CN115215833B - 化学发光探针及其应用 - Google Patents

化学发光探针及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115215833B
CN115215833B CN202110406797.5A CN202110406797A CN115215833B CN 115215833 B CN115215833 B CN 115215833B CN 202110406797 A CN202110406797 A CN 202110406797A CN 115215833 B CN115215833 B CN 115215833B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chemiluminescent probe
chemiluminescent
probe
concentration
thiol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110406797.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115215833A (zh
Inventor
傅安辰
王宏博
曹志娟
毛彦佳
孙茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Fudan University
Original Assignee
Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Fudan University filed Critical Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority to CN202110406797.5A priority Critical patent/CN115215833B/zh
Publication of CN115215833A publication Critical patent/CN115215833A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115215833B publication Critical patent/CN115215833B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种化学发光探针及其应用。所述化学发光探针的结构式如本发明中所示；其中，所述化学发光探针在巯基存在下产生化学发光。本发明的化学发光探针SHCL准确性高，具有良好的特异性和灵敏度，操作过程简便高效。

Description

化学发光探针及其应用
技术领域
本发明涉及分子识别、生物传感、光学分析和小分子化学发光探针领域，具体是一种化学发光探针及其应用。
背景技术
生物硫醇在有机生命体的生理活动中具有重要作用，包括谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)。体内生物硫醇含量异常与众多生理病理过程相关，包括肝损伤、心血管疾病、神经退行性疾病以及癌症[Huang,C.et al.,Science 1992,257,1496]。在生物硫醇参与疾病的有利证据下，精准检测生物硫醇的技术在疾病诊断和药物开发中起着重要作用。因此，发展一种精准检测生物硫醇技术是亟待解决的问题。
目前，生物硫醇的检测方法主要有紫外吸收法、电化学分析法、荧光检测法、生物发光法等。但是传统的紫外吸收法和电化学分析法，需要大量样品才能准确检测，具有一定的局限性；荧光技术则需外部激发光源，易受到光散射和自体荧光的干扰；生物发光体系更需要依赖各种虫荧光素酶-底物的特异性反应才能达到效果。而化学发光技术，其原理源于化学反应，规避了上述其他方法的限制，其灵敏度高，且易于操作，是极具潜力的检测手段和生物成像技术。但目前常用到的化学发光体系，包括鲁米诺、过氧化草酸盐等体系在生理环境下适用性较弱，并且反应中均需氧化性物质的参与，在体内光学分析的应用中多局限于过氧化氢、活性氧自由基及其抑制剂或增强剂的测定，这些限制了它们在生物成像分析中的应用。
因此，发展不依赖于外部光源、无需特异性生物酶和氧化剂参与的化学发光体系具有重要的科学意义和实用价值。1987年，Schaap教授发展了一种基于金刚烷-二氧杂环丁烷(adamantane-dioxetane)结构的化学发光探针，实现了无需氧化剂参与的化学发光体系在生理条件下应用的重大突破。但是因为发光效率过低而无法很好地应用于生理条件下的物质分析[Schaap,A.P.；Handley,R.S.；Giri,B.P.Tetrahedron Lett.1987,28,935；Schaap,A.P.；Chen,T.-S.；Handley,R.S.；DeSilva,R.；Giri,B.P.TetrahedronLett.1987,28,1155.；Schaap,A.P.；Sandison,M.D.；Handley,R.S.TetrahedronLett.1987,28,1159]。2017年以来，对于该体系的改造，尤其是苯酚氧基团的邻位引入吸电子基团，如丙烯酸甲酯等，可显著增强其化学发光效率，而逐渐成为新的研究热点，可用于蛋白酶、致病菌和体内疾病相关小分子的检测[Green,O.et al.,ACS Cent.Sci.2017,3,349]。
