CN109770853B - 一种斑马鱼伤口检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种斑马鱼伤口检测方法，该方法包括以下步骤：(1)斑马鱼的准备：将斑马鱼割伤，制造创伤部位；(2)测试溶液的配制：制备荧光探针储备液和对照探针储备液，并利用PBS缓冲液分别将两种储备液稀释成荧光探针测试溶液和对照探针测试溶液；(3)斑马鱼伤口的检测：将两种测试溶液分别作为斑马鱼的培养用水，持续培养，并利用荧光显微镜分别采集记录荧光探针和对照探针在斑马鱼体内的荧光成像，将两组荧光成像进行对比，判断斑马鱼伤口情况。与现有技术相比，本发明不仅可以检测伤口情况，也可以用于监测伤口愈合情况，而且所用的检测探针细胞毒性小，具有方法简便、实用性强、快速准确等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种斑马鱼伤口检测方法。
背景技术
斑马鱼属于脊椎动物，和人类基因极为相似，具有高达87％的同源性，可作为一种理想的动物模型(MEEKER,Nathan D.；TREDE,Nikolaus S.Immunology and zebrafish:spawning new models of human disease.Developmental&Comparative Immunology,2008,32.7:745-757)。此外，斑马鱼体型小，易于养殖，产卵量高且繁殖周期短，这意味着大大降低了使用成本。斑马鱼的受精方式为体外受精，生长发育全程透明，有利于实时观察病原体和损伤。因而，斑马鱼可作为理想的炎症药物筛选模型。如通过构建由绿色荧光蛋白标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系，筛选出其中绿色荧光蛋白表达稳定的斑马鱼，进一步切割尾部构建巨噬细胞聚集的炎症模型，通过追踪炎症细胞迁移，监测伤口愈合情况(秦帅,陈希,and孔德明."构建由绿色荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼模型."贵阳中医学院学报33.5(2011):133-135.)。类似的，通过构建中性粒细胞转基因斑马鱼系，可建立炎症反应的体内遗传分析模型(RENSHAW,Stephen A.,et al.A transgenic zebrafish model ofneutrophilic inflammation.Blood,2006,108.13:3976-3978)，从而追踪炎症反应。这一类构建炎症模型的方法基于机体受到刺激发生炎症反应，中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集，通过追踪炎症细胞迁移，监测伤口愈合情况，筛选炎症药物。但是，这一类方法需要使用特殊转基因斑马鱼系，相较于普通斑马鱼成本较高，且后续测试繁琐。因而，开发一种用于快速检测斑马鱼伤口及监测伤口愈合情况的简便方法具有非常重要的意义。
近年来，荧光检测技术发展迅速，已广泛应用到食品检测、分子生物学、医学、临床诊断和环境监测分析等领域。荧光分析法是一种利用待测定组分荧光光谱性质进行定量或定性的化学分析方法，具有灵敏度高、选择性好、方法简便、快速准确、线性范围宽等优点。
专利CN105105716A公开了一种用于检测伤口愈合程度的智能传感器及其制备方法。该智能传感器包括第一多模光纤、第二多模光纤及单模光纤，单模光纤位于第一多模光纤及第二多模光纤之间并形成直线连接。其中，单模光纤表面涂覆有一层基质金属蛋白酶感应膜，该层基质金属蛋白酶感应膜根据皮肤伤口的基质金属蛋白酶的活性程度变化导致基质金属蛋白酶感应膜的颜色变化对第一波长光进行吸收。第二多模光纤将被所述单模光纤中的基质金属蛋白酶感应膜吸收后的第一波长光送至监测设备来确定皮肤伤口的愈合程度。该发明的装置结构复杂，操作比较不方便，而且无法快速准确的确知伤口愈合程度。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种斑马鱼伤口检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种斑马鱼伤口检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)斑马鱼的准备：用一次性无菌手术刀片将斑马鱼割伤，制造创伤部位；
(2)测试溶液的配制：制备荧光探针储备液和对照探针储备液，并利用PBS缓冲液分别将两种储备液稀释成荧光探针测试溶液和对照探针测试溶液；
(3)斑马鱼伤口的检测：将两种测试溶液分别作为斑马鱼的培养用水，持续培养，并利用荧光显微镜分别采集记录荧光探针和对照探针在斑马鱼体内的荧光成像，将两组荧光成像进行对比，判断斑马鱼伤口情况，其中，测试过程中的斑马鱼不需喂食，通过肉眼观察初步判断伤口情况，其次采用ImageJ软件对伤口处的荧光强度进行计算，进一步判断。
优选地，所述步骤(2)中的荧光探针为4-碘代-2-丁醇修饰的七甲川花菁染料，简称C7H，结构式为：
优选地，所述步骤(2)中的对照探针为对叔丁基苯酚修饰的七甲川花菁染料，简称Con-C7H，结构式为：
优选地，所述步骤(2)中的探针储备液通过将探针固体用二甲基亚砜(DMSO)溶剂溶解、超声制备得到。
优选地，所述步骤(2)中的探针测试溶液里溶剂DMSO的含量不高于1％。
优选地，所述步骤(2)中采用的PBS缓冲液含有NaCl、KCl、NaHPO4·12H2O和KH2PO4，pH为7.2-7.6。
优选地，所述步骤(3)中采集记录完两组斑马鱼的荧光成像后，将斑马鱼身上的测试溶液清洗干净。进一步优选地，所述清洗方式为将斑马鱼从测试溶液取出，用PBS缓冲液进行三次清洗，每次三分钟。
优选地，所述步骤(1)中的斑马鱼选用鱼龄不少于72h的斑马鱼。进一步优选地，所述斑马鱼是由在培养箱中养殖的斑马鱼卵孵化得来，培养箱的水温为25-30℃，光照条件为光照14h-黑暗10h交替进行，斑马鱼卵孵化次日在水中加入1-苯基-2-硫脲。
本发明基于七甲川花菁衍生物C7H可发射近红外荧光(～710nm)，能有效地避免生物分子自身荧光，并且生物相容性好，具有检测伤口及监测愈合情况的特性，且结合斑马鱼具有显著的自愈能力，提出一种斑马鱼伤口检测方法，将斑马鱼幼鱼浸泡在探针溶液中，通过观察比较荧光探针在不同斑马鱼体内的荧光成像情况，判断伤口大小与程度；同时，利用对照探针对伤口的特异性进行评价，发现荧光探针对伤口具有良好的特异性；此外，通过比较同一只斑马鱼在不同时刻的荧光成像，能够监测伤口愈合情况。最后利用软件ImageJ将荧光图像转变为荧光强度数值，保证了结果的可靠性。因此此种方法可进一步推广用于炎症药物的筛选。
与现有技术相比，本发明不仅可以检测伤口情况，也可以用于监测斑马鱼伤口愈合情况，对于基于斑马鱼模型的炎症药物筛选和人类伤口愈合研究具有较大的潜在价值，而且所用的检测探针细胞毒性小，具有方法简便、实用性强、快速准确。
附图说明
图1为荧光探针C7H的细胞毒性测试结果图；
图2为五组实验对斑马鱼创面特异性荧光成像的结果比较图；
图3为荧光探针C7H在创伤部位荧光成像放大图；
图4为荧光探针C7H对斑马鱼伤口处荧光成像随时间的变化监测结果图；
图5为荧光探针C7H对创伤斑马鱼平均荧光强度随时间的变化监测结果图。
图中：a-荧光探针C7H+受伤斑马鱼；b-对照探针Con-C7H+受伤斑马鱼；c-荧光探针C7H+正常斑马鱼；d-DMSO溶液+受伤斑马鱼；e-PBS缓冲液+受伤斑马鱼。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
在进行采用荧光探针对斑马鱼伤口进行荧光成像的实验之前，先进行荧光探针C7H的细胞毒性测试，具体测试方法如下：
采用标准MTT法检测C7H的细胞毒性。具体实验步骤如下：首先将处于对数期生长且状态良好的人张氏肝细胞Chang-liver接种到96孔板中，细胞密度7000/孔，每孔加入100μL完全培养基(90％DMEM培养基和10％FBS胎牛血清，并在细胞培养箱中孵育过夜(37℃，5％CO2)，使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，用新鲜DMEM冲洗三次。加入浓度梯度探针(0-15μM)到不同孔中，细胞在培养箱中孵育12h。然后去除培养基，加入1mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液。孵育4小时后，吸出上清液，每孔加入150μL的DMSO以溶解甲瓒晶体。随后，将96孔板置于摇床上摇动15min。最后，用酶标仪测定溶液在490nm处的吸光度，利用Origin软件处理数据得到图1。由图1可以看出，当荧光探针C7H的浓度增大到15μM时，12小时细胞存活率大于95％，表明荧光探针C7H的细胞毒性很低，可以用于生物实验。
采用以下具体方法对斑马鱼伤口的荧光成像进行实验：
将荧光探针C7H与对照探针Con-C7H分别溶于溶剂DMSO中，配成储备液，然后分别用PBS缓冲液将储备液稀释成终浓度为10μM的探针测试溶液、对照探针测试溶液，其中DMSO的最终含量不高于1％，PBS缓冲液由NaCl 4g、KCl 0.1g、NaHPO4·12H2O 1.45g和KH2PO40.1g，加超纯水至500mL制备而得，pH为7.4，再配制与探针测试溶液含相同量DMSO的PBS缓冲液，备用。将产自同一母鱼、发育至72小时的健康斑马鱼随机分成A、B、C、D、E五组。对A、B、E、D四组的鱼进行割伤预处理，即采用锋利的一次性无菌手术刀将斑马鱼的腰部轻轻割伤，而C组的鱼不采取上述预处理，继续维持健康生长状态。然后将斑马鱼转移至六孔板中培养，A、C组分别加入2mL荧光探针测试溶液；B组加入2mL对照探针测试溶液；D组加入2mL与探针测试溶液含相同量DMSO的PBS缓冲液；E组加入2mL PBS缓冲液。然后分别置于倒置荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光变化，观察过程不对斑马鱼进行喂食，结果如图2所示。
由图2可观察出，荧光探针C7H在受伤斑马鱼(A组)斑马鱼体内的荧光成像与其它四组的荧光成像差别非常明显。荧光探针在正常的斑马鱼(C组)的腰部几乎没有红色荧光表达；而对于经过手术刀割伤处理的斑马鱼，5分钟内可观察到探针在斑马鱼伤口处有明显的荧光；而相同的测试条件下，B、D、E组的斑马鱼无明显的荧光。这些结果表明荧光探针C7H对斑马鱼的伤口有特异性响应，所得结果可靠。
将荧光探针溶液培养的受伤斑马鱼的伤口处局部放大，结果如图3所示。此时，斑马鱼伤口处荧光更加清晰，便于确认伤口具体位置与伤口大小。此结果进一步表明荧光探针C7H对斑马鱼的伤口有良好的响应，所得结果可靠。
之后继续进行斑马鱼伤口自愈的研究：
首先用锋利的手术刀将斑马鱼的腰部轻轻割伤，然后将斑马鱼浸泡在装有2mL荧光探针测试溶液培养皿中，利用倒置荧光显微镜记录此过程中荧光探针C7H在斑马鱼体内的荧光成像。30分钟后，将斑马鱼取出，用PBS缓冲液清洗斑马鱼三遍，每次三分钟，随之将斑马鱼转移至PBS缓冲液中培养，继续记录荧光探针C7H在斑马鱼体内的荧光成像，一小时后，终止拍摄，将斑马鱼放入培养箱中。一段时间后，将斑马鱼从培养箱中捞出，第二次放入装有2mL探针测试溶液培养皿中，利用倒置荧光显微镜记录30分钟内荧光探针C7H在斑马鱼幼鱼体内的荧光成像。然后将斑马鱼取出，用PBS缓冲液清洗斑马鱼三遍，每次三分钟，随之将斑马鱼转移至装有PBS缓冲液的培养皿中，记录荧光探针C7H在斑马鱼体内的荧光成像，一小时后，终止拍摄，再次将斑马鱼放入培养箱中。再过一段时间，重复上述过程。为了使得结果更为直观，利用ImageJ软件将荧光图像转换为荧光强度数值，结果如图4和图5所示。
由图4和图5可以看出，荧光探针C7H溶液浸泡受伤的斑马鱼时，荧光强度逐渐增强，而当斑马鱼离开探针溶液，荧光强度逐渐减弱，1小时内消退明显。这表明荧光探针不仅可以对斑马鱼的伤口进行响应，而且在斑马鱼体内代谢非常快，大大降低了探针对斑马鱼健康状况的影响。鉴于斑马鱼具有一定自愈能力，随着养殖时间增长，其伤口逐渐愈合；另一方面伤口越严重，荧光强度越高。从荧光图像看，第二次的测试荧光强度明显弱于第一次，第三次最弱。此实验结果与理论正好吻合，表明可利用荧光探针C7H实现对伤口愈合情况的监测。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种斑马鱼伤口检测的测试溶液的配制方法，其特征在于，制备荧光探针储备液，利用PBS缓冲液将储备液稀释成荧光探针测试溶液，所述的荧光探针为4-碘代-2-丁醇修饰的七甲川花菁染料，结构式为：
配制对照探针储备液，利用PBS缓冲液将储备液稀释成对照探针测试溶液，所述的对照探针为对叔丁基苯酚修饰的七甲川花菁染料，结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种斑马鱼伤口检测的测试溶液的配制方法，其特征在于，所述的探针储备液通过将探针固体用二甲基亚砜溶剂溶解、超声制备得到，探针测试溶液里溶剂二甲基亚砜的含量不高于1％。
3.根据权利要求1所述的一种斑马鱼伤口检测的测试溶液的配制方法，其特征在于，采用的PBS缓冲液含有NaCl、KCl、NaHPO4·12H2O或KH2PO4的一种或多种，pH为7.2-7.6，PBS缓冲液将储备液稀释成10μM的测试溶液。
4.根据权利要求1所述的一种斑马鱼伤口检测的测试溶液的配制方法，其特征在于，将斑马鱼幼鱼浸泡在探针溶液中，通过观察比较荧光探针在不同斑马鱼体内的荧光成像情况，判断伤口大小与程度。
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