CN104597590A - 一种超分辨荧光光谱成像显微镜 - Google Patents

Abstract

一种超分辨荧光光谱成像显微镜，包括激光发射器、双色镜、分光镜、图像控制器和光谱仪，所述激光发射器激发样品的荧光团发出荧光，所述分光镜将所述荧光分为第一束光路和第二束光路，所述第一束光路和所述第二束光路均具有所述荧光的荧光信号与激发光的杂散信号，所述第一束光路发射至所述图像控制器，以采集所述荧光的强度信息，所述第二束光路发射至所述光谱仪，以分析所述荧光的光谱信息，并根据光谱信息区分所述荧光中来自不同荧光团的荧光信号，利用所述光谱仪采集的光谱信息区分所述荧光的荧光信号和激发光杂散信号，从而实现利用光谱仪能将激发光与荧光信号区别开，提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜的成像效果。

Description

一种超分辨荧光光谱成像显微镜

技术领域

本发明属于图像显示技术领域，尤其涉及一种超分辨荧光光谱成像显微镜。

背景技术

在细胞生物学领域中，超分辨荧光显微镜在研究细胞的结构、功能和各种生命规律中有着重要的应用。但是，由于光学系统的限制，使得传统的超分辨荧光显微镜存在衍射极限，导致其极限分辨率难以超越200nm。而超分辨荧光显微技术能突破传统光学系统中衍射极限的限制，进一步的提高分辨率。利用超分辨荧光显微镜，可以使科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子与细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。

目前超分辨率荧光显微技术虽然在图像的分辨率上有所提高，但是对荧光检测至关重要的波长信息，仅仅只是用滤光片进行提取，这种做法无法在单次的检测中区别出发不同波长的荧光团。而且由于采用了面阵的CCD进行信号采集，不可避免的会引入一些激发光的杂散信号。这些杂散信号虽然经过滤光片的衰减，但有时仍然在强度上可比拟微弱的荧光信号。使得CCD在采集荧光信号时，无法区分激发光信号和荧光信号，导致样本图像受到影响，从而显微成像的信噪比较低。

发明内容

本发明要目的在于提供一种提高荧光成像信噪比的超分辨荧光光谱成像显微镜。

本发明解决上述技术问题，本发明提供一种超分辨荧光光谱成像显微镜，其中，所述超分辨荧光光谱成像显微镜包括激光发射器、双色镜、分光镜、图像控制器和光谱仪，所述激光发射器发射激发光至所述双色镜，所述双色镜将所述激发光反射至所述样品，以激发样品的荧光团发出荧光，所述荧光具有荧光信号以及杂散信号，所述双色镜透过所述样品的荧光至所述分光镜，所述分光镜将所述荧光分为第一束光路和第二束光路，所述第一束光路和所述第二束光路均具有所述荧光的荧光信号与杂散信号，所述第一束光路发射至所述图像控制器，以采集所述荧光的强度信息，所述第二束光路发射至所述光谱仪，以分析所述荧光的光谱信息，并根据所述光谱信息区分所述荧光信号和所述杂散信号。

其中，所述超分辨荧光光谱成像显微镜包括第一扫描组件和第二扫描组件，

所述第一扫描组件包括第一振镜，所述第一振镜接收所述双色镜反射的激发光，并反射激发光至所述样品，所述第一振镜还接收所述样品的荧光，并反射所述荧光至所述双色镜；

所述第二扫描组件包括第二振镜，所述第二振镜将所述第一束光路扫描至所述图像控制器。

其中，所述第一扫描组件还包括第一物镜，所述第一物镜将所述激发光聚焦于所述样品上。

其中，所述第一扫描组件还包括第一组合透镜，所述第一组合透镜位于所述第一振镜和所述第一物镜之间，以改变所述激发光的光斑半径。

其中，所述第二扫描组件还包括第二组合透镜，所述第二组合透镜透过所述第二振镜的出射光，并发射至所述图像控制器。

其中，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括第二物镜、针孔和第三物镜，所述第二物镜将透过所述双色镜的荧光聚焦于所述针孔上，所述针孔透过所述荧光，并发射所述荧光至所述第三物镜，所述第三物镜将所述荧光恢复呈平行光束，并将所述平行光束发射至所述分光镜。

其中，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括光学衰减片，所述光学衰减片将所述激光发射器发射的激发光衰减后，发射至所述双色镜。

其中，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括滤光片，所述滤光片将透过所述双色镜的荧光过滤后，发射至所述分光镜。

其中，所述光谱仪设有采集所述第二路光束的接收端，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括第四物镜，所述第四物镜将所述第二路光束聚集于所述接收端。

其中，所述光谱仪设置有光纤，所述接收端设置于所述光纤上

本发明所提供的超分辨荧光光谱成像显微镜通过所述分光镜将所述荧光分为第一束光路和第二束光路，利用所述第一束光路将样品的荧光强度信息发射至所述图像控制器，以实现样品成像，同时利用第二束光路发送至所述光谱仪，利用所述光谱仪采集的光谱信息区分所述荧光中来自不同荧光团的荧光信号，从而实现利用光谱仪对样品的图像信息中的不同荧光团加以区分，并且能将激发光与荧光信号从波长上区别开。从而降低荧光成像的信噪比，提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜的成像效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的超分辨荧光光谱成像显微镜的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。

请参阅图1，本发明提供一种超分辨荧光光谱成像显微镜100。所述超分辨荧光光谱成像显微镜100包括激光发射器10、双色镜20、分光镜30、图像控制器40和光谱仪50。所述激光发射器10发射激发光至所述双色镜20，所述双色镜20将所述激发光反射至所述样品1，以激发样品1的荧光团发出荧光A，所述荧光A具有荧光信号以及激发光的杂散信号，所述双色镜20透过所述样品1的荧光A至所述分光镜30。所述分光镜30将所述荧光A分为第一束光路A1和第二束光路A2，所述第一束光路A1发射至所述图像控制器40，以采集所述荧光A的图像信息，所述第二束光路A2发射至所述光谱仪50，以分析所述荧光A的光谱信息，并根据所述光谱信息区分所述荧光信号和所述杂散信号。

通过所述分光镜30将所述荧光A分为第一束光路A1和第二书光路A2，利用所述第一束光路A1将样品的图像信息发射至所述图像控制器40，以实现样品成像，同时利用第二束光路A2发送至所述光谱仪50，利用所述光谱仪50采集的光谱信息区分所述荧光A中来自不同荧光团的荧光信号，从而实现利用光谱仪50对样品的图像信息中的不同荧光团加以区分，并且能将激发光与荧光信号从波长上区别开。从而降低荧光成像的信噪比，提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的成像效果。

本实施方式中，所述激光发射器10发射的激发光对荧光团进行激发，即可激发荧光团发出荧光，所述荧光的波长大于所述激发光的波长。对于不同的荧光团可以选用不同波长的激发光，即对于不同的所述样品1可以对所述激发光的波长进行调节。所述激发光10的波长可通过所述激光发射器10进行调节。对于不同的所述样品1还可以调节所述激发光的光强，具体的，可以是调节所述激光发射器10的功率，从而实现所述激发光光强的调节。在其他实施方式中，所述激光发射器10还可以是对激发光的光束大小进行调节。

本实施方式中，所述双色镜20可反射激发光并透过荧光。即所述双色镜20接收所述激光发射器10发射的激发光后，将所述激发光反射至所述样品1。所述样品1的荧光团可以吸收所述激发光，并发出与所述激发光不同波长的所述荧光A，所述荧光A沿所述激发光的入射方向反向入射至所述双色镜20。从而所述双色镜20透过所述荧光A，所述荧光A的荧光信号和激发光杂散信号均透过所述双色镜20，其中，所述荧光信号可反映出所述样品1的图像。本实施方式中，所述分光镜30既反射所述荧光A，又透过所述荧光A，从而实现荧光A被分为所述第一路光束A1和所述第二路光束A2，由于所述分光镜30的吸收率低，所述分光镜30对所述荧光A的荧光信号以及杂散信号影响较低，从而避免所述超分辨荧光光谱成像显微镜100失真。所述第一路光束A1由所述分光镜30透过所述荧光A所形成，所述第二路光束A2由分光镜30反射所述荧光A所形成。在其他实施方式中，所述第一路光束A1也可以由所述分光镜30透过所述荧光A所形成，所述第二路光束A2也可以由所述分光镜30反射所述荧光A所形成。

本实施方式中，所述图像控制器40(CCD，Charge-coupled Device)接收所述第一光束A1的光信号，即所述图像控制器40可以采集所述荧光A的所述荧光信号以及所述杂散信号。所述图像控制器40将所述荧光信号和所述杂散信号均转换成电荷信号，电荷信号通过移位寄存器传输至模数转换器，而后输出至缓冲区组合成图像信号。由于所述荧光A中具有所述杂散信号存在，所述杂散信号在所述图像控制器40的图像中表现图像对比度降低，影响所述样品1的图像采集。即所述荧光A的所述荧光信号在所述图像控制器40中被转换成所述样品1的图像，所述荧光A的杂散信号在所述图像控制器40中与信号光相叠加，影响所述样品1的图像的分辨率，降低了图像的信噪比。在所述图像控制器40的基础上利用所述光谱仪50区分所述荧光A的荧光信号和杂散信号，从而实现对所述图像控制器40的降噪，提高所述样品1的成像信噪比，有效提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的成像效果。

本实施方式中，所述第二束光路A2中具有与所述第一束光路A1相同的荧光信号和杂散信号。所述光谱仪50从所述第二束光路A2中采集所述荧光A的荧光信号和杂散信号，由于所述杂散信号为从所述样品1反射出的剩余激发光，所述杂散信号的波长与所述荧光信号的波长不同。所述光谱仪50可利用光电倍增管等光探测器测量光束的不同波长位置强度，即所述光谱仪50可分离出需要的波长，以及需要的波长区域，即所述光谱仪50根据需要可分离出所述荧光信号或者所述杂散信号，以及可分离出所述荧光信号的强度，或分离出所述杂散信号的强度。从而在所述图像控制器40中可去掉所述杂散信号，提高所述样品1的荧光成像信噪比，使得所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的使用效率提高。在其他实施方式中，还可以是将所述光谱仪50与所述图像控制器40相结合，从而利用所述光谱仪50的光谱信息以检测出多种形式的所述样品1的荧光。

进一步地，所述超分辨荧光光谱成像显微镜100包括第一扫描组件60和第二扫描组件70。所述第一扫描组件60包括第一振镜61，所述第一振镜接61接收所述双色镜20反射的激发光，并反射激发光斑至所述样品1，所述第一振镜61还接收所述样品1的荧光A，并反射所述荧光A至所述双色镜20；所述第二扫描组件70包括第二振镜71，所述第二振镜71将所述第一束光路A1扫描至所述图像控制器40。

本实施方式中，所述第一振镜61可改变所述激发光的照射方向，从而实现对所述样品1的多点扫描，以扫描出所述样品1的面图像，所述激发光的光斑大小并没改变，所述第一振镜61是通过改变所述激发光的方向进行扫描。所述激发光的光斑对所述样品1进行激发后，所述样品1发出所述荧光A，所述荧光A为激发光焦点的荧光。所述荧光A沿所述激发光的入射方向反向投射至所述第一振镜61，所述第一振镜61改变所述荧光A的投射方向，将所述荧光A反射至所述双色镜20。利用所述第一振镜61的对所述样品1的扫描可以实现所述样品1的点扫描成像，以便了解所述样品1的形态，以及方便记录所述样品1的形态。

本实施方式中，所述第二振镜71位于所述分光镜30和所述图像控制器40之间，所述荧光A经过所述分光镜30分为所述第一路光束A1后，所述第一路光束A1投射至所述第二振镜71，所述第二振镜71改变所述第一路光束A1的入射方向，将所述第一路光束A1扫描至所述图像控制器40上，以便所述图像控制器40对所述样品1的面图像进行采集。

在所述第二振镜71和所述第一振镜61进行扫描时，若所述样品1中有两个相距间隔小于物镜衍射极限的荧光分子，当所述第二振镜71的摆动角度与所述第一振镜61摆动角度相同时，激发光依次扫过所述样品1的荧光团激发出荧光信号，由于所述样品1中两个荧光分子距离较近，导致其发出的荧光信号在空间上有部分的重叠，无法区分出两个荧光分子。但是当所述第二振镜71的摆动角度正好是所述第一振镜61摆动角度的两倍时，由于所述超分辨荧光光谱成像显微镜100对样品1的放大率大于激发光斑的放大率，导致两个荧光分子的成像之间的距离增加，使得所述超分辨荧光光谱成像显微镜100能够分辨出这两个原本发光信号重叠的荧光分子，由此所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的分辨率能突破衍射极限，达到超分辨的效果。

进一步地，所述第一扫描组件60还包括第一物镜62，所述第一物镜62将所述激发光斑聚焦于所述样品1上。为了实现所述第一振镜61对样品1的点扫描，需要利用所述第一物镜62的聚焦功能，将所述激发光聚集于所述样品1上，从而使得所述样品1被扫描。

进一步地，所述第一扫描组件60还包括第一组合透镜63，所述第一组合透镜63位于所述第一振镜61和所述第一物镜62之间，所述第一组合透镜63改变激发光的光斑半径，使得所述激发光填充所述第一物镜62的后聚焦孔径，并方便所述第一物镜62聚焦所述样品1上。

本实施方式中，所述第一组合透镜63包括第一凸透镜631和第一凸透镜632，所述第一凸透镜631的焦距小于所述第二凸透镜632的焦距，从而将所述第一凸透镜631和所述第二凸透镜632对焦后，实现所述第一凸透镜631和所述第二凸透镜632构成望远镜，以放大所述第一振镜61所反射的激发光直径，以方便所述平行光充满所述第一物镜62的整个入射口，从而方面所述第一物镜62将所述激发光聚焦于所述样品1上。

进一步地，所述第二扫描组件70还包括第二组合透镜72，所述第二组合透镜72透过所述第二振镜71的出射光，并发射至所述图像控制器40。

本实施方式中，所述第二组合透镜72包括第三凸透镜721，所述第三凸透镜721将所述第一路光束A1聚焦于所述图像控制器40的接收端上，从而实现所述图像控制器40对所述第一路光束A1的采集。进一步地，所述超分辨荧光光谱成像显微镜100还包括第二物镜81、针孔82和第三物镜83，所述第二物镜81将透过所述双色镜30的荧光A聚焦于所述针镜82上，所述针孔82透过所述荧光A，并发射所述荧光A至所述第三物镜83，所述第三物镜83将所述荧光A恢复呈平行光束，并将所述平行光束发射至所述分光镜。本实施方式中，利用所述第二物镜81将所述荧光A聚集于所述针孔衍射镜82上的针孔，将离焦的荧光信号屏蔽，从而实现对所述样品的层析，即实现样品具有深度的立体图像，结合所述第二振镜71对所述荧光A进行扫描，从而可以反映出所述荧光A的立体图像。所述第二物镜81和所述第三物镜83除了维持所述荧光A为平行光束外，所述第二物镜81和所述第三物镜83还可以消除所述荧光A的像差以及色差。

进一步地，所述超分辨荧光光谱成像显微镜100还包括光学衰减片84，所述光学衰减片84将所述激光发射器10发射的激发光衰减后，发射至所述双色镜20。本实施方式中，利用所述光学衰减片84降低所述激光10的光强，实现所述激光发射器10的功率可调，以及实现所述激发光的光强可调。在其他实施方式中，还可以是设置所述激光发射器的功率可调。

进一步地，所述超分辨荧光光谱成像显微镜100还包括滤光片85，所述滤光片85将透过所述双色镜20的荧光A过滤后，发射至所述分光镜30。本实施方式中，所述滤光片85可以进一步地消除所述荧光A中的杂散信号，从而更进一步地提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的信噪比。

进一步地，所述光谱仪50设有采集所述第二路光束A2的接收端51，所述超分辨荧光光谱成像显微镜100还包括第四物镜86，所述第四物镜86将所述第二路光束A2聚集于所述接收端51。利用所述第四物镜86将所述第二路光束A2聚集于所述光谱仪50，使得所述光谱仪50可以更有效率的采集所述样品1所发出的荧光A的光谱信息。

进一步地，所述光谱仪50设置有光纤52，所述接收端51设置于所述光纤52上。利用所述光线52接收所述第二路光束A2，降低来自周围环境光的影响，以及提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜100的使用效率。

本发明所提供的超分辨荧光光谱成像显微镜通过所述分光镜将所述荧光分为第一束光路和第二书光路，利用所述第一束光路将样品的图像信息发射至所述图像控制器，以实现样品成像，同时利用第二束光路发送至所述光谱仪，

利用所述光谱仪采集的光谱信息区分所述荧光的荧光信号和杂散信号，从而实现利用光谱仪对样品的图像信息中不同荧光团的荧光信号加以区分，并且能将激发光与荧光信号区别开，提高所述超分辨荧光光谱成像显微镜的成像效果。

Claims (10)

1.一种超分辨荧光光谱成像显微镜，用于对样品进行显微成像，其特征在于，所述超分辨荧光光谱成像显微镜包括激光发射器、双色镜、分光镜、图像控制器和光谱仪，所述激光发射器发射激发光至所述双色镜，所述双色镜将所述激发光反射至所述样品，以激发样品的荧光团发出荧光，所述荧光具有荧光信号以及激发光的杂散信号，所述双色镜透过所述样品的荧光至所述分光镜，所述分光镜将所述荧光分为第一束光路和第二束光路，所述第一束光路和所述第二束光路均具有所述荧光的荧光信号与激发光杂散信号，所述第一束光路发射至所述图像控制器，以采集所述荧光的强度信息，所述第二束光路发射至所述光谱仪，以分析所述荧光的光谱信息，并根据所述光谱信息区分所述荧光信号和所述杂散信号。

2.根据权利要求1所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述超分辨荧光光谱成像显微镜包括第一扫描组件和第二扫描组件，

所述第一扫描组件包括第一振镜，所述第一振镜接收所述双色镜反射的激发光，并反射激发光至所述样品，所述第一振镜还接收所述样品的荧光，并反射所述荧光至所述双色镜；

所述第二扫描组件包括第二振镜，所述第二振镜将所述第一束光路扫描至所述图像控制器。

3.根据权利要求2所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述第一扫描组件还包括第一物镜，所述第一物镜将所述激发光聚焦于所述样品上。

4.根据权利要求3所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述第一扫描组件还包括第一组合透镜，所述第一组合透镜位于所述第一振镜和所述第一物镜之间，以改变所述激发光的光斑半径。

5.根据权利要求2所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述第二扫描组件还包括第二组合透镜，所述第二组合透镜透过所述第二振镜的出射光，并将其聚焦至所述图像控制器。

6.根据权利要求1任意一项所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括第二物镜、针孔和第三物镜，所述第二物镜将透过所述双色镜的荧光聚焦于所述针孔上，所述针孔透过所述荧光，并发射所述荧光至所述第三物镜，所述第三物镜将所述荧光恢复呈平行光束，并将所述平行光束发射至所述分光镜。

7.根据权利要求1所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括光学衰减片，所述光学衰减片将所述激光发射器发射的激发光衰减后，发射至所述双色镜。

8.根据权利要求1所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括滤光片，所述滤光片将透过所述双色镜的荧光过滤后，发射至所述分光镜。

9.根据权利要求1所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述光谱仪设有采集所述第二路光束的接收端，所述超分辨荧光光谱成像显微镜还包括第四物镜，所述第四物镜将所述第二路光束聚集于所述接收端。

10.根据权利要求9所述的超分辨荧光光谱成像显微镜，其特征在于，所述光谱仪设置有光纤，所述接收端设置于所述光纤上。