CN112485231B - 一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒 - Google Patents

一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ以及试剂Ⅲ，其中，试剂Ⅰ为缓冲液，试剂Ⅱ为二氧化硫荧光探针溶液，试剂Ⅲ为谷胱甘肽荧光探针溶液，其中谷胱甘肽荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示，而二氧化硫荧光探针的结构式如(Ⅱ)所示。
Figure DDA0002201518820000011
与现有技术相比，本发明能同时检测细胞内二氧化硫和谷胱甘肽的含量，并且本发明中的谷胱甘肽荧光探针和二氧化硫荧光探针均荧光探针无毒、安全性高，抗干扰能力强、特异性高，检测结果准确，两种荧光探针的联用能更好地研究、评估二氧化硫对细胞的影响。

Description

一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是由甘氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸形成的三肽化合物，是哺乳动物细胞中最丰富的非酶类抗氧化剂。在许多生命活动中GSH起着直接或者间接的作用包括基因表达调控、酶活性、代谢调节、免疫功能调节等。在正常的情况下，GSH的水平异常会直接导致癌变、心脏病、衰老以及其他的疾病。二氧化硫(SO2)是一种常见的对人体健康危害较大的大气污染物，可引起气管炎、哮喘、肺气肿等多种呼吸道疾病，甚至与肺癌的发生有关，已有研究证实高浓度的SO2及其衍生物对机体各脏器具有损伤作用。L-半胱氨酸是体内最主要的含硫氨基酸，其在体内代谢可以产生硫化氢和SO2，可见，正常人体内含硫氨基酸的代谢也能产生SO2。随着研究的深入，已逐渐认识到内源性的SO2及其衍生物在生物体内具有重要的作用。进一步，目前研究发现SO2能在一定调节下诱导细胞内GSH含量的增加，说明GSH对于SO2在体内的解毒过程具有重要作用，因此同时检测细胞内GSH和SO2水平对综合评估SO2对机体的影响具有重要意义。
探针对试剂盒的检测结果有重要影响，荧光检测法因其灵敏度高、检测速度快、分辨率高而成为一种重要的检测方法。近年来有许多关于GSH荧光探针的报道，例如：申请号为CN201510917437.6(公开号为CN106866689A)的中国发明专利、申请号为CN201710466525.8(公开号为CN107235946A)的中国发明专利等均公开了现有的GSH荧光探针。此外，针对检测SO2的小分子荧光探针已有报道，如：申请号为CN2018100220449.2(公开号为CN108129459A)的中国发明专利、申请号为CN201811115332.9(公开号为CN108997288A)的中国发明专利等公开了现有的用于检测SO2的荧光探针。然而，这些常见的荧光探针多有背景的干扰，易受环境及浓度的影响而导致测量数据误差大，从而影响探针在复杂环境中的应用。大部分现有的GSH探针不能特异性的响应GSH的变化，由于细胞微环境复杂，关于GSH的检测大都会受到其他硫醇的影响如Cys、同型半胱氨酸(Hcy)等。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种能同时实现细胞内谷胱甘肽检测和二氧化硫检测的试剂盒。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种灵敏度高、选择性好、能特异性强的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ以及试剂Ⅲ，其中，试剂Ⅰ为缓冲液，试剂Ⅱ为二氧化硫荧光探针溶液，试剂Ⅲ为谷胱甘肽荧光探针溶液，其中谷胱甘肽荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示，而二氧化硫荧光探针的结构式如(Ⅱ)所示。
Figure GDA0003741803850000021
作为优选，所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或HEPES缓冲液中的一种。
进一步，优选地，所述缓冲液为pH值为6.0～8.5磷酸盐缓冲液，该磷酸盐为Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。再进一步，所述磷酸盐的浓度为10～35mmol/L。
本发明中的磷酸盐缓冲液除含有上述磷酸盐为，还包括KCl和MgCl2，且KCl的浓度为0.5～2.0mmol/L，MgCl2浓度为1.0～5.0mmol/L。
作为优选，所述谷胱甘肽荧光探针溶液中谷胱甘肽荧光探针的浓度为300～500nM/L，二氧化硫荧光探针溶液中二氧化硫荧光探针的浓度为100～200nM/L。
作为优选，所述谷胱甘肽荧光探针溶液的溶剂为水或乙醇或二甲基亚砜，所述二氧化硫荧光探针溶液的溶剂为乙腈或二甲基亚砜。
