CN101933794A

CN101933794A - 一种荧光多参量内窥测量方法及系统

Info

Publication number: CN101933794A
Application number: CN 201010279725
Authority: CN
Inventors: 邵永红; 屈军乐; 牛憨笨
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2030-09-13
Also published as: CN101933794B

Abstract

本发明适用于光电检测领域，提供了一种荧光多参量内窥测量方法及系统，所述荧光多参量内窥测量方法包括以下步骤：产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内均匀分布有荧光物质；调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品；利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；实时采集所述荧光；分辨所述荧光的多参量信息。本发明由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品不同位置光谱分辨的荧光寿命信息，速度快、时间短，对生物体损伤小，有利于生物医学研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。

Description

一种荧光多参量内窥测量方法及系统

技术领域

本发明属于光电检测领域，尤其涉及一种荧光多参量内窥测量方法及系统。

背景技术

荧光显微技术已经成为生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要工具。多光子激发荧光显微技术具有对生命体的杀伤作用小，穿透深度大，具有层析能力等优点，已经成为生命科学研究的重要手段。除荧光强度的分布和变化反应样品的结构信息以外，荧光光谱和荧光寿命都包含有丰富的生物体系功能信息。由于荧光发射波长与荧光团的能级结构有关，因此荧光光谱测量可以区分样品的分子种类或鉴别不同的荧光团。荧光寿命对荧光团所处微环境非常敏感，能够对离子浓度(Ca²⁺，Na⁺)、pH值和pO₂等生理生化参数进行定量测量。将荧光强度、荧光光谱和荧光寿命测量相结合能够为生物医学检测和分析提供不同但互补的结构和功能信息，多种特征参量能够分别从不同的层次、不同的角度，互补的研究同一生命现象。

近年来，随着新型光纤和微制造技术的迅猛发展，光纤双光子荧光显微镜和内窥镜的研究使双光子荧光显微成像技术在活体的内部器官和活体动物中的研究成为可能。目前双光子荧光内窥显微技术已经引起了国际上的高度重视，针对这一课题做出了大量的研究成果，在内窥系统设计、扫描机制、光学传导和高数值孔径的微物镜及其应用等方面取得了很多研究成果。受到活体内窥应用条件限制，测量时间不宜过长。然而目前荧光多参量内窥测量的速度慢，效率低，耗时长，对生物体造成极大的影响。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种荧光多参量内窥测量方法，旨在解决现有荧光多参量内窥测量速度慢、效率低的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种荧光多参量内窥测量方法，包括以下步骤：

产生激发光；

将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内均匀分布有荧光物质；

调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品；

利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

实时采集所述荧光；

分辨所述荧光的多参量信息。

本发明实施例的另一目的在于提供一种荧光多参量内窥测量系统，所述系统包括：

激发光源，用于产生激发光；

分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内均匀分布有荧光物质；

柔性介质，用于调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品；

扫描镜，用于利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

双色镜，用于导出所述荧光；

色散元件，用于分辨所述荧光的光谱信息；

扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息；

探测器，用于记录所述荧光的多参量信息。

本发明实施例将激发光分为与样品的多个子区域一一对应的多个子光束，该多个子光束通过柔性介质并行传导至生物体内，各子光束聚焦于具有荧光物质的样品，形成多点激发荧光，将所激发的荧光通过柔性介质导出，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品不同位置光谱分辨的荧光寿命信息，速度快、时间短，对生物体损伤小，有利于生物医学研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量方法的实现流程图；

图2是本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量系统的结构及其光路图；

图3是本发明实施例提供的激光阵列点图；

图4是探测器所记录的一幅光谱分辨的荧光衰减信息图像；

图5是样品上一点的荧光衰减曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例将激发光分为与样品多个子区域一一对应的多个子光束，使该多个子光束传导至生物体内，各子光束聚焦于具有荧光物质的样品，形成多点激发荧光，将荧光导出，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品不同位置光谱分辨的荧光寿命信息，速度快、时间短，对生物体损伤小，有利于生物医学研究。

