ！−
。

がアルキル、アリールまたはアラルキルであり；最後に
フェノキシリングのＲ５＋　Ｒ６およびＲ丁の置換位置
が交換できる）。

特異結合アッセイのための標識として従来の非置換のも
のよりも本発明の多置換アリールアクリジニウムエステ
ルの性能が著しく改善されたのは、本発明化合物のアリ
ールエステル結合の遮蔽に由来する。立体効果、電子効
果、またはこれらの組み合わせは、抗体／抗原免疫反応
または相補的核酸ハイブリッド形成反応のような分野で
知られている特異結合現象を用いる発光アッセイに、こ
れらの化合物を市販品として用いることができる。

この分野で知られているように、これらのアッセイのた
めの標識化合物は、リガンドまたは分析物（例えば抗原
）、あるいはリガンドまたは分析物（例えば対応する抗
体）にカップルすることを含め、種々の通常の構造に使
用できる。

好適には、本発明の多置換アリールアクリジニウムエス
テル化合物は、上述のように次の置換基を有する。すな
わち、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２＋　Ｒ３＋　Ｒ５お
よびＲ７は水素であり、Ｒ４およびＲ８はメチル基であ
り、ＲＩｌｌはフェノキシリングのバラ位に直接結合し
たＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル基であり、Ｘ
はＣＨ３５Ｏａ−である。次の実施例は好ましい化合物
、オルト−ジメチルアリールアクリジニウムエステルの
合成法を開示している。

（実　施　例） 実施例１ ３．５ジメチル−４−ヒドロキシ安息香酸のカリウム塩
の調製 ５０ｄのメタノールに溶かした３、５ジメチル−４−ヒ
ドロキシ安息香酸（７，８ｇ、４７ミリモル）の溶液に
２．５　Ｎ　　Ｎａ　ＯＨを混合物の］）Ｈが約７，０
になるまで滴下した。反応混合物を室温で１時間かきま
ぜ、真空下に乾燥するまで蒸発させた。残渣をアセトン
で粉にして濾過した。希望するカリウム塩を白色塩とし
て集め、次にアセトンで洗浄し、空気乾燥した（７．８
　ｇ、８０％）。

実施例２ ３．５ジメチル−４−ヒドロキシ安息香酸のベンジルエ
ステルの調製 実施例１の３．５ジメチル−４−ヒドロキシ安息香酸の
カリウム塩（５，８９，２７ミリモル）、ジベンゾ−１
８−クラウン−６（１，０ｇ、３ミリモル）およびｔｏ
ｏ　ｄのＤＭＥ／アセトニトリル（１：２、Ｖ／Ｖ　）
を、還流コンデンサ、乾燥管、およびかきまぜ棒を備え
た２５０ｄの丸底フラスコに添加した。

混合物を８０℃で３０分間、油浴中で加熱した後、塩化
ベンジル（３，５ｔｄ、３０ミリモル）を添加した。

この反応混合物をさらに３時間８０℃で加熱し、冷却し
濾過した。濾液を蒸発転層した。残渣を最小量のクロロ
ホルムに溶解し、クロロホルム／ヘキサン（３：　１、
ｖ／ｖ　）を用いて溶出するシリカゲル充填カラム（６
０人、２３０〜４００メツシユ）で精製した。溶出液を
１００％クロロホルムに変えた。

トルエン／酢酸エチル（４：　Ｌ　ｖ／ｖ　）を用いて
展開するとき、メルクシリカゲル薄層クロマトグラフィ
で０．６のＲ２値を有する部分を集め、蒸発させて白色
固体の希望するベンジルエステル（４゜８ｇ、７０％、
融点１０８℃）を得た。

実施例３ ９−アクリジンカルボニルクロリドの調製９−アクリジ
ンカルボン酸水和物（７４ｇ、３０ミリモル）と塩化チ
オニル（５０ｍ、、０．８８５モル）の混合物を還流コ
ンデンサ、乾燥管、およびかきまぜ棒を備えた丸底フラ
スコに入れ熱還流した。

