CN104119860A - 用于实时可逆检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

用于实时可逆检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用涉及一种在ONOO^-存在下荧光发生增强，在还原性物质存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性地实时检测溶液体系、细胞、动物组织或动物个体内ONOO^-变化的可逆荧光探针。本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机碲结构作为与ONOO^-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO^-；利用有机碲醚被氧化后形成的有机碲氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机碲醚的性质，实现探针分子对ONOO^-的可逆性检测。

Description

用于实时可逆检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用

技术领域：

本发明涉及一种用于可逆检测过氧化亚硝酰（ONOO^-）的荧光探针，具体的说，是一种在ONOO^-存在下荧光发生增强，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。 

背景技术：

过氧化亚硝酰（ONOO^-）是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。ONOO^-能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量ONOO^-的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对ONOO^-在生命体系中作用行为的研究。 

荧光探针是有效检测生命体内ONOO^-的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Tetsuo Nagano等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF（结构见图1，T.Nagano et.al,J.Bio.Chem,2003,278,3170），与ONOO^-作用后荧光增强从而检测ONOO^-的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测ONOO^-，也不具有可逆性，不能用于ONOO^-的实时检测。Dan Yang等公开了一种检测ONOO^-的荧光探针HKGreen-1（结构见图1，Dan Yang et.al,J.Am.Chem.Soc,2006,128,6004）,次氯酸根不干扰ONOO^-的检测，但羟自由基对ONOO^-检测的干扰很大，并且这种探针不具有可逆性，不能用于ONOO^-的实时检测。最近，Dan Yang等公开了一种检测ONOO^-的荧光探针HKGreen-2（结构见图1，Dan Yang et.al,Org.Lett.,2009,11,1887），该探针仍然对羟自由基有较强响应，并且不具有可逆性，不能用于ONOO^-的实时检测。由于不具有可逆性，上述探针无法准确提供生物体系中由ONOO^-引起的氧化应激随时间变化的情况，不具有应用前景。开发具有选择性，可用于溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中ONOO^-实时可逆检测的荧光探针具有重要意义。 

发明内容：

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO^-的可逆荧光探针，此探针可以选择性地与ONOO^-作用，作用后荧光强度发生改变，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。 

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机碲结构作为与ONOO^-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO^-；利用有机碲被氧化后形成的有机碲氧化物容 易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机碲醚的性质，实现探针对过氧化亚硝酰的可逆性检测。 

所述的荧光探针的通式为： 

通式Ⅰ：R₁-Te-R₂-Y-F， 

通式Ⅰ中，R₁为1～20个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为1-5个； 

R2为1～20个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为1-5个； 

Y为O、S、Se、NR′R"、NR′-CO、NR′-CS、NR′-NR′-CO或NR′-NR′-CS;其中R′和R"分别为H或C₁～C₁₀的烷基,R′和R"相同或不同； 

F为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。 

F为七甲川花菁时，所述荧光探针的通式为： 

R₃为C₁～C₂₀的烷基，最佳为C₁～C₁₀的烷基； 

R₄为C₁～C₂₀的烷基，最佳为C₁～C₁₀的烷基； 

Y为O、S、Se、NR′R"、NR′-CO、NR′-CS、NR′-NR′-CO或NR′-NR′-CS;其中R′和R"分别为H或C₁～C₁₀的烷基,R′和R"相同或不同； 

R₅、R₆分别为H、C₁～C₂₀的烷基、磺酸基、羧基、环烷基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R₅、R₆相同或不同。 

R₅或R₆为环烷基时，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。 

将通式Ⅰ应用于检测ONOO^-时，其是与ONOO^-作用，生成具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光的改变； 

具有通式Ⅲ结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式I结构的化合物，从而导致荧光的恢复，此过程可定性检测ONOO^-。 

将通式Ⅱ应用于检测ONOO^-时，其是与ONOO^-作用，生成具有通式Ⅳ结构的化合物，从而导致荧光的改变； 

具有通式Ⅳ结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式Ⅱ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。 

通式Ⅰ可对ONOO^-进行定量检测。 

用通式Ⅰ测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-进行实时可逆检测。 

将浓度呈梯度变化的过氧化亚硝酰水溶液分别加入通式Ⅰ的水溶液中，分别测定加入后各体系的荧光强度，然后以过氧化亚硝酰溶液的浓度和加入后体系的荧光强度为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度，即可从图中读出溶液中过氧化亚硝酰的含量。 

通式Ⅱ所代表的化合物，本身荧光很弱，可以特异性地与ONOO^-迅速作用，生成通式Ⅳ所代表的的碲氧化物，同时荧光增强； 

通式Ⅳ所代表的具有较强荧光的碲氧化物与还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等作用会重新回到具有通式Ⅲ所代表的结构的化合物，相应的荧光也变回初始的较弱的状态。 

具有通式Ⅱ结构的化合物用作ONOO^-荧光探针测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-的进行实时可逆检测；具体的说就是，当溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中ONOO^-的浓度增加时，其与探针作用而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物的浓度增加，从而导致荧光增强；在此基础上，当溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白增加时，ONOO^-的浓度降低，先前被ONOO^-氧化而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物也会被还原到具有通式Ⅱ结构的化合物，从而导致荧光减弱。 

具有通式Ⅱ结构的化合物用作ONOO^-荧光探针测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-，其浓度为1μM-1mM。 

所述荧光探针与ONOO^-作用后荧光增强是由于生成了具有通式Ⅳ结构的化合物。也就是说，荧光探针与被检测物种作用后荧光发生增强并不是荧光探针本身的荧光发生了增强，而是其氧化产物使检测体系的荧光增强了。 

碲原子是本发明所述荧光探针的反应中心。即碲原子提供具有通式Ⅱ结构 的化合物与ONOO^-选择性作用的活性中心，也提供具有通式Ⅳ结构的化合物与还原性物质如半胱氨酸作用的活性中心。同时，本发明所述荧光探针的荧光变化也是由有机碲片段的氧化还原状态调节。具有通式Ⅱ结构的化合物，其碲原子具有很强的给电子能力，容易通过光诱导电子转移过程猝灭花菁母体的荧光，使具有通式Ⅱ结构的化合物的荧光减弱；具有通式Ⅱ结构的化合物与ONOO^-作用后变为具有通式Ⅳ结构的化合物，具有通式Ⅳ结构的化合物其碲原子由于被氧化而不再具有强的给电子能力，不能有效猝灭花菁母体的荧光，从而出现体系荧光增强的现象。 

本发明的有益效果： 

这类化合物用作过氧化亚硝酰荧光探针，在过氧化亚硝酰存在下荧光发生增强，再在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白等存在下荧光恢复原来状态，可用于过氧化亚硝酰的实时可逆检测。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞内过氧化亚硝酰的实时可逆检测，这对深入研究过氧化亚硝酰在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解过氧化亚硝酰的生理和毒理作用具有重要意义。 

附图说明：

图1背景技术中所举的已公开的过氧化亚硝酰荧光探针结构示意图； 

图2本发明提供的探针检测原理示意图； 

图3实施例1中合成Cy-Te的反应方程式； 

图4实施例2所采用的荧光探针对ONOO^-的选择性示意图，图4中，分别用待测物平衡0,5,10,15,20,25和30min后测的荧光强度：1、过氧化亚硝酰，2、一氧化氮，3、双氧水，4、过氧化叔丁醇，5、枯烯氢过氧化物，6、脂质过氧化物，7、羟基自由基，8、超氧阴离子，9、次氯酸根； 

图5（a）表示实施例3所采用的荧光探针Cy-Te的荧光强度随ONOO^-浓度变化的示意图；图5（b）表示实施例所采用的荧光探针Cy-Te荧光强度随ONOO^-浓度变化的线性拟合曲线； 

图6表示实施例4所采用的荧光探针Cy-Te的可逆性示意图，图6中，分别用还原剂平衡0,3,5,20和30min；1.半胱氨酸；2.还原型谷胱甘肽；3.硫氧还蛋白；4.金属硫蛋白；5.Vc；6.Ve；7.尿酸；8.组氨； 

图7a、b、c、d、e表示实施例5所采用的荧光探针Cy-Te用于检测细胞内ONOO^-的共聚焦显微镜照片。图7f分别表示图7a、b、c、d、e所代表的荧光强度的平均值。 

具体实施方式：

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。 

实施例1（探针的合成）： 

如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号Cy-Te表示，合成探针化合物所用的花菁母体用代号Cy7-Cl-1表示。 

Cy-Te的合成：0.30g Cy7-Cl-1（可购买获得）和0.32g化合物1在氩气下溶于10ml无水乙腈中，加热至40℃反应12小时。真空下蒸去溶剂，所得固体 经柱层析纯化得目标化合物Cy-Te。 

¹H NMR(400MHz,CD₃OD-D⁴)δ(ppm):8.92(1H,m),8.09(1H,m),7.88(1H,m),7.54-7.05(12H,m),6.69-6.49(3H,m),6.00(1H,s),5.18(1H,s),4.44-3.99(6H,m),2.87(1H,s),2.59(4H,t),1.78-1.30(20H,m).¹³C NMR(CD₃OD-D⁴,100MHz)δ(ppm):178.03,175.96,169.18,167.68,153.33,136.90,136.69,135.11,131.83,130.81,128.86,128.63,128.07,127.92,126.29,126.04,125.54,123.01,122.30,122.23,118.41,114.05,110.27,97.52,50.12,48.46,46.48,45.42,43.10,29.69,28.11,27.05,26.00,23.50,20.29.¹²⁵Te NMR(157MHz,DMSO-D⁶)δ(ppm):969.71. 

LC-MS(API-ES):m/z C₄₇H₅₁N₄OTe⁺Calcd.817.3120,found[M]817.3022,[M-2H]815.1387. 

实施例2（Cy-Te对ONOO^-的选择性）： 

为尽可能模拟生理条件，以下各项实验均在PH=7.4条件下进行（PBS缓冲溶液，浓度为10mM），探针浓度仍采用10.0μM。 

于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入10mM PBS pH7.4到10ml，摇匀，然后加入各种待测物。摇匀溶液，分别平衡0,5,10,15,20,25和30min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。Cy-Te对ONOO^-的选择性如图4所示。图4表明Cy-Te对ONOO^-具有很好的选择性，体系荧光增强。测定条件下双氧水也能使探针荧光增强，但增加程度仅为ONOO^-的10%左右。超氧负离子、单线态氧、过氧化脂肪酸、过氧叔丁醇等不能使探针荧光增强。 

实施例3（Cy-Te对ONOO^-的定量检测）： 

于10ml比色管中加入10.0μM Cy-Te，再加入10mM PBS pH7.4至10ml，摇匀，然后加入不同浓度过氧化亚硝酰。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱，取各荧光光谱最大值，输入软件OriginPro8.5,得到线性工作曲线。 

定容后过氧化亚硝酰浓度：0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μM. 

图5（a）表示随ONOO^-浓度的变化体系荧光强度的变化，表明随ONOO^-浓度的增加，体系荧光在明显增强；图5（b）表示荧光强度随ONOO^-浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.963，表明探针能定量的测定ONOO^-的浓度。 

实施例4（Cy-Te的可逆性）： 

于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入10mM PBS pH7.4到10ml，摇匀，然后加入过氧化亚硝酰10.0μM。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。将荧光皿中的工作液倒回比色管中，加入20.0μM还原性物质（还原性物质包括半胱氨酸；还原型谷胱甘肽；硫氧还蛋白；金属硫蛋白；Vc；Ve；尿酸；组氨；摇匀，分别平衡0,3,5,20和30min，将工作液倒入荧光皿测定光谱强度。图6表示在Cy-Te与ONOO^-作用后的残液中加入还原性化合物后体系荧光的变化。图6表明还原性巯基化合物如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等能有效的还原Cy-Te的氧化产物，即具有通式Ⅳ结构的化合物，重新生成荧光较弱的Cy-Te。其中，半胱氨酸和还原型谷胱甘肽使体系荧光强度降低95%以上，金属硫蛋白使体系荧光降低50%左右。图6表明Cy-Te 作为ONOO^-荧光探针具有可逆性，能实时检测ONOO^-的浓度变化。 

实施例5（Cy-Te用于细胞内ONOO^-的可逆检测）： 

Cy-Te RAW264.7细胞按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。1.0uM孵育RAW264.7细胞5分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图7a所示；RAW264.7细胞用1.0μM探针哺育，再用脂多糖(1μg/mL)和干扰素-γ(50ng/mL)哺育4小时，然后用伏波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐(10nM)刺激0.5h，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7b所示，荧光强度明显增强；图7b的细胞用氨基胍(1mM)和谷胱甘肽转移酶(250units/mL)孵育细胞10分钟后，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7c所示，荧光强度又减弱；探针哺育的细胞用100μM5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑鎓（ONOO^-源）哺育20分钟，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7d所示，荧光增强；图7d的细胞用半胱氨酸(1mM)和谷胱甘肽转移酶(250units/mL)哺育15分钟后，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7e所示。 

实施例6将实施例5中在不同操作下所得的共聚焦显微镜照片（图7a、b、c、d、e）分别进行定量统计，所得的荧光强度的平均值见图7f。 

Claims (7)

1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为：

通式Ⅰ：R₁-Te-R₂-Y-F，

通式Ⅰ中，R₁为1～20个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为1-5个；

R₂为1～20个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为1-5个；

Y为O、S、Se、NR′R"、NR′-CO、NR′-CS、NR′-NR′-CO或NR′-NR′-CS;其中R′和R"分别为H或C₁～C₁₀的烷基,R′和R"相同或不同；

F为一甲川花菁母体、三甲川花菁母体、五甲川花菁母体或七甲川花菁母体。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：F为七甲川花菁母体，所述荧光探针的通式为：

R₃为C₁～C₂₀的烷基，最佳为C₁～C₁₀的烷基；

R₄为C₁～C₂₀的烷基，最佳为C₁～C₁₀的烷基；

Y为O、S、Se、NR′R"、NR′-CO、NR′-CS、NR′-NR′-CO或NR′-NR′-CS;其中R′和R"分别为H或C₁～C₁₀的烷基,R′和R"相同或不同；

R₅、R₆分别为H、C₁～C₂₀的烷基、磺酸基、羧基、环烷基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R₅、R₆相同或不同。

3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于：R₅或R₆为环烷基，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。

4.一种权利要求1、2或3所述的荧光探针在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于：将通式Ⅰ应用于检测ONOO^-时，其是与ONOO^-作用，生成具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光的改变；

具有通式Ⅲ结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式I结构的化合物，从而导致荧光的恢复，此过程可定性检测ONOO^-。

5.根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于：将通式Ⅱ应用于检测ONOO^-时，其是与ONOO^-作用，生成具有通式Ⅳ结构的化合物，从而导致荧光的改变；

具有通式Ⅳ结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下存在下，重新变为具有通式Ⅱ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。

6.根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于：通式Ⅰ可对ONOO^-进行定量检测。

7.根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于：用通式Ⅰ测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO^-的进行实时可逆检测。