CN104830317B

CN104830317B - 一种硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN104830317B
Application number: CN201510239407.4A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 任明光; 邓贝贝
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2035-05-11
Also published as: CN104830317A

Abstract

本发明公开了一种硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该探针结构式如下：该探针的合成只需要三步就可以完成，且后处理过程相对简单；实现了硫化氢分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。该探针可作为显示水溶液中和生物细胞内硫化氢分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的硫化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

硫化氢 (H₂S) 在调节人的生理机能方面起着极其重要的作用，硫化氢可参与血红蛋白改变，参与体内亚硝基类化合物的还原，调节体内多种酶的功能等。硫化氢已被证明与众多疾病有着紧密关系，例如调节正常肝脏以及肝硬病变化肝脏中的微血管循环；硫化氢还具有高效的调节心肌收缩力，舒张血管，平稳双向的调节血压。硫化氢能够有效清除过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸、过氧亚硝基等; 实验表明硫化氢能够有效地降低AP诱导的神经细胞毒性。硫化氢与FPG表现为负比例关系，升高二型糖尿病病人硫化氢浓度也许有助于降血糖。所以对生物体内硫化氢的检测意义极其重要。

H₂S作为一种人体内的信号分子，其浓度变化较快，所以检测硫化氢的荧光探针需要一定的响应速度，以达到对生物体系硫化氢进行实时检测的目的。谷胱甘肽在人体内有着重要的作用，其在肝脏中浓度达到5 mmol/L，而谷胱甘肽具有和硫化氢性质相似的巯基，极易影响探针对生物体系内硫化氢的检测，同时生物体系内还有多种阴离子，都可能对探针的效果产生影响，所以探针必须具有一定的选择性。

生物体内存在大量的不同类型的还原剂，在其他干扰离子或分子存在的条件下，专一性的对体内硫化氢进行识别，需要探针分子具有较好的抗干扰性。然而目前现有的硫化氢探针响应时间慢并且在生物体内的选择专一性不是很好，本专利通过分子设计，通过电子效应来提高化合物对硫化氢的响应速度。在反应位点附近设置位阻基团，通过位阻效应的方式来提高探针的选择专一性。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快和较高选择性的硫化氢分子荧光探针。

本发明还提供了上述硫化氢分子荧光探针的制备方法。

本发明还提供了上述硫化氢分子荧光探针的应用。

本发明采用以下技术方案：

一种硫化氢分子荧光探针，其特征在于，探针分子式为C₃₅H₄₀BF₂IN₄，结构式如下：

。

上述硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将对二甲胺基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯与三氟化硼乙醚反应得到化合物1；

2）三氯氧磷与化合物1反应得到化合物2；

3）将化合物2与1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物反应得到目标化合物硫化氢分子荧光探针FP-H₂S。

上述硫化氢分子荧光探针的合成路线如下：

所述步骤1）是采用下述方法完成：将1eq对二甲胺基苯甲醛与2eq 2，4-二甲基吡咯溶于二氯甲烷中，三氟乙酸作为催化剂，在氮气条件下反应过夜，然后再缓慢加入1eq的溶于二氯甲烷中的DDQ，室温下反应10min后加入5eq三乙胺室温搅拌30min，将反应体系置入冰水中，再加入5eq三氟化硼乙醚，室温下反应过夜，反应液经减压旋干溶剂后用乙酸乙酯溶解，再用水、饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥、减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到化合物1。

上述硅胶柱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：石油醚=2:1。

所述步骤2）是采用下述方法完成：氮气保护，冰浴条件下三氯氧磷逐滴与DMF混合，室温下搅拌30 min，将1 eq化合物1溶于1，2-二氯乙烷溶液中，并将其加入到上述反应液中，常温反应1h，再加热至60℃反应3 h，将反应液冷却至室温，倒入50 mL冰的NaHCO3溶液后经萃取、干燥、减压旋干得到粗产品再用柱色谱分离提纯得到化合物2。

上述柱色谱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=50:1。

上述萃取溶剂为二氯甲烷。

所述步骤3）是采用下述方法完成：将1eq化合物2与1eq 的1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物在无水乙醇中，氮气保护，加热回流反应24小时，反应产物减压旋干后得到粗产品用二氯甲烷溶解，乙醚析出固体后减压过滤，柱色谱分离后得到目标化合物硫化氢分子荧光探针FP-H₂S。

上述柱色谱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=10:1。

所述的硫化氢分子荧光探针的应用，其特征在于，用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、目视定性检测、细胞成像检测。

本发明的优点：（1）探针的合成只需要三步就可以完成，且后处理过程相对简单；（2）本发明实现了硫化氢分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内硫化氢分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的硫化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例一中探针FP-H₂S的¹H NMR图谱；

图2是探针FP-H₂S随硫氢化钠的加入荧光谱图的变化情况；

图3是探针FP-H₂S对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图4是探针FP-H₂S对不同离子和分子的选择性柱状图数据；

图5是探针FP-H₂S溶液在NaHS加入前后溶液颜色的变化；

图6是探针FP-H₂S溶液在NaHS加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化；

图7是探针FP-H₂S应用与细胞中对外源性硫化氢进行荧光成像，其中a）探针浓度为5μM加入到SiHa细胞中培养30min后明场图，b) NaHS加入前荧光成像图，c）NaHS 20μM加入后5 min 后的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

硫化氢分子荧光探针的制备

（1）化合物1的合成：

250 ml三口瓶中，二甲胺基苯甲醛（1.57g，10.54mmol, 1eq）与2,4-二甲基吡咯（2.0g，21.08mmol, 2eq）溶于120ml二氯甲烷中，抽真空通氮气三次后，加入一滴三氟乙酸做催化剂，在室温搅拌下过夜，将二氯二氰基苯醌DDQ（2.6g，10.54mmol, 1eq）溶在15 ml二氯甲烷中，向反应体系中缓慢加入，加入完全后在室温反应10 min后，加入12ml 三乙胺，在室温搅拌30min，将反应体系置入冰水中，加入12ml 三氟化硼乙醚，在室温下搅拌过夜。用TCL板检测反应，反应完全后，减压旋干溶剂后用200ml 乙酸乙酯溶解，用水100ml*3洗涤，用饱和食盐水100ml*1洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=2:1，产率为30%。

（2）化合物2的合成：

取1mL无水DMF于烧瓶中，在冰浴条件下逐滴加入1 mL POCl₃，氮气保护。滴加完毕常温搅拌30 min。将化合物1（500 mg，1.36 mmol, 1 eq）溶于1,2-二氯乙烷溶液中，并将其加入到上述溶液中，常温反应1h，再加热60℃反应3 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，倒入50 mL冰的NaHCO₃溶液中，用二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥。减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇=50:1，产率为45.6%。

（3）目标化合物FP-H₂S的合成：

化合物2（200mg，0.51mmol, 1eq）与1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物（化合物3，160 mg，0.51mmol, 1eq）溶于50 mL绝对无水乙醇中，氮气保护，加热回流，反应24 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压旋干溶剂得粗产品，用二氯甲烷溶解，将该溶液逐滴加入到50mL乙醚中，并有固体析出。减压过滤，用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇=10:1，真空干燥，得到产品。产率为60%。1H-NMR (400MHz, CDCl₃) δ8.29 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.83 – 7.69 (m, 2H), 7.69– 7.53 (m, 2H), 7.19 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 14.3, 12.5 Hz, 2H),6.40 (s, 1H), 4.52 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.08 (s,4H), 2.88 (s, 2H), 2.64 (d, J = 9.7 Hz, 2H), 1.91 – 1.77 (m, 6H), 1.65 (s,2H), 1.54 (t, J = 7.3 Hz, 2H). 该探针的¹H NMR图谱见图1。

实施例2

化合物FP-H₂S硫化氢荧光探针随NaHS加入当量的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的FP-H₂S硫化氢荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，制成1mmol/L 储备液。从储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，加入不同当量（0-80eq）的NaHS标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）与DMF体积比为1:1的溶液稀释至3mL，以410nm为激发光测量其荧光性质。荧光光谱如图2 所示。由图2可见，随着NaHS加入当量的增加荧光逐渐增强。

实施例3

化合物FP-H₂S荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例2 中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液（Cl^-、CO₃ ^2-、GSH、HCO₃ ^-、Br^-、I^-、N₂H₄、PO₄ ^2-、S₂O₃ ^2-、F^-、HPO₄ ^-、HSO₃ ^-、NO₂ ^-、ACO₂ ^-、NH₃、NO₃ ^2-、SO₄ ^2-），其中一个加入等摩尔量的硫氢化钠标准溶液，30min 后以410nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3 和图4 可以发现，其他金属离子对化合物FP-H₂S的荧光几乎没有影响，而硫氢化钠溶液的加入使化合物FP-H₂S的荧光显著增强。

实施例4

化合物FP-H₂S荧光探针对硫化氢的可视化检测

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的样品管当中，加入80摩尔量的硫氢化钠标准溶液如图5所示，硫氢化钠可以使合物FP-H₂S荧光探针的PBS：DMF体积比为1:1的缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从暗红色变成浅红色。伴随着紫外灯下肉眼可视的硫化氢诱导荧光探针发出明亮的黄色荧光（图6），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5

化合物FP-H₂S荧光探针对细胞外源性硫化氢荧光成像

我们将本发明探针应用与SiHa细胞中对外源性的硫化氢进行荧光成像应用（图7）具体操作步骤如下：将5μM探针DMF溶液加入到育有SiHa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30 min后用共聚焦显微镜进行成像。首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓。然后用蓝光进行激发观察在未加入NaHS前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。向体系中加入NaHS 20μM的水溶液后，等待5min后在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出，说明此荧光探针可以对外源性的硫化氢进行荧光成像。

Claims

1.一种硫化氢分子荧光探针，其特征在于，探针分子式为C₃₅H₄₀BF₂IN₄，结构式如下：

。

2.一种权利要求1所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将对二甲胺基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯与三氟化硼乙醚反应得到化合物1，其结构式如下：

；

2）三氯氧磷与化合物1反应得到化合物2，其结构式如下：

；

3.根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1）是采用下述方法完成：将1eq对二甲胺基苯甲醛与2eq 2，4-二甲基吡咯溶于二氯甲烷中，三氟乙酸作为催化剂，在氮气条件下反应过夜，然后再缓慢加入1eq的溶于二氯甲烷中的DDQ，室温下反应10min后加入5eq三乙胺室温搅拌30min，将反应体系置入冰水中，再加入5eq三氟化硼乙醚，室温下反应过夜，反应液经减压旋干溶剂后用乙酸乙酯溶解，再用水、饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥、减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到化合物1。

4.根据权利要求3所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：石油醚=2:1。

5.根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）是采用下述方法完成：氮气保护，冰浴条件下三氯氧磷逐滴与DMF混合，室温下搅拌30 min，将1 eq化合物1溶于1，2-二氯乙烷溶液中，并将其加入到上述反应液中，常温反应1h，再加热至60℃反应3 h，将反应液冷却至室温，倒入50 mL冰的NaHCO₃溶液后经萃取、干燥、减压旋干得到粗产品再用柱色谱分离提纯得到化合物2。

6.根据权利要求5所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述柱色谱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=50:1。

7.根据权利要求5所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述萃取剂为二氯甲烷。

8.根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3）是采用下述方法完成：将1eq化合物2与1eq 的1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物在无水乙醇中，氮气保护，加热回流反应24小时，反应产物减压旋干后得到粗产品用二氯甲烷溶解，乙醚析出固体后减压过滤，柱色谱分离后得到目标化合物硫化氢分子荧光探针FP-H₂S。

9.根据权利要求8所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述柱色谱分离洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=10:1。

10.一种权利要求1所述的硫化氢分子荧光探针的应用，其特征在于，用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、目视定性检测、细胞成像检测。