鉴于上文所述在光学分析中化学发光法的优势以及金刚烷二氧杂环-丁烷化学发光体系的巨大发展，发展一种检测生物硫醇的金刚烷-二氧杂环丁烷化学发光探针是一项重要的技术突破，进一步拓展它的应用范围将是相关领域发展的重要方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺少准确、高效简便的含巯基化合物的化学发光探针的不足，提供一种化学发光探针及其应用。本发明的化学发光探针用于含巯基化合物的检测，例如生物硫醇的检测，灵敏度和特异性好，操作简便高效。
本发明通过以下技术方案解决上述问题。
本发明的第一方面提供一种化学发光探针，所述化学发光探针的结构式如下：
其中，所述化学发光探针在巯基存在下产生化学发光。
所述化学发光探针为基于金刚烷-二氧杂环丁烷结构的3-氯-2(((2,4-二硝基苯)磺酰)氧)-4-(4’-甲氧基[金刚烷-2，3’-[1,2]二氧四环])苯基丙烯酸酯(3-chloro-2-(((2,4-dinitrophenyl)sulfonyl)oxy)-4-(4'-methoxyspiro[adamantane-2,3'-[1,2]dioxetan]-4'-yl)phenylacrylate,SHCL)。
所述化学发光探针包括识别元件和发光元件，其中：所述识别元件为2，4-二硝基苯磺酸酯，所述发光元件为金刚烷-二氧杂环丁烷结构。
所述识别元件可识别生物硫醇；所述发光元件具有氯取代、丙烯酸甲酯修饰。
所述化学发光探针的化学发光原理如下：所述识别元件2，4-二硝基苯磺酸酯具有吸电子作用，使磺酸酯基的硫原子带部分正电荷，在亲核试剂的进攻下磺酸酯基容易断裂，从而使得发光元件金刚烷-二氧杂环丁烷结构暴露出酚氧负离子，经过化学反应引发电子交换发光机制(CIEEL)分解产生激发态的苯甲酸酯，随后跃迁回基态产生化学发光。
所述所述巯基以含巯基化合物形式存在，所述含巯基化合物可为本领域常规，较佳地包括生物硫醇。
所述生物硫醇可为本领域常规，较佳地包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽和/或二硫苏糖醇。
本发明的第二方面提供一种检测含巯基化合物的方法，包括：将如第一方面所述的化学发光探针加入待测溶液中，收集产生的光信号；所述化学发光探针的浓度为20-80μM。
较佳地，所述化学发光探针的浓度为30-60μM。
在本发明一具体实施方案中，所述化学发光探针的浓度为40μM。
本发明的第三方面提供一种非诊断目的的检测分离的细胞内生物硫醇的方法，包括：将第一方面所述的化学发光探针与待测细胞混合，收集产生的光信号并成像；所述化学发光探针的浓度为20-80μM。
较佳地，所述化学发光探针的浓度为30-60μM。
较佳地，所述待测细胞可为本领域常规，例如为肿瘤细胞。
较佳地，所述待测细胞的个数为1-50000个。
更佳地，所述化学发光探针的浓度为40μM。
所述肿瘤细胞可为本领域常规，例如为宫颈癌细胞或乳腺癌细胞。
较佳地，所述宫颈癌细胞可为本领域常规，例如为人宫颈癌细胞HeLa。
较佳地，所述乳腺癌细胞可为本领域常规，例如为人乳腺癌细胞MCF-7。
本发明还提供一种体内检测动物内源性生物硫醇的方法，包括：将如第一方面所述的化学发光探针输入待测动物体内，收集产生的光信号并成像；所述化学发光探针的浓度为20-80μM。
较佳地，所述化学发光探针的浓度为30-60μM。
更佳地，所述化学发光探针的浓度为40μM。
所述体内检测动物内源性生物硫醇的方法可应用于实验室动物疾病模型的研究检测。
较佳地，所述输入为注射。
在本发明一较佳实施方案中，所述待测动物可为本领域常规，例如荷瘤动物。
在本发明一较佳实施方案中，所述化学发光探针的输入浓度为0.28μM/g。
更佳地，所述注射为皮下注射。
更佳地，当所述待测动物为荷瘤动物时，所述注射为瘤内注射。
本发明的第四方面提供一种检测乙酰胆碱酯酶活性的方法，包括：将乙酰胆碱酯酶与等体积的乙酰胆碱酯酶底物混合，避光孵育后加入如第一方面所述的化学发光探针，收集产生的光信号并成像；所述化学发光探针的浓度为20-80μM。
较佳地，所述化学发光探针的浓度为30-60μM。
较佳地，所述乙酰胆碱酯酶的浓度为0.98-62.5μg/mL。
较佳地，所述避光孵育的温度为22-28℃，时间为30-60分钟。
在本发明一具体实施方案中，所述化学发光探针的浓度为40μM。
在本发明一具体实施方案中，所述避光孵育的温度为25℃，时间为45分钟。
本发明的第五方面提供一种组合物，包括如第一方面所述的化学发光探针和药学上可接受的载体。
本发明的第六方面提供一种非诊断目的的检测生物样品中生物硫醇的方法，包括：将如第一方面所述的化学发光探针、或者如第五方面所述的组合物在溶液体系中与待测生物样品在液相条件下接触，收集产生的光信号并成像。
较佳地，所述待测生物样品为组织活检样品。
本发明的第七方面提供一种如第一方面所述的化学发光探针、或者如第五方面所述的组合物在检测含巯基化合物中的应用。
较佳地，所述含巯基化合物为生物硫醇。
