JP5991831B2 - 蛍光プローブ - Google Patents
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Description
R1及びR2は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
R3及びR4は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R1及びR2が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよく、
R1及びR3が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R2及びR4が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R5は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式(A):−NR51R52(式中、R51及びR52は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはR51及びR52が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよい。)で示される基であり、
R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R5が式(A)で示される基のとき、R51及びR6が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R52及びR7が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R8は水素原子、水酸基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−N=C=O、−N=C=S、スルホ基又は活性エステル基であり、m及びnは同一又は異なって、0又は1である。)
で表される化合物。
R1及びR2は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
R3及びR4は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R1及びR2が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよく、
R1及びR3が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R2及びR4が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R5は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式(A):−NR51R52(式中、R51及びR52は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはR51及びR52が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよい。)で示される基であり、
R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R5が式(A)で示される基のとき、R51及びR6が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R52及びR7が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R8は水素原子、水酸基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−N=C=O、−N=C=S、スルホ基又は活性エステル基であり、m及びnは同一又は異なって、0又は1である。)
で表される化合物の製造方法であって、一般式(II):
で表される化合物を酸化反応に付すことを特徴とする製造方法。
1.本発明化合物
本発明の化合物は、一般式(I)で表されるN−オキシドを有する化合物であり、鉄(II)イオンを高選択的かつ高感度で検出できる蛍光特性を有しているため、鉄(II)イオン選択的蛍光プローブとして極めて有用である
R1、R2、R3、R4、R51、R52、R6及びR7で示される「低級アルキル基」としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のC1〜C6アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、sec−ブチル基、n−ペンチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基、イソヘキシル基、3−メチルペンチル基等が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基のC1〜C3アルキル基であり、より好ましくは、メチル又はエチル基である。
で示される基が、式:
で示される基であることを意味する。
で示される基が、式:
で示される基であることを意味する。
で示される基が、式:
で示される基であることを意味する。
で示される基が、式:
で示される基であることを意味する。
が挙げられる。
で表される化合物が挙げられる。
2.製造方法
本発明の化合物は、例えば次のようにして製造することができる。
一般式(I)で表される化合物は、一般式(II)で表される化合物を酸化反応に付すことにより製造することができる。
で表される化合物となる場合もある。この化合物は、通常、強い蛍光を発する。一般式(II)で表される化合物及び/又は一般式(IIa)で表される化合物を媒体(溶媒)に溶解した場合には、通常、一般式(II)で表される化合物及び一般式(IIa)で表される化合物の平衡状態にあり、その媒体(溶媒)の極性やpH等によりその平衡の偏りが変動し得る。そのため、本明細書では、一般式(II)で表される化合物及び一般式(IIa)で表される化合物をまとめて、一般式(II)で表される化合物として表記することとする。
3.蛍光プローブ
本発明の化合物は、蛍光プローブ、特に、鉄(II)イオン選択的蛍光プローブとして用いることができる。
3’−(ジエチルアミノ)−N,N−ジエチル−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−6’−アミンオキサイド(以下、「RhoNox-1」と表記する)の合成
1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ : 1.18-1.13 (m, 12H), 3.36 (q, 4H, J = 6.9 Hz), 3.70 (brs, 4H), 6.38 (dd, 1H, J = 9.1, 2.3 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 2.3 Hz ), 6.58 (d, 1H, J = 8.6 Hz ), 6.84 (d, 1H, J = 8.6 Hz ), 7.21 (d, 1H, J = 7.4 Hz ), 7.26 (br, 1H), 7.65 (t, 1H, J = 7.5 Hz ), 7.69 (t, 1H, J = 7.4 Hz ), 7.97 (d, 1H, J = 2.3 Hz ), 8.04 (d, 1H, J = 7.5 Hz );
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 8.4, 12.6, 44.6, 67.1, 83.3, 97.7, 102.7, 104.5, 108.9, 112.6, 115.8, 120.4, 124.1, 125.2, 127.0, 128.9, 129.0, 129.9, 135.2, 149.9, 152.7, 152.8, 169.4;
HRMS (ESI+): m/z calculated for C28H31N2O4 +: 459.2278, found 459.2264。
RhoNox-1の50 mM HEPES緩衝液中pH7.4における蛍光特性を調べた。以下の測定は特別な記述がない限りすべてこの条件下にて行なった。
λem,max = 575 nm
蛍光量子収率 Φ = 0.010
(1)蛍光強度の測定
生理的条件下におけるRhoNox-1の蛍光応答を調べるために2 μMのRhoNox-1に対して20 μMのFeSO4を加え、一時間後の蛍光強度を調べた(励起波長540 nm)。図1(a)にその結果を示す。
(2)金属イオン選択性試験
金属イオン選択性試験については、金属種としてMnSO4、CoSO4、NiSO4、FeSO4、FeCl3、CuSO4、ZnSO4、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2を用い、遷移金属イオンについては10 mM、アルカリ金属、アルカリ土類金属イオンは1Mの水溶液を作成し、これらを使用した。銅(I)については10 mM の[Cu(CH3CN)4]PF4のアセトニトリル溶液を作成し、これを用いた。上記のストック溶液を用いて20 μMの遷移金属イオン及び1 mMのアルカリ、アルカリ土類金属イオンを2 μMのRhoNox-1に添加し、一時間後の575 nmにおける蛍光強度を比較した。さらに、鉄(II)イオンに対する応答性が他種の金属イオン種により阻害されないことを確かめるために上記の金属イオンの存在下において硫酸鉄(II)を加え、一時間後の蛍光強度を同様に調べた。その結果を、図1(b)に示す。
(3)鉄(II)イオン濃度と蛍光強度変化
様々な濃度の硫酸鉄(II)を、2 μMのRhoNox-1に対して行った上記(1)と同条件において添加し、575 nmにおける蛍光強度変化を測定した。得られた蛍光強度の変化量を加えた硫酸鉄(II)の濃度に対してプロットし、その検出限界および定量性について調べた。その結果を、図2に示す。
(4)各種試薬の存在下での蛍光強度変化
各種還元剤、活性酸素種、およびキレーターを用いた選択性試験は、2 μMのRhoNox-1に対して以下の濃度で試薬を加え、一時間後の蛍光強度変化を調べることにより行った。その結果を、図3に示す。
・チオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3): 100 μM(100 mM水溶液より調製)
・アスコルビン酸ナトリウム: 1 mM(100 mM水溶液より調製)
・システイン: 1 mM(100 mM水溶液より調製)
・還元型グルタチオン: 1 mM (100 mM HEPES緩衝液(pH 7.4)より調製)
・亜硝酸ナトリウム(NaNO2): 100 μM(100 mM水溶液より調製)
活性酸素種:
・スーパーオキシドラジカルアニオン(O2 ・-): 100 μM(1 mM KO2 DMSO溶液より調製)
・過酸化水素(H2O2): 100 μM(100 mM水溶液より調製)
・ヒドロキシルラジカル(・OH): 200 μM H2O2に20 μM FeSO4.を加えて調製(それぞれ100 mM水溶液および10 mM水溶液より調製)
・次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl): 100 μM(100 mM水溶液より調製)
キレーター:
・2,2’-ビピリジル: 100 μM (100 mM DMSO溶液より調製)
図1から図3に示す結果から、硫酸鉄(II)を添加した時のみRhoNox-1は蛍光強度の増加を示し、他の遷移金属イオン、アルカリ金属、およびアルカリ土類金属種に対してはほとんど応答が見られなかった。特筆すべきことにRhoNox-1はもう一つの鉄の安定酸化状態である鉄(III)イオンに対しては全く応答せず、鉄イオンの価数の違いを区別して鉄(II)のみを選択的に検出することができることがわかった。さらに、生体内に存在しうる酸化剤や還元剤への暴露に対しても安定であることを確認し、RhoNox-1の蛍光応答が鉄(II)イオンに対して非常に高選択的であることがわかった。
(5)反応物の解析
RhoNox-1と硫酸鉄(II) の反応後生成物についてはHPLC分析にて調べた(図4)。50 μM のRhoNox-1の50 mM HEPES 溶液 (pH 7.4) に対して 500 μM の硫酸鉄(II) を加え一時間室温にて静置した。この反応混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー一体型質量分析計(HP 1100 LC system、Agilent 1946B ESI-mass system、Waters symmetry C18 column, 3.5 mm, 4.6 × 100 mm) にて分析した。保持時間の基準物質として同濃度のローダミンB を使用した。また、HPLC分析の溶出条件は以下の通りである。A液(0.05%ギ酸水溶液)、B液(0.05% ギ酸アセトニトリル溶液);5-20 min、30-95% B。540 nmの吸光度により検出した。
ヒト肝ガン細胞(HepG2) は使用二日前に約10万個の細胞をガラスボトムシャーレに撒き、10%ウシ胎児血清(FBS, Gibco)、および2 mMグルタミンを含むMEM培地にて37℃で培養した。
共焦点蛍光顕微鏡による蛍光イメージングはZeiss社製 LSM 700 レーザースキャン蛍光顕微鏡システムを用い、レンズは40倍油浸レンズを使用した。一連のイメージング実験には、カルシウム、マグネシウム含有、フェノールレッド不含有のHank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco) を用いた。
また、同様のイメージング実験をヒト乳ガン細胞(MCF-7)にて行った。RhoNox-1および2,2'-ビピリジルを加えた際のインキュベート時間が15分である以外はHepG2細胞のときと全く同様の手順で行った。(図7)
まず、図5(a)と(b)を比較すると、コントロールの細胞に比べ鉄を添加した細胞においては非常に強い蛍光シグナルが見られた。また、(c)の明視野画像および核染色の結果からRhoNox-1の細胞毒性が低いことがわかった。鉄処理した細胞に鉄(II)のキレーターである2,2'-ビピリジルを添加した(d)の場合、その蛍光シグナルはコントロールと同程度まで低下した。このことから、(b)において見られた強い蛍光シグナルが鉄(II)に由来するものであると言える。さらに、鉄処理無しでキレーターを作用させた(e)においてはコントロールである(a)の場合よりも弱い蛍光シグナルが得られる結果となった。この事実はRhoNox-1が細胞内在性の鉄(II)イオンにより還元され、ローダミンBへと変換されていることを示しており、RhoNox-1によって細胞内在性の鉄(II)イオンの濃度変化を検出可能であることがわかった。
Claims (5)
- 一般式(I):
R1及びR2は同一又は異なって、低級アルキル基又はカルボキシ低級アルキル基であり、
R3及びR4は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R1及びR2が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよく、
R1及びR3が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R2及びR4が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R5は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式(A):−NR51R52(式中、R51及びR52は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはR51及びR52が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよい。)で示される基であり、
R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R5が式(A)で示される基のとき、R51及びR6が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R52及びR7が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R8は水素原子、水酸基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−N=C=O、−N=C=S、スルホ基又は活性エステル基であり、m及びnは同一又は異なって、0又は1である。)
で表される化合物。 - 一般式(I)において、R1及びR2が同一又は異なって、C1〜C6アルキル基であり、R3及びR4が水素原子であり、或いはR1及びR3が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R2及びR4が結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R5が式(A):−NR51R52で示される基であり、R51及びR52は同一又は異なって、C1〜C6アルキル基であり、R6及びR7が水素原子であり、或いはR51及びR6が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R52及びR7が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R8が水素原子であり、mが0であり、nが0である、請求項1に記載の化合物。
- 一般式(I)において、R1及びR2が同一又は異なって、C1〜C3アルキル基であり、R3及びR4が水素原子であり、R5が式(A):−NR51R52で示される基であり、R51及びR52は同一又は異なって、C1〜C3アルキル基であり、R6及びR7が水素原子であり、R8が水素原子であり、mが0であり、nが0である、請求項1又は2に記載の化合物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物を含む蛍光プローブ。
- 一般式(I):
R1及びR2は同一又は異なって、低級アルキル基又はカルボキシ低級アルキル基であり、
R3及びR4は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R1及びR2が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよく、
R1及びR3が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R2及びR4が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R5は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式(A):−NR51R52(式中、R51及びR52は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはR51及びR52が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成していてもよい。)で示される基であり、
R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
R5が式(A)で示される基のとき、R51及びR6が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、R52及びR7が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
R8は水素原子、水酸基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−N=C=O、−N=C=S、スルホ基又は活性エステル基であり、m及びnは同一又は異なって、0又は1である。)
で表される化合物の製造方法であって、一般式(II):
で表される化合物を酸化反応に付すことを特徴とする製造方法。
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