本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量方法包括以下步骤：

产生激发光；

实时采集所述荧光；

分辨所述荧光的多参量信息。

本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量系统包括：

激发光源，用于产生激发光；

双色镜，用于导出所述荧光；

色散元件，用于分辨所述荧光的光谱信息；

扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息；

探测器，用于记录所述荧光的多参量信息。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

图1示出了本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量方法的实现流程，详述如下：

在步骤S101中，产生激发光；

本发明实施例优选工作频率为76MHz，周期为120fs，中心波长为800nm的脉冲激光作为激发光，此激发光可实现荧光物质的双光子激发。

作为本发明的一个实施例，使上述脉冲激光产生负色散，按所需频率提取具有负色散特性的脉冲激光，对获取的脉冲激光进行扩束准直并调整其强度分布，使脉冲激光的强度分布均匀。例如，提取76MHz的脉冲激光获得2MHz的脉冲激光。

在步骤S102中，将激发光分为多个子光束，多个子光束对应于样品的多个子区域；

本发明实施例中，将激发光均分为多个平行的子光束，多个子光束一一对应于具有荧光物质的样品的多个子区域。

为将多个子光束调整至生物体内，对各个子光束进行准直，使各个子光束成为平行光。

在步骤S103中，调整多个子光束，使多个子光束通过柔性介质传导至生物体内并聚焦于样品；

本发明实施例中，将多个子光束调整至柔性介质的输入端，使多个子光束并行传导至生物体内，并各自聚焦于样品。

在步骤S104中，利用多个子光束对样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

本发明实施例中的扫描分为逐点扫描和步进扫描，具体过程如下：

1、逐点扫描

多个子光束经聚焦形成激发光阵列点分别投射至样品的各个子区域，沿样品纵向对各子区域进行逐点扫描，各子区域内的荧光物质在激发光阵列点的作用下发出荧光。

2、步进扫描

对各个子区域纵向的逐点扫描结束后，沿样品横向对各个子区域进行步进扫描即调整激发光阵列点在样品横向的位置。

循环执行上述逐点扫描和步进扫描，直至完成对样品各个子区域的扫描。应当理解，具体实施时还可以调换逐点扫描与步进扫描的方向。

在步骤S105中，实时采集扫描时发出的荧光；

本发明实施例中，对各子区域进行逐点扫描的同时，采集各子区域内荧光物质发出的荧光。

在步骤S106中，分辨荧光的多参量信息；

本发明实施例中，将荧光的多参量信息转换为可分辨的光谱和空间信息，从而获取样品各点荧光的多参量信息。

具体地，对荧光进行色散，获取荧光的光谱；将荧光的寿命信息转换为可分辨的空间信息，获取荧光的寿命信息。

本领域的普通技术人员应当理解，实现上述实施例方法中的全部或部分步骤可以通过程序来指令相关的硬件完成，该程序可以存储于一计算机可读取存储介质中，如ROM/RAM、磁盘、光盘等。

上述实施例将激发光分为与样品多个子区域一一对应的多个子光束，该多个子光束通过柔性介质并行传导至生物体内，并各自聚焦于具有荧光物质的样品，形成多点激发荧光，将所激发的荧光通过柔性介质导出，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品不同位置光谱分辨的荧光寿命信息，速度快、时间短，对生物体损伤小，有利于生物医学研究。

图2示出了本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量系统的结构，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关的部分。

本发明实施例提供的荧光多参量内窥测量系统具有一激发光路和一探测光路。激发光路包括激发光源、色散补偿器、脉冲提取器、扩束准直装置、整形器、分光器、准直透镜、耦合透镜、光子晶体光纤阵列、自聚焦透镜、扫描镜以及微物镜。探测光路包括微物镜、扫描镜、自聚焦透镜、光子晶体光纤阵列、耦合透镜、双色镜、滤光片、色散元件、成像透镜、扫描相机以及探测器。其中耦合透镜、光子晶体光纤阵列、自聚焦透镜、扫描镜以及微物镜为激发光路和探测光路所共有。

以下对激发光路的结构进行详细说明。

如图2所示，本发明实施例优选钛宝石飞秒激光器101作为激发光源，其可产生中心波长为800nm、频率为76MHz、周期为120fs的脉冲激光，该脉冲激光可实现荧光物质的双光子激发。色散补偿器102用于产生负色散，钛宝石飞秒激光器101发出的脉冲激光经色散补偿器102产生负色散。脉冲提取器103用于选择性提取脉冲激光，钛宝石飞秒激光器101发出的高频率(如76MHz)的脉冲激光经脉冲提取后形成低频率(如2MHz)的脉冲激光。脉冲激光经由扩束准直透镜104和扩束准直透镜105构成的扩束准直装置，变成所需尺寸的准直光。

本发明实施例中，整形器为光束整形器106，经准直的脉冲激光经光束整形器106整形，形成强度平顶分布的光束，强度分布均匀。分光器可为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器，本实施例优选微透镜阵列107，平顶分布的脉冲激光经微透镜阵列107被分成多个子光束，多个子光束对应样品的多个子区域，本实施例中微透镜阵列107为3×3微透镜阵列即微透镜阵列107具有九个微透镜。

本发明实施例中，准直透镜108的后焦面与微透镜阵列107的前焦面重合，子光束在微透镜阵列107的前焦面即在准直透镜108的后焦面聚焦，各子光束经准直透镜108均变为平行光的子光束。

在本发明实施例中，多个子光束经双色镜109调整投射至耦合透镜110，由耦合透镜110将多个子光束耦合进入光子晶体光纤阵列111。光子晶体光纤阵列111由多根光子晶体光纤等间距排列形成，光子晶体光纤的个数及其排列方式与微透镜阵列107的相同。多个子光束经光子晶体光纤阵列111传导至生物体内，从光子晶体光纤阵列111出射的多个子光束经自聚焦透镜112投射至扫描镜113。自聚焦透镜112为折射率沿径向渐变的棒透镜，各子光束经自聚焦透镜112均变为平行光。各子光束经扫描镜113投射至具有荧光物质的样品114，样品114与扫描镜113之间设有起会聚作用的微物镜115。所述扫描镜113优选为MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems，微机电系统)扫描镜，该MEMS扫描镜可进行二维扫描。各子光束经本激发光路传导后形成激发光阵列点并聚焦于样品，激发样品内的荧光物质发出荧光。

以下对探测光路的结构进行详细说明。

本发明实施例探测光路中双色镜109设于耦合透镜110与准直透镜108之间，双色镜109对中心波长为800nm的脉冲激光高反，对波长为400～700nm的荧光高透，双色镜109与子光束之间的夹角为45°或135°。荧光经双色镜109透射后的传导光路上依次设有色散元件、成像透镜117、扫描相机118以及探测器。

上述色散元件优选为色散棱镜116，亦可为光栅。色散棱镜116将荧光按不同波长区分开，以便探测器识别荧光光谱信息，从而获取样品各点的荧光光谱信息。

在本发明实施例中，成像透镜117将荧光按不同波长会聚于扫描相机118的光电阴极的不同位置。扫描相机118具有电压线性变化的偏转电场，能够将在空间上不可分辨的的寿命信息转换为在空间上可分辨的信息，以便探测器识别荧光衰减信息，从而获取样品各点的荧光寿命信息。

本发明实施例中，探测器为面阵探测器119，面阵探测器119优选为CCD相机或CMOS相机，面阵探测器119用于记录不同波长的荧光衰减信息即光谱分辨的荧光衰减信息，同时记录荧光的空间位置。面阵探测器119与计算机120连接，计算机120用于读取、存储和处理探测器探测到的光谱分辨的荧光衰减信息，由计算机120控制面阵探测器119的曝光。工作时，脉冲提取器103每提取一个脉冲激光，扫描镜113扫描一次，面阵探测器119曝光一次。计算机120同时控制扫描镜113进行逐点扫描和步进扫描，扫描镜每进行一次逐点扫描或步进扫描，计算机120记录各次扫描所对应样品上的位置。

此外，色散元件116与双色镜109之间设滤光片，滤光片为干涉滤光片121，干涉滤光片121将反射回来的激光以及其它杂散光去除，避免干扰，各参量测量准确。

本发明实施例中，各个子光束经扫描镜113沿样品纵向进行逐点扫描，各子光束沿样品纵向每移动一个点位，面阵探测器119曝光一次即记录一幅图像，如图3所示，该图像包含样品114的九个位置点的荧光光谱和荧光寿命信息。沿样品纵向的扫描结束后，扫描镜113步进扫描即沿样品横向移至下一位置，进行下一纵向位置的逐点扫描，如此循环，即可实现对整个样品的扫描，获取整个样品不同位置处光谱分辨的荧光衰减信息。