作为优选，上述谷胱甘肽荧光探针通过如下制备方法制备，且该制备方法包括以下步骤：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯的甲苯溶液中加入3-(N,N-二乙基氨基)苯酚，加热回流，反应后得浅黄色固体，该浅黄色固体即为所需的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(A)所示；
Figure GDA0003741803850000031
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将DMF滴加到POCl3中并搅拌，得到红色液体；将一部分上述7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素滴加到上述红色液体中，得到猩红色悬浮液；将该悬浮液在70℃下搅拌直至完全反应，加入NaOH溶液沉淀，得橙黄色固体，该橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(B)所示；
Figure GDA0003741803850000032
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至TLC显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体TCF，TCF的结构式如式(C)所示；
Figure GDA0003741803850000033
第四步，荧光探针的合成：
向上述第二步合成的4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃，室温下搅拌反应完，得到黑绿色产物，该黑绿色产物即为所需的谷胱甘肽荧光探针。
作为优选，上述二氧化硫荧光探针通过如下方法制备：第一步，HBN的合成：
将3-甲基水杨酸和1,2-苯二胺(2)混合，向混合物中加入多聚磷酸进行反应得灰色产物HBN，HBN的结构式如式(D)所示；
Figure GDA0003741803850000034
第二步，HBN-CHO的合成：
向含有上述获得的化合物HBN的2,2,2-三氟乙酸的溶液中加入六亚甲基四胺，加热回流至HBN消耗完全，得黄色产物HBN-CHO，HBN-CHO的结构式如式(E)所示；
Figure GDA0003741803850000041
第三步，TCF的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至TLC显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体TCF，TCF的结构式如式(F)所示；
Figure GDA0003741803850000042
第四步，HBN-TCF的合成：
向上述第二步合成的HNB-CHO和第三步合成的化合物TCF的混合物溶液中加入3滴哌啶，加热回流，得到深红色固体粗产物，纯化得到所需的上述二氧化硫荧光探针HBN-TCF。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的试剂盒中同时包括二氧化硫荧光探针溶液和谷胱甘肽荧光探针溶液，因此能同时检测细胞内二氧化硫和谷胱甘肽的含量。此外，本发明中二氧化硫荧光探针无毒、安全性高，抗干扰能力强、特异性高，能较好地检测细胞内源性和外源性的SO2，并且不受Cys、Hcy、GSH的干扰，能应用于细胞内复杂环境中SO2的检测，同时，本发明中的谷胱甘肽荧光探针无毒、安全性高，对肿瘤细胞、肝细胞、巨噬细胞没有毒性，抗干扰能力强、特异性高，具有良好的组织穿透性，能较好地检测细胞内源性和外源性的GSH，并且不受Cys、Hcy、SO2的干扰，应用于细胞内复杂环境中GSH的检测，可响应细胞内氧化应激引起的GSH的变化，因此通过本发明中的两种荧光探针的联用能更好地研究、评估二氧化硫对细胞的影响。
附图说明
图1为本发明实施例1中谷胱甘肽荧光探针合成过程示意图；
图2为本发明实施例1中谷胱甘肽荧光探针与CSH反应机理示意图；
图3为本发明实施例1中谷胱甘肽荧光探针的与GSH反应的光谱图；
图4为本发明实施例1中谷胱甘肽荧光探针与CSH结合的1H-NMR谱图；
图5为本发明实施例1中二氧化硫荧光探针的合成过程示意图；
图6为本发明实施例1中二氧化硫荧光探针检测原理示意图；
图7为本发明实施例2中谷胱甘肽荧光探针对Raw264.7、L-02和BEL-7402细胞存活率的影响；
图8为本发明实施例2中二氧化硫荧光探针对HUVEC和BEL-7402细胞存活率的影响；
图9为本发明实施例3中不同浓度谷胱甘肽荧光探针对内源性GSH的响应；
图10为本发明实施例4中5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用不同时间点对内源性GSH的响应；
图11为本发明实施例5中5μM浓度谷胱甘肽荧光探针对外源加入不同浓度GSH的响应；
图12为本发明实施例6中5μM浓度谷胱甘肽荧光探针对外源加入0.5mM GSH作用不同时间点的响应；
图13本发明实施例7中谷胱甘肽荧光探针对硫醇及SO2的响应；
图14本发明实施例8中谷胱甘肽荧光探针对氧化应激的响应；
图15为本发明实施例9中二氧化硫荧光探针对内源性SO2的响应；
图16为本发明实施例10中二氧化硫荧光探针对外源性SO2的响应；
图17为本发明实施例11中二氧化硫荧光探针对硫醇的响应；
图18为本发明实施例12中二氧化硫荧光探针对复杂环境中SO2的响应。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：荧光探针的合成
1-1本发明中的谷胱甘肽荧光探针的合成过程如图1所示，具体过程如下：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯(20克，78.05毫摩尔)的甲苯(80ml)溶液中加入3-(N,N-二乙基氨基)苯酚(12.9克，78.05毫摩尔)，加热回流7h。反应完成后，过滤，过滤所得的滤饼用己烷洗涤，真空干燥后得浅黄色固体(约9.8克，53.8％)，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(A)所示。
Figure GDA0003741803850000051
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将新鲜蒸馏的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(5.6毫升)滴加到POCl3(5.6毫升)中并搅拌30分钟，得到红色液体。将一部分上述制得的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素(5.00克，21.43毫摩尔，溶于25毫升DCF中)滴加到上述红色溶液中，得到猩红色悬浮液。将该悬浮液在70℃下搅拌12h直至完全反应，倒入150毫升冰水中，加入NaOH溶液(20％)pH调节至6，得到大量沉淀。过滤粗产物，滤饼用水洗涤，真空干燥得橙黄色固体(5.5克，91.7％)，粗产物可直接用于后续实验无需进一步纯化。上述橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(B)所示；
Figure GDA0003741803850000061
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮(4.50克，44.06毫摩尔)和丙二腈(5.96克，90.22毫摩尔)的乙醇(20毫升)混合物中加入乙醇钠(0.45克，6.61毫摩尔)，加热回流2h，直至TLC显示没有原料3-羟基-3-甲基-2-丁酮。将反应液冷却至室温后，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤3次后真空干燥，得到灰色固体TCF(约7.20克，83％)，即得上述2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃，TCF的结构式如式(C)所示；
Figure GDA0003741803850000062
第四步，谷胱甘肽荧光探针的合成
向含4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛(0.2克，0.72毫摩尔)的7毫升无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃(0.14克，0.72毫摩尔)，室温下搅拌。反应完成后，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤。将固体真空干燥，并通过柱色谱法进一步纯化，得到黑绿色产物(0.260克，78.9％)，该黑绿色产物即为所需的谷胱甘肽荧光探针，且该谷胱甘肽荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示。
Figure GDA0003741803850000063
上述制得的谷胱甘肽荧光探针与GSH作用的机制如图2所示，光谱图如图3所示，谷胱甘肽荧光探针与CSH结合的1H-NMR谱图如图4所示。
1-2二氧化硫荧光探针HBN-TCF的合成过程如图5所示，具体包括以下步骤：
第一步，HBN的合成：
将3-甲基水杨酸(5.00g，32.86mmol)和1,2-苯二胺(2)(3.24g，29.95mmol)置入250ml圆底烧瓶中，向混合物中加入多聚磷酸(100ml)，120℃下搅拌2h，接着升温至170℃加热3h。反应结束后，将混合物冷却至约80℃后缓慢倒入冰水中。最后，将所得溶液冷却至室温并在恒定搅拌下用NaHCO3中和析出固体，过滤，并在真空下干燥滤饼，获得灰色产物HBN(约5.15g，65％)，HBN的结构式如式(D)所示.
Figure GDA0003741803850000071
第二步，HBN-CHO的合成：
向含有上述第一步制得的化合物HBN(5.00g，20.72mmol)的2,2,2-三氟乙酸(40ml，52.27mmol)的溶液中加入六亚甲基四胺(14.52g,103.60mmol)，加热回流5h至HBN消耗完全。将反应液冷却至室温后，缓慢倒入冰水中，搅拌30min，过滤，将滤饼用去离子水洗涤3次后得粗产物。通过柱层析进一步纯化上述粗产物得黄色产物HBN-CHO(约2.91g，52％)，HBN-CHO的结构式如式(E)所示。
Figure GDA0003741803850000072
第三步，TCF的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮(4.50g，44.06mmol)和丙二腈(5.96g，90.22mmol)的乙醇(20ml)混合物中加入乙醇钠(0.45g，6.61mmol)，加热回流2h，直至TLC显示没有原料3-羟基-3-甲基-2-丁酮。将反应液冷却至室温后，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤3次后真空干燥，得到灰色固体TCF(约7.20g，83％)，TCF的结构式如式(F)。
Figure GDA0003741803850000073
第四步，HBN-TCF的合成：
向上述第二步合成的HNB-CHO(0.2g，0.79mmol)和第三步合成的化合物TCF(0.16g，0.8mmol)的混合物溶液中加入3滴哌啶，加热回流4h。将溶液冷却至室温后，过滤，滤饼用冷的无水乙醇洗涤3次，将固体真空干燥，得到深红色固体粗产物，通过柱层析进一步纯化得到二氧化硫荧光探针HBN-TCF，得到纯产物(0.14g，91.92％)，HBN-TCF的结构式如式(Ⅱ)。上述制得的二氧化硫荧光探针HBN-TCF与SO3 2-作用的机制如图6所示。
Figure GDA0003741803850000081
实施例2：荧光探针对细胞毒性检测
2-1本实施例中探究上述实施例1制备的谷胱甘肽荧光探针对巨噬细胞Raw264.7(购于中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142C0001000000131)、肝细胞L-02(购于中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142C0001000000077)和肿瘤细胞BEL-7402毒性(中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142C0001000000035)的影响。由图7所示，在谷胱甘肽荧光探针浓度(0.625-5μM)作用24h下，3种细胞存活率均在90％以上，说明本发明中的谷胱甘肽荧光探针对细胞是无毒、安全的。
2-2本实施例探究了上述实施例1制得的二氧化硫荧光探针对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购于中国武汉典型培养物保藏中心)和肿瘤细胞(BEL-7402)(购于中国武汉典型培养物保藏中心)毒性的影响。具体过程如下：细胞培养于96孔板中，待细胞融合率达50-60％时加入不同浓度的二氧化硫荧光探针(0.625～5μM)作用24h，待二氧化硫荧光探针作用结束后，利用MTT法检测细胞的存活率。由图8所示，二氧化硫荧光探针浓度(0.625～5μM)作用24h下，2种细胞存活率都为90％以上，说明该二氧化硫荧光探针对细胞是无毒、安全的。
实施例3：不同浓度谷胱甘肽荧光探针对内源性GSH的响应
本发明中的谷胱甘肽荧光探针发红色和蓝色两种荧光，其中红色为谷胱甘肽荧光探针的自发荧光，蓝色为谷胱甘肽荧光探针和GSH反应后的荧光。BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入不同浓度的谷胱甘肽荧光探针(0.625、1.25、2.5和5μM)作用30分钟。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～490nm；红色通道激发波长为575nm，发射波长为590～650nm。
由图9所示，其中A-D为0.625、1、2.5、5μM谷胱甘肽荧光探针分别作用30分钟，Scale bar为50μm。由图9可知，不同浓度谷胱甘肽荧光探针作用30分钟后红色荧光趋于稳定，蓝色荧光逐渐增强，说明本发明中的谷胱甘肽荧光探针可用于后续细胞内源性GSH的检测。
实施例4：5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用不同时间点对内源性GSH的响应
本实施例利用浓度为5μM的谷胱甘肽荧光探针进行后续时间点的检测，具体过程如下：BEL-7402细胞培养于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入5μM浓度谷胱甘肽荧光探针分别作用30、60、90分钟，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图10所示，A为对照组(未加谷胱甘肽荧光探针)，B-D为5μM浓度谷胱甘肽荧光探针分别作用30、60、90分钟，Scale bar为50μm。由图10可知，随着谷胱甘肽荧光探针作用时间的延长，红色荧光保持不变，蓝色荧光逐渐增强，说明该谷胱甘肽荧光探针可用于不同时间点内源性GSH的检测。
实施例5：5μM浓度谷胱甘肽荧光探针对外源加入不同浓度GSH的响应
待BEL-7402细胞融合率达80％左右，先加入0.25mM NEM作用30分钟，5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，不同浓度GSH(0.125、0.25、0.5、1和2mM)作用30分钟，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图11所示，A为NEM作用30分钟，5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用30分钟；B-F为NEM作用30分钟，5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，不同浓度GSH分别作用30分钟，Scale bar为50μm。由图11可知，随着GSH浓度的升高，红色荧光保持稳定，蓝色荧光逐渐增强。由上可知，本发明中的谷胱甘肽荧光探针可以响应广泛的GSH浓度的变化。
实施例6：5μM浓度谷胱甘肽荧光探针对外源加入0.5mM GSH作用不同时间点的响应
本实施例中选用0.5mM GSH浓度进行GSH作用不同时间点的研究，具体过程如下：先加入0.25mM NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM GSH分别作用30、60、90分钟。
由图12所示，A为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟；B-D为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM GSH分别作用30、60、90分钟，Scalebar为50μm。由图12可知，随着GSH作用时间的延长，红色荧光保持稳定，蓝色荧光逐渐增强。由上可知，本发明中的谷胱甘肽荧光探针可以检测外源性不同时间点的GSH。
实施例7：谷胱甘肽荧光探针对硫醇及SO2的响应
细胞内主要的硫醇有3种：GSH、Cys、Hcy，其中Cys为GSH合成的限速底物，因此本实施例检测了该谷胱甘肽荧光探针是否可以特异性检测细胞内GSH，此外也探究了SO2是否会干扰GSH的检测。具体过程如下：BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞存活率达80％左右，加入0.25mM NEM作用30分钟，5μM浓度谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM GSH/Cys/Hcy/NaHSO3分别作用30分钟。
由图13所示，A为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟；B为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM GSH作用30分钟；C为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM Cys作用30分钟；D为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM Hcy作用30分钟；E为NEM作用30分钟，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，0.5mM NaHSO3作用30分钟；Scale bar为50μm。由图13可知，Cys、Hcy、NaHSO3作用下红色荧光稳定，未观察到蓝色荧光的变化。而GSH作用下，谷胱甘肽荧光探针出现明显的蓝色荧光，说明谷胱甘肽荧光探针可以特异性检测细胞内的GSH。
实施例8：谷胱甘肽荧光探针对氧化应激的响应
GSH作为细胞内主要的非酶类抗氧化物质，在细胞抵抗氧化应激方面起重要的作用。本实施例利用不同浓度的H2O2作用来探究谷胱甘肽荧光探针是否可以检测到H2O2引起的细胞内GSH的变化。BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞存活率达80％左右，加入H2O2(0.25、1、2.5μM)作用60分钟，PBS洗1次，加入5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图14所示，A为5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟，B-D为0.25、1、2.5mM H2O2作用1h，5μM谷胱甘肽荧光探针作用30分钟；Scale bar为50μm。由图14可知，与对照组相比，0.25和1mM H2O2作用下，红光荧光趋于稳定，蓝色荧光在H2O2作用下增强；在2.5mM H2O2作用下，红色荧光和蓝色荧光都减弱，原因可能是低浓度H2O2作用调动了细胞内源性的抗氧化机制来共同抵抗氧化应激，因此GSH水平出现先升高的趋势；而高浓度H2O2(2.5mM)作用下细胞难以抵抗氧化应激引起的损伤而趋于程序性死亡，因此荧光减弱。由上可见，本谷胱甘肽荧光探针可以应用于细胞氧化应激的检测。
实施例9：二氧化硫荧光探针对内源性SO2的响应
BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入5μM二氧化硫荧光探针分别作用30、60、90min。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～490nm，红色通道激发波长为575nm，发射波长为590～650nm。
本发明中的二氧化硫荧光探针发红色和蓝色两种荧光，其中红色为二氧化硫荧光探针的自发荧光，蓝色为二氧化硫荧光探针和SO2反应后的荧光。由图15所示，A-C为5μM二氧化硫荧光探针分别作用30、60、90min，Scale bar为50μm。由图15可知，随着二氧化硫荧光探针作用时间的延长，红色荧光逐渐减弱，蓝色荧光逐渐增强，说明该二氧化硫荧光探针可用于不同时间点内源性SO2的检测。
实施例10：二氧化硫荧光探针对外源性SO2的响应
BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入5μM作用30min，Na2SO3(0.05mM和0.1mM)分别作用30、60、90min。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～-490nm，红色通道激发波长为575nm，发射波长为590～650nm。
如图16所示，A～C分别为0.05mM Na2SO3分别作用30、60、90min；D～F分别为0.1mMNa2SO3分别作用30、60、90min；Scale bar为50μm。由图16可知，0.05mM和0.1mM Na2SO3分别作用不同时间点，红色通道荧光逐渐减弱，蓝色荧光逐渐增强；并且在0.1mM Na2SO3作用90min时，红色通道荧光消失，蓝色通道荧光增强，这可能跟二氧化硫荧光探针与SO2反应完全有关。上述结果说明二氧化硫荧光探针可用于外源性SO2的检测。
实施例11：二氧化硫荧光探针对硫醇的响应
BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入0.25mM NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.5mM GSH/Cys/Hcy/分别作用30min。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～490nm，红色通道激发波长为575nm，发射波长为590-650nm。
由图17所示，A为NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min；B为NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.5mM Cys作用30min；C为NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.5mM Hcy作用30min；D为NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.5mM GSH作用30min；Scale bar为50μm。由图17可知，Cys、Hcy、GSH作用下红色荧光稳定，未观察到蓝色荧光，说明二氧化硫荧光探针可以特异性检测细胞内SO2而不受硫醇的干扰。
实施例12：二氧化硫荧光探针对复杂环境中SO2的响应
由于细胞内环境比较复杂，本实验利用SO2供体来进一步探究二氧化硫荧光探针是否可以检测外源性的SO2。具体操作如下：
BEL-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右加入0.25mM NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.2mM Cys和40μM SO2 donor分别作用15、30、60min。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～490nm；红色通道激发波长为575nm，发射波长为590～650nm。
由图18所示，A为NEM作用30min，5μM二氧化硫荧光探针作用30min；B-D为NEM作用30min,5μM二氧化硫荧光探针作用30min，0.2mM Cys和40μM SO2donor分别作用15、30、60min；Scale bar为50μm。如图18可知，随时间的延长，红色通道荧光减弱，蓝色荧光逐渐增强，说明二氧化硫荧光探针可用于检测复杂环境下外源性的SO2。
实施例13：试剂盒的制备
将上述实施例1中制备的谷胱甘肽荧光探针用二甲基亚砜(也可以使用水或乙醇)调配成谷胱甘肽荧光探针溶液(即为试剂Ⅲ)，该谷胱甘肽荧光探针溶液中谷胱甘肽荧光探针的浓度为300～500nM/L。将上述实施例1中制备的二氧化硫荧光探针用二甲基亚砜(也可以使用乙腈)调配成二氧化硫荧光探针溶液(即为试剂Ⅱ)，该二氧化硫荧光探针溶液中二氧化硫荧光探针的浓度为100～200nM/L。
进一步，配置试剂Ⅰ，该试剂Ⅰ为缓冲液，可选用Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或HEPES缓冲液中的一种，本实施例中为使该缓冲液能更好地同时适用于上述谷胱甘肽荧光探针和二氧化硫荧光探针，该缓冲液选用磷酸盐缓冲液，并且该磷酸盐缓冲液的pH值为6.0～8.5，且磷酸盐缓冲液中选用的磷酸盐为Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，磷酸盐的浓度为10～35mmol/L。此外，本实施例中，上述磷酸盐缓冲液除磷酸盐外，还包括KCl和MgCl2，且KCl的浓度为0.5～2.0mmol/L，Mgcl2浓度为1.0～5.0mmol/L。上述试剂Ⅰ、试剂Ⅱ以及试剂Ⅲ即组成了本发明中所需的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒。

Claims (9)

