CN104403663B - 一种检测内源性h2s的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测内源性h2s的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种检测内源性H2S的荧光探针及其制备方法和应用。本发明所述荧光探针由化合物BODInD和氟硼二吡咯甲川在两性表面活性剂中经自组装而制得；所述化合物BODInD为：其中：R1，R2，R3为烷基取代基，R4为烷基取代基、端基炔、酯取代基。本发明提供的检测内源性H2S的荧光探针可用于检测内源性小分子(H2S)，利用了表面活性剂的两亲性而使该荧光探针具有较好的溶解性；本发明所述的荧光探针可以应用于细胞内的生理和病理过程的检测，可用于构建生物体内检测内源性H2S的新型荧光染料。本发明提供的荧光探针对H2S选择性比较好，具有更高的灵敏性。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及可用于构建生物体内检测内源性H2S的新型荧光染料，具体涉及一种检测内源性H2S的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
氟化硼络合二吡咯甲川类(Boron-dipyrromethene，简称BODIPY)荧光染料是一类性能优异的新型荧光染料，具有较高的荧光量子产率和摩尔消光系数，并且表现出很好的光稳定性；染料分子在一定的条件下容易得到或者失去电子，可以用于设计基于电子转移原理的荧光探针，还可以经适当修饰应用在荧光标记和DNA测序中。BODIPY染料由硼桥键和甲川键把两个吡咯环固定在一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生强烈的荧光。BODIPY类荧光染料分子的高度刚性使其具有高的摩尔消光系数，还具有高荧光离子产率、良好的光稳定性、激发波长在可见光区、结构易修饰、发射波长可调至近红外、不易受环境、溶液pH的影响等优点。目前合成此类染料的研究工作仍存在不足，如水溶性差、检测范围比较局限大部分用于检测外源性的小分子等。
发明内容
本发明的第一个目的提供一种检测内源性H2S的荧光探针。
本发明第二个目的是提供一种检测内源性H2S的荧光探针的制备方法。
本发明第三个目的是提供一种检测内源性H2S的荧光探针在检测内源性H2S上的应用。
本发明第四个目的是提供一种用于检测内源性H2S的化合物。
本发明第五个目的是提供一种用于检测内源性H2S的化合物的制备方法。
本发明第六个目的是提供一种用于检测内源性H2S的化合物在检测内源性H2S上的应用。
本发明的技术方案如下：
一种检测内源性H2S的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针由化合物BODInD和氟硼二吡咯甲川在两性表面活性剂中经自组装而制得；
所述化合物BODInD为：
其中：R1，R2，R3为烷基取代基，R4为烷基取代基、端基炔或酯取代基。
所述氟硼二吡咯甲川为下式9所示的结构式：
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，所述荧光探针为纳米球，所述纳米球的外围为两性表面活性剂，内部为化合物BODInD和氟硼二吡咯甲川。
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，所述纳米球的粒径为10-20nm。
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，优选的是，所述两性表面活性剂选自DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)和DSPE-PEG-NH2(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基)中的一种。
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，优选的是，所述烷基取代基为甲基、乙基或正丙基。
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，优选的是，所述端基炔为乙炔或正丙炔。
根据本发明所述检测内源性H2S的荧光探针，优选的是，所述酯取代基为乙酸甲酯或乙酸乙酯。
本发明还提供一种所述检测内源性H2S的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)以酰基乙酸乙酯为原料经成环、水解、脱羧、还原得到烷基吡咯；
(2)以苯甲酰氯为原料经酰化、氯代反应得到苯甲酰吡咯氯；
(3)所述的烷基吡咯与苯甲酰吡咯氯反应生成取代的BODIPY；
(4)所述取代的BODIPY经过醛基化反应，再与吲哚盐缩合得到化合物BODInD；
(5)所述化合物BODInD与氟硼二吡咯甲川在两性表面活性剂的水溶液中形成所述的荧光探针。
所述检测内源性H2S的荧光探针的制备方法，所述两性表面活性剂选自DSPE-PEG和DSPE-PEG-NH2中的一种。
所述检测内源性H2S的荧光探针的制备方法的合成路线如下：
(a)ⅰ:NaNO2,CH3COOH；ⅱ:Zn,1,4-Diacetylmethane；(b)ⅰ:KOH,ethanediol；ⅱ:LiAlH4 dry THF；(c)CH2Cl2,Et3N；(d)ⅰ:pyrrole，POCl3；ⅱ:CuCl2·2H2O；(e)ⅰ:POCl3；ⅱ:BF3·Et2O,Et3N；(f)DMF,POCl3；(g)CH3CN；(h)TFA,DDQ,dryCH2Cl2,BF3·OEt2,anhydrousCH2Cl2.