显然，通过计算机控制并调整扫描镜的方位，即可进行逐点扫描或步进扫描。具体实施时还可互换逐点扫描与步进扫描的方向。

本发明实施例中，钛宝石飞秒激光器101发出的激光脉冲由脉冲提取器103按所需频率提取用于触发扫描相机118，使扫描相机118与脉冲提取器103同步开启。钛宝石飞秒激光器101发出的激光脉冲到达样品114时激发出荧光，扫描相机118的光电阴极接收到所激发出的荧光时发射出光电子，所发出的光电子在扫描相机118的偏转电场的作用下发生偏转，光电子于扫描相机118的荧光屏上按空间位置产生二次荧光，所产生的二次荧光对应于样品上不同位置点发出的不同波长的荧光不同时间的强度分布，即荧光强度的衰减信息，如图5所示。如图5所示，计算出荧光衰减至其最大强度值的1/e的时间即为荧光寿命。

本发明实施例中，扫描镜移动一个位置，面阵探测器记录一幅图像，一幅图像同时记录样品上九个点的荧光多参量信息。通过扫描镜的二维扫描即可实现对整个样品的扫描，获取整个样品不同位置不同光谱的荧光寿命信息。

图4所示为面阵探测器119所记录的荧光图像，该图像包含荧光的多参量信息，其横轴为荧光光谱信息，纵轴为荧光寿命信息。

本发明实施例同样对于512×512图像，阵列点为3x3，仅需记录29127幅图像；阵列点为4×4，仅需记录16384幅图像；依此类推，阵列点越多，需记录的图像越少。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荧光多参量内窥测量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

产生激发光；

实时采集所述荧光；

分辨所述荧光的多参量信息。

2.如权利要求1所述的荧光多参量内窥测量方法，其特征在于，所述扫描分为逐点扫描和步进扫描，所述利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光的步骤具体为：

各子光束沿所述样品纵向逐点扫描对应子区域，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

所述逐点扫描结束后，沿所述样品横向对对应子区域进行步进扫描，即调整各子光束在所述样品横向的位置；

循环执行所述逐点扫描和步进扫描，直至完成对各个子区域的扫描。

3.如权利要求1所述的荧光多参量内窥测量方法，其特征在于，所述产生激发光的步骤之后还包括以下步骤：

使所述激发光产生负色散；

按所需频率提取所述激发光；

对所述激发光进行扩束准直；

调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀；

所述调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的步骤之前还包括以下步骤：

对各个所述子光束进行准直，使各个所述子光束成为平行光；

4.如权利要求1～3任一项所述的荧光多参量内窥测量方法，其特征在于，所述分辨所述荧光的多参量信息的步骤具体为：

对所述荧光进行色散，获取所述荧光的光谱；

将所述荧光的寿命信息转换为可分辨的空间信息，获取所述荧光的寿命信息。

5.一种荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述系统包括：

激发光源，用于产生激发光；

双色镜，用于导出所述荧光；

色散元件，用于分辨所述荧光的光谱信息；

扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息；

探测器，用于记录所述荧光的多参量信息。

6.如权利要求5所述的荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述激发光源与所述分光器之间还设有：

扩束准直装置，用于调整所述激发光的尺寸并进行准直；以及

整形器，用于调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀。

7.如权利要求6所述的荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述激发光源与所述扩束准直装置之间还设有：

色散补偿器，用于使所述激发光产生负色散；

脉冲提取器，用于按所需频率提取所述激发光，所述激发光为脉冲激光。

8.如权利要求7所述的荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述分光器与所述双色镜之间还设有：

准直透镜，用于准直各个所述子光束，使各个所述子光束成为平行光；

所述双色镜与所述柔性介质之间还设有：

耦合透镜，使各个子光束耦合进入所述柔性介质；

所述柔性介质与所述扫描镜之间还设有：

自聚焦透镜，用于准直从所述柔性介质输出的各个子光束；

所述扫描镜与所述样品之间还设有：

微物镜，用于将各个所述子光束会聚于所述样品。

9.如权利要求8所述的荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述分光器为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器，所述柔性介质为光子晶体光纤阵列，所述微透镜阵列的前焦面与所述准直透镜的后焦面重合。

10.如权利要求7～9中任一项所述的荧光多参量内窥测量系统，其特征在于，所述脉冲提取器每提取一个脉冲激光，所述探测器曝光一次；所述扫描相机与所述脉冲提取器同步开启。