反応混合物が溶解した後、さらに１時間加熱し、次に冷
却し、蒸発させて過剰の塩化チオニルを除いた。残渣は
、さらに精製することなく直接次の反応に使用した。

実施例４ ２’　、　　６’　−ジメチル−４′−ベンジルオキシ
カルボニルフェニルアクリジン−９−カルボキシレート
の調製 実施例２からの３．５−ジメチル−４−ビトロキシ安息
香酸のベンジルエステル（６，４ｇ、２５ミリ・モル）
と４−ジメチルアミノピリジン＜３４５ｍｇ、３ミリモ
ル）を５（７のピリジン（３Ａ以上の分子ふるい）に溶
かした溶液を、乾燥管を備えた丸底フラスコに入れて９
０℃で加熱した。溶液を冷却し、実施例３からの乾燥し
たアクリジン−９−カルボニルクロリド（７，０５ｇ、
２９．２ミリモル）を含むフラスコにピペットで移した
。反応混合物を１００℃で３時間、次いで室温で終夜か
きまぜた。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲル充
填カラムでクロロホルム、次いで酢酸エチルで溶出して
精製した。トルエン／酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ　）
で０．６のＲ２値を有する希望する生成物が酢酸エチル
／ヘキサンから結晶になって精製された（６．３７９．
５０％、融点１４６〜１４８℃）。

実施例５ ２’、６’　−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル
アクリジン−９−カルボキシレートの調製実施例４から
の２’　、６’　−ジメチル−４′−ベンジルオキシカ
ルボニルフェニルアクリジン−９−カルボキシレート（
５，４び、１１．７ミリモル）、１００　ｄの氷酢酸、
および２５ｄの４８％臭化水素の混合物を、１００℃で
３時間加熱し冷却した。反応混合物を６００戒の水に添
加し、クロロホルム中２０％のメタノールを用いて抽出
した（１００　ｄで３回）。

有機抽出物を合わせて、蒸発させ、残渣をフリットディ
スクを有する漏斗でヘキサンを用いて洗浄した。（ＨＢ
ｒ塩として得られた）黄色固体をクロロホルムに懸濁し
、水で洗浄する前に僅かに過剰のトリエチルアミンで中
和し、硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発させた（３．８３ｇ
、８８％）。このようにして得られた希望する生成物は
１０％のメタノール／クロロホルムで０．４のＲ５値を
示した。

実施例６ ２’　、　６’　−ジメチル−４’　−（Ｎ−スクシン
イミジルオキシカルボニル）フェニルアクリジン−９−
カルボキシレートの調製 ４５０ｄのＤＭＦに溶かした実施例５からの２′。

６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニルアクリジ
ン−９−カルボキシレート（３，５８び、９，６４ミリ
モル）の溶液を、乾燥管とかきまぜ棒を備えた１見の丸
底フラスコに入れた。溶液を１ｏ分間水浴で冷却し、次
に５（］ｄのＤＭＦに溶かしたジシクロへキシルカルボ
ジイミド（３，０ｇ、　１４．８ミリモル）の溶液と混
合した。反応混合物を３０分間水浴中でかきまぜ、５０
Ｉｄ！のＤＭＦに溶かしたＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（１，７ｇ、１４．５ミリモル）の溶液と混合し、室
温で終夜かきまぜ、蒸発転層させた。残渣を１５０戒の
塩化メチレンで抽出し、濾過した。濾液を湿った固体に
濃縮し、２０ｄの酢酸エチルで粉にして、濾過し、真空
デシケータ−で乾燥し、粗生成物（３，５ｇ）を得た。

さらに従来のフラッシュクロマトグラフィ技術を用いて
生成物の精製を行った。シリカゲル（ジェー・ティー・
ベーカー、＃　７０２４−１）カラムを充填し、クロロ
ホルム／酢酸エチル（４：　Ｌ　ｖ／ｖ　）を用いて溶
出した。エチルエーテル／酢酸エチル（４：１、Ｖ／Ｖ
　）で展開したときシルカゲル薄層クロマトグラフィプ
レートで０６２８のＲｒ値を示した部分を集め、白色固
体（ＨＰＬＣで９５％の純度）を与えるように蒸発させ
た。充填シリカゲルカラムを用いてヘキサン／アセトン
（２：１）で溶出し繰り返しフラッシュクロマトグラフ
ィーで精製し、希望する純生成物（３４％の収量、融点
２７６〜２７７℃）を得た。

実施例７ ２’、６′−ジメチル−４′−（Ｎ−スクシンイミジル
オキシカルボニル）フェニル１０−メチル−アクリジニ
ウム−９−カルボキシレートメソスルフェートの調製 ３．８ｍｌの塩化エチレンに溶かした実施例６からの２
’　、６’　−ジメチル−４’　−（Ｎ−スクシンイミ
ジルオキシカルボニル）フェニルアクリジン−９−カル
ボキシレート（９１，５ｍｇ、０．１９５　ミリモル）
の溶液に、２．０　ｄの再蒸留ジメチルスルフェートを
加えた。得られた溶液を４日間無水の条件下に還流した
。室温で黄色均質溶液に１５ｍ１のジエチルエーテルを
加え、希望する生成物を沈澱させた。塩化メチレンとジ
エチルエーテルの混合物から再結晶して精製し、黄色固
体（９２，７ｍｙ、８０％、融点２２８〜２３０℃）を
与えた。

実施例８ ２’　、６’　−ジメチル−４′−ベンジルオキシカル
ボニルフェニル１０−メチル−アクリジニウム−９−カ
ルボキシレートメソスルフェートの調製１ｉのクロロホ
ルムと０．３　ｄのジメチルスルフェート（３，１７ミ
リモル）に溶かした実施例４からの２’　、６’　−ジ
メチル−４′−ヘンシルオキシカルボニルフェニルアク
リジン−９−カルボキシレート（４６ｍ、０．１　　ミ
リモル）の溶液を、ビグロウ蒸留カラムとかきまぜ棒を
備えた２５ｄ丸底フラスコに入れた。溶液を１０５°Ｃ
で１０分間加熱し、冷却した。反応混合物を２戒の塩化
メチレンで希釈し、次いで無水エチルエーテルを加えて
、希望する生成物の最大量の沈澱物を得た。混合物を濾
過し、エチルエーテルで洗浄し、空気乾燥して黄色固体
＜４８ｍｇ、７８％）を与えた。

合成中にＲ１０部分は上述のように、限定された部分に
転換する必要がある前駆体である。例えば保護基を限定
された部分に結合し、限定された部分を生成するように
除去する。このような合成技術は既知である。

本発明の共役体の調製 ＲＩＤカップリング部分を選択すると、エステル標識は
直接、水または有機媒体中で特異結合パートナ−または
リガンドと直接反応できる。また、このようなカップリ
ング技術は既知である。

発光効率 好ましいオルトジメチル置換アリールアクリジニウム化
合物単独では従来の非置換化合物の発光効率の１／３で
あるが、共役体を形成するように抗体に結合すると、本
発明の共役体の発光効率が３倍になり、従って、意外な
ことに従来技術の共役体と同じ効率になる。

本発明の共役体は、置換アクリジニウムエステルが非置
換化合物よりもカップリングに必要なアルカリ性緩衝溶
液において一層大きい安定性を有するため、従来のもの
よりも高い特異的活性を示す。

さらに特に、次のアッセイはオルトジメチルエステルと
従来の非置換化合物で行った。

従来の蛋白質カップリング法によって実施例７の多置換
アクリジニウムエステルに抗ＴＳＨ抗体を結合して共役
体を調製したが、このように既知の方法はいずれも適し
ている。

最終の抗体濃度は０．８　ｍＦｌ／ｍｌであった。０．
１ＮＨＮ０３．０．１％Ｈ２Ｏ２、および０．２％のア
ークアト（Ａｒｑｕａｄ登録商標）表面活性剤を含有す
る第１溶液をＯＪ　ｄ、続いて０．Ｌ　Ｎ　　Ｎａ　Ｏ
Ｈの第２溶液を０．３　ｍ注入して、１２００倍に水で
希釈した共役体１９Ｊのうち１０マイクロリツトルをフ
ラッシュした。発光はバーソルド発光計で２秒間であっ
た。

