CN113348238B - 细胞检测装置以及细胞检测方法 - Google Patents

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Abstract

高灵敏度地实施基于ATP法的样本中的菌的检测，缩短检测时间。一种检测样本中的细胞的细胞检测装置，具备：密闭容器，其具有能够密闭的样本导入部、容纳培养液的培养部、容纳提取试剂的提取试剂部以及容纳发光试剂的发光试剂部；接触机构，其控制培养液、提取试剂以及发光试剂的接触；光检测器，其检测来自发光试剂部的发光；以及运算部，其根据光检测器的检测信号来判定细胞的增殖。培养液、提取试剂和发光试剂在密闭容器内分离地配置，接触机构使添加了样本的培养液和提取试剂断续地接触来得到提取溶液，并使提取溶液和发光试剂断续地接触。

Description

细胞检测装置以及细胞检测方法
技术领域
本公开涉及细胞检测装置和细胞检测方法。
背景技术
为了确认血液等临床样本、细胞制剂这样的通常无菌的样本中是否存在菌，以往进行如下方法：将样本添加到液体培养基中进行培养，使细菌或真菌(菌)增殖来检测有无菌。特别是，由于面向再生医疗的细胞制剂的大部分在制造后最晚2天以内对患者给药，因此为了能够在给药前判定细菌的有无，期望使现有方法中最长花费14天的检查迅速化。
作为检测菌的增殖的方法，浊度测量简便且常规，但在如血液、细胞培养液那样原本浑浊的样本的情况下难以检测。作为除了浊度测量以外的检测菌的增殖的方法，在专利文献1中公开了使用自动测量装置的方法，该自动测量装置同时多样本地检测与菌的增殖相伴随的气体的产生和消耗。该自动测量装置是采用了荧光法的装置，该荧光法在培养瓶底部固定荧光随着二氧化碳、氧等气体浓度的变化而变化的荧光色素，对由细菌的增殖而引起的气体浓度的变化进行荧光检测。已知荧光法中，在活菌大致增殖至107CFU/mL(CFU：Colony forming unit，菌落形成单位)以上的情况下判定为阳性(非专利文献1)。
另外，作为高灵敏度地检测菌的方法，已知有利用ATP法(AdenosineTriphosphate：三磷酸腺苷)的检测方法。ATP法是通过基于荧光素-荧光素酶反应的生物发光来检测细胞的ATP的方法，一般能够检测100CFU左右的菌，灵敏度高。例如在专利文献2中公开了如下内容：向平板分注细菌培养液和发光试剂，进行基于ATP法的发光测量，由此检测细菌的增殖、死亡。另外，在专利文献2中还公开了为了能够进行厌氧菌的检测而将容器密闭并设置气体供给机构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第2696081号
专利文献2：国际公开第2016/147313号
非专利文献
非专利文献1：Journal of Microbiology，Immunology and Infection(2015)48，419-424
发明内容
发明所要解决的课题
然而，专利文献1中记载的荧光法的灵敏度低，若活菌未增殖至107CFU/mL以上则无法检测。因此，在初始菌数低的样本、增殖慢的菌的情况下，到检测出为止较花费时间。
另外，现有的ATP法中，由于每个一段时间分取培养液来与发光试剂混合的操作，存在细菌从外部混入而污染培养液的可能性，导致检查的假阳性。如果在培养液中预先混合发光试剂并密闭，则能够不进行分取操作而连续地进行发光测量。但是，在荧光素-荧光素酶反应中，ATP与荧光素发生不可逆地反应而将ATP从反应体系中除去，因此细菌生成的ATP始终被发光反应消耗，发光强度降低，灵敏度降低。进而，在为了操作的简便性而使用预先混合有ATP提取试剂的发光试剂的情况下，作为酶的发光试剂被ATP提取试剂阻碍，因此发光强度降低，灵敏度降低。