本发明是BODIPY经过Vilsmeier-Haack醛基化反应，与吲哚盐缩合，自组装等过程，得到能检测内源性H2S小分子的NanoBODIPY。
本发明独创性是基于BODIPY母体和2,3,3-三甲基-3H-吲哚，设计合成了一系列能够检测内源性H2S的NanoBODIPY(如图1所示)，NanoBODIPY是利用自组装的方法，将化合物8和9包裹到一起，进而实现能量传递的效果；图1为NanoBODIPY效果示意图,红色代表化合物8、绿色代表化合物9、外围灰色及灰色折线代表表面活性剂DSPE-PEG，箭头指示是指化合物9给化合物8提供能量，发生了能量传递，进 而使得化合物8荧光增强。
本发明还提供一种用于检测内源性H2S的化合物，其特征在于，所述化合物为BODInD，其结构为：
其中：R1，R2，R3为烷基取代基，R4为烷基取代基、端基炔、酯取代基。
根据所述用于检测内源性H2S的化合物，优选的是，所述烷基取代基为甲基、乙基或正丙基。
根据所述用于检测内源性H2S的化合物，优选的是，所述端基炔为乙炔或正丙炔。
根据所述用于检测内源性H2S的化合物，优选的是，所述酯取代基为乙酸甲酯或乙酸乙酯。
本发明还提供一种所述用于检测内源性H2S的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)以酰基乙酸乙酯为原料经成环、水解、脱羧、还原得到烷基吡咯；
(2)以苯甲酰氯为原料经酰化、氯代反应得到苯甲酰吡咯氯；
(3)所述的烷基吡咯与苯甲酰吡咯氯反应生成取代的BODIPY；
(4)所述取代的BODIPY经过醛基化反应，再与吲哚盐缩合得到化合物BODInD。
所述化合物BODInD(化合物8)的合成路线如下：
(a)ⅰ:NaNO2,CH3COOH；ⅱ:Zn,1,4-Diacetylmethane；(b)ⅰ:KOH,ethanediol；ⅱ:LiAlH4 dry THF；(c)CH2Cl2,Et3N；(d)ⅰ:pyrrole，POCl3；ⅱ:CuCl2·2H2O；(e)ⅰ:POCl3；ⅱ:BF3·Et2O,Et3N；(f)DMF,POCl3；(g)CH3CN。
本发明进一步提供一种所述检测内源性H2S的荧光探针在检测内源性H2S的应用。
本发明进一步提供一种所述用于检测内源性H2S的化合物在检测内源性H2S的应用。
本发明提供的检测内源性H2S的荧光探针的详细制备方法：
(1)化合物1的合成
酰基乙酸乙酯溶于冰醋酸中，滴加亚硝酸钠水溶液，室温反应，向反应体系中再加入1,4-戊二酮，加入锌粉(2-3eq)，升温至40℃-60℃继续反应0.5-1.5h。反应完成后抽滤，萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干得橙红色固体化合物1。
(2)化合物2的合成
将化合物1置于圆底烧瓶中，加入乙二醇，然后加入氢氧化钾，升温至100-160℃回流反应4-8h。反应完成后，萃取，干燥，旋干得米白色固体。然后取该化合物溶于四氢呋喃，冰浴条件下滴入氢化铝锂的四氢呋喃悬浊液中，回流至反应完全。萃取， 干燥，旋干，得到化合物2。
(3)化合物3的合成
取化合物吗啡啉和三乙胺加入到圆底烧瓶中，再向体系中加入适量的DCM搅拌至均匀；向体系中加入的苯甲酰氯；待滴加完成后于室温下反应，待反应完成后，水洗，干燥有机相；旋干溶剂；得到化合物3。
(4)化合物4的合成
在冰浴条件下，取苯甲酰吗啡啉与POCl3混合加入到圆底烧瓶中，室温搅拌均匀至全部溶解，在室温下反应；取吡咯滴加入反应体系中反应；待反应完全，将体系至于冰浴条件下，向其中滴加过量的饱和Na2CO3的水溶液，至没有气泡放出；萃取，干燥；旋干，得到白色固体。然后称取CuCl2·2H2O溶解于适量的CH3CN中，向体系中加入苯甲酰吡咯，升温至40-60℃，待反应完全，将体系冷却到室温，加入10％的H2SO4溶液，搅拌，萃取，干燥，得到化合物4。
(5)化合物8的合成
第一步：化合物5的合成
首先将所用到的仪器全部干燥，取化合物2用DCM溶解，将体系置于冰浴下搅拌，再加入POCl3，将体系升温到室温搅拌；取化合物4用少量的干燥的DCM溶解，滴加到体系中，待反应完全，将体系置于冰浴条件下，滴加过量的饱和Na2CO3溶液，室温反应；待反应完全萃取，干燥、旋干；然后溶于适量的二氯甲烷，加入三乙胺，搅拌；在向体系中加入BF3·OEt2；搅拌均匀，室温反应，待反应完全，分别用饱和NaHCO3水溶液和去离子水洗涤有机相；干燥有机相，旋干得到化合物5。
第二步化合物6的合成
将DMF和三氯氧磷室温搅拌，加入化合物5的无水二氯甲烷溶液，室温反应完后，用饱和NaHCO3水溶液和二氯甲烷萃取，洗涤，干燥，旋干得到化合物6。
第三步：化合物8的合成
将化合物6溶于适量的乙腈中，加入化合物7，化合物6和7的投量比为1.5-2:1，再加入的吡啶，回流反应过夜，冷却至室温，旋干，得到化合物8。
(6)化合物9的合成
将苯甲醛和2,4-二甲基吡咯溶于干燥的DCM中，氮气保护，然后加入三氟乙酸，室温搅拌过夜。DDQ溶于干燥的THF中，加入到反应体系，搅拌反应，然后于冰浴下滴加三乙胺，室温搅拌，逐滴滴加BF3·OEt2，室温搅拌反应完后，除去溶剂，洗涤，干燥，得到化合物9。
(7)NanoBODIPY的合成
将化合物8和化合物9按一定的比例(摩尔比1:1-6:1)加入到两性聚合物的水溶液中，用超声震荡，滤膜过滤，冷冻干燥，即可得检测内源性H2S的荧光探针纳米球。
本发明提供的用于检测内源性H2S的化合物BODInD，如下结构：
其中，可以通过改变R1，R2，R3，R4得到一系列具有特定功能的BODInD(氯代氟硼吡咯吲哚盐)，进而利用自助装的方法合成一系列水溶性较好的检测内源性H2S的NanoBODIPY(纳米微粒)。
本发明所述的两性表面活性剂为DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)，结构式如下：(MW 2000)
表面活性剂DSPE-PEG结构：一端是烷基链是油溶性的，一端是醚链是水溶性的，在形成纳米球之后，油溶性的链包裹在里面溶解化合物8和9，水溶性的裸露在外面增强了水溶性。
术语：
本发明所述自组装，是指基本结构单元(分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质)自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。
Absorption(a.u.)为吸收值。
Fluoresence intensity(a.u.)荧光强度。
BODIPY分子为氟硼二吡咯(BODIPY)。
BODInD分子为化合物8，氯代氟硼吡咯吲哚盐。
I511为511nm的荧光强度。
I589为589nm的荧光强度。
有益技术效果：
本发明提供的检测内源性H2S的荧光探针可用于检测内源性小分子(H2S)，克服了现有技术中用于检测外源性的小分子的缺陷；本发明荧光探针利用了表面活性剂的两亲性而使该荧光探针具有较好的溶解性，解决了传统的荧光探针水溶性差的问题。本发明所述的荧光探针可以应用于细胞内的生理和病理过程的检测，可用于构建生物 体内检测内源性H2S的新型荧光染料。本发明提供的荧光探针对H2S选择性比较好，具有更高的灵敏性。其制备方法比较简单易操作、环境友好、成本低廉、产率较高。
本发明提供的用于检测内源性H2S的化合物BODInD，可用于检测检测内源性H2S，可以应用于细胞内的生理和病理过程的检测，可用于构建生物体内检测内源性H2S的新型荧光染料；化合物BODInD对H2S选择性比较好，具有更高的灵敏性。
附图说明
图1为NanoBODIPY的结构和效果示意图。
图2是化合物BODInD-Cl在PBS缓冲溶液(pH＝7.4,50％CH3CN,v/v))中随光照(λ＝490nm)时间的光谱变化。图(a)紫外吸收光谱图，图(b)荧光发射光谱图。
图3是化合物BODInD-Cl在PBS缓冲溶液(pH＝7.4,50％CH3CN,v/v))中的离子干扰图。
图4是化合物NanoBODIPY1在PBS缓冲溶液(pH＝7.40)中随光照(λ＝490nm)时间的荧光发射光谱图。图(a)为与NaHS反应前后的荧光变化图，图(b)I511/I589的ratio值随时间的变化图。
图5是化合物NanoBODIPY1在PBS缓冲溶液(pH＝7.40)的离子干扰图。
图6是化合物NanoBODIPY1在RAW264.7细胞成像的荧光照片。此图是空白对照图，只加NanoBODIPY1，而不添加H2S的情况下激光共聚焦拍摄的细胞图，图(a)为收集的500nm-550nm范围内绿色荧光图(化合物9的发光图)，图(b)为560nm-620nm之间收集的红色荧光图(BODInD-Cl的发光)，图(c)为(a)和(b)叠加的ratio图，ratio值约为0.9(绿光光强/红光光强)。
图7是化合物NanoBODIPY1在RAW264.7细胞中用氟伐他汀刺激产生H2S，并与之反应之后成像的荧光照片。图(a)为收集的500nm-550nm范围内绿色荧光图(化合物9的发光图)，图(b)为560nm-620nm之间收集的红色荧光图(BODInD-Cl的发光)，图(c)为(a)和(b)叠加的ratio图(绿光光强/红光光强)，ratio值约为4.5。
图8是化合物BODInD-Cl的氢谱，氘代试剂为CDCl3。
图9是化合物BODInD-Cl的碳谱，氘代试剂为CDCl3。
图10是化合物BODInD-Cl的高分辨率质谱HRMS(m/z)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：化合物1的合成
乙酰乙酸乙酯(10.0g，63.2mmol)溶于40ml冰醋酸中，滴加亚硝酸钠(7.90g溶于40ml水)水溶液，室温反应约4h，向反应体系中加入1,4-戊二酮(7.60ml)，加入锌粉(10.60g)，升温至60℃继续反应1h。反应完成后抽滤，萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干得橙红色固体。产率约78％。
实施例2：化合物2的合成
将化合物1(20.00g，9.60mmol)置于圆底烧瓶中，加入乙二醇(80.00ml)，然后加入氢氧化钾(10.00g)，升温至160℃回流反应4h。反应完成后，萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干得米白色固体，产率约96％。然后取8.20g该化合物溶于四氢呋喃，冰浴条件下滴入氢化铝锂(4.54g)的四氢呋喃悬浊液中，85℃下回流4h。反应完全，用饱和的硫酸钠溶液淬灭未反应的氢化铝锂。萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干。用柱层析分离，产物为有刺激气味的棕色液体，产率约为80％。
实施例3化合物3的合成
取化合物吗啡啉(96ml，0.51mol)和三乙胺(60ml，0.43mol)加入到圆底烧瓶中，再向体系中加入适量的DCM搅拌至均匀；用恒压滴液漏斗向体系中加入(84ml，0.73mol)的苯甲酰氯；待滴加完成后于室温下反应，待反应完成后，利用去离子水洗涤3次；用无水Na2SO4干燥有机相；旋干溶剂；得到白色固体。产率85％。
实施例4：化合物4的合成
在冰浴条件下，取苯甲酰吗啡啉(47.6g，0.25mol)与POCl3(25ml，0.27mol)混合加入到圆底烧瓶中，室温搅拌均匀至全部溶解，在室温下反应5.5h；取吡咯(11.05g，0.16mol)滴加入反应体系中反应1h；待反应完全，将体系至于冰浴条件下，向其中缓慢滴加过量的饱和Na2CO3的水溶液，至没有气泡放出；萃取，合并有机相，用无水Na2SO4干燥；旋干，得到白色固体，产率约82.0％。然后称取CuCl2·2H2O(5.97g，0.035mol)溶解于适量的CH3CN中，并向体系中加入苯甲酰吡咯(3.03g，0.018mol)，升温至60℃，待反应完全，将体系冷却到室温，加入10％的H2SO4溶液，混合室温搅拌30min；萃取，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，旋干溶剂，柱层析分离，产物为白色针状固体，产率为50％。
实施例5：化合物8的合成
第一步：化合物5的合成
首先将所用到的仪器全部干燥，取化合物2(1.0g，0.0053mol)用DCM溶解，将体系置于冰浴下搅拌，再迅速加入POCl3(1.0ml，0.011mol，将体系升温到室温搅拌30min；取化合物4(2.60g，0.021mol)用少量的干燥的DCM溶解，滴加到体系中，室温反应待反应完全，将体系置于冰浴条件下，体系中缓慢滴加过量的饱和Na2CO3溶液，置于室温下反应30min；待反应完全萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥、旋干；然后溶于适量的二氯甲烷，加入三乙胺(0.8ml，0.0057mol)，搅拌15min； 在向体系中加入BF3·OEt2(0.8ml，0.0069mol)；搅拌均匀，室温反应24小时，待反应完全，分别用饱和NaHCO3水溶液和去离子水洗涤有机相；用无水Na2SO4干燥有机相；旋干；利用硅胶柱层析分离产物，产物为橙红色带金属光泽固体；产率为50.0％
第二步化合物6的合成
3ml DMF和3ml三氯氧磷室温搅拌10min，随后加入化合物5的无水二氯甲烷溶液，室温反应48小时，用饱和NaHCO3水溶液和二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析，得到金属光泽的棕色固体粉末，产率为80％。
第三步：化合物8的合成
将2mmol的化合物6溶于适量的乙腈中，加入1.76mmol化合物7，加入1.76mmol的吡啶，85℃回流反应过夜，冷却至室温，旋干溶剂，柱层析分离，得紫红色色固体，产率为50％。
其中，可以通过改变R,R1,R2,R3得到一系列检测内源性H2S的BODInD。
化合物BODInD-Cl的氢谱(如图8)，氘代试剂为CDCl3。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.06-1.09(t,3H),1.29(s,3H),1.52(s,3H),1.51-1.55(t,3H),1.78(s,6H),2.39-2.45(q,2H),4.90-4.95(q,2H),7.43-7.44(m,2H),7.51-7.65(m,8H),8.02(s,1H),8.05-8.09(d,1H).
化合物BODInD-Cl的碳谱(如图9)，氘代试剂为CDCl3。
13C NMR(100MHz,CDCl3):δ12.8,13.9,17.3,27.5,29.7,31.4,36.4,43.5,51.8,110.2,114.5,122.5,123.3,128.9,129.1,129.5,129.64,130.5,131.7,135.4,136.2,139.3,140.2,140.5,140.9,142.9,144.4,144.5,162.5,168.5,180.5.
化合物BODInD-Cl的高分辨率质谱HRMS(m/z)(如图10):Calcd forC33H34BClF2N3:556.2502,found:556.2501for[M-Br]+.
实施例6：化合物9的合成
将苯甲醛(2g，0.0188mol)和2,4-二甲基吡咯(3.9ml，0.0377mol)溶于干燥的DCM于100ml圆底烧瓶中，加氮气保护室温搅拌3小时，然后加入360μL的三氟 乙酸，室温搅拌过夜。DDQ(1.08g，0.0048mol)溶于干燥的THF中，加入到反应体系，搅拌4小时，然后于冰浴下滴加三乙胺(2ml，0.0143mol)，室温搅拌0.5小时，逐滴滴加BF3·OEt2(3.2ml，0.0276mol)，室温搅拌24小时，除去溶剂，分别用DCM和水洗涤，合并有机相，旋干后无水硫酸钠干燥，柱层析分离，得有金属光泽的红色固体，产率为50％。
实施例7：NanoBODIPY的合成
将化合物8和化合物9按摩尔比2:1加入到两性聚合物的水溶液中，用超声震荡2min，用0.2μm的滤膜过滤，然后冷冻干燥，即可得如图1中所示的NanoBODIPY纳米球，纳米球的粒径为15nm。
效果例：
参看图2化合物BODInD-Cl在PBS缓冲溶液(pH＝7.4,50％CH3CN,v/v))中随光照(λ＝490nm)时间的光谱变化。图(a)紫外吸收光谱图，图(b)荧光发射光谱图。
由图中得出：化合物BODInD-Cl在没有加入NaHS的情况下，其在缓冲溶液中的紫外吸收波长在540nm，最大荧光发射波长在590nm。而加入100μMNaHS后，化合物BODInD-Cl与NaHS在一分钟之内反应完全，紫外吸收出现了很大的红移，由原来的540nm红移到738nm如图3，荧光发生淬灭。由此可以看出BODInD-Cl对H2S具有很高的灵敏性。
参看图3化合物BODInD-Cl在PBS缓冲溶液(pH＝7.4,50％CH3CN,v/v)中的离子干扰图。图中曲线分别为向BODInD-Cl在PBS缓冲溶液加入1mM的干扰离子a:Free；b:Cl-；c:Br-；d:I-；e:F-；f:OAc-；g:N3 -；h:NO2 -；i:HCO3 -；j:SO4 2-；k:S2O3 2-l:HPO4 2-；m:GSH；n:Cys；o:NaHS；p:Cys(1mM)+NaHS；q:GSH(1mM)+NaHS，于37℃恒温反应30min之后的荧光变化图，由图可以看出BODInD-Cl选择性比较好，只对H2S 有响应，排除了其他离子的干扰。
参看图4化合物NanoBODIPY1在PBS缓冲溶液(pH＝7.40)中随光照(λ＝490nm)时间的荧光发射光谱图。图(a)为与NaHS反应前后的荧光变化图，未加入NaHS时，NanoBODIPY1在511nm和589nm处均有荧光，I511/I589的ratio值约为1.7，在加入100μM的NaHS后589nm处荧光减弱，511nm处荧光大大增强，ratio值增大到14，图(b)I511/I589的ratio值随时间的变化图，由此可以看出在短时间内可以反应完全，说明了NanoBODIPY1对NaHS具有很高的灵敏度。
参看图5化合物NanoBODIPY1在PBS缓冲溶液(pH＝7.40)的离子干扰图。
图中曲线分别为向NanoBODIPYl在PBS缓冲溶液加入1mM的干扰离子a:Free；b:Cl-；c:Br-；d:I-；e:F-；f:OAc-；g:N3 -；h:NO2 -；i:HCO3 -；j:SO4 2-；k:S2O3 2-l:HPO4 2-；m:GSH；n:Cys；o:NaHS；p:Cys(1mM)+NaHS；q:GSH(1mM)+NaHS，于37℃恒温反应30min之后的荧光变化图，由图可以看出NanoBODIPYl具有较高的特异选择性，只对H2S有响应，排除了其他离子的干扰。
参看图6化合物NanoBODIPY1在RAW264.7细胞成像的荧光照片。
此图是空白对照图，只加NanoBODIPY1，而不添加H2S的情况下激光共聚焦拍摄的细胞图，图(a)为收集的500nm-550nm范围内绿色荧光图(化合物9的发光图)，图(b)为560nm-620nm之间收集的红色荧光图(BODInD-Cl的发光)，图(c)为(a)和(b)叠加的ratio图，ratio值约为0.9(绿光光强/红光光强)。
参看图7化合物NanoBODIPY1在RAW264.7细胞中用氟伐他汀刺激产生H2S，并与之反应之后成像的荧光照片。图(a)为收集的500nm-550nm范围内绿色荧光图(化合物9的发光图)，图(b)为560nm-620nm之间收集的红色荧光图(BODInD-Cl的发光)，图(c)为(a)和(b)叠加的ratio图(绿光光强/红光光强)，ratio值约为4.5， 由此可以看出NanoBODIPY1中包裹的化合物8已经与产生的内源性H2S发生了反应，因此NanoBODIPY1可以用来检测内源性的H2S。
本发明所要求保护的荧光探针经实验证明均具有类似上述效果例所述的功能，即本发明提供的检测内源性H2S的荧光探针和化合物BODInD；
其中化合物BODInD：
其中：R1，R2，R3选自甲基、乙基或正丙基，R4为选自甲基、乙基、正丙基、乙炔或正丙炔、乙酸甲酯或乙酸乙酯。
本发明提供的检测内源性H2S的荧光探针可用于检测内源性小分子(H2S)，克服了现有技术中用于检测外源性的小分子的缺陷；本发明荧光探针利用了表面活性剂的两亲性而使该荧光探针具有较好的溶解性，解决了传统的荧光探针水溶性差的问题。本发明所述的荧光探针可以应用于细胞内的生理和病理过程的检测，可用于构建生物体内检测内源性H2S的新型荧光染料。本发明提供的荧光探针对H2S选择性比较好，具有更高的灵敏性。
本发明提供的用于检测内源性H2S的化合物BODInD，可用于检测检测内源性H2S，可以应用于细胞内的生理和病理过程的检测，可用于构建生物体内检测内源性H2S的新型荧光染料；化合物BODInD对H2S选择性比较好，具有更高的灵敏性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的主要用途。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和 改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (7)
1.一种检测内源性H2S的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针由化合物BODInD和氟硼二吡咯甲川在两性表面活性剂中经自组装而制得；
所述化合物BODInD结构式为：
其中：R1，R2，R3为烷基取代基，R4为烷基取代基、端基炔或酯取代基；
所述两性表面活性剂选自DSPE-PEG和DSPE-PEG-NH2中的一种；
所述烷基取代基为甲基、乙基或正丙基；所述端基炔为乙炔或正丙炔；所述酯取代基为乙酸甲酯取代基或乙酸乙酯取代基。
2.根据权利要求1所述检测内源性H2S的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为纳米球，所述纳米球的外围为两性表面活性剂，内部为化合物BODInD和氟硼二吡咯甲川。
3.根据权利要求2所述检测内源性H2S的荧光探针，其特征在于，所述纳米球的粒径为10-20nm。
4.一种权利要求1所述检测内源性H2S的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)以酰基乙酸乙酯为原料经成环、水解、脱羧、还原得到烷基吡咯；
(2)以苯甲酰氯为原料经酰化、氯代反应得到苯甲酰吡咯氯；
(3)所述的烷基吡咯与苯甲酰吡咯氯反应生成取代的BODIPY；
(4)所述取代的BODIPY经过醛基化反应，再与吲哚盐缩合得到化合物BODInD；
(5)所述化合物BODInD与氟硼二吡咯甲川在两性表面活性剂的水溶液中形成所述的荧光探针。
5.一种权利要求1所述检测内源性H2S的荧光探针中化合物BODInD的制备方法，包括如下步骤：
(1)以酰基乙酸乙酯为原料经成环、水解、脱羧、还原得到烷基吡咯；
(2)以苯甲酰氯为原料经酰化、氯代反应得到苯甲酰吡咯氯；
(3)所述的烷基吡咯与苯甲酰吡咯氯反应生成取代的BODIPY；
(4)所述取代的BODIPY经过醛基化反应，再与吲哚盐缩合得到化合物BODInD。
6.一种权利要求1所述检测内源性H2S的荧光探针在检测内源性H2S的应用。
7.一种权利要求5所述检测内源性H2S的荧光探针中化合物BODInD的制备方法制备的化合物BODInD在检测内源性H2S的应用。
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