本发明的第八方面提供一种如第一方面所述的化学发光探针、或者如第五方面所述的组合物在制备用于检测含巯基化合物的试剂或试剂盒中的应用。
较佳地，所述含巯基化合物为生物硫醇。
较佳地，所述试剂或试剂盒用于检测生物体内的含巯基化合物。
本发明所述的成像可为本领域常规技术，优选通过成像仪，例如Xenogen Spectrum拍摄图像。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的化学发光探针SHCL准确性高，具有良好的特异性和灵敏度，在测定含巯基化合物如GSH中响应值与GSH浓度之间存在良好的线性关系；在测定分离的细胞如人乳腺癌细胞MCF-7中的生物硫醇中响应值与细胞数量之间存在良好的线性关系，成像亮度随细胞数量的增加而增加；在测定乙酰胆碱酯酶活性中响应值与细胞数量之间存在良好的线性关系，且成像亮度随乙酰胆碱酯酶浓度的增加而增加。并且操作过程简便高效。
附图说明
图1为实施例1的SHCL合成路线示意图。
图2为实施例2中SHCL对不同物质的产生化学发光的信号响应图；
图中：1表示GSH；2表示Cys；3表示Hcy；4表示DTT；5表示Arg；6表示Gly；7表示His；8表示Lys；9表示Pro；10表示Tyr；11表示Ala；12表示Leu；13表示K+；14表示Ca2+；15表示Na+；16表示Mg2+；17表示Zn2+；18表示Cu2+；19表示2.5％H2O2；20表示2.5％葡萄糖；21表示PBS缓冲液。
图3为实施例3中SHCL测定不同浓度GSH溶液的化学发光曲线图及线性关系图；
图中：(a)为发光强度随时间变化的曲线，(b)为整合的发光强度与GSH浓度的线性关系。
图4为实施例4中SHCL测定细胞内生物硫醇的化学发光曲线图及线性关系图；
图中：(a)为相对发光单位随时间变化的曲线，(b)为相对发光单位与细胞数量的线性关系。
图5为实施例4中SHCL对不同数量的细胞内生物硫醇的成像图。
图6为实施例5中SHCL对动物体内源性生物硫醇成像图；
图中：(a)为小鼠内源性生物硫醇和注射抑制剂的成像示意图，(b)为不同时间的小鼠内源性生物硫醇和注射抑制剂的成像示意图。
图7为实施例6中SHCL测定不同浓度的乙酰胆碱酯酶活性的成像图及线性关系图；
图中：(a)为不同AchE浓度的成像示意图，(b)为细胞数量与AchE浓度的线性关系。
图8为实施例7细胞毒性测定结果示意图；
图中：A为50mM的GSH与不同浓度的SHCL反应得到的信号；B为不同浓度的SHCL与MCF-10a(人乳腺癌细胞)孵育后的细胞存活率。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中使用的试剂/材料信息如下表所示：
名称 供应商
GSH adamas
MCF-7细胞系 中国科学院上海细胞库
HeLa细胞系 中国科学院上海细胞库
MCF-10a细胞系 中国科学院上海细胞库
硫醇清除剂 adamas
AchE adamas
碘代硫代乙酰胆碱 adamas
荷瘤雌性裸鼠 上海灵畅生物科技有限公司
CCK8试剂盒 大连美仑生物技术有限公司，MA0218-2
实施例1SHCL的制备
如图1所示合成SHCL，包括：
1、化合物1的合成
将间羟基苯甲醛(25.6g，209.6mmol，1equiv.)溶于150mL 90％醋酸溶液，降至0℃，逐滴加入次氯酸叔丁酯(25.0g，230.6mmol，1.1equiv.)，用高效液相色谱监测反应，反应结束后，过滤得到13.8g白色固体化合物1。
2、化合物2的合成
将化合物1(10.8g，69.2mmol，1equiv.)溶于100mL甲醇，加入正四丁基三溴化铵(1.7g，3.5mmol，0.05equiv.)和原甲酸三甲酯(TBATB)(11.8g，110.8mmol，1.6equiv.)，室温反应4小时，反应结束后，溶剂旋转蒸发去除得到17.0g黄色油状物化合物2。
3、化合物3的合成
将化合物2(13.0g，64.1mmol，1equiv.)和咪唑(Immidazole)(8.8g，128.7mmol，2equiv.)溶于100mL的二氯甲烷(DCM)中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)(11.6g，77.0mmol，1.2equiv.)，室温反应完全后，过滤去除白色固体，溶剂旋转蒸发去除，得到27.4g黄色油状物化合物3。
4、化合物4的合成
将化合物3(0.923g，2.9mmol，1equiv.)和亚磷酸三甲酯(P(OMe)3)(449μL，3.8mmol，1.3equiv.)溶于15mL二氯甲烷中，降至0℃，搅拌20分钟后，逐滴加入四氯化钛(TiCl4)(391μL，3.5mmol，1.2equiv.)，高效液相色谱监测反应，反应结束后，将反应液倒至饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌至无气泡产生，加入50mL二氯甲烷，有机层用无水硫酸钠干燥，硅胶柱色谱纯化得到0.474g白色固体化合物4。
5、化合物5的合成
