CN112986204A - 一种扫描式显微高光谱成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于显微成像技术领域，提供了一种扫描式显微高光谱成像系统，包括：激发光源；样本显微组件，包括放置待测样本的样品台以及对待测样本进行显微的物镜组；振镜扫描组件，产生不同偏转角度的激发光，不同偏转角度的激发光经物镜组聚焦到待测样本上，以对待测样本进行扫描；滤光部件，设置于激发光出射光路和反射光路上，对入射激光和反射荧光进行滤波；图像探测模块，设置于反射路径上，用于接收滤波后的混合荧光并进行显微高光谱成像。本发明利用光的点扫描成像方式，提高了系统的空间分辨率，结合物镜组不同的放大倍率，可实现对多种目标的高分辨率探测，还消除了样品机械运动对成像造成的模糊和伪影。
Description
技术领域
本发明属于显微成像技术领域，尤其涉及一种扫描式显微高光谱成像系统。
背景技术
高光谱成像作为光谱成像技术的分支，自20世纪80年代诞生以来，广泛应用于农业学、矿物学、大气学以及生命科学等领域新兴技术。它与传统的成像技术相比，在获得目标图像信息的同时，又可以获得特定波段的光谱信息，且高光谱成像的光谱分辨率能够达到10nm以下，它能够瞬时记录视场角内每个像素几十个甚至数百个连续窄波段的光谱信息。近年来，随着显微技术渗透到生物医学检测各方面，出现了许多高光谱技术与显微成像结合的报导，如：染色体识别、癌症诊断、皮肤病检查、食品、农产品等无损检测、细胞功能研究等。
现有的细胞检测技术难以同时获得样本的空间信息和组成成分信息，而显微高光谱技术能够很好地呈现细胞的外观信息和内部的化学成分信息，因而研究显微高光谱成像系统对于细胞乃至于整个生命科学领域来说都有重大的意义。在生物医学研究领域，生物组织的自体荧光检测已经被广泛地应用于疑难病症的预防和诊断研究，而高光谱显微成像技术结合显微镜技术和光谱成像技术，能够被用来进行病理学的定量分析，相对于传统的医学成像方法，它能提供更丰富的光谱成分信息和客观的诊断标准，在生物医学领域有着广阔的应用前景。
目前多数高光谱成像系统多采用推扫视和凝视式的扫描方式，但是大部分的生物体自发荧光信号较弱，如果使用推扫式和凝视型的方式进行成像的话，很容易受到其他背景荧光的影响使得数据采集不准确、光谱以及重建后的图像分辨率低，同时对于液态样品或活体样品来说易造成运动伪影。同时，目前的高光谱成像系统无法做到一次扫描同时获得光谱和显微图像，也就无法通过图谱合一的信息来对样本进行全面分析。
发明内容
本发明实施例提供一种扫描式显微高光谱成像系统，旨在解决现有显微高光谱成像的分辨率低的技术问题。
本发明实施例是这样实现的，一种扫描式显微高光谱成像系统，所述系统包括：
激发光源，用于提供照射待测样本的激发光；
样本显微组件，包括放置所述待测样本的样品台以及对所述待测样本进行显微的物镜组；
振镜扫描组件，包括沿所述激发光的出射光路依次布置的扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜，所述激发光经所述扫描振镜和所述扫描透镜调节之后，产生不同偏转角度的激发光，所述不同偏转角度的激发光经所述套筒透镜准直后进入所述物镜组并聚焦到所述待测样本上，以对所述待测样本进行扫描，所述待测样本被激发光扫描激发后发射荧光，所述荧光和所述待测样本反射的激发光混合形成混合荧光，所述混合荧光沿反射光路传导；
滤光部件，设置于所述激发光出射光路和反射光路上，对入射激光和反射荧光进行滤波；
图像探测模块，设置于所述反射路径上，用于接收所述滤光部件滤波后的混合荧光并进行显微高光谱成像；
硬件控制模块，与所述图像探测模块和所述振镜扫描组件电连接，用于对所述图像探测模块和所述振镜扫描组件电连接进行同步控制，所述硬件控制模块包括人机交互的控制操作面板；
数据处理模块，与所述图像探测模块电连接，用于对所述图像探测模块所采集到的高光谱数据进行处理。
优选地，所述图像探测模块包括：
光路切换部件，设置于所述反射路径上，用于接收所述滤光部件滤波后的混合荧光、并使滤波后的混合荧光沿第一传导光路传导或沿第二传导光路传导；