1.一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ以及试剂Ⅲ，其中，试剂Ⅰ为缓冲液，试剂Ⅱ为二氧化硫荧光探针溶液，试剂Ⅲ为谷胱甘肽荧光探针溶液，其中谷胱甘肽荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示，而二氧化硫荧光探针的结构式如(Ⅱ)所示，
Figure FDA0003741803840000011
2.如权利要求1所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或HEPES缓冲液中的一种。
3.如权利要求2所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为pH值为6.0～8.5磷酸盐缓冲液，该磷酸盐为Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。
4.如权利要求3所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐的浓度为10～35mmol/L。
5.如权利要求4所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液还包括KCl和MgCl2，且KCl的浓度为0.5～2.0mmol/L，MgCl2浓度为1.0～5.0mmol/L。
6.如权利要求1～5中任一项所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述谷胱甘肽荧光探针溶液中谷胱甘肽荧光探针的浓度为300～500nM/L，二氧化硫荧光探针溶液中二氧化硫荧光探针的浓度为100～200nM/L。
7.如权利要求6所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述谷胱甘肽荧光探针溶液的溶剂为水或乙醇或二甲基亚砜，所述二氧化硫荧光探针溶液的溶剂为乙腈或二甲基亚砜。
8.如权利要求1～5中任一项所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述谷胱甘肽荧光探针通过如下制备方法制备，且该制备方法包括以下步骤：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯的甲苯溶液中加入3-(N,N-二乙基氨基)苯酚，加热回流，反应后得浅黄色固体，该浅黄色固体即为所需的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(A)所示；
Figure FDA0003741803840000021
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将DMF滴加到POCl3中并搅拌，得到红色液体；将一部分上述7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素滴加到上述红色液体中，得到猩红色悬浮液；将该悬浮液在70℃下搅拌直至完全反应，加入NaOH溶液沉淀，得橙黄色固体，该橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(B)所示；
Figure FDA0003741803840000022
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至TLC显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体TCF，TCF的结构式如式(C)所示；
式(C)
Figure FDA0003741803840000023
第四步，荧光探针的合成：
向上述第二步合成的4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃，室温下搅拌反应完，得到黑绿色产物，该黑绿色产物即为所需的谷胱甘肽荧光探针。
9.如权利要求1～5中任一项所述的二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述二氧化硫荧光探针通过如下制备方法制备，且该制备方法包括以下步骤：
第一步，HBN的合成：
将3-甲基水杨酸和1,2-苯二胺(2)混合，向混合物中加入多聚磷酸进行反应得灰色产物HBN，HBN的结构式如式(D)所示；
Figure FDA0003741803840000024
第二步，HBN-CHO的合成：
向含有上述获得的化合物HBN的2,2,2-三氟乙酸的溶液中加入六亚甲基四胺，加热回流至HBN消耗完全，得黄色产物HBN-CHO，HBN-CHO的结构式如式(E)所示；
Figure FDA0003741803840000031
第三步，TCF的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至TLC显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体TCF，TCF的结构式如式(F)所示；
Figure FDA0003741803840000032
第四步，HBN-TCF的合成：
向上述第二步合成的HNB-CHO和第三步合成的化合物TCF的混合物溶液中加入3滴哌啶，加热回流，得到深红色固体粗产物，纯化得到所需的上述荧光探针二氧化硫HBN-TCF。
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