因此，本公开提供一种使基于ATP法的样本中的细胞的检测为高灵敏度并缩短检测时间的细胞检测装置以及细胞检测方法。
用于解决课题的方法
本公开的细胞检测装置是检测样本中的细胞的细胞检测装置，其特征在于，具备：密闭容器，其具有能够密闭的样本导入部、容纳培养液的培养部、容纳提取试剂的提取试剂部以及容纳发光试剂的发光试剂部；接触机构，其控制前述培养液、前述提取试剂以及前述发光试剂的接触；光检测器，其检测来自前述发光试剂部的发光；以及运算部，其根据前述光检测器的检测信号计算发光量，基于前述发光量的经时变化来判定前述细胞的增殖；前述提取试剂是从前述细胞提取与前述发光试剂的发光反应所需的物质而得到提取溶液的试剂，前述发光试剂是通过与前述提取溶液的接触而发光的试剂，前述培养液、前述提取试剂以及前述发光试剂在前述密闭容器内分离地配置，前述接触机构使添加了前述样本的前述培养液以及前述提取试剂断续地接触来得到前述提取溶液、并且使前述提取溶液以及前述发光试剂断续地接触。
根据本说明书的记述、附图，与本公开相关的进一步的特征将变得清楚。另外，本公开的方式通过要素以及多种要素的组合以及以后的详细记述和所附的方式来达成、实现。
本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上都不限定本公开的权利要求书或应用例。
发明效果
根据本公开，能够使基于ATP法的样本中的菌的检测为高灵敏度，缩短检测时间。
上述以外的课题、构成以及效果通过以下的实施方式的说明而变得明确。
附图说明
[图1]是示出第一实施方式涉及的细胞检测装置的构成的示意图。
[图2]是示出第二实施方式涉及的细胞检测装置的构成的示意图。
[图3]是示出使用了第二实施方式涉及的细胞检测装置的细胞检测方法的一例的流程图。
[图4]是示出第三实施方式涉及的细胞检测装置的构成的示意图。
[图5]是示出第四实施方式涉及的细胞检测装置的构成的示意图。
[图6]是示出第五实施方式涉及的细胞检测装置的构成的示意图。
具体实施方式
[第一实施方式]
<细胞检测装置的构成>
图1是示出第一实施方式涉及的细胞检测装置1的构成的示意图。如图1(a)所示，细胞检测装置1具备密闭容器10、注射器20(接触机构)、光检测器30以及运算装置31(运算部)。
密闭容器10具备开口部11和隔膜12、以及隔膜13和隔膜14。密闭容器10的内部被隔膜13(第一隔膜)以及隔膜14(第二隔膜)分离成3个空间。在隔膜13上方的空间(培养部)导入有培养基，在隔膜14上方的空间(提取试剂部)导入有ATP提取试剂7，在隔膜14下方的空间(发光试剂部)导入有发光试剂8。如此，培养部配置于提取试剂部的上方，提取试剂部配置于发光试剂部的上方，在密闭容器10内，培养液6、ATP提取试剂7及发光试剂8容纳于分离的位置。
需要说明的是，在本说明书中，“密闭”的意思是微生物不通过，只要是微生物不通过的大小的细孔、间隙，例如0.1μm以下的细孔、间隙，则是允许的。因此，也可以将密闭容器10的壁的一部分设为不使细胞通过而气体能够通过的材料。作为气体能够通过的材料，例如可举出孔径0.1μm左右的膜过滤器。
这样，通过使密闭容器10内外的气体能够通过，能够从密闭容器10外控制密闭容器10内的气体组成，设为适于菌的增殖的气体组成。例如在进行厌氧性菌的发光测量的情况下，也可以向容纳有培养液6的空间导入不含氧的气体而设为厌氧性条件，向容纳有发光试剂8的空间导入含氧的气体。或者，也可以用气体不透过的材料制作密闭容器10，在封入发光试剂8时导入含有氧的气体，在封入培养基时导入不含有氧的气体，使得能够进行厌氧培养。
开口部11以及与该开口部11嵌合的隔膜12(样本导入部)设置于能够向隔膜13上方的空间(培养部)导入样本的位置(例如密闭容器10的上部)。样本是成为有无菌的检测对象的医药品、食品、化妆品、细胞培养液、细胞制剂等，例如由用户用未图示的样本用注射器采集，使该样本用注射器的针贯通隔膜12而导入至隔膜13上的培养基。这样，通过将样本和培养基混合而得到培养液6。通过刺入样本用注射器的针而形成的孔由于隔膜12的弹力而被堵塞，密闭容器10被密闭。由此，能够防止样本导入时的来自外部的微生物的混入(污染)。
密闭容器10内可以被灭菌，样本向培养部的导入也可以无菌地进行。也可以代替隔膜12而在开口部11设置能够开闭的盖(例如嵌入式的盖、螺纹盖)等其他机构。
培养基可以是液体培养基，也可以是冷冻干燥后的粉末培养基。在培养基为粉末状的情况下，将用于形成液体培养基的溶剂(缓冲液等)进一步导入至隔膜13上。培养基中可以预先添加有促进细胞发育的成分、捕捉阻碍细胞发育的物质的成分。
如上所述，样本从嵌合于开口部11的隔膜12添加至培养基，但也可以构成为，代替设置开口部11以及隔膜12，而通过注射器20采集样本，将注射器20嵌合于密闭容器10，并添加至隔膜13上的培养基。
ATP提取试剂7是从细胞内提取ATP的试剂，也可以包含能够使ATP分解酶失活的试剂。具体而言，作为ATP提取试剂7，在将ATP等存在于菌体内的物质作为测定对象时，例如可以使用作用于菌的膜的苯扎氯铵、苄索氯铵等表面活性剂、三氯乙酸(TCA)、Tris缓冲液、乙醇、具有蛋白酶活性的溶菌酶或包含溶菌酶等的水溶液。另外，在将由菌所具有的酶生成的物质作为测定对象的情况下，可以使用含有酶的底物的水溶液来代替ATP提取试剂7。
发光试剂8是通过与ATP混合而发光的试剂，例如可以使用包含在ATP的存在下通过荧光素-荧光素酶反应而发光的荧光素酶和荧光素的试剂。需说明的是，也可以将荧光素酶导入到发光试剂8中，将荧光素混合到ATP提取试剂7中。另外，在将由菌所具有的酶生成的物质作为测定对象的情况下，可以使用与由菌所具有的酶生成的物质反应而发光的试剂。
注射器20(接触机构)结合于密闭容器10的上部。在注射器20与密闭容器10之间设置有衬垫24，保持密闭容器10内部的气密性。注射器20具有柱塞21、注射器针22及罩23。注射器20能够上下移动，与此联动地注射器针22也上下移动。注射器20以注射器针22的前端位于隔膜13上的空间(培养部)的状态提供给用户。
注射器针22具有在用于进行发光测量的一系列操作中注射器20上下移动的距离以上的长度。具体而言，注射器针22的长度是在使注射器20向下方移动时能够贯通隔膜13以及14的长度。通过使柱塞21相对于注射器20上下移动，能够从注射器针22吸引或排出培养液6、ATP提取试剂7。只要不妨碍注射器针22的上下移动、培养液6的吸引，则样本可以是固体、液体、气体中的任一种。
隔膜13以及14例如由硅橡胶等具有通过弹力堵塞由注射器针22形成的贯通孔的作用的材料形成。由此，即使使注射器针22的前端多次重复贯通隔膜13及14，培养液6及ATP提取试剂7也不会从贯通孔漏出，能够分别留在隔膜13及14上而保持分离的状态。
注射器20设置有覆盖比衬垫24靠上的侧面的罩23。罩23具有挠性，例如形成为波纹状，与注射器20的上下移动联动地伸缩。通过罩23，在注射器20下降而进入密闭容器10时，能够防止附着于注射器20的外部的微生物混入培养液6。
密闭容器10的至少发光试剂8附近由使在发光反应中放出的光的波长透过的材质形成。例如，在发光试剂8引起发出可见光的反应的情况下，作为密闭容器10的材质，能够使用无色透明的塑料、玻璃等。
光检测器30在密闭容器10外配置于能够检测发光试剂8放出的光的位置。光检测器30每隔规定的时间或者在培养中始终检测发光试剂8放出的光，并将检测信号输出到运算装置31。作为光检测器30，例如能够使用光电倍增管、CCD照相机、光电二极管等。