光谱仪，设置于所述第一传导光路上，用于接收沿所述第一传导光路传导的荧光，并对混合荧光进行分离，以形成所述待测样本的光谱；
成像装置，设置于所述第二传导光路上，用于接收沿所述第二传导光路传导的荧光，以形成所述待测样本的显微图像。
优选地，所述第一传导光路上设置有荧光滤色片和第一聚焦透镜，沿所述第一传导光路传导的荧光依次经过所述荧光滤色片和所述第一聚焦透镜之后射向所述光谱仪；
所述第二传导光路上设置有第二聚焦透镜，沿所述第二传导光路传导的荧光经过所述第二聚焦透镜之后射向所述成像装置。
优选地，所述物镜组倒置在所述样品台的下方。
优选地，所述样本显微组件还包括设置于所述样品台上方且依次靠近所述样品台设置的卤素灯、相差环和聚光镜。
优选地，所述扫描式显微高光谱成像系统还包括：
空间扩束滤波器，设置在所述激发光的出射光路上，且位于所述激发光源和所述滤光部件之间，用于对所述激发光进行扩束并消除杂散光。
优选地，所述空间扩束滤波器包括沿所述激发光的出射光路依次布置的第一扩束透镜、针孔、第二扩束透镜和激发滤色片。
优选地，所述滤光部件为二向色镜。
优选地，所述光路切换部件为可调平面反射镜，所述激发光源为可出射多种波长的激发光的多线程激光器。
优选地，所述系统满足以下条件：
光谱范围为500-750nm，光谱分辨率<2nm。
本发明所达到的有益效果：通过设置振镜扫描组件来对激发光进行调节，产生不同偏转角度的激发光来对待测样本进行扫描，以利用光的点扫描成像方式，提高了系统的空间分辨率，结合物镜组不同的放大倍率，可实现对多种目标的高分辨率探测，还消除了样品机械运动对成像造成的模糊和伪影。
附图说明
图1是本发明实施例一当中的扫描式显微高光谱成像系统的结构示意图；
图2是本发明实施例一当中的扫描式显微高光谱成像系统的三维结构图。
图3是本发明实施例一当中的扫描式显微高光谱成像系统的硬件控制流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
请参阅图1-图2，所示为本发明实施例一当中的扫描式显微高光谱成像系统，包括激发光源1、振镜扫描组件30、样本显微组件40、滤光部件5、及图像探测模块50。其中：
激发光源1用于提供照射待测样本的激发光，激发光将沿设定的出射光路射向待测样本，待测样本被激发光照射激发后会产生荧光信号，该荧光信号可用于后续的高光谱成像。优选地，激发光源1具体可以为可出射多种波长的激发光的多线程激光器，这样可以满足多种可见光范围内的荧光信号的激发，提高系统的通用性。示例而非限定，更具体地，该多线程激光器具体可以出射405nm、488nm和561nm的激发光，但实际并不限于此，可以根据实际需求相应增加或减少其激发光种类的数量，或采用不同波长的激发光。
样本显微组件40包括放置待测样本的样品台12以及对待测样本进行显微的物镜组10。在本实施例当中，物镜组10倒置在样品台12的下方，这种采用倒置型的显微结构有利于对半透明乃至透明的样本进行成像，更有助于实现对细胞等的透射和荧光成像。在本实施例一些情况当中，样本显微组件40还包括设置于样品台12上方且依次靠近样品台12设置的卤素灯16、相差环15和聚光镜14，通过搭载卤素灯16等部件可以在获取荧光成像的同时获取明场图像，并且可以通过切换物镜组10得到不同的空间分辨率。
振镜扫描组件30设置在激发光的出射光路上，用于接收激发光并对激发光进行调节，以产生不同偏转角度的激发光，该不同偏转角度的激发光将经过物镜组10聚焦到待测样本上，以对待测样本进行扫描，从而以光的点扫描成像方式进行高光谱成像。具体地，在本实施例当中，振镜扫描组件30具体包括沿激发光的出射光路依次布置的扫描振镜6、扫描透镜7和套筒透镜8，激发光经扫描振镜6和扫描透镜7调节之后、再由套筒透镜8进行准直后进入物镜组10。此外，在本实施例一些可选情况当中，系统还可以包括平面反射镜9，平面反射镜9设置在激发光的出射光路上、且位于套筒透镜8和物镜组10之间，套筒透镜8准直后的激发光经平面反射镜9反射后进入物镜组10。通过设置平面反射镜9，以将水平传导的激发光切换为竖向传导，这样振镜扫描组件30和样本显微组件40就可以一个水平布置另一个竖向布置，有利于缩小系统体积。其中扫描振镜6可以为Thorlabs GVS212，其波长范围为400-750nm，电压范围±10V，角分辨率0.0008°，光束直径10mm(max)，扫描频率30KHz。