将化合物4(8.562g，21.7mmol，1equiv.)溶于10mL的无水四氢呋喃(THF)中，降至-78℃后，逐滴加入二异丙基氨基锂(LDA)(16.3mL，32.6mmol，1.5equiv.)，继续搅拌20分钟后，逐滴加入30mL的金刚烷酮(3.260g，21.7mmol，1equiv.)的无水四氢呋喃溶液，-78℃搅拌15分钟后，恢复至室温继续反应，用高效液相色谱监测反应，反应结束后，加入10mL纯水，过夜搅拌。反应液用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂旋转蒸发去除，得到5.307g白色固体化合物5。
6、化合物6的合成
将化合物5(100mg，0.33mmol，1equiv.)和氢氧化钠(19.7mg，0.49mmol，1.5equiv.)溶于5mL的甲醇中，降至0℃，逐滴加入5mL一氯化碘(53.4mg，0.33mmol，1equiv.)的甲醇溶液，用高效液相色谱监测反应，反应结束后，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，溶剂旋转蒸发去除，硅胶柱色谱纯化得到113mg白色固体化合物6。
7、化合物7(phenol a)的合成
将化合物6(600mg，1.40mmol，1equiv.)溶解于30mL乙腈中，加入三乙胺(292μL，2.10mmol，1.5equiv.)、含丙烯酸甲酯(378μL，4.18mmol，3equiv.)、三(2-甲基苯基)膦(424μL，0.014mmol，0.01equiv.)和醋酸钯(280μL，0.06mmol，0.05equiv.)的乙腈溶液，反应瓶密封，120℃反应2小时后，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，溶剂旋转蒸发去除，硅胶柱色谱纯化得到390mg浅黄色固体化合物7。
8、化合物SHCL的合成
将化合物7(phenol a，19.5mg，0.050mmol，1equiv.)溶于5mL的二氯甲烷中，加入三乙胺(7.7μL，0.055mmol，1.1equiv.)，降至0℃，逐滴加入6mL的2，4-二硝基苯磺酰氯(13.4mg,0.050mmol,1equiv.)的二氯甲烷溶液，用高效液相色谱监测反应，反应结束后，用饱和食盐水洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，直接下步反应使用。加入催化量的亚甲基蓝，黄光照射下鼓入氧气，用高效液相色谱监测反应，反应结束后，溶剂旋转蒸发去除，薄层制备色谱纯化得到21mg浅黄色油状物化合物SHCL。
核磁数据如下：1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.73(d,J＝2.2Hz,1H)，8.48(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H)，8.19(d,J＝8.6Hz,1H)，8.15(d,J＝8.4Hz,1H)，7.61(d,J＝8.4Hz,1H)，7.48(d,J＝16.0Hz,1H)，6.30(d,J＝16.0Hz,1H)，3.67(s,3H)，3.23(s,3H)，2.02–1.98(m,2H)，1.99–1.59(m,12H).13C NMR(600MHz,CDCl3):δ164.75,150.11,147.87,144.56,135.57,135.35,133.88,132.09,131.28,130.28,127.66,125.60,124.16,121.62,120.12,110.35,95.46,51.05,48.78,35.47,32.90,32.65,31.48,31.13,30.53,25.09,24.72.MS(ESI-):m/z C28H27ClN2O12S:650.10(理论值)，可见649.09[M-H]-。
实施例2
本实施例设置硫醇物质、干扰离子与氨基酸作为样品进行测定。
分别配制50μM的GSH、Cys、Hcy、DTT(二硫苏糖醇)、Arg、Gly、His、Lys、Pro、Tyr、Ala、Leu、K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+溶液、2.5％(w/w)过氧化氢溶液、2.5％(w/w)葡萄糖溶液和PBS缓冲液(1mM，pH为7.4)，其中GSH增设一项浓度为1mM。
分别取100μL上述各溶液加于黑色96孔板的孔内，其中空白组为100μL反应缓冲液(即PBS缓冲液)，再向各孔加入100μL的SHCL探针(40μM，溶于0.4％的DMSO中)，由荧光化学发光仪测定信号。上述各干扰物设置三组平行样品进行测定。如图2所示，干扰物不影响SHCL对含巯基化合物的测定。并且发现，光信号的强度与巯基数成正比，二硫苏糖醇DTT结构中含有两个巯基，在相同浓度下，其产生的光信号高于仅含有一个巯基的谷胱甘肽GSH和半胱氨酸Cys；同型半胱氨酸由于比半胱氨酸多出一个亚甲基结构，容易在体外脱水环化生成不含巯基的同型半胱氨酸硫内酯(参见1.HTL JAKUBOWSKI H.,Metabolism ofHomocysteine Thiolactone in Human Cell Cultures:POSSIBLE MECHANISM FORPATHOLOGICAL CONSEQUENCES OF ELEVATED HOMOCYSTEINE LEVELS[J].Journal ofBiological Chemistry,1997,272(3):1935-42；2.JAKUBOWSKI H.,Thepathophysiological hypothesis of homocysteine thiolactone-mediated vasculardisease[J].J Physiol Pharmacol,2008,59Suppl 9(155-67))，因此产生的光信号低。
由于细胞内GSH浓度(0.5-10mM)(参见3.HWANG C,et al.,Oxidized redox stateof glutathione in the endoplasmic reticulum[J].Science,1992,257(5076):1496-502.)比Cys(30-200μM)(参见4.DEBRECENI B,et al.,The Role of Homocysteine-Lowering B-Vitamins in the Primary Prevention of Cardiovascular Disease[J].Cardiovascular Therapeutics，2014，32(3):130-8.)和Hcy(5-15μM)(参见5.KIMURAH.Hydrogen sulfide:its production and functions[J].Exp Physiol,2011,96(9):833-5.)高，我们又测定了较高浓度下GSH(1mM)的光信号，其余硫醇物质及干扰离子与氨基酸浓度均为50μM，可发现，1mM的GSH能够产生更高的光信号。模拟细胞内生物硫醇的浓度，我们猜测，细胞内SHCL产生的信号将主要由谷胱甘肽产生，半胱氨酸及同型半胱氨酸的干扰较小。
实施例3SHCL体外测定谷胱甘肽(GSH)
配制一系列不同浓度(0-50mM)的GSH溶液，各浓度分别取100μL于黑色96孔板小孔内，各孔加入100μL浓度为40μM的SHCL化学发光探针，由Fluoroskan Ascent FL(热电公司，美国)荧光/化学发光仪测定并进行定量分析。如图3所示，响应值随GSH浓度的增加而增大，线性相关性R2＝0.996，检测限为170nM，响应值与GSH浓度之间存在良好的线性关系。
实施例4SHCL测定及成像细胞内源性生物硫醇
将不同数量(0、10、100、1000、5000、10000和50000个细胞/孔)的人乳腺癌细胞MCF-7提前一天接种于黑色96孔板小孔内，第二天待细胞贴壁完全后，吸取去除细胞培养液，各孔加入100μL浓度为20μM的SHCL化学发光探针，由Fluoroskan Ascent FL荧光/化学发光仪测定并进行定量分析。如图4所示，响应值随细胞数量的增加而增大，响应值与细胞数量之间存在良好的线性关系。
将不同数量(0、10、100、1000、5000、10000和50000个细胞/孔)的人宫颈癌细胞HeLa、人乳腺癌细胞MCF-7、人正常乳腺细胞MCF-10a提前一天接种于黑色96孔板小孔内，第二天待细胞贴壁完全后，吸取去除细胞培养液，各孔加入100μL浓度为20μM的SHCL化学发光探针，其中对照组预先加入100μL浓度为1mM的硫醇清除剂(N-琥珀酰亚胺，NEM)，30分钟后，加入100μL浓度为20μM的SHCL化学发光探针，由Xenogen IVIS spectrum拍摄。如图5所示，成像亮度随细胞数量的增加而增加，明显地，相同数量的肿瘤细胞较正常细胞亮度大。
实施例5SHCL对动物体内源性生物硫醇的成像
于雌性裸鼠后肢皮下分别注射50μL空白磷酸盐缓冲液、50μL浓度为5μM的SHCL化学发光探针，其中对照组预先皮下注射50μL浓度为1mM的硫醇清除剂(N-琥珀酰亚胺)，30分钟后皮下注射50μL浓度为5μM的SHCL化学发光探针，由Xenogen活体成像仪拍摄并由仪器自带软件进行定量分析。如图6(a)所示，仅注射SHCL的实验组皮下区域亮度明显比对照组亮度高。
于右肢皮下荷瘤(MCF-7)的雌性裸鼠，瘤内注射50μL浓度为40μM的SHCL化学发光探针，其中对照组预先瘤内注射100μL浓度为1mM的硫醇清除剂(N-琥珀酰亚胺)，45分钟后瘤内注射50μL浓度为40μM的SHCL化学发光探针，由Xenogen活体成像仪拍摄并由仪器自带软件进行定量分析。如图6(b)所示，仅注射SHCL的实验组皮下瘤部位亮度明显比对照组亮度高。
实施例6SHCL体外测定乙酰胆碱酯酶(AchE)活性
配制一系列不同浓度(0、0.98、1.95、3.9、7.8、15.6、31.2和62.5μg/mL)的AchE，各浓度分别取50μL于黑色96孔板小孔内，各孔加入50μL浓度为1mM碘代硫代乙酰胆碱，25℃避光孵育45分钟，各孔加入100μL浓度为40μM的SHCL化学发光探针，由Xenogen活体成像仪拍摄并由仪器自带软件进行定量分析。如图7所示，成像亮度随AchE浓度的增加而增加，y＝8074598x+94923720，R2＝0.992，响应值与细胞数量之间存在良好的线性关系，检测限为0.256μg/mL。
实施例7SHCL细胞毒性测定
为了将SHCL探针进一步应用于细胞及体内的生物硫醇检测，本实施例采用CCK8实验法对其细胞毒性进行了研究，结果如图8所示。由图可知，当SHCL浓度增加至80μM时，与MCF-10a细胞共孵育12小时后，细胞的存活率仍在80％以上，而超过80μM后，探针产生明显的细胞毒性，说明化学发光探针SHCL在80μM以下时对细胞的毒性较小。同时，保持待测物浓度不变，20μM-200μM的探针浓度将产生合适的光信号强度。综上，我们认为20μM-80μM的探针浓度具有良好的细胞相容性与光信号强度，可用于后续研究。

Claims (9)

1.一种化学发光探针，其特征在于，所述化学发光探针的结构式如下：；其中，所述化学发光探针在巯基存在下产生化学发光。
2.如权利要求1所述的化学发光探针，其特征在于，所述巯基以含巯基化合物形式存在，所述含巯基化合物包括生物硫醇。
3.如权利要求2所述的化学发光探针，其特征在于，所述生物硫醇包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽和/或二硫苏糖醇。
4.一种检测乙酰胆碱酯酶活性的方法，其特征在于，包括：
将乙酰胆碱酯酶与等体积的乙酰胆碱酯酶底物混合，避光孵育后加入如权利要求1-3任一项所述的化学发光探针，收集产生的光信号并成像；所述化学发光探针的浓度为20-80μM。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学发光探针的浓度为30-60 μM；和/或，所述乙酰胆碱酯酶的浓度为0.98-62.5 μg/mL；和/或，所述避光孵育的温度为22-28℃，时间为30-60分钟。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学发光探针的浓度为40 μM；和/或，所述避光孵育的温度为25℃，时间为45分钟。
7.一种组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的化学发光探针和药学上可接受的载体。
8.如权利要求1-3任一项所述的化学发光探针或如权利要求7所述的组合物在制备用于检测生物硫醇的试剂或试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒用于检测生物体内的生物硫醇。
CN202110406797.5A 2021-04-15 2021-04-15 化学发光探针及其应用 Active CN115215833B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110406797.5A CN115215833B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 化学发光探针及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110406797.5A CN115215833B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 化学发光探针及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115215833A CN115215833A (zh) 2022-10-21
CN115215833B true CN115215833B (zh) 2024-02-02

Family

ID=83605515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110406797.5A Active CN115215833B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 化学发光探针及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115215833B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115819416B (zh) * 2022-11-29 2024-06-25 遵义医科大学 一种用于检测和区分的多模态化学发光分子及其应用
WO2024152296A1 (zh) * 2023-01-19 2024-07-25 昆明理工大学 一种检测硫醇的化学发光试剂、合成方法及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11241507B2 (en) * 2017-05-24 2022-02-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Near-infrared chemiluminescent probes for in-vivo imaging

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jinyu Sun et al..A Novel Chemiluminescent Probe Based on 1,2-Dioxetane Scaffold for Imaging Cysteine in Living Mice.ACS Sens..2018,第4卷87-92. *
Recent Advances and Challenges in Luminescent Imaging: Bright Outlook for Chemiluminescence of Dioxetanes in Water;Nir Hananya et al.;ACS Cent. Sci.;第5卷;949-959 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115215833A (zh) 2022-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115215833B (zh) 化学发光探针及其应用
Liu et al. A novel red light emissive two-photon fluorescent probe for hydrogen sulfide (H2S) in nucleolus region and its application for H2S detection in zebrafish and live mice
CN110204536B (zh) 一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法
CN111499604B (zh) 一种溶酶体靶向的Cys近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN108997326B (zh) 一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用
US8178669B2 (en) Fluorescent probe for peroxynitrite
Zhu et al. A novel and simple imidazo [1, 2-a] pyridin fluorescent probe for the sensitive and selective imaging of cysteine in living cells and zebrafish
CN104830317B (zh) 一种硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用
CN105419788B (zh) 一种识别硫化氢的小分子荧光探针及其制备方法和应用
Qian et al. A BODIPY–coumarin-based selective fluorescent probe for rapidly detecting hydrogen sulfide in blood plasma and living cells
Cao et al. A sensitive fluorescent probe for imaging biothiol in zebrafish
Chen et al. Rapid and sensitive detection of H2S by a 4-phenylselenium coumarin as a dual-active-site fluorescent probe
CN109336835B (zh) 用于检测髓过氧化物酶活性荧光探针及其制备方法和应用
CN113024523B (zh) 检测成纤维细胞激活蛋白的化学发光探针及其合成方法与应用
CN109232626A (zh) 一种基于二氟硼氧基香豆素的so2比率型荧光探针
CN111072648A (zh) 一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用
Wang et al. A diazabenzoperylene derivative as ratiometric fluorescent probe for cysteine with super large Stokes shift
CN110128440A (zh) 一种检测水溶性环境中生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用
KR20150104911A (ko) 암 진단용 마커 및 이를 이용한 암 진단 방법
CN109776564A (zh) 一种氧杂蒽结构的亚铁离子荧光探针及其合成方法和应用
CN114539183B (zh) 一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针及制备和应用
CN108299450A (zh) 一种检测生物硫醇的荧光探针
Rong et al. Double-channel based fluorescent probe for differentiating GSH and H2Sn (n> 1) via a single-wavelength excitation with long-wavelength emission
CN109180716B (zh) 一种多信号比率型区分检测h2o2和h2s的荧光探针的设计、合成及应用
CN104529841A (zh) 一种类salen型化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant