CN114315735B - 一种鲁米诺酯化衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种鲁米诺酯化衍生物及其制备方法与应用。本发明将鲁米诺与酰氯化合物在碱性条件下反应制备得到的鲁米诺酯化衍生物，所得鲁米诺酯化衍生物具有优异的发光性能，具体体现为发光强度增加、发光时间延长；且制备方法简单，常温常压下即可合成，不需要添加贵金属，反应廉价易得，适用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于化学合成技术领域。更具体地，涉及一种鲁米诺酯化衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
鲁米诺(3-氨基-邻苯二甲酰肼)，又名发光氨，是重要的化学发光小分子物质之一，被广泛用于自由基检测、血红素与血迹的快速鉴别。在刑事侦查中，利用含有鲁米诺和过氧化物(通常为双氧水H2O2)的发光液对血迹进行成像是血迹快速鉴别的重要方法。
虽然鲁米诺应用广泛，但存在发光强度不佳、发光时间短等缺点。为解决这一问题，常将鲁米诺与贵金属纳米材料共同使用，如中国专利申请公开了一种双功能化纳米材料，采用贵金属纳米粒子的鲁米诺类化合物进行配位得到一种双功能化纳米材料，鲁米诺的化学发光的强度有一定的增加，但仍然存在发光时间短(仅50s荧光强度就开始下降)的问题，并且该纳米材料使用了贵金属纳米粒子，价格昂贵，不适合放大生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有鲁米诺发光强度不佳、发光时间短的缺陷和不足，提供一种发光强度好、发光时间长的鲁米诺酯化衍生物。
本发明的目的是提供所述鲁米诺酯化衍生物的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种发光液。
本发明的另一目的是提供所述鲁米诺酯化衍生物在血红素检测、血迹检测或作为辣根过氧化物酶发光底物中的应用。
本发明的上述目通过以下技术方案实现：
一种鲁米诺酯化衍生物，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，R1为C1～8烷基、C1～8氘代烷基、C3～10环烷基、六元芳杂环、呋喃或氨基。
优选地，所述R1为C1～6烷基、C1～6氘代烷基、C3～8环烷基、吡啶、呋喃或氨基。
更优选地，所述R1为C1～4烷基、C1～4氘代烷基、C3～6环烷基、吡啶、呋喃或氨基。
具体地，所述R1为
本发明进一步保护鲁米诺酯化衍生物的制备方法，包括如下步骤：
将鲁米诺和碱性试剂溶解在有机溶剂中，加入反应完全后，后处理，即得，其中R1的定义与上述定义一致。
具体地，鲁米诺酯化衍生物的合成路线如下所示：
优选地，所述鲁米诺和碱性试剂的摩尔比为1：(2～5)。
优选地，所述碱性试剂包括三乙胺、二异丙基乙胺、三乙醇胺、吡啶。
优选地，所述有机溶剂包括DMSO、DMF、THF。
更优选地，所述有机溶剂包括DMF。
在DMF溶液以及碱性条件下，鲁米诺与相应的酰氯化合物能快速生成酯化产物，碱性条件下鲁米诺的二甲酰肼会发生脱质子以及重排形成烯醇式化合物。
优选地，所述与鲁米诺的摩尔比为1：(0.5～2)。
优选地，所述反应的温度为25～40℃。
优选地，所述反应的时间为2～6h。
优选地，所述后处理的方法为减压除溶剂、用快速柱色谱法纯化。
更优选地，所述快速柱色谱法的洗脱剂为体积比为(40～60)：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂。
本发明进一步保护一种发光液，包括上述鲁米诺酯化衍生物。
本发明进一步保护鲁米诺酯化衍生物在血红素检测、血迹检测或作为辣根过氧化物酶(HRP)发光底物中的应用。
将本发明制备得到的鲁米诺酯化衍生物与过氧化氢(H2O2)共同使用，H2O2在血迹中血红素的催化作用下产生超氧阴离子等活性氧自由基，在碱性条件下鲁米诺酯化衍生物与活性氧自由基快速反应形成具有过氧桥键的中间体化合物，该化合物不稳定，进一步降解形成3-氨基邻苯二甲酸，在这个过程中，化学能以光子的形式释放产生蓝色的光(如图1所示)达到检测血迹的作用。
辣根过氧化物酶(HRP)常用来标记抗体，其催化中心为血红素分子，当本发明制备得到的鲁米诺酯化衍生物、过氧化氢与辣根过氧化物酶共同使用时，辣根过氧化物酶中的血红素分子催化H2O2产生等活性氧自由基，活性氧自由基在碱性条件下与鲁米诺酯化衍生物反应，产生发光的现象达到体外诊断的作用(发光的机理与上述机理抑一致)。
由于酯键的羰基具有较强的吸电子性，烯醇酯化后会降低与O相连的C原子上电子云密度，使其跟亲核能力较强的超氧离子具有更高的反应活性，促进过氧中间体的形成，/>自由基存在寿命较短，增加自由基的利用效率能显著提高酯化鲁米诺衍生物的发光效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将鲁米诺与酰氯化合物在碱性条件下反应制备得到的鲁米诺酯化衍生物，所得鲁米诺酯化衍生物具有优异的发光性能，具体体现为发光强度增加、发光时间延长；且制备方法简单，常温常压下即可合成，不需要添加贵金属，反应廉价易得，适用于大规模生产。
附图说明
图1为鲁米诺酯化衍生物检测血迹的机理图。
图2为鲁米诺酯化衍生物(LC-1)的核磁氢谱图。
图3为鲁米诺酯化衍生物(LC-1)的核磁碳谱图。
图4为鲁米诺酯化衍生物(LC-2)的核磁氢谱图。
图5为鲁米诺酯化衍生物(LC-2)的核磁碳谱图。
图6为鲁米诺酯化衍生物(LC-3)的核磁氢谱图。
图7为鲁米诺酯化衍生物(LC-3)的核磁碳谱图。
图8为鲁米诺酯化衍生物(LC-4)的核磁氢谱图。
图9为鲁米诺酯化衍生物(LC-4)的核磁碳谱图。
图10为鲁米诺酯化衍生物(LC-5)的核磁氢谱图。
图11为鲁米诺酯化衍生物(LC-5)的核磁碳谱图。
图12为鲁米诺酯化衍生物(LC-6)的核磁氢谱图。
图13为鲁米诺酯化衍生物(LC-6)的核磁碳谱图。
图14为鲁米诺酯化衍生物(LC-7)的核磁氢谱图。
图15为鲁米诺酯化衍生物(LC-7)的核磁碳谱图。
图16为鲁米诺酯化衍生物(LC-8)的核磁氢谱图。
图17为鲁米诺酯化衍生物(LC-8)的核磁碳谱图。
图18为鲁米诺酯化衍生物(LC-10)的核磁氢谱图。
图19为鲁米诺酯化衍生物(LC-10)的核磁碳谱图。
图20为鲁米诺酯化衍生物(LC-12)的核磁氢谱图。
图21为鲁米诺酯化衍生物(LC-12)的核磁碳谱图。
图22为实施例3所得鲁米诺酯化衍生物(LC-3)的单晶结构。