需要说明的是，待测样本被激发光扫描激发后会发射出荧光，同时待测样本也会对激发光进行反射，待测样本反射的激发光和待测样本发射的荧光将混合在一起形成混合荧光，混合荧光将沿反射光路传导。
滤光部件5设置于反射路径上，用于接收反射的混合荧光并滤除非感兴趣波段的荧光，滤波后的混合荧光继续沿反射光路传导。同时滤光部件5还设置在激发光的出射光路上，激发光经滤光部件5反射后进入振镜扫描组件30，这样系统可以节省一个光学器件，降低成本，且能够使系统集成化更高。
图像探测模块50设置于反射路径上，用于接收经滤光部件5滤波后的混合荧光并进行显微高光谱成像。具体地，图像探测模块50具体包括光路切换部件17、光谱仪22及成像装置19，光路切换部件17设置于反射路径上，用于接收滤光部件5滤波后的混合荧光、并使滤波后的混合荧光沿第一传导光路传导或沿第二传导光路传导。光谱仪22设置于第一传导光路上用于接收沿第一传导光路传导的荧光，并对混合荧光进行分离(即从混合荧光当中将荧光信号分离出)，以形成待测样本的光谱。成像装置19设置于第二传导光路上，用于接收沿第二传导光路传导的荧光以形成待测样本的显微图像。此外，在第一传导光路还设置有荧光滤色片20和第一聚焦透镜21，沿第一传导光路传导的荧光依次经过荧光滤色片和第一聚焦透镜之后射向光谱仪，荧光滤色片20用于过滤荧光信号当中的杂光，过滤之后，荧光信号由第一聚焦透镜21进行聚焦后进入光谱仪22。光谱仪22选用的是Andor Kymera 328i-B1，其内置的光栅有150g/mm、600g/mm、1200g/mm三种规格，其理论光谱分辨率分别能够达到到0.62nm、0.15nm、0.07nm，但是对于光谱分辨来说，入射狭缝的大小也会对其造成影响。根据所需研究样品需求，在狭缝150um的情况下使用150g/mm的光栅，其光谱分辨率为1.56nm。同理，在第二传导光路还设置有第二聚焦透镜18，沿第二传导光路传导的荧光经过第二聚焦透镜之后射向成像装置，即荧光信号由第二聚焦透镜18进行聚焦后进入成像装置19。
示例而非限定，在本实施例当中，滤光部件5具体可以为二向色镜，光路切换部件17具体可以为可调平面反射镜9。成像装置19具体可以为CCD或sCMOs相机。为了能够实现较高速度的采样，成像装置19选用的是Andor Zyla5.5 sCMOs，其有效像元数为2560*2160，像元尺寸为6.5um*6.5um，全幅帧速为40fps，像素时钟为200MHz/560MHz，根据所需采集要求，只选用了2000*30像元区域，在曝光1.4ms的情况下，采样频率为500Hz。
应当理解的，由于光具有可逆性，混合荧光的反射光路会与激发光的出射光路互逆，即混合荧光会原路返回。
进一步地，在本实施例一些情况当中，本扫描式显微高光谱成像系统还进一步包括空间扩束滤波器60，空间扩束滤波器60设置在激发光的出射光路上，且位于激发光源1和滤光部件5之间，用于对激发光进行扩束并消除杂散光。具体地，在本实施例当中，空间扩束滤波器60具体包括沿激发光的出射光路依次布置的第一扩束透镜2、针孔、第二扩束透镜3和激发滤色片4。通过空间扩束滤波器60可以将激光光斑扩大40倍，而且使入射光更为均匀，入射光斑尽可能放大，使得从物镜出来的聚焦光斑能尽可能小，可提高空间分辨率。例如，在40X物镜的情况下，光斑直径仅有0.41um。
基于上述结构，请参阅图2，本扫描式显微高光谱成像系统的工作原理为：激发光源1射出激发光，激发光依次经过第一扩束透镜2、针孔、第二扩束透镜3和激发滤色片4之后，经滤光部件5反射后进入扫描振镜6，在扫描振镜6内完成调节，形成不同偏转角度的激发光，再由扫描透镜7将该不同偏转角度的激发光聚焦在同一焦平面上，再通过套筒透镜8进行准直之后，经平面反射镜9反射进入物镜组10，从而对样品台12上的待测样本进行扫描；
扫描产生的混合荧光原路返回，混合荧光到达滤光部件5之后，混合荧光将透过滤光部件5射向光路切换部件17，通过光路切换部件17的切换，使荧光信号先后射向成像装置19和光谱仪22，从而实现一次扫描可以同时获得光谱和显微图像。
除此之外，本扫描式显微高光谱成像系统还进一步包括计算机14，计算机14分别连接光谱仪22和成像装置19，同时还通过NI数据采集卡11连接扫描振镜6。计算机14作为上位机主要控制了扫描振镜6和光谱成像的同步响应，即扫描振镜6每扫描一个点，就会给NI数据采集卡11一个触发采集光谱的信号，使得计算机14同步控制光谱仪22和成像装置19进行光谱成像。
进一步地，所述扫描式显微高光谱成像系统还包括硬件控制模块和数据处理模块，硬件控制模块和数据处理模块均位于计算机14上。硬件控制模块与光路切换部件17、光谱仪22、成像装置19和扫描振镜6电连接，用于对光路切换部件17、光谱仪22、成像装置19和扫描振镜6进行同步控制，硬件控制模块包括人机交互的基于LabVIEW编写的控制操作面板，控制操作面板具体可以为计算机14的面板，通过在自主发开的控制操作面板进行参数设置，实现对扫描振镜6不同的扫描区域和频率以及图像探测模块的同步信号采集。数据处理模块与光谱仪22和成像装置19电连接，用于对图像探测模块所采集到的高光谱数据进行数据降维/重组、图像预处理、谱线提取、细胞分类计数等处理处理。数据处理模块可以设计开发高光谱数据处理软件界面。
请参阅图3，所示为硬件控制流程图，整个硬件控制流程如下：
启动针对系统所设计的应用程序，首先初始化整套系统的硬件(包括扫描振镜、光谱仪以及成像装置等)，并且根据需求设置程序的控制和采集参数，如二维扫描振镜的扫描电压值范围、二维平面X/Y两个方向的扫描采样点数、振镜的扫描频率以及分光的中心波长等。振镜扫描完整的一次X向的点数就相当于采样了一行，通过X/Y两个方向完整的循环，就能得到完整的一幅图像。由于希望振镜能实现高速扫描，而一般的软件的循环均有一定速度限制，因而对于振镜的扫描控制主要基于硬件对硬件的控制，即通过设置的采样参数生成的模拟信号数组记录在NI数据采集卡上，然后通过设置的频率实现对扫描振镜和PMT的控制，当振镜每扫描一个点会生成一个脉冲数字信号赋予光谱探测器，进行同步外部触发，这就能实现光谱信号采集和振镜扫描的同步，然后光谱仪探测器所采集的每个点的信号会通过USB3.0缓存在计算机硬盘上，实现数据保存。而PMT探测的是每个点的光强信号，然后转换成电信号传送到NI数据采集卡中，当完成一个完整的扫描后电信号矩阵会将数据传输至计算机硬盘中形成一个二维的灰度图像。当扫描结束后，振镜会回到初始位置。除此之外，数据处理模块对数据的处理选择基于Python来进行设计，相比于Matlab，Python作为一款免费的、开源的计算机程序设计语言，更容易推广使用。而且针对于高光谱数据量庞大的问题(通常在1GB以上)，利用matlab进行数据的读取和重组计算都会耗费大量的时间以及给计算机带来巨大的负载，相对而言，python对于大数据的处理会更加便捷，相同计算机配置下比matlab重组速度提高了约100倍。为了能够实现人机交互，增加操作的便利性，可利用python基于QT Designer设计了一个图像处理界面。
综上，本实施例当中的扫描式显微高光谱成像系统，至少具有以下有益效果：
1、通过设置振镜扫描组件30来对激发光进行调节，产生不同偏转角度的激发光来对待测样本进行扫描，以利用光的点扫描成像方式，提高了系统的空间分辨率，结合物镜组10不同的放大倍率，可实现对多种目标的高分辨率探测，还消除了样品机械运动对成像造成的模糊和伪影；
2、采用二向色镜进行滤光，然后采用光谱仪内的光栅对光谱进行分光，即光谱分光采用光栅分光，光谱分辨率可以达到1nm，相对于液晶可调谐滤波片和声光可调谐滤光片具有更高的光谱分辨率，可以更好地区分不同的荧光发射峰，避免串扰；
3、本发明将整个振镜扫描组件30设计为一整个模块(如图2所示)，可以方便搭载在各种显微镜中，实现高光谱显微系统搭建的模块化和简易化；
4、设计开发了硬件控制系统和数据处理模块的软件和交互界面，实现系统的完整性，便利性和推广性，便于人机交互以及系统的集成化，可运用于多种场景。
5、通过上述各参数的设置，使得系统的主要性能指标高，具体如下：光谱范围：500-750nm、光谱分辨率：<2nm、波段数：1000、空间分辨率：跟物镜放大倍数有关，40倍时为0.41um。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述系统包括：
激发光源，用于提供照射待测样本的激发光；
样本显微组件，包括放置所述待测样本的样品台以及对所述待测样本进行显微的物镜组；
振镜扫描组件，包括沿所述激发光的出射光路依次布置的扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜，所述激发光经所述扫描振镜和所述扫描透镜调节之后，产生不同偏转角度的激发光，所述不同偏转角度的激发光经所述套筒透镜准直后进入所述物镜组并聚焦到所述待测样本上，以对所述待测样本进行扫描，所述待测样本被激发光扫描激发后发射荧光，所述荧光和所述待测样本反射的激发光混合形成混合荧光，所述混合荧光沿反射光路传导；
滤光部件，设置于所述激发光出射光路和反射光路上，对入射激光和反射荧光进行滤波；
图像探测模块，设置于所述反射路径上，用于接收所述滤光部件滤波后的混合荧光并进行显微高光谱成像；
硬件控制模块，与所述图像探测模块和所述振镜扫描组件电连接，用于对所述图像探测模块和所述振镜扫描组件电连接进行同步控制，所述硬件控制模块包括人机交互的控制操作面板；
数据处理模块，与所述图像探测模块电连接，用于对所述图像探测模块所采集到的高光谱数据进行处理。
2.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述图像探测模块包括：
光路切换部件，设置于所述反射路径上，用于接收所述滤光部件滤波后的混合荧光、并使滤波后的混合荧光沿第一传导光路传导或沿第二传导光路传导；
光谱仪，设置于所述第一传导光路上，用于接收沿所述第一传导光路传导的荧光，并对混合荧光进行分离，以形成所述待测样本的光谱；
成像装置，设置于所述第二传导光路上，用于接收沿所述第二传导光路传导的荧光，以形成所述待测样本的显微图像。
3.根据权利要求2所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述第一传导光路上设置有荧光滤色片和第一聚焦透镜，沿所述第一传导光路传导的荧光依次经过所述荧光滤色片和所述第一聚焦透镜之后射向所述光谱仪；
所述第二传导光路上设置有第二聚焦透镜，沿所述第二传导光路传导的荧光经过所述第二聚焦透镜之后射向所述成像装置。
4.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述物镜组倒置在所述样品台的下方。
5.根据权利要求1或4所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述样本显微组件还包括设置于所述样品台上方且依次靠近所述样品台设置的卤素灯、相差环和聚光镜。
6.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，还包括：
空间扩束滤波器，设置在所述激发光的出射光路上，且位于所述激发光源和所述滤光部件之间，用于对所述激发光进行扩束并消除杂散光。
7.根据权利要求6所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述空间扩束滤波器包括沿所述激发光的出射光路依次布置的第一扩束透镜、针孔、第二扩束透镜和激发滤色片。
8.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述滤光部件为二向色镜。
9.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述光路切换部件为可调平面反射镜，所述激发光源为可出射多种波长的激发光的多线程激光器。
10.根据权利要求1所述的扫描式显微高光谱成像系统，其特征在于，所述系统满足以下条件：
光谱范围为500-750nm，光谱分辨率<2nm。
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