従来の非置換アクリジニウムエステル化合物の置換以外
は、上記方法を繰り返した。

本発明のオルソジメチルエステルを用いてつくった共役
体の発光効率は、従来の非置換エステルを用いてつくっ
た同様の共役体に匹敵するか、またはそれよりも優れて
いた。

表　　　１ 共役体　　　　総　数 非置換エステル　　　　　　　３，４０８．口３０非置
換エステル　　　　　　　３．ＬＩｏ、９９０オルトジ
メチルエステル　　　３，９１３，６９０オルトジメチ
ルエステル　　　３，４６７．０３０共役体の安定性 上述の従来の非置換エステル共役体とオルトジメチルエ
ステル共役体の安定性を試験した。発光活性の保持力を
種々のｐＨ値（クエン酸塩−リン酸塩緩衝剤を使用）お
よび温度で試験した。上記各共役体のアリコート５ミリ
リツトルを、２組の３種の緩衝液（ｐＨ５，０，７，４
，８，０）に各々０．１％ＢＳＡを含ませた液に加えた
。１組はコントロールとして４〜８℃に保持し、残りの
１組を７日間３７℃に（呆持した。３白目、７日目に２
５マイクロリツトルの緩衝液を上記のようにフラッシュ
させた。

結果は次の通りであった。

表　　　２ 熱ストレス対非熱ストレス共役体 の相対的安定度 ｐＨ３７℃、３日　　　３７℃、７日 ５．０　　　７７％／９１％＊６２％／７７％７．４　
　　６６％７１０１％　　　４６％／９２％８．０　　
　４５％／１０２％　　　１３％／１０６％＊　従来の
非置換エステルの相対活性を最初に示し、次に本発明の
オルトジメチルエステルの相対活性を示す。従って、こ
の場合、本発明のオルトジメチルエステルは９１％の相
対活性であり、これに対して従来の非置換エステルは７
７％のト百対活性を有する。活性はすべて２〜８℃の安
定度に戻して記述する。

信号対ノイズの比較 上述の非置換エステル共役体と本発明のオルトジメチル
エステルのイムノアッセイにおける信号対ノイズ（Ｓ／
Ｎ）比に対する試験をした。試験を次のように行った。

上記共役体のひとつを１００マイクロリツトル用いて、
２００ｕ９ＪのＴＳＨ標阜液（チバコーニングダイアグ
ノスティックス社、メトフィールド、マサチュセッツ州
）と共に室温で２時間インキュベートした。インキュベ
ーションは、０．　０．４　、　１．０またはＬＯＯｕ
ｌＵ／　ｍｌのＴＳＨを含有する４種の標準液で別々に
行った。第２のインキュベーションは、上記混合物に５
００ｕマイクロリツトルのヒツジ抗ＴＳＨ，ＭＡＧＩＣ
”磁気粒子共役体（チバコーニングダイアグノスティッ
クス社から入手）を添加し、次に３０分間室温に保持し
た。最初溶液から粒子を磁気分離し、溶液をデカントし
、次々に５００マイクロリツトルの水を加え、さらに磁
気分離した。洗浄した粒子をＯ、ｌ　Ｎ　ＨＮ　Ｏ３と
０．１％Ｈ２０□を含む溶液１００マイクロリツトルに
再懸濁した。上述の方法によってフラッシングと計数を
行った。その結果をＴＳＨ含有のＴＳＨ標準液対ゼロＴ
ＳＨ標準液の計数比で表に示した。

表　　　３ 共役体　　　標準液 ０．４ｕｌＵ　１．０ｕｌＵ　１００ｕｌＵ／ｄ　　／
ｄ　　／ｄ 非置換エステル　　　　　１．４　　１．９　　２０．
７オルソジメチルエステル　１．９　　２．３　　４４
．５この結果の比較は、本発明共役体が従来の共役体よ
りも信号対ノイズの比が平均して増加していることを示
している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の構造式； ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＿１はアルキル，アルケニル，アルキニル，
   またはアリール基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，ま
   たはＲ＿７は水素，アミノ，カルボキシル，ヒドロキシ
   ル，アルコキシル，ニトロまたはハライド基であり；Ｒ
   ＿４またはＲ＿８はアルコキシル，アミノ，アミド，ス
   ルホンアミド，またはスルフイド基であり；Ｒ６は次の
   置換体を示し、 Ｒ＿６＝−Ｒ＿９−Ｒ＿１０ Ｒ＿９は必須ではないが任意にアルキル，，アリール，
   またはアラルキル基であり、Ｒ−は次の ▲数式、化学式、表等があります▼ から選ばれ、ＸがＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−，ＯＳＯ＿２Ｆ
   ＾−，ハライド，ＯＳＯ＿２ＣＦ＿３＾−，ＯＳＯ＿２
   Ｃ＿４Ｆ＿９＾−，または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼であり；Ｒがアルキル， アリールまたはアラルキルであり；Ｒ＿５，Ｒ＿６，お
   よびＲ＿７のフェノキシリングの置換位置が交換できる
   ） を有する群から選ばれた多置換アリールアクリジニウム
   エステルを含む発光化合物。 　２）Ｒ＿１がメチル基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿
   ５およびＲ＿７が水素であり；Ｒ＿４およびＲ＿８がメ
   チル基であり；Ｒ＿１＿６がフェノキシリングのパラ位
   に直接結合したＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル
   基であり；ＸがＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−である特許請求の
   範囲第１項記載の発光化合物。 　３）次の構造式； ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＿１はアルキル，アルケニル，アルキニル，
   またはアリール基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ
   ＿６またはＲ＿７は水素，アミノ，カルボキシル，ヒド
   ロキシル，アルコキシル，ニトロまたはハライド基であ
   り；Ｒ＿４またはＲ＿８はアルキル，アルケニル，アル
   キニル，アリール，アルコキシル，アミノ，アミド，ス
   ルホンアミド，またはスルフィド基であり；Ｒ＿５，Ｒ
   ＿６，およびＲ＿７のフェノキシリングの置換位置が交
   換できる） を有する群から選ばれる多置換アリールアクリジニウム
   エステルを含む発光化合物。 　４）Ｒ＿１がメチル基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿
   ５，Ｒ＿６およびＲ＿７が水素であり；Ｒ＿４およびＲ
   ＿８がメチル基であり；ＸがＣＨ＿３ＳＯＦ＿４＾−で
   ある特許請求の範囲第３項記載の発光化合物。 　５）次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＿１はアルキル，アルケニル，アルキニル，
   またはアリール基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５また
   はＲ＿７は水素，アミノ，カルボキシル，ヒドロキシル
   ，アルコキシル，ニトロまたはハライド基であり；Ｒ＿
   ４またはＲ＿８はアルキル，アルケニル，アルキニル，
   アリール，アルコキシル，アミノ，アミド，スルホンア
   ミド，またはスルフィド基であり；Ｒ＿６は次の置換体
   を示し、 Ｒ＿６＝−Ｒ＿９−Ｒ＿１＿０ Ｒ＿９は必須ではないが任意にアルキル，アリール，ま
   たはアラルキル基であり、Ｒ＿１＿０は次の：▲数式、
   化学式、表等があります▼ から選ばれ、 ＸがＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−，ＯＳＯ＿２Ｆ＾−，ハライ
   ド，ＯＳＯ＿２ＣＦ＿３＾−，ＯＳＯ＿２Ｃ＿４Ｆ＿９
   ＾−，またはＯＳＯ＿２■ＣＨ＿３であり；Ｒがアルキ
   ル，アリールまたはアラルキルであり；Ｒ＿５，Ｒ＿６
   ，およびＲ＿７のフェノキシリングの置換位置が交換で
   きる） を有する群から選ばれた多置換アリールアクリジニウム
   エステルを含む発光化合物を含有し、Ｒ＿６置換体がリ
   ガンドまたは特異結合パートナーに共役結合している発
   光共役体。 　６）Ｒ＿１がメチル基であり；Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿
   ５およびＲ＿７が水素であり；Ｒ＿４およびＲ＿８がメ
   チル基であり；Ｒ＿１＿０がフェノキシリングのパラ位
   に直接結合したＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル
   基であり：ＸがＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−である特許請求の
   範囲第５項記載の発光共役体。