CN102344794B - 一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用涉及一类在ONOO-存在下荧光发生增强，在还原性物质存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的可逆荧光探针。本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与ONOO-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO-；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。
Description
技术领域：
本发明涉及一类用于可逆检测过氧化亚硝酰(ONOO-)的荧光探针，具体的说，是一类在ONOO-存在下荧光发生增强，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。
背景技术：
过氧化亚硝酰(ONOO-)是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。ONOO-能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量ONOO-的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对ONOO-在生命体系中作用行为的研究。
荧光探针是有效检测生命体内ONOO-的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Tetsuo Nagano等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF(结构见图1，T.Nagano et.al，J.Bio.Chem，2003，278，3170)，与ONOO-作用后荧光增强从而检测ONOO-的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测ONOO-，也不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-1(结构见图1，Dan Yang et.al，J.Am.Chem.Soc，2006，128，6004)，次氯酸根不干扰ONOO-的检测，但羟自由基对ONOO-检测的干扰很大，并且这种探针不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。最近，Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-2(结构见图1，Dan Yang et.al，Org.Lett.，2009，11，1887)，该探针仍然对羟自由基有较强响应，并且不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。由于不具有可逆性，上述探针无法准确提供生物体系中由ONOO-引起的氧化应激随时间变化的情况，不具有应用前景。开发具有选择性，可用于生物体系中ONOO-实时可逆检测的荧光探针具有重要意义。
发明内容：
本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的可逆荧光探针，此探针可以选择性地与ONOO-作用，作用后荧光强度发生改变，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与ONOO-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO-；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。
所述的荧光探针的通式为：
通式Ⅰ：R1-Se-R2-Y-R7，
通式Ⅰ中，R1为C1-20的烷基，R2为C1-15的烷基；
Y为R′-C-R″，NR’，O，S，或Se，其中R’，R”为H或C1～C10的烷基；R’、R”相同或不同；
R7为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。
当R7为七甲川花菁时，所述荧光探针的通式为：
通式Ⅲ
R3为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；
R4为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；
R5、R6为H、C1～C20的烷基、磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R5、R6相同或不同；
R5或R6为环烷基时，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。
将通式Ⅰ应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式Ⅱ结构的化合物，从而导致荧光的改变；
通式Ⅱ；
具有通式Ⅱ结构的化合物，在还原性物质存在下，重新变为具有通式Ⅰ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。
所述还原性物质为半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白。
将通式Ⅲ应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式Ⅳ结构的化合物，从而导致荧光的改变；
通式Ⅳ
具有通式Ⅳ结构的化合物，在还原性物质存在下，重新变为具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。
通式Ⅰ可对ONOO-进行定性、定量的检测。
将浓度呈梯度变化的过氧化亚硝酰水溶液分别加入通式Ⅰ的水溶液中，分别测定加入后各体系的荧光强度，然后以过氧化亚硝酰溶液的浓度和加入后体系的荧光强度为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度，即可从图中读出溶液中过氧化亚硝酰的含量。
用通式Ⅰ测定生物体系中的ONOO-，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的ONOO-的进行实时可逆检测。
通式Ⅲ所代表的化合物，本身荧光很弱，可以特异性地与ONOO-迅速作用，生成通式Ⅳ所代表的的硒氧化物，同时荧光增强；
通式Ⅳ所代表的具有较强荧光的硒氧化物与还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等作用会重新回到具有通式Ⅲ所代表的结构的化合物，相应的荧光也变回初始的较弱的状态。
具有通式Ⅲ结构的化合物用作ONOO-荧光探针测定生物体系中的ONOO-，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的ONOO-的进行实时可逆检测；具体的说就是，当生物体系中ONOO-的浓度增加时，其与探针作用而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物的浓度增加，从而导致荧光增强；在此基础上，当生物体系中还原性物质增加时，ONOO-的浓度降低，先前被ONOO-氧化而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物也会被还原到具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光减弱。
所述荧光探针与ONOO-作用后荧光增强是由于生成了具有通式Ⅳ结构的化合物。也就是说，荧光探针与被检测物种作用后荧光发生增强并不是荧光探针本身的荧光发生了增强，而是其氧化产物使检测体系的荧光增强了。
硒原子是本发明所述荧光探针的反应中心。即硒原子提供具有通式Ⅲ结构的化合物与ONOO-选择性作用的活性中心，也提供具有通式Ⅳ结构的化合物与还原性物质如半胱氨酸作用的活性中心。同时，本发明所述荧光探针的荧光变化也是由有机硒片段的氧化还原状态调节。具有通式Ⅲ结构的化合物，其硒原子具有很强的给电子能力，容易通过光诱导电子转移过程猝灭花菁母体的荧光，使具有通式Ⅲ结构的化合物的荧光减弱；具有通式Ⅲ结构的化合物与ONOO-作用后变为具有通式Ⅳ结构的化合物，具有通式Ⅳ结构的化合物其硒原子由于被氧化而不再具有强的给电子能力，不能有效猝灭花菁母体的荧光，从而出现体系荧光增强的现象。
本发明的有益效果：
这类化合物用作过氧化亚硝酰荧光探针，在过氧化亚硝酰存在下荧光发生增强，再在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白等存在下荧光恢复原来状态，可用于过氧化亚硝酰的实时可逆检测。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞内过氧化亚硝酰的实时可逆检测，这对深入研究过氧化亚硝酰在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解过氧化亚硝酰的生理和毒理作用具有重要意义。
附图说明：
图1背景技术中所举的已公开的过氧化亚硝酰荧光探针结构示意图；
图2本发明提供的探针检测原理示意图；
图3实施例1中合成FSe-1的反应方程式；
图4实施例2所采用的荧光探针FSe-1在不同PH值下的荧光强度示意图；
图5实施例2所采用的荧光探针对ONOO-的选择性示意图；图5中：1、空白，2、过氧化亚硝酰，3、一氧化氮，4、双氧水，5、羟基自由基，6、单线态氧，7、超氧阴离子，8、脂质过氧化物，9、过氧化叔丁醇，10、枯烯氢过氧化物，11、次氯酸根；
图6(a)表示实施例3所采用的荧光探针FSe-1的荧光强度随ONOO-浓度变化的示意图；图6(b)表示实施例所采用的荧光探针FSe-1荧光强度随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线；
图7表示实施例4所采用的荧光探针FSe-1的可逆性示意图；1.半胱氨酸；2.还原型谷胱甘肽；3.金属硫蛋白；4.Vc；5.尿酸；6.酪氨酸；7.组氨酸；8.氢醌；
图8a、b、c、d表示实施例5所采用的荧光探针FSe-1用于检测细胞内ONOO-的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式：
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1(探针的合成)：
如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号FSe-1表示，合成探针化合物所用的花菁母体用代号Cy7-Cl-1表示。
FSe-1的合成：0.6g Cy7-Cl-1(可购买获得)和2.5g对苯硒基苯胺(Gaythwait，J.Chem.Soc.，1928，2289.)溶于20ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，加热至60～150℃反应2小时。真空下蒸去溶剂，所得固体经柱层析纯化得目标化合物FSe-1。
1H NMR(400MHz，CDCl3-D1)δ(ppm)：8.49(s，1H)，7.42-7.29(m，7H)，7.24-7.20(m，4H)，7.15-6.93(m，6H)，5.85-5.80(m，3H)，5.30(s，1H)，3.98-4.11(t，2H)，3.41-3.42(d，2H)，2.05-2.09(t，4H)，2.05-1.66(m，8H)，1.42(m，12H).13C NMR(CDCl3-D1，100MHz)δ(ppm)：170.50，159.00，147.39，144.03，143.65，142.22，141.09，136.50，133.28，131.19，129.12，128.39，126.56，125.43，124.23，122.37，120.87，118.80，118.01，117.87，109.39，109.26，97.95，97.45，69.92，48.96，48.73，39.28，30.97，28.49，24.86，21.74，19.00，14.34，12.08；
GC-MS(API-ES)：m/z C46H50N3Se+ Calcd 724.3164，found 724.3194.。
也可将反应混合物倾入水中，过滤后收集固体，进一步纯化得FSe-1。
实施例2(FSe-1对ONOO-的选择性)：
PH采用PBS缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10.0μM FSe-1，再加入20mM PBS，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡1min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光强度随PH的变化如图4所示。图4表明在PH4.0～8.5的范围内FSe-1的荧光强度没有明显变化，即在PH 4.0～8.5的体系中，都可以使用FSe-1检测ONOO-。
为尽可能模拟生理条件，以下各项实验均在PH＝-7.4条件下进行(PBS缓冲溶液，浓度为20mM)，探针浓度仍采用10.0μM。
于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入20mM PBS pH 7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入各种待测物(空白实验不加待测物)，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。FSe-1对ONOO-的选择性如图5所示。图5表明FSe-1对ONOO-具有很好的选择性，体系荧光增强。测定条件下NO和双氧水也能使探针荧光增强，但增加程度仅为ONOO-的10％左右。超氧负离子、单线态氧、过氧化脂肪酸、过氧叔丁醇等不能使探针荧光增强。
实施例3(FSe-1对ONOO-的定量检测)：
于10ml比色管中加入10.0μM FSe-1，再加入20mM PBS pH 7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入不同浓度过氧化亚硝酰，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱，取各荧光光谱最大值，输入软件OriginPro 8.0，得到线性工作曲线。
定容后过氧化亚硝酰浓度：0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0μM.
图6(a)表示随ONOO-浓度的变化体系荧光强度及位移的变化，表明随ONOO-浓度的增加，体系荧光在明显增强的同时发生蓝移；图6(b)表示荧光强度随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.9956，表明探针能定量的测定ONOO-的浓度。
实施例4(FSe-1的可逆性)：
于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入20mM PBS pH 7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入过氧化亚硝酰10.0μM，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。将荧光皿中的工作液倒回比色管中，加入10.0μM还原性物质(还原性物质包括半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白、Vc、尿酸、酪氨酸、组氨酸、氢醌，摇匀，平衡10min，将工作液倒入荧光皿测定光谱强度。图7表示在FSe-1与ONOO-作用后的残液中加入还原性化合物后体系荧光的变化。图7表明还原性巯基化合物如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等能有效的还原FSe-1的氧化产物，即具有通式Ⅳ结构的化合物，重新生成荧光较弱的FSe-1。其中，半胱氨酸和还原型谷胱甘肽使体系荧光强度降低95％以上，金属硫蛋白使体系荧光降低50％左右。图7表明FSe-1作为ONOO-荧光探针具有可逆性，能实时检测ONOO-的浓度变化。
实施例5(FSe-1用于细胞内ONOO-的可逆检测)：
FSe-1 murine microglial N9细胞按照American type Tissue CultureCollection规定进行培养。10.0uM孵育murine microglia N9细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图8a所示；然后10.0uM 5-氨基-3-(4-吗啉基)-1，2，3-恶二唑鎓(ONOO-源)孵育细胞10分钟，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图8b所示，荧光强度明显增强；再用30uM还原谷胱甘肽孵育细胞10分钟后，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图8c所示，荧光强度又减弱。图8d表示细胞的明场。
Claims (5)
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的结构为：
2.一种权利要求1所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，将结构I表示的化合物应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用，生成具有结构II的化合物，从而导致荧光的改变；
具有结构II的化合物，在还原性物质存在下，重新变为具有结构I的化合物，从而导致荧光的恢复，此过程可定性检测ONOO-。
3.根据权利要求2所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，所述还原性物质为半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白。
4.根据权利要求2所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，结构I可对ONOO-进行定量检测。
5.根据权利要求2所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，用结构I测定生物体系中的ONOO-，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的ONOO-的进行实时可逆检测。
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