图23为实施例3所得鲁米诺酯化衍生物(LC-3)的单晶数据分析。
图24为鲁米诺衍生物在血红素/H2O2体系中的发光性能图，图24中的A为发光机理，图24中的B、图24中的D为不同鲁米诺酯化衍生物的荧光光谱图，图24中的C为不同鲁米诺酯化衍生物荧光强度柱状图。
图25为实施例1所得鲁米诺酯化衍生物(LC-1)与鲁米诺对不同浓度血红素的荧光图，图25中的A为LC-1对不同浓度血红素的荧光图，图25中的B为鲁米诺对不同浓度血红素的荧光图。
图26为实施例1所得鲁米诺酯化衍生物(LC-1)在血迹成像中的应用图，图26中的A为LC-1与鲁米诺在血迹成像中应用的示意图，图26中的B为LC-1与鲁米诺在不同浓度血迹下的成像图，图26中的C为LC-1与鲁米诺在不同浓度血迹下的灰度值。
图27为实施例1、6、7所得鲁米诺酯化衍生物(LC-1、LC-6、LC-7)在辣根过氧化物酶发光体系中的应用图，图27中的A为LC-1、LC-6、LC-7的结构式，图27中的B为化合物发光强度随时间变化的动力学曲线，图27中的C为27中的B曲线下面积的积分柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1鲁米诺酯化衍生物(LC-1)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入乙酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-1(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.07(s,1H),7.53–7.48(m,1H),7.40(s,2H),6.95(dd,J＝8.3,0.8Hz,1H),6.73(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),2.40(s,3H)(图2)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ169.41,162.88,151.50,146.21,135.20,126.81,117.34,110.46,108.79,20.78(图3)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C10H9N3O3H+220.0717；Found 220.0713。
实施例2鲁米诺酯化衍生物(LC-2)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入丙酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-2(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.41(s,2H),6.96(d,J＝8.3Hz,1H),6.71(d,J＝7.6Hz,1H),2.77(q,J＝7.4Hz,2H),1.17(t,J＝7.5Hz,3H)(图4)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ172.75,162.89,151.50,146.22,135.22,126.85,117.33,110.46,108.74,26.93,9.18(图5)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C11H11N3O3H+234.0873；Found 234.0868。
实施例3鲁米诺酯化衍生物(LC-3)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入正丁酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-3(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.07(s,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.40(s,2H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),6.70–6.65(m,1H),2.71(t,J＝7.2Hz,2H),1.68(dd,J＝14.7,7.3Hz,2H),1.02–0.95(m,3H)(图6)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.86,162.88,151.51,146.21,135.23,126.86,117.33,110.46,108.65,35.21,18.19,13.78(图7)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C12H13N3O3H+248.1030；Found 248.1028。
实施例4鲁米诺酯化衍生物(LC-4)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入异丁酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-4(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),7.54–7.49(m,1H),7.41(s,2H),6.95(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),6.63(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),2.97(dt,J＝14.0,7.0Hz,1H),1.28(d,J＝7.0Hz,6H)(图8)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ175.07,162.88,151.54,146.20,135.29,126.86,117.35,110.44,108.46,33.64,19.03(图9)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C12H13N3O3H+248.1030；Found 248.1027。
实施例5鲁米诺酯化衍生物(LC-5)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入异戊酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-5(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.07(s,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.47–7.31(m,2H),6.95(dd,J＝8.3,0.6Hz,1H),6.68(dd,J＝7.6,0.7Hz,1H),2.73(t,J＝7.4Hz,2H),1.70–1.59(m,2H),1.46–1.33(m,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,3H)(图10)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.99,162.88,151.52,146.21,135.22,126.87,117.33,110.47,108.64,33.14,26.72,21.99,14.05(图11)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H15N3O3H+262.1186；Found 262.1182。
实施例6鲁米诺酯化衍生物(LC-6)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入环丙基甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-6(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),7.55–7.49(m,1H),7.41(s,2H),6.95(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),6.60(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),2.05–1.96(m,1H),1.19–1.11(m,2H),1.11–1.04(m,2H)(图12)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ173.00,162.86,151.56,146.04,135.30,126.83,117.32,110.43,108.35,12.66,9.93(图13)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C12H11N3O3H+246.0873；Found 246.0791。
实施例7鲁米诺酯化衍生物(LC-7)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-7(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.40(s,2H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(dd,J＝7.6,0.6Hz,1H),2.40–2.36(m,1H)(图14)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ169.42,162.89,151.50,146.21,135.20,126.81,117.34,110.47,108.80,20.77,20.55,20.34(图15)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C10H6D3N3O3H+223.0905；Found 223.0897。
实施例8鲁米诺酯化衍生物(LC-8)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入环己甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-8(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),7.52(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(s,2H),6.96(d,J＝7.7Hz,1H),6.63(dd,J＝7.6,0.6Hz,1H),2.77(tt,J＝10.9,3.6Hz,1H),2.03(dt,J＝18.5,6.8Hz,2H),1.80–1.70(m,2H),1.68–1.48(m,3H),1.43–1.23(m,3H)(图16)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ173.84,162.88,151.55,146.19,135.26,126.88,117.31,110.45,108.45,42.23,28.88,25.63,25.12(图17)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C15H17N3O3H+288.1343；Found 288.1340。
实施例9鲁米诺酯化衍生物(LC-10)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入呋喃甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-10(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.18(s,1H),8.18(s,1H),7.74(d,J＝3.5Hz,1H),7.49(dd,J＝20.7,12.4Hz,3H),6.97(d,J＝8.4Hz,1H),6.89–6.83(m,1H),6.66(d,J＝7.6Hz,1H)(图18)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ162.89,156.03,151.61,150.20,145.53,142.14,135.39,126.69,122.18,117.54,113.58,110.42,108.44(图19)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H9N3O4H+272.0666；Found 272.0663。
实施例10鲁米诺酯化衍生物(LC-12)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入氯化异腈盐酸盐(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-12(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.23(s,1H),8.94(dd,J＝4.4,1.7Hz,2H),8.08(dd,J＝4.4,1.7Hz,2H),7.49(dd,J＝17.3,9.2Hz,3H),6.99(dd,J＝8.4,0.8Hz,1H),6.72(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H)(图20)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ163.67,162.92,151.67,151.63,145.90,135.42,135.32,126.37,123.59,117.66,110.40,108.58(图21)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C14H10N4O3H+283.0826；Found 283.0825。对比例1鲁米诺酯化衍生物(LC-9)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入苯甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-9(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.18(s,1H),8.23–8.15(m,2H),7.86–7.77(m,1H),7.66(dd,J＝10.7,4.9Hz,2H),7.48(dd,J＝17.0,9.1Hz,3H),6.97(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),6.65(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ164.62,162.93,151.62,146.28,135.37,135.29,130.54,129.76,127.93,126.76,117.47,110.48,108.47。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C15H11N3O3H+282.0873；Found 282.0870。对比例2鲁米诺酯化衍生物(LC-11)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入2-噻吩甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-11(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.19(s,1H),8.17(ddd,J＝5.1,4.4,1.3Hz,2H),7.58–7.39(m,3H),7.37(dd,J＝5.0,3.8Hz,1H),6.98(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),6.66(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ162.91,159.92,151.62,145.81,137.09,136.82,135.40,130.53,129.61,126.73,117.52,110.45,108.37。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H9N3O3SH+288.0437；Found288.0435。
对比例3鲁米诺酯化衍生物(LC-13)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入二甲氨基甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-13(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),7.54–7.47(m,1H),7.38(s,2H),6.93(dd,J＝8.3,0.8Hz,1H),6.66(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),3.11(s,3H),2.92(s,3H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ162.88,153.38,151.42,146.63,135.12,127.50,117.11,110.54,108.70,36.86,36.71。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C11H12N4O3H+249.0982；Found 249.0980。
对比例4鲁米诺酯化衍生物(LC-14)的合成
将鲁米诺(177.16mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶解在DMF(3mL)溶液中，室温搅拌下缓慢加入二甲氨基硫代甲酰氯(1mmol)反应4小时，反应完全后，减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化(洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂)，即得LC-14(白色固体)。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.05(s,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(s,2H),6.91(d,J＝8.2Hz,1H),6.60(d,J＝7.6Hz,1H),3.37(d,J＝6.7Hz,6H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ185.06,162.92,151.39,148.51,135.00,127.67,116.86,110.54,109.18,43.30,39.23。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C11H12N4O2SH+265.0754；Found265.0750。
对比例5鲁米诺酯化衍生物(LC-15)的合成
S1.将3-氨基邻苯二甲酸(181mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶于8mL DCM中，缓慢加入乙酰氯(1mmol)，室温下搅拌反应，TLC监测直至反应完全后用2M醋酸水溶液酸化，DCM萃取浓缩，快速硅胶柱分离得化合物1(洗脱剂为甲醇：二氯甲烷1：10)；
S2.将步骤S1所得化合物1溶于3mL醋酸中加热至110℃直至完全溶解，冷却至室温后，缓慢加入30％水合肼水溶液，再加热至125℃反应2h，冷却至室温，析出白色固体，过滤，即得LC-15。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.77(s,1H),11.82(d,J＝116.5Hz,2H),8.85(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),7.84(t,J＝8.1Hz,1H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),2.16(s,3H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ169.20,161.43,151.96,141.12,135.06,126.30,120.75,118.05,114.75,25.67。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C10H9N3O3H+220.0717；Found 220.0708。
对比例6鲁米诺酯化衍生物(LC-16)的合成
S1.将3-氨基邻苯二甲酸(181mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶于8mL DCM中，缓慢加入环丙基甲酰氯(1mmol)，室温下搅拌反应，TLC监测直至反应完全后用2M醋酸水溶液酸化，DCM萃取浓缩，快速硅胶柱分离得化合物2(洗脱剂为甲醇：二氯甲烷1：10)；
S2.将步骤S1所得化合物1溶于3mL醋酸中加热至110℃直至完全溶解，冷却至室温后，缓慢加入30％水合肼水溶液，再加热至125℃反应2h，冷却至室温，析出白色固体，过滤，即得LC-16。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.09(s,1H),11.87(s,2H),8.84(dd,J＝8.3,0.9Hz,1H),7.84(t,J＝8.1Hz,1H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),1.69(p,J＝6.2Hz,1H),0.90(d,J＝6.2Hz,4H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ172.53,141.10,135.07,120.92,118.00,114.71,16.77,8.33。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C12H11N3O3H+246.0873；Found 246.0867。对比例7鲁米诺酯化衍生物(LC-17)的合成
S1.将3-羥酞酸(181mg，1mmol)和三乙胺(303.57mg，3mmol)溶于8mL DCM中，缓慢加入苯甲酰氯(1mmol)，室温下搅拌反应，TLC监测直至反应完全后用2M醋酸水溶液酸化，DCM萃取浓缩，快速硅胶柱分离得化合物3(洗脱剂为甲醇：二氯甲烷1：10)；
S2.将步骤S1所得化合物1溶于3mL醋酸中加热至110℃直至完全溶解，冷却至室温后，缓慢加入30％水合肼水溶液，再加热至125℃反应2h，冷却至室温，析出白色固体，过滤，即得LC-17。
表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.91(s,1H),11.92(d,J＝83.9Hz,2H),9.08(d,J＝8.3Hz,1H),8.08–7.99(m,2H),7.94(t,J＝8.1Hz,1H),7.63(ddd,J＝15.9,11.4,4.6Hz,4H)。
13C NMR(100MHz,DMSO)δ165.31,161.73,152.14,141.19,135.26,134.72,132.79,129.50,127.56,121.06,118.54,115.37。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C15H11N3O3H+282.0873；Found 282.0871。
结构表征：
核磁表征：将实施例1～10制备得到的鲁米诺酯化衍生物进行核磁氢谱与碳谱检测，结果如图2～21所示，数据一一对应，结构正确。
XRD单晶衍射：将实施例3制备得到的鲁米诺酯化衍生物进行XRD单晶衍射测试，如图22～23所示，环丙基甲酸酯确实存在于氨基异侧的烯醇上。其他实施例中的单晶衍射数据与实施例3的类似。
证明鲁米诺在碱性条件下与酰氯类化合物发生的酰基化反应并没有发生在3位的伯胺上，而是酰肼的质子被夺取从而形成酮-烯醇的互变异构，酰基化反应选择性的发生在与氨基异侧的烯醇上，形成相应的酯化衍生物。
实验例1血红素的化学发光检测
1.溶液的制备
发光底物溶液：分别用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置1mM鲁米诺及其衍生物溶液(A液)；
H2O2溶液：用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置1mM H2O2溶液(B液)；
Hemin溶液：用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置0.4μM氯化血红素(Hemin)溶液；
配置过程中BR缓冲液提供碱性环境。
2.测试方法
将50μL A液和50μL血红素溶液先后加入到96孔板的孔中进行混合，然后利用酶标仪的自动进样器或者手动加入100μL B液。利用酶标仪记录化学发光信号，所得数据导出成excel文件，利用Origin软件进行绘图处理。由于鲁米诺的化学发光时间短导致发光光谱不易捕捉，所以进行光谱记录时，将A液的浓度增至2mM，B液H2O2浓度增至40mM。
3.测试结果
如图24所示：鲁米诺本身与实施例1～10制备得到的鲁米诺酯化衍生物在Hemin/H2O2体系中均能产生化学发光(机理如图24中的A所示)。其中LC-1和LC-7具有最高的发光效率，其发光强度与发光时间(0-750秒)动力学曲线下积分面积分别达到鲁米诺的6.27和6.98倍；LC-2，LC-4的发光效率也明显高于鲁米诺；LC-3、LC-5、LC-6、LC-8、LC-10、和LC-12发光效率与鲁米诺持平(图24中的B，图24中的C)。
对比例1～7制备得到的鲁米诺衍生物发光较弱，其中，LC-14、LC-16和LC-17三个衍生物的发光最弱(图24中的B，图24中的C)。氨基酰胺化后会显著降低鲁米诺发光效率；N,N-二甲基硫羰基酰胺类结构自身会与自由基反应，这是LC-14发光效率低的原因之一；大位阻以及疏水性强的取代基会影响衍生物的反应性和水溶性，因此LC-9、LC-11和LC-13并没有表现出显著加强的发光效率。此外，实施例与对比例制备得到的鲁米诺衍生物的光谱峰值均在425nm附近(图24中的D)。
实验例2血红素灵敏度的检测
综合考虑发光效率、原料成本以及合成的难易程度，我们最终选择LC-1用于后续测试。
1.溶液配制
发光底物溶液：分别用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置1mM鲁米诺及LC-1溶液(A液)；
H2O2溶液：用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置1mM H2O2溶液(B液)；
Hemin溶液：用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置氯化血红素(Hemin)溶液(0.001μM、0.002μM、0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM)。
2.测试方法
将50μL A液和100μL B液加入到96孔板的孔中进行混合，然后利用排枪移液器加入50μL Hemin溶液。利用酶标仪记录化学发光信号，所得数据导出成excel文件，利用Origin软件进行绘图处理。
3.测试结果
如图25所示：LC-1在Hemin各种浓度的存在下，均表现出比鲁米诺更强的发光，且在100s后荧光强度才开始下降。因此，实验表明利用LC-1配置发光液可以更灵敏的检测血红素。
实验例3鲁米诺衍生物在血迹成像中的测试
1.溶液的制备
发光液：分别用pH为9.0的伯瑞坦-罗比森(BR)缓冲液(0.04M)配置1mM LC-1和1mM鲁米诺(A液)和1mM H2O2溶液(B液)；将A液与B液混合，分别形成LC-1发光液和鲁米诺发光液。
2.测试方法
将小鼠的新鲜血液梯度稀释(浓度为1/10、1/100、1/200、1/500、1/1000mM)，然后志愿者带上乳胶手套沾染稀释的血液后将手印拓在打印纸上，待血迹自然风干后，利用装有发光液的喷瓶对准血迹碰洒后，立即使用智能手机进行拍照，持续曝光8秒(图26中的A)。
3.测试结果
如图26所示，针对各稀释倍数的血迹，LC-1发光液在化学发光成像上都表现出明显优势。当血迹稀释1000倍时，鲁米诺发光液已经无法成像，但LC-1发光液仍然可以明显成像(图26中的B)。我们利用图像分析软件Image J对血迹成像进行定量分析。从灰度值可以看到，各个浓度的血迹成像上LC-1发光液均表现出更高的发光强度(图26中的C)。证明用LC-1配置的发光液，在同样条件下比鲁米诺本身具有明亮的化学发光和更高的灵敏度。该发光液在刑事侦查中具有较好的应用前景。
实验例4鲁米诺衍生物催化辣根过氧化物酶的测试
1.溶液的制备
发光液：用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.5)分别配置400μM鲁米诺、400μM LC-1、LC-6、LC-7溶液(A液)，LC-1、LC-6、LC-7的结构式如图27中的A所示；
H2O2溶液：用双蒸水配置20mM H2O2溶液(B液)；
辣根过氧化物酶溶液：用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.5)40ng/mL辣根过氧化物酶(HRP)溶液。
2.测试方法
在96-孔板中将100μL A液与50μL HRP溶液先混合，然后立即加入50μL B液，利用多功能酶标仪手动进样系统进样，并记录发光信号。利用Image J进行灰度值定量分析。
3.测试结果
由图27中的B可知，氘代乙酯衍生物(LC-7)比鲁米诺具有更高的发光信号。对0～600s内的动力学曲线下面积进行积分，我们可以看到LC-7对应的数值明显大于其他几个分子(图27中的C)。LC-1和LC-6的积分面积也略大于鲁米诺，但是与LC-7差距较大。结果表明，该类酯化衍生物可以像鲁米诺一样作为HRP的发光底物，且氘代乙酯衍生物的发光效率更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种鲁米诺酯化衍生物，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
其中，R1为C1~6烷基、C1~6氘代烷基、C3~8环烷基、吡啶或呋喃。
2.根据权利要求1所述鲁米诺酯化衍生物，其特征在于，所述R1为C1~4烷基、C1~4氘代烷基、C3~6环烷基、吡啶或呋喃。
3.权利要求1或2所述鲁米诺酯化衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将鲁米诺和碱性试剂溶解在DMF中，加入反应完全后，后处理，即得，其中R1的定义与权利要求1或2定义一致；
其中，所述鲁米诺和碱性试剂的摩尔比为1：（2~5），所述碱性试剂为三乙胺，所述与鲁米诺的摩尔比为1：1。
4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述反应的时间为2~6 h。
5.一种发光液，其特征在于，包括权利要求1或2所述鲁米诺酯化衍生物。
6.权利要求1或2所述鲁米诺酯化衍生物以非治疗目的在血红素检测、血迹检测或作为辣根过氧化物酶发光底物中的应用。
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