CN113533279A - 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 - Google Patents
一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113533279A CN113533279A CN202110799453.5A CN202110799453A CN113533279A CN 113533279 A CN113533279 A CN 113533279A CN 202110799453 A CN202110799453 A CN 202110799453A CN 113533279 A CN113533279 A CN 113533279A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enrofloxacin
- dnps
- dipeptide
- aptamer
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Abstract
本发明涉及一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,该方法具体步骤如下:(1)制备二肽荧光纳米微球;(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物;(3)制备磁性Fe3O4微球;(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物;(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4‑Apt混合;(6)将步骤(2)中合成的DNPs‑cDNA与步骤(5)中Fe3O4‑Apt混合,测定上清液荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。本发明用于检测方法的二肽荧光纳米微球制备方法简单、环境友好、荧光信号稳定;检测方法灵敏度高、抗干扰能力强、应用前景巨大。
Description
技术领域
本发明属于生物、材料、生物检测等交叉领域,主要涉及二肽荧光纳米微球制备技术,特别涉及一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法。
背景技术
自组装肽荧光纳米材料因其组装过程可控,生物相容性良好、化学可修饰性强、稳定性强、环境友好等优点成为目前检测方法中最具潜力的荧光标记材料。目前,肽荧光纳米材料主要基于具有荧光特性的氨基酸组成的寡肽制备而成。与传统的有机染料和量子点荧光标记材料相比,上转换发光材料以其荧光效率高、稳定性好、分辨率高、灵敏度高、毒性小、机体损伤小等特点,是理想的荧光探针标记物。
核酸适配体是一类人工合成配体,是利用体外筛选技术筛选出的单链DNA或RNA片段,对多数的靶物都具有较强的亲和力。与传统抗体相比,核酸适配体在纳摩尔到微摩尔浓度下对物质具有相似的亲和力,具有目标多样性,稳定性高,成本低等特点,是荧光传感器中潜力巨大的特异性新型分子识别元件。
磁性纳米颗粒拥有优异的磁分离性能,已广泛应用于生物大分子的分离与纯化,利用磁性微球的磁分离特点结合核酸适配体的特异性识别功能,开发新型荧光检测方法,可大大简化检测步骤,缩短检测时间。
第三代氟喹诺酮类抗生素恩诺沙星(ENR)抗菌广谱、高效,广泛应用于畜禽、水产等养殖过程中的疾病预防和治疗。然而,不规范或违法使用ENR造成的动物源食品药物残留极大损害了人体健康,还对环境造成了污染,提高了细菌的耐药性。因此,建立一种简单、灵敏、抗干扰的荧光检测方法具有重要意义。
发明内容
发明目的:
本发明提出一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,旨在利用小分子生物配体二肽制备荧光纳米微球作为荧光信号元件,利用特异性核酸适配体为分子识别元件建立一种检测恩诺沙星的方法,该方法过程简单,抗干扰能力强,具有很好的应用前景。
技术方案:
一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其步骤如下:(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球:
将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合,混合均匀后加入水热反应釜内在70-80℃加热反应55-65min,反应结束后在70-80℃温度下干燥获得DNPs,干燥后的DNPs复溶于水中,DNPs浓度为0.1mg/mL,用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联,色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1:1.5-2.0;溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9:1;
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物:
向步骤(1)合成的DNPs溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和cDNA,振荡条件下反应10~12h,反应结束后透析24-26h得到DNPs-cDNA;所述的DNPs、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积质量比为0.8-1.2mL:4mg:4mg;DNPs和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL:0.001μmol;
(3)制备磁性Fe3O4微球;
将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠混合,加入一定体积的乙二醇,搅拌至固体全部溶解,将制得的溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h,反应完成后,自然冷却至室温,取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe3O4微球;六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g:30-40mL;
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物;
将步骤(3)制备的Fe3O4分散于磷酸盐缓冲液中,Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL;超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h,Fe3O4与戊二醛(25%)的质量体积比为10mg:1.25mL,磷酸盐缓冲液清洗3-6次除去戊二醛,再次分散于磷酸盐缓冲液,Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL,加入恩诺沙星核酸适配体反应12-16h,Fe3O4与恩诺沙星核酸适配体的质量摩尔比为10mg:0.00015μmol,除去未反应的恩诺沙星核酸适配体后用牛血清白蛋白封闭1h,磷酸盐缓冲液清洗3次去除未吸附的牛血清白蛋白后得到Fe3O4-Apt;
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合;
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合,37℃孵育15-20min,磁铁辅助分离去除上清液,用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次;
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合;
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液,37℃孵育15-20min,测定上清液的荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。
步骤(1)所述的制备的DNPs直径2.5-3.0nm。
步骤(2)透析使用的透析袋的分子量截取值为7000D。
步骤(2)中cDNA为氨基化的cDNA,序列为5'-GTG TTA GCC TAG CCC CCT GAT-NH2-3'。
步骤(3)所述的1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠的质量比为6.5-7.5:1.0:2.0;水热反应釜反应温度为198℃;用无水乙醇和去离子水反复清洗的次数为5-8次;水热反应釜外壳为不锈钢,内胆为聚四氟乙烯。
步骤(4)所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4;Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL;Fe3O4与25%戊二醛的质量体积比为10mg:1.25mL;Fe3O4与Apt的质量摩尔比为10mg:0.00015μmol。
核酸适配体为氨基化修饰的恩诺沙星核酸适配体,序列为5'-CCC ATC AGG GGGCTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-NH2-3'。
优点及效果:
以二肽荧光纳米微球为荧光信号,适配体为分子识别元件,结合磁性Fe3O4适宜的操作性,建立的恩诺沙星荧光检测方法抗干扰能力强、灵敏度高、生物相容性好、环境友好、操作简单,适合实际样品中恩诺沙星的荧光快速测定。
附图说明
图1为色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的透射电镜图。图中显示:色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的直径约2.5-3.0nm。
图2为不同恩诺沙星浓度下该检测方的荧光光谱图。随着恩诺沙星浓度的增大荧光强度不断增强,可说明该发明建立的检测方法对目标物恩诺沙星具有较好的识别行为。
图3为一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法的标准曲线图。由图3可以看到,目标物恩诺沙星的浓度与荧光信号增强程度ΔF在0-10ng/mL范围内呈线性关系,线性方程为ΔF=95.1539C+37.4452,相关系数为0.9738,灵敏度为0.37ng/mL。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细的说明:
本发明将核酸适配体及互补链、磁性材料与肽荧光纳米材料联合,结合核酸适配体的高特异性与肽纳米材料荧光检测技术的高灵敏性,设计一种利用二肽荧光纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,该检测方法抗干扰能力强、灵敏度高、生物相容性好、环境友好、操作简单,具有广阔的应用前景。
一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,是以色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球、恩诺沙星核酸适配体、适配体互补链、磁性Fe3O4微球为材料检测的恩诺沙星检测方法,其制备步骤如下:
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs):
将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合,混合均匀后70-80℃加热反应55-65min,反应结束后在70-80℃干燥箱中干燥获得DNPs,干燥后的DNPs复溶于水中,DNPs水溶液中DNPs浓度为0.1mg/mL,DNPs水溶液用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。所述的色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1:1.5-2.0;溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9:1;所使用的水为去离子水;
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA):
向步骤(1)合成的DNPs溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和cDNA,振荡条件下反应10~12h,反应结束后将反应液转移至透析袋中透析24-26h得到DNPs-cDNA。所述的DNPs、EDC和NHS的体积质量比为0.8-1.2mL:4mg:4mg;DNPs和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL:0.001μmol;所述的cDNA氨基化的序列为5'-GTG TTA GCC TAG CCC CCT GAT-NH2-3';
(3)制备磁性Fe3O4微球;
将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠置于烧杯中,加入一定体积的乙二醇,搅拌至固体全部溶解的混合溶液,将制得的混合溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h,反应完成后,自然冷却至室温,取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗,至清洗液为中性,后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe3O4微球;六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g:30-40mL;
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt);
将步骤(3)制备的磁性Fe3O4微球分散于磷酸盐缓冲液(PBS)中,超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h,PBS清洗3-6次除去戊二醛,再次分散于PBS后加入恩诺沙星核酸适配体(Apt)反应12-16h,除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h,PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。所述的恩诺沙星核酸适配体氨基化的序列为5'-CCC ATC AGGGGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-NH2-3';
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合;
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合,37℃孵育15-20min,磁铁辅助分离去除上清液,用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次。
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合;
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液,37℃孵育15-20min,测定上清液中的荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。
步骤(1)所述的制备的DNPs直径约2.5-3.0nm。图1为色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的透射电镜图。图中显示:色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的直径约2.5-3.0nm。增大了反应的表面积。
步骤(2)所述的透析袋的分子量截取值为7000D。
步骤(3)所述的1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠的质量比为6.5-7.5:1.0:2.0;水热反应釜反应温度为198℃;用无水乙醇和去离子水反复清洗的次数为5-8次;水热反应釜外壳为不锈钢,内胆为聚四氟乙烯。
步骤(4)所述的PBS的pH为7.4;Fe3O4与PBS的质量体积比为2mg:1mL;Fe3O4与戊二醛(25%)的质量体积比为10mg:1.25mL;Fe3O4与Apt的质量摩尔比为10mg:0.00015μmol。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs):
取900μL含有1mg的色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与100μL含有1.5mg的氯化锌水溶液混合,混合均匀后70℃加热反应55min,反应结束后在70℃干燥箱中干燥获得DNPs,干燥后的DNPs复溶于2mL水中,DNPs浓度为0.1mg/mL,用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA):
取0.8mLDNPs溶液中分别加入400μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(10mg/mL)、400μL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液(10mg/mL)和100μL的cDNA溶液(10μmol/L),振荡条件下反应10h,反应结束后将反应液转移至7000D的透析袋中透析24h,得到DNPs-cDNA。
(3)制备磁性Fe3O4微球;
将6.5g的1,6-己二胺、1.0g的六水合三氯化铁和2.0g的无水乙酸钠置于烧杯中,加入30mL的乙二醇,搅拌至固体全部溶解,将制得的溶液置于水热反应釜中于198℃加热反应6h,反应完成后,自然冷却至室温,取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗5次后于60℃下真空干燥10h制得磁性Fe3O4微球。
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt);
取10mg的Fe3O4分散于5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH为7.4),超声分散均匀后加入1.25mL的戊二醛溶液(25%)反应2h,PBS清洗3次除去戊二醛,再次分散于PBS后加入15μL的恩诺沙星核酸适配体(Apt)溶液(10μmol/L)反应12h,除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h,PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合;
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合,37℃孵育15-20min,磁铁辅助分离去除上清液,用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次;
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合;
向步骤(5)Fe3O4-Apt中加入DNPs-cDNA溶液,37℃孵育15-20min,测定上清液中的荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。
实施例2
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs):
取900μL含有1mg的色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与100μL含有2.0mg的氯化锌水溶液混合,混合均匀后80℃加热反应60min,反应结束后在80℃干燥箱中干燥获得DNPs,干燥后的DNPs复溶于2mL水中,DNPs浓度为0.1mg/mL,用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA):
取1.2mLDNPs溶液中分别加入400μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(10mg/mL)、400μL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液(10mg/mL)和100μL的cDNA溶液(10μmol/L),振荡条件下反应12h,反应结束后将反应液转移至7000D的透析袋中透析26h,得到DNPs-cDNA。
(3)制备磁性Fe3O4微球;
将7.5g的1,6-己二胺、1.0g的六水合三氯化铁和2.0g的无水乙酸钠置于烧杯中,加入40ml的乙二醇,搅拌至固体全部溶解,将制得的溶液置于水热反应釜中于198℃加热反应8h,反应完成后,自然冷却至室温,取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗5次后于60℃下真空干燥12h制得磁性Fe3O4微球。
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt);
取10mg的Fe3O4分散于5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH为7.4),超声分散均匀后加入1.25mL的戊二醛溶液(25%)反应4h,PBS清洗5次除去戊二醛,再次分散于PBS后加入15μL的恩诺沙星核酸适配体(Apt)溶液(10μmol/L)反应14h,除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h,PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合;
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合,37℃孵育15-20min,磁铁辅助分离去除上清液,用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次;
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合;
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液,37℃孵育15-20min,测定上清液中的荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。
图2为不同恩诺沙星浓度下该检测方法的荧光光谱图。随着恩诺沙星浓度的增大荧光强度不断增强,可说明该发明建立的检测方法对目标物恩诺沙星具有较好的识别行为。
图3为一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法的标准曲线图。由图3可以看到,目标物恩诺沙星的浓度与荧光信号增强程度ΔF在0-10ng/mL范围内呈线性关系,线性方程为ΔF=95.1539C+37.4452,相关系数为0.9738,灵敏度为0.37ng/mL。
实施例3
鸡肉和鳗鱼样品经以下处理方法处理后,采用上述检测方法检测结果见表1。
鸡肉:确称取5g鸡肉糜样品,置于50mL离心管中,加入10mL乙腈震荡混匀,超声提取后离心,取上清液,残渣再次加入10mL乙腈,重复上述方法提取,获得两次的上清液,合并两次上清液,将其置于旋转蒸发仪中50℃旋转蒸发20min,蒸干后用PBS缓冲液溶解,备用。
鳗鱼:鳗鱼去皮取肌肉部分制成肉糜,置于冰箱储藏备用。称取5g样品,放入50mL离心管中,加入25mL乙腈,均质后离心,分离上清液,残渣再加入10mL乙腈,重复上述步骤三次,获得三次的上清液,将三次上清液合并,定容至40mL,摇匀后量取10mL提取液,加入正己烷振摇脱脂,然后置于分液漏斗中,充分静置,取下层乙腈层置于烧瓶中,50℃蒸干,用PBS缓冲液溶解,备用。
表1鸡肉、鳗鱼样品中ENR的检测
从表1中可知样品的添加回收率为84.36-96.43%,相对标准偏差为1.19-5.84%。说明本发明方法的稳定性和回收率好。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgttagcct agccccctga t 21
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccatcaggg ggctaggcta acacggttcg gctctctgag cccgggttat ttcaggggga 60
Claims (7)
1.一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:其步骤如下:
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球:
将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合,混合均匀后加入水热反应釜内在70-80℃加热反应55-65min,反应结束后在70-80℃温度下干燥获得DNPs,干燥后的DNPs复溶于水中,DNPs浓度为0.1mg/mL,用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联,色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1:1.5-2.0;溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9:1;
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物:
向步骤(1)合成的DNPs溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和cDNA,振荡条件下反应10~12h,反应结束后透析24-26h得到DNPs-cDNA;所述的DNPs、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积质量比为0.8-1.2mL:4mg:4mg;DNPs和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL:0.001μmol;
(3)制备磁性Fe3O4微球;
将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠混合,加入一定体积的乙二醇,搅拌至固体全部溶解,将制得的溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h,反应完成后,自然冷却至室温,取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe3O4微球;六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g:30-40mL;
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物;
将步骤(3)制备的Fe3O4分散于磷酸盐缓冲液中,Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL;超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h,Fe3O4与戊二醛(25%)的质量体积比为10mg:1.25mL,磷酸盐缓冲液清洗3-6次除去戊二醛,再次分散于磷酸盐缓冲液,Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL,加入恩诺沙星核酸适配体反应12-16h,Fe3O4与恩诺沙星核酸适配体的质量摩尔比为10mg:0.00015μmol,除去未反应的恩诺沙星核酸适配体后用牛血清白蛋白封闭1h,磷酸盐缓冲液清洗3次去除未吸附的牛血清白蛋白后得到Fe3O4-Apt;
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合;
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合,37℃孵育15-20min,磁铁辅助分离去除上清液,用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次;
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合;
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液,37℃孵育15-20min,测定上清液的荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:步骤(1)所述的制备的DNPs直径2.5-3.0nm。
3.根据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:步骤(2)透析使用的透析袋的分子量截取值为7000D。
4.据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:步骤(2)中cDNA为氨基化的cDNA,序列为5'-GTG TTA GCC TAG CCC CCT GAT-NH2-3'。
5.据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:步骤(3)所述的1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠的质量比为6.5-7.5:1.0:2.0;水热反应釜反应温度为198℃;用无水乙醇和去离子水反复清洗的次数为5-8次;水热反应釜外壳为不锈钢,内胆为聚四氟乙烯。
6.据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:步骤(4)所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4;Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg:1mL;Fe3O4与25%戊二醛的质量体积比为10mg:1.25mL;Fe3O4与Apt的质量摩尔比为10mg:0.00015μmol。
7.据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,其特征在于:核酸适配体为氨基化修饰的恩诺沙星核酸适配体,序列为5'-CCC ATC AGGGGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-NH2-3'。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110799453.5A CN113533279B (zh) | 2021-07-15 | 2021-07-15 | 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110799453.5A CN113533279B (zh) | 2021-07-15 | 2021-07-15 | 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113533279A true CN113533279A (zh) | 2021-10-22 |
CN113533279B CN113533279B (zh) | 2022-07-29 |
Family
ID=78099366
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110799453.5A Active CN113533279B (zh) | 2021-07-15 | 2021-07-15 | 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113533279B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116031036A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-28 | 北京工商大学 | 一种负载荧光肽的磁性纳米材料及其制备方法和应用 |
Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993000897A1 (en) * | 1991-07-12 | 1993-01-21 | Warner-Lambert Company | Cholecystokinin antagonists useful in the treatment of panic attacks |
US20070054873A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-08 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Glucocorticoid modulation of nucleic acid-mediated immune stimulation |
CN101173058A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-05-07 | 上海交通大学 | 分子印迹聚合物微球的制备方法及其分离恩诺沙星的方法 |
CN102023210A (zh) * | 2009-09-21 | 2011-04-20 | 北京中德大地食品安全技术开发有限责任公司 | 检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法 |
CN105044365A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 天水师范学院 | 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法 |
EP2975391A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Peptisyntha Sa | Chemosensor, its method of manufacture, and a method for the selective detection of analytes |
CN105911042A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-08-31 | 吉林大学 | 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素 |
US20160272960A1 (en) * | 2014-10-14 | 2016-09-22 | Halozyme, Inc. | Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same |
CN106084114A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-11-09 | 渤海大学 | 一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法 |
CN107987126A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-04 | 哈尔滨工业大学 | 4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物及其合成方法和应用 |
CN111004804A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-04-14 | 中国海洋大学 | 一种用于检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用 |
CN111257397A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-06-09 | 烟台大学 | 一种用于恩诺沙星检测的印迹电致发光传感器的制备方法 |
KR20200117266A (ko) * | 2019-04-03 | 2020-10-14 | 이화여자대학교 산학협력단 | 올리고펩타이드를 이용한 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법 |
CN112394053A (zh) * | 2019-08-16 | 2021-02-23 | 吉林师范大学 | 超灵敏sers柔性复合膜制备方法及用于检测水体中盐酸恩诺沙星 |
CN112386584A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-02-23 | 华中农业大学 | 一种细菌响应性兽用恩诺沙星复合纳米系统及其制备方法 |
CN112505024A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-03-16 | 常州大学 | 检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法 |
-
2021
- 2021-07-15 CN CN202110799453.5A patent/CN113533279B/zh active Active
Patent Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993000897A1 (en) * | 1991-07-12 | 1993-01-21 | Warner-Lambert Company | Cholecystokinin antagonists useful in the treatment of panic attacks |
US20070054873A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-08 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Glucocorticoid modulation of nucleic acid-mediated immune stimulation |
CN101173058A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-05-07 | 上海交通大学 | 分子印迹聚合物微球的制备方法及其分离恩诺沙星的方法 |
CN102023210A (zh) * | 2009-09-21 | 2011-04-20 | 北京中德大地食品安全技术开发有限责任公司 | 检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法 |
EP2975391A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Peptisyntha Sa | Chemosensor, its method of manufacture, and a method for the selective detection of analytes |
US20160272960A1 (en) * | 2014-10-14 | 2016-09-22 | Halozyme, Inc. | Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same |
CN105044365A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 天水师范学院 | 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法 |
CN106084114A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-11-09 | 渤海大学 | 一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法 |
CN105911042A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-08-31 | 吉林大学 | 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素 |
CN107987126A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-04 | 哈尔滨工业大学 | 4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物及其合成方法和应用 |
KR20200117266A (ko) * | 2019-04-03 | 2020-10-14 | 이화여자대학교 산학협력단 | 올리고펩타이드를 이용한 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법 |
CN112394053A (zh) * | 2019-08-16 | 2021-02-23 | 吉林师范大学 | 超灵敏sers柔性复合膜制备方法及用于检测水体中盐酸恩诺沙星 |
CN111004804A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-04-14 | 中国海洋大学 | 一种用于检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用 |
CN111257397A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-06-09 | 烟台大学 | 一种用于恩诺沙星检测的印迹电致发光传感器的制备方法 |
CN112386584A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-02-23 | 华中农业大学 | 一种细菌响应性兽用恩诺沙星复合纳米系统及其制备方法 |
CN112505024A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-03-16 | 常州大学 | 检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
AMY V. HALL: "Properties and Applications of Stimuli-Responsive Diacetylenes", 《CRYSTAL GROWTH & DESIGN》 * |
刘若冰: "基于核酸适配体的AccuBlue荧光法检测动物食品中的恩诺沙星", 《食品科学》 * |
高雪梅: "恩诺沙星淀粉微球的制备及缓释性能的研究", 《动物保健品》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116031036A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-28 | 北京工商大学 | 一种负载荧光肽的磁性纳米材料及其制备方法和应用 |
CN116031036B (zh) * | 2022-12-23 | 2023-12-01 | 北京工商大学 | 一种负载荧光肽的磁性纳米材料及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113533279B (zh) | 2022-07-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wei et al. | Ratiometric method based on silicon nanodots and Eu3+ system for highly-sensitive detection of tetracyclines | |
Bogdan et al. | Carbohydrate-coated lanthanide-doped upconverting nanoparticles for lectin recognition | |
CN106970061B (zh) | 碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法 | |
EP1469989B1 (en) | Amine functionalized superparamagnetic nanoparticles for the synthesis of bioconjugates | |
CN108998012B (zh) | 一种蓝色荧光量子点及其制备方法和铜离子检测应用 | |
KR101097882B1 (ko) | 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법 | |
AU2020205292B2 (en) | Biosensor for detection of salmonella typhimurium and its application | |
Chen et al. | Indirect immunofluorescence detection of E. coli O157: H7 with fluorescent silica nanoparticles | |
CN113533279B (zh) | 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 | |
CN104146964B (zh) | 一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用 | |
CN108267572A (zh) | 一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法 | |
CN110118759B (zh) | 一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法 | |
CN112881352B (zh) | 用于沙门氏菌检测和消杀的核酸适配体-量子点生物传感器、其制备方法及应用 | |
CN112924695B (zh) | 基于dna四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用 | |
CN112390786B (zh) | 一种具有aie特性的荧光和磁共振造影信号同时增强的两亲性分子、纳米颗粒及制备方法与应用 | |
CN114460054B (zh) | 一种量子点-MXene荧光传感器及其制备方法和应用 | |
CN113388616B (zh) | 特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法 | |
CN109100340B (zh) | 一种硫化镉量子点修饰的可植入传感器的制备方法 | |
CN107722968B (zh) | 一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法 | |
CN112980437A (zh) | 一种氮硫掺杂高效红光发射的碳点及制备方法和应用 | |
US11040118B2 (en) | In-vivo reactive species imaging | |
CN113804665B (zh) | 一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器及其制备方法和应用 | |
CN114324279B (zh) | 伏马毒素b1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用 | |
WO2001026673A1 (en) | Antibiotic-metal complex and methods | |
Nekounam et al. | Application of functional magnetic nanoparticles for separation of target materials: a review |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |