CN103571456A - 一种利用酰胺键断裂检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种利用酰胺键断裂检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用涉及一类在ONOO-存在下荧光波长发生明显位移的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的荧光探针。本发明分别采用BODIPY染料和萘酰亚胺染料作为荧光母体，通过引入o-苯硒（碲）苯甲酰胺结构作为与ONOO-反应的活性中心，利用有机硒（碲）醚被氧化后能使酰胺键断裂的过程，以实现选择性地检测ONOO-；利用酰胺键断裂前后对整个化合物荧光波长的影响作为探针识别的检测信号，并将探针用于检测细胞内ONOO-的荧光成像。
Description
技术领域
本发明涉及一类用于检测过氧化亚硝酰（ONOO-）的荧光探针，具体地说，是一类在ONOO-存在下荧光波长发生明显变化的荧光探针。
背景技术
过氧化亚硝酰（ONOO-）是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。ONOO-能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量ONOO-的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对ONOO-在生命体系中作用行为的研究。
荧光探针是有效检测生命体内ONOO-的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Tetsuo Nagano等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF（结构见图1，T.Nagano et.al,J.Bio.Chem,2003,278,3170），与ONOO-作用后荧光增强从而检测ONOO-的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测ONOO-。Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-1（结构见图1，Dan Yang et.al,J.Am.Chem.Soc,2006,128,6004）,次氯酸根不干扰ONOO-的检测，但羟自由基对ONOO-检测的干扰很大。最近，Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-2（结构见图1，Dan Yang et.al,Org.Lett.,2009,11,1887），该探针仍然对羟自由基有较强响应。上述探针都是荧光增强型探针，没有波长的变化，无法实现定量检测。双波长变化的比率型探针由于可以建立内标，可大大降低外部环境的干扰，实现定量检测。因此，开发具有良好选择性，可进行比率检测生物体系中ONOO-的荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的荧光探针，此探针可以选择性地与ONOO-作用，作用后荧光波长发生明显改变，可实现对ONOO-比率检测。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明分别采用BODIPY染料和萘酰亚胺染料作为荧光母体，通过引入o-苯硒（碲）苯甲酰胺结构作为与ONOO-反应的活性中心，利用有机硒（碲）醚被氧化后能使酰胺键断裂的过程，以实现选择性地检测ONOO-；同时利用酰胺键断裂前后对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。
所述的荧光探针的通式为：
通式Ⅰ
通式Ⅰ中，
R1、R2为H、C1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素或磺酸基；
R3为C1-10烷基、苯基或苄基；
X为Se或Te；
Y与R3NH-中的N以C-N键相连构成荧光染料F，并且R3NH-中H被o-(R1PhX)-R2PhC=O取代，即通式I中除Y-N-R3部分；F为在酰胺基和氨基两种状态下，其荧光波长发生明显位移的荧光染料，Y为荧光染料F结构中除去R3NH-的部分。所述荧光染料F为含R3NH-的多甲川菁染料、含R3NH-的罗丹名类染料、含R3NH-的BODIPY类染料、含R3NH-的萘酰亚胺类染料或含R3NH-的香豆素类染料等。
当F分别为BODIPY类染料和萘酰亚胺类染料时，所述荧光探针的通式为：
通式Ⅲ 通式Ⅳ
通式Ⅲ中：
R4、R5、R6、R7、R8、R9分别独自为H、C1～C20的烷基、苯基、取代的苯基、苄基、苯环上含取代基的苄基、磺酸基、羟基、卤素、烷氧基、氰基、硝基、五元或六元O、N、S杂环、取代或不取代的苯乙烯基；
通式Ⅳ中：
R10为C1～C20的烷基、苯基、取代的苯基、苄基、苯环上含取代基的苄基、(CH2)mR11、(CH2CH2O)nH、(CH2CH2O)n Ac；R11为羟基、羧基、酯基、磺酸基或磺酸酯基；m、n=1-20正整数。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义：
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于H、C1-18烷基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰氨基、卤素、或C1-6卤代烷基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由COOH、NH2、OH、C1-6烷氧基、卤素任选取代。
在本发明的通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ化合物中，优选R1、R2各自独立选自H、C1-10烷基、卤素、氰基、C1-10烷氧基或C1-10烷基仲胺基；最优选R1为H、C1-4烷基、C1-4烷氧基或C1-4烷基仲胺基。
优选R3为C1-5烷基；最优选R3为甲基、乙基。
优选R4、R8各自独立选自H、C1-10烷基、卤素、五元或六元O、N、S杂环；最优选R4、R8均为H、C1-4烷基。
优选R5、R7各自独立选自H、C1-12烷基、卤素；最优选R5、R7均为H、CH3。
优选R6为C1-10的烷基、苯基或取代的苯基；
优选R9为H、C1-10烷基、五元或六元O、N、S杂环、取代或不取代的苯乙烯基；最优选R9为H、甲基和对位甲氧基取代的苯乙烯基。
优选R10为C1-10的烷基、苯基、取代的苯基、(CH2)mR11或(CH2CH2O)n Ac；
优选R11为酯基；m、n=1-5正整数。
将通式Ⅰ应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式II结构的化合物，从而导致荧光的改变；
Y-NH-R3
通式Ⅱ
将通式Ⅲ、Ⅳ结构应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式Ⅴ、Ⅵ结构的化合物，从而导致荧光波长的改变；
通式Ⅴ 通式Ⅵ
通式Ⅰ可对ONOO-进行定性、定量的检测。
将浓度呈梯度变化的过氧化亚硝酰水溶液分别加入通式Ⅰ的水溶液中，分别测定加入前后各体系的两个波长的荧光强度，然后以过氧化亚硝酰溶液的浓度和加入前后体系的两波长荧光强度的比值为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度比值，即可从图中读出溶液中过氧化亚硝酰的含量。由于双波长荧光测定是的外部条件保持一致，作比值后外部条件参数可以消除，这就大大降低了外部环境的干扰，提高检测准确度。
邻硒（碲）苯甲酰胺部分是本发明所述荧光探针的反应中心。即硒（碲）原子提供具有通式Ⅰ结构的化合物与ONOO-选择性作用的活性中心，当硒（碲）原子被氧化后，通过与羰基的作用，使酰胺键断裂，导致化合物荧光性质的改变。
通式Ⅲ、Ⅳ所代表的化合物，本身荧光波长相对较短，当特异性地与ONOO-迅速作用，生成通式Ⅴ、Ⅵ结构的化合物，由于氨基的供电能力远大于酰胺基团的供电能力，增强了整个化合物的供-受电子体系，是荧光波长明显红移，同时短波长荧光降低或消失，长波长荧光出现。
本发明的有益效果：
这类化合物用作过氧化亚硝酰荧光探针，在过氧化亚硝酰存在下荧光波长和对应的荧光强度发生变化，可用于过氧化亚硝酰的比率检测检测，大大降低外部条件的干扰，提高检测准确度。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞内过氧化亚硝酰的检测，这对深入研究过氧化亚硝酰在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解过氧化亚硝酰的生理和毒理作用具有重要意义。
附图说明
图1背景技术中所举的已公开的过氧化亚硝酰荧光探针结构示意图；
图2本发明提供的探针检测原理示意图；
图3实施例2中合成探针BODSe的合成路线；
图4实施例4中合成探针NASe的合成路线；
图5不同pH下探针实施例2所采用的荧光探针的荧光强度变化曲线；
图6实施例2所采用的荧光探针对ONOO-的选择性示意图；图5中：1、过氧化亚硝酰，2、一氧化氮，3、双氧水，4、脂质过氧化物，5、过氧化叔丁醇，6、枯烯氢过氧化物，7、羟基自由基，8、次氯酸根，9、次溴酸根，10、超氧阴离子；
图7（a）表示实施例2所采用的荧光探针BODSe的吸收强度随ONOO-浓度变化的示意图；图7（b）表示实施例2所采用的荧光探针BODSe荧光强度随ONOO-浓度变化的示意图，插图表示归一化后675nm荧光变化图；图7（c）表示实施例2所采用的荧光探针675nm荧光强度与572nm荧光强度比值随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线；
图8a、b、c、d、e、f表示实施例2所采用的荧光探针BODSe用于检测细胞内ONOO-的共聚焦显微镜照片。
图9不同pH下探针实施例4所采用的荧光探针的荧光强度变化曲线；
图10实施例4所采用的荧光探针对ONOO-的选择性示意图；图9a 463nm处荧光强度随时间变化趋势，图9b 542nm处荧光强度随时间变化趋势。图9中：1、过氧化亚硝酰，2、次氯酸根，3、次溴酸根，4、脂质过氧化物，5、过氧化叔丁醇，6、枯烯氢过氧化物，7、双氧水，8、羟基自由基 9、一氧化氮，10、超氧阴离子；
图11（a）表示实施例4所采用的荧光探针NASe的吸收强度随ONOO-浓度变化的示意图；图11（b）表示实施例4所采用的荧光探针542nm荧光强度与463nm荧光强度比值随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线；
图12a、b、c、d表示实施例4所采用的荧光探针NASe用于检测细胞内ONOO-的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1（中间体化合物BOD的合成）：
如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号BODSe表示，合成探针化合物所用的染料母体用代号BOD表示。
BOD的合成：原料BODIPY（J.Phys.Chem.A 1998,102,10211-10220）0.76g，对乙胺基苯甲醛（JOC 2011，76，1180-1183）0.3g，1mL哌啶作为催化剂，20mL邻二氯苯作为溶剂，氮气保护，140℃反应6h后，蒸干溶剂。柱分纯化，收集红色荧光组分，蒸干溶剂，得带绿色光泽固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):7.49-7.17(m,8H),6.58-6.56(s,2H),5.96(s,2H),3.90(s,2H),3.22-3.20(q,2H),2.58(s,3H),1.54(s,3H),1.41-1.37(s,3H),1.27-1.26(t,3H).GC-MS(API-ES):m/z C28H28BF2N3 Calcd 455.2,found455.2.
实施例2（探针BODSe的合成）：
探针BODSe的合成：将0.3g邻苯硒苯甲酸（Organic Syntheses Coll.1988，6,533，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1999,1,1915-1916）和2mL氯化亚砜溶于5mL二氯甲烷中，65℃反应7h，减压蒸干溶剂，用10mL苯溶解所得固体。将酰氯的溶液滴入BOD 0.41g溶于10mL苯形成的溶液中，室温搅拌10小时后，蒸干溶剂，所得固体经柱层析纯化得目标化合物BODSe。
1H NMR(400MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):7.60-7.29(m,8H),7.16-6.96(m,12H),6.55(s,1H),6.03(s,1H),4.10-3.99(q,2H),2.60(s,3H),1.59(s,3H),1.42-1.39(d,3H),1.27-1.26(m,3H).13CNMR(100MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):182.25,168.70,153.79,151.82,143.62,142.94,141.93,141.54,141.37,139.41,135.62,132.36,131.69,131.62,130.92,130.46,130.13,129.98,129.75,129.50,129.15,128.85,127.62,123.06,122.61,118.05,115.21,115.01,112.47,52.59,37.83,26.91,23.17,17.36.77Se NMR(95MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):444.05.LC-MS(API-ES):m/zC41H36BF2N3OSe Calcd 715.2085,found 715.2094.
实施例3（中间体化合物NA的合成）：
如图4所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号NASe表示，合成探针化合物所用的染料母体用代号NA表示。
4-溴-1，8二萘甲酸酐2.77g，40%甲胺水溶液5mL，乙二醇单甲醚20mL，在氮气保护下135℃反应18h后，将反应液倒入200mL水中，二氯甲烷萃取至水层无色，合并有机层，无水硫酸钠干燥。柱分纯化，得黄色粉末1.8g。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ8.45(d,1H,J=8.0Hz),8.30(d,1H,J=8.0Hz),8.25(d,1H,J=8.4Hz),7.92(t,1H,J=8.0Hz),7.17(d,1H,J=8.4Hz),4.76(s,1H),3.62(s,3H),3.52(s,3H).
GC-MS(API-ES):m/z C14H12N2O2[M+H]+Calcd:241.0899,found:241.0932.
实施例4（探针NASe的合成）：
探针NASe的合成：将0.3g邻苯硒苯甲酸和2mL氯化亚砜溶于5mL二氯甲烷中，65℃反应7h，减压蒸干溶剂，用10mL苯溶解所得固体。将酰氯的溶液滴入NA0.23g溶于10mL苯形成的溶液中，室温搅拌10小时后，蒸干溶剂，所得固体经柱层析纯化得目标化合物NASe。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ8.58(d,1H,J=8.0Hz),8.39(d,1H,J=8.0Hz),8.2,d,1H,8.15(d,1H,J=8.4Hz),7.92t,1H,7.67,t,1H,7.63(t,1H,J=8.1Hz),7.53,m,3H,7.18t 1H,7.10d,2H;6.80(d,1H,J=8.4Hz),3.72(s,3H),3.54(s,3H).1H NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ170.23,162.85,160.56,152.43,140.23,133.54,132.86,131.36,131.34,130.45,130.28,129.46,129.06,128.75,128.58,128.34,128.10,127.75,127.68,126.15,114.76,106.85,33.62,27.43.GC-MS(API-ES):m/z C27H20N2O3Se[M+H]+Calcd 501.0712,found 501.0724.
实施例5（BODSe对ONOO-的选择性）：
pH采用PBS缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10.0μM BODSe，再加入20mM PBS，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡1min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光强度随pH的变化如图5所示。其中：ΔF=F0-F，F0是不同pH下BODSe的荧光强度，F是对应pH下BOD的荧光强度。图5表明在pH4.0～9.0的范围内ΔF没有明显变化，即在pH4.0～9.0的体系中，都可以使用BODSe检测ONOO-。
为尽可能模拟生理条件，以下各项实验均在PH=7.4条件下进行（PBS缓冲溶液，浓度为20mM），探针浓度仍采用10.0μM。
于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入20mM PBS pH7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入各种待测物，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。BODSe对ONOO-的选择性如图6所示。图6表明BODSe对ONOO-具有很好的选择性，与ONOO-作用后，BODSe对应的572nm荧光降低。测定条件下双氧水、脂质过氧化物、过氧化叔丁醇、枯烯氢过氧化物、羟基自由基、次氯酸根、次溴酸根也能使探针荧光降低，但降低程度仅为ONOO-的10%左右，超氧阴离子、脂质过氧化物、一氧化氮等不能使探针荧光变化。
实施例6（BODSe对ONOO-的定量检测）：
于10ml比色管中加入10.0μM BODSe，再加入20mM PBS pH7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入不同浓度过氧化亚硝酰，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱，取各荧光光谱最大值，输入软件OriginPro 8.0,得到线性工作曲线。
定容后过氧化亚硝酰浓度：0,2.0,4.0,6.0,10.0,15.0,20.0,40.0,50.0,100.0μM.
图7（a）表示随ONOO-浓度的变化体系吸收强度及位移的变化，表明随ONOO-浓度的增加，体系550nm吸收强度在明显降低，同时600nm吸收强度增强；图7（b）表示随ONOO-浓度的变化体系荧光强度及位移的变化，表明随ONOO-浓度的增加，体系572nm荧光强度降低，插图表示675nm荧光强度在升高；图7（c）表示675nm的荧光强度与572nm荧光强度的比值随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.9982，表明探针能定量的测定ONOO-的浓度。
实施例7（BODSe用于细胞内ONOO-的检测）：
BODSe RAW264细胞按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。10.0uM BODSe孵育RAW264细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图8a所示；然后加入1uM Hoechest（商品化细胞核核染色染料）孵育RAW264细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，与8a叠加后结果如图8b所示，图8b表明探针主要对细胞质染色；另取一组细胞，加入10.0uM BODSe孵育RAW264细胞10分钟，然后加入50.0uM5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑鎓（ONOO-源）孵育细胞30分钟，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图8d所示，荧光强度明显降低；然后加入1uM Hoechest孵育RAW264细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，与8d叠加后结果如图8e所示。图8c、8f表示8b、8e与对应的明场叠加图片。
实施例8（NASe对ONOO-的选择性）：
pH采用PBS缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10.0μM BODSe，再加入20mM PBS，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡1min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光强度随pH的变化如图9所示。图9表明在pH6.0～12.0的范围内荧光强度没有明显变化，即在pH6.0～12.0的体系中，都可以使用NASe检测ONOO-。
为尽可能模拟生理条件，以下各项实验均在PH=7.4条件下进行（PBS缓冲溶液，浓度为20mM），探针浓度仍采用10.0μM。
于10ml比色管中加入10.0μM探针，再加入20mM PBS pH7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入各种待测物，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。NASe对ONOO-的选择性如图10所示。图10表明BODSe对ONOO-具有很好的选择性，与ONOO-作用后，NASe对应的463nm荧光降低,同时542nm出荧光强度升高。测定条件下次氯酸、次溴酸、双氧水也能使探针荧光产生变化，但变化程度仅为ONOO-的10%左右，其他活性氧物种不能使探针荧光变化。
实施例9（NASe对ONOO-的定量检测）：
于10ml比色管中加入10.0μM NASe，再加入20mM PBS pH7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入不同浓度过氧化亚硝酰，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱，取各荧光光谱最大值，输入软件OriginPro 8.0,得到线性工作曲线。
定容后过氧化亚硝酰浓度：0,2.0,5.0,12.0,14.0,18.0,25.0，30.0，40.0,45.0，50.0,60.0，70.0，80.0μM.
图11（a）表示随ONOO-浓度的变化体系荧光强度及位移的变化，表明随ONOO-浓度的增加，体系463nm吸收强度在明显降低，同时542nm吸收强度增强；图11（b）表示542nm的荧光强度与463nm荧光强度的比值随ONOO-浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.9971，表明探针能定量的测定ONOO-的浓度。
实施例10（NASe用于细胞内ONOO-的检测）：
NASe RAW264细胞按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。10.0uM NASe孵育RAW264细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，激发波长405nm，分别收集420-500nm波段和500-600nm波段荧光图像，做比率图像（长波长比短波长）结果如图12a所示，图12a表明长波与短波荧光强度比为0.8；然后加入2uM PMA（刺激细胞产生次氯酸）孵育RAW264细胞30分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，分别收集420-500nm波段和500-600nm波段荧光图像，做比率图像（长波长比短波长）结果如图12b所示，图12b表明长波与短波荧光强度比为4.8。图12c、12d表示12a、12b对应的明场图片。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为：
通式Ⅰ
通式Ⅰ中，
R1、R2为H、C1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素或磺酸基；
R3为C1-5烷基、苯基或苄基；
X为Se或Te；
Y与R3NH-中的N以C-N键相连构成荧光染料F，并且R3NH-中H被o-(R1PhX)-R2PhC=O取代，即通式I中除Y-N-R3部分；F为在酰胺基和氨基两种状态下，其荧光波长发生明显位移的荧光染料，Y为荧光染料F结构中除去R3NH-的部分。
2.根据权利要求1荧光探针，其特征在于：
所述荧光染料F为含R3NH-的多甲川菁染料、含R3NH-的罗丹名类染料、含R3NH-的BODIPY类染料、含R3NH-的萘酰亚胺类染料或含R3NH-的香豆素类染料。
3.根据权利要求1或2所述荧光探针，其特征在于：所述通式Ⅰ化合物，当X被氧化后，使邻位的酰胺键断裂。
4.一种权利要求1所述的荧光探针用于生物体内或外活性氧的检测。
5.一种权利要求1所述的荧光探针在检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，将通式Ⅰ应用于检测过氧化亚硝酰（ONOO-）时，其是与ONOO-作用，生成具有通式II结构的化合物，从而导致荧光的改变；
Y-NH-R3
通式Ⅱ。
6.根据权利要求5所述荧光探针的应用，荧光探针用于检测生物体系内过氧化亚硝酰，并进行细胞或组织的荧光成像。
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2012
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|---|---|---|---|---|
| WO2007044641A2 (en) * | 2005-10-06 | 2007-04-19 | University Technologies International Inc. | Glutathione peroxidase mimetics and uses thereof |
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