运算装置31基于从光检测器30接收到的检测信号，进行发光量的计算、阳性或阴性的判定等运算处理。虽然省略了图示，但运算装置31也可以具备存储过去的测定数据、用于存储根据来自菌的发光量判定样本是阳性还是阴性的规定的阈值等数据的存储部、将算出的发光量、判定结果进行显示的显示部、发出表示判定结果的警报音的扬声器等。
运算装置31能够计算从将培养液6与ATP提取试剂7混合而得到的ATP溶液9(提取溶液)添加到发光试剂8中时的发光量的最大值减去即将添加前的发光量而得到的值(发光量的增加量)作为来自菌的发光量。另外，运算装置31通过将预先设定的规定的阈值与来自菌的发光量进行比较，能够进行是阳性(在样本中存在菌)还是阴性(在样本中不存在菌)的判定。
<细胞检测方法>
接着，对使用了本实施方式涉及的细胞检测装置1的细胞检测方法的一例进行说明。本方法是用户使用细胞检测装置1手动进行发光测量的方法。
首先，用户使用样本用注射器采集样本，使样本用注射器的针贯通隔膜12而向隔膜13上的培养基导入样本，得到培养液6(图1(a))。
在隔膜13上的培养基中，也可以预先添加ATP分解酶等ATP消去试剂。由此，能够分解培养基所包含的ATP以及样本所包含的游离ATP。通过消去菌体内以外的ATP，能够仅测量菌体内的ATP，提高菌来源ATP的检测灵敏度。
根据需要，也可以通过将注射器20的注射器针22的前端放入培养液6中并使柱塞21上下移动、或利用搅拌机或手动从外部摇动密闭容器10、或在培养基中放入搅拌子17(搅拌单元)等方法，来搅拌培养液6。通过搅拌培养液6，能够促进好氧性菌的增殖，缩短到细菌检测为止的时间。另外，在将培养液6的一部分吸引至注射器20时，培养液6变得均匀，能够得到偏差少的数据。
接着，为了测量第0小时的发光量(菌的初始浓度)，用户将注射器针22的前端浸入培养液6，提升柱塞21，将培养液6的一部分以一定量吸引到注射器20。接着，用户使注射器20下降而使注射器针22贯通隔膜13，将注射器针22的前端浸入ATP提取试剂7，进一步提升柱塞21而将ATP提取试剂7的一部分以一定量吸引至注射器20。先吸入的培养液6的一部分和ATP提取试剂7的一部分在注射器20中混合，菌被破坏、菌体内的ATP被取出，得到ATP溶液9(图1(b))。
接着，用户在进一步降下注射器20而使注射器针22贯通隔膜14之后，降下柱塞21而将注射器20内的ATP溶液9添加到发光试剂8中(图1(c))。此时，光检测器30检测ATP溶液9与发光试剂8的接触所引起的发光，并将检测信号输出至运算装置31。运算装置31接收光检测器30的检测信号，计算从ATP溶液9的滴加后的发光量的最大值减去即将滴加之前的发光量所得的值(发光量的增加量)作为第0小时的发光量。
培养规定的时间后，例如1小时后，用户操作注射器20，将注射器针22的前端浸入培养液6中。然后，再次以与上述相同的步骤进行培养液6的吸引、ATP提取试剂7的吸引、ATP溶液9向发光试剂8的添加以及发光测量。需要说明的是，培养液6的培养可以在未图示的培养器(温度调节单元)中一边调节温度一边进行。
通过以上的操作，每隔规定的时间重复进行发光量的测量，根据发光量的经时变化来判定菌的增殖。需要说明的是，该时间间隔(培养时间)可以恒定，也可以在适当的时机变更。
运算装置31在培养液6整体的发光量或来自菌的发光量为预先设定的阈值以上的情况下，视为菌增殖，判定为阳性。
用于判定为阳性的发光量的阈值例如能够设定为第0小时的发光量的3倍的值等。另外，阈值也能够设定为如下值等：求出多次测量中的第0小时的发光量的标准偏差，对第0小时的发光量加上第0小时的发光量的标准偏差的3倍而得到的值。在想要提高判定为阳性的可靠性的情况下，例如，能够将阈值设定为第0小时的发光量的10倍的值、或者对第0小时的发光量加上第0小时的发光量的标准偏差的10倍的值而得到的值等。另外，例如，也可以多次在相同的条件(相同的初始菌浓度、相同的温度等)下进行发光测量，计算判定为阳性的培养时间中的发光量的平均值，将该平均值作为阈值。另外，也可以对所测量的每个菌种分别设定推荐的阈值，也可以使用户能够在测定前或测定中进行设定。
需说明的是，在本实施方式中，也可以设为在隔膜13上配置ATP提取试剂7、在隔膜14上配置培养液6的构成。
以上，对通过荧光素-荧光素酶反应检测ATP的方法进行了说明，除此之外，例如也有在醌存在下通过活菌的醌氧化还原酶(NADPH或NADH)生成活性氧，使用用于对其进行定量的化学发光试剂的方法。在该情况下，将作为发光试剂8的化学发光试剂导入密闭容器10的最下部(隔膜14的下方的空间)，并将醌溶液导入隔膜14上。将培养液6和醌溶液吸引到注射器20中进行混合，从而通过醌和醌氧化还原酶的反应而产生活性氧，将该溶液滴加到化学发光试剂中，从而化学发光试剂与活性氧反应而发光。活性氧根据菌的增殖而增加，因此能够测量与菌的增殖成比例的发光量。
作为上述化学发光试剂，可列举例如2-甲基-6-苯基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(CLA)、2-甲基-6-(4-甲氧基苯基)-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(MCLA)、2-甲基-6-对甲氧基苯基乙炔基咪唑并吡嗪酮(MPEC)和吲哚菁型咪唑并吡嗪化合物(NIR-CLA)等。
在本实施方式中，对培养部、提取试剂部以及发光试剂部在上下方向上配置、注射器20上下移动的情况进行了说明，但并不限定于此，也可以是培养部、提取试剂部以及发光试剂部例如在水平方向上配置、注射器20在水平方向上移动的构成。
<技术效果>
如上所述，本实施方式采用如下构成：将培养液6、ATP提取试剂7及发光试剂8以配置于分离的位置的方式容纳于密闭容器10，将培养液6的一部分及ATP提取试剂7的一部分吸引至注射器20而获得ATP溶液9，并添加至发光试剂8。这样，由于在提取出菌的ATP之后混合到发光试剂8中，因此能够灵敏度好地检测出菌的ATP，能够在短时间内检测出菌的增殖。另外，不需要每隔一段培养时间通过手动移液器等分取培养液6并与发光试剂8混合的操作，因此能够防止因来自外部的微生物的混入而导致的假阳性。
进而，培养液6、ATP提取试剂7和发光试剂8被分离，断续地进行它们的接触，因此菌产生的ATP不会始终被发光反应消耗。由此，培养液6中的ATP浓度与菌的增殖成比例地上升，因此能够高灵敏度地检测菌的增殖。另外，与使用预先混合有ATP提取试剂7和发光试剂8的试剂的情况相比，抑制了发光试剂8的阻碍，能够进行高灵敏度的ATP测量。因此，能够高灵敏度地检测菌的增殖，能够在比以往的浊度法、荧光法短的时间内进行发光测量。
[第二实施方式]
<细胞检测装置的构成>
图2是示出第二实施方式涉及的细胞检测装置2的构成的示意图。本实施方式的细胞检测装置2是自动进行发光测量的装置，这一点与第一实施方式不同。对于与第一实施方式相同的构成，省略说明。
如图2所示，细胞检测装置2具备密闭容器210、接触机构220、光检测器30、运算装置31以及显示部32。
密闭容器210例如可以是与第一实施方式涉及的密闭容器10相同的构成，具有样本导入部211、培养部206、提取试剂部207、发光试剂部208。培养部206配置在提取试剂部207的上方，提取试剂部207配置在发光试剂部208的上方。
样本从样本导入部211被导入至培养部206。样本导入部211是能够在向培养部206导入培养液后将密闭容器210密闭的结构，防止来自外部的菌的混入(污染)。样本导入部211例如与第一实施方式同样地，也可以由设置于密闭容器210的开口部以及嵌合于该开口部的隔膜构成。
培养部206容纳包含样本和培养基的培养液。提取试剂部207容纳从细胞提取测定对象物质的ATP提取试剂。发光试剂部208容纳通过ATP的接触而发光的发光试剂。在密闭容器210内，培养部206、提取试剂部207以及发光试剂部208相互分离地配置，由此，培养液、ATP提取试剂以及发光试剂被容纳在分离的位置。
接触机构220是控制培养部206的培养液、提取试剂部207的ATP提取试剂以及发光试剂部208的发光试剂的接触的机构。为了防止培养液的污染，接触机构220也可以设置于密闭容器210的外部。作为本实施方式的细胞检测装置2，假设第一实施方式的细胞检测装置1自动化的装置，则接触机构220例如具备注射器20和驱动注射器20的注射器驱动装置。在该情况下，注射器驱动装置具有用于分别驱动注射器20及柱塞21的致动器。作为致动器，例如能够使用滚珠丝杠式的致动器等。
在运算装置31的存储部中，可以预先存储有与隔膜13以及14的位置、厚度相关的数据、与培养基或者培养液6的量、ATP提取试剂7的量以及发光试剂8的量相关的数据等。运算装置31也可以在开始发光测量的动作之前，使注射器20及柱塞21的位置移动至规定的原点位置，基于上述的数据、距规定的原点位置的距离等，计算注射器20及柱塞21的移动量，控制注射器驱动装置。作为注射器20的规定的原点位置，例如能够设为注射器针22的前端浸入培养基的位置。
虽然省略了图示，但细胞检测装置2也可以具备用于从样本导入部211导入样本的样本用注射器和控制该样本用注射器的驱动的样本用注射器驱动器。此时，样本用注射器驱动器驱动样本用注射器来采集样本，使样本用注射器的针贯通样本导入部211，并添加到培养部206。
运算装置31连接于样本用注射器驱动器、接触机构220、光检测器30以及显示部32，并控制它们的动作。显示部32按照来自运算装置31的指示，显示测量结果等各种数据、GUI画面等。
<细胞检测方法>
图3是示出使用了第二实施方式涉及的细胞检测装置2的细胞检测方法的一例的流程图。以下，对使用第一实施方式(图1)的密闭容器10作为密闭容器210、使用注射器20及注射器驱动装置作为接触机构220的例子进行说明。
首先，在步骤S1中，运算装置31驱动样本用注射器驱动器，通过未图示的样本用注射器采集样本。此时，运算装置31也可以驱动注射器驱动装置，使注射器20及柱塞21移动至规定的原点位置。接着，在步骤S2中，运算装置31驱动样本用注射器驱动器，使样本用注射器的针贯通样本导入部211，将样本添加到培养部206内的培养基中作为培养液6。在样本导入部211为隔膜的情况下，在步骤S3中，通过从隔膜拔出样本用注射器，将密闭容器210密闭。
接着，在步骤S4中，运算装置31驱动注射器驱动装置，将柱塞21提升规定量而将培养液6的一部分采集到注射器20。
在步骤S5中，运算装置31驱动注射器驱动装置而使注射器20向下方移动，使隔膜13被注射器针22贯通。运算装置31例如通过计算从上述规定的原点位置到ATP提取试剂7的距离，在驱动注射器20直至注射器针22的前端浸入ATP提取试剂7后，停止注射器20的驱动。之后，运算装置31通过注射器驱动装置使柱塞21向上方移动，吸引规定量的ATP提取试剂7，由此与采集到注射器20内的培养液6混合。由此，培养液6中的菌被破坏、ATP被提取，得到ATP溶液9。
接着，在步骤S6中，运算装置31通过注射器驱动装置使注射器20向下方移动，使隔膜14被注射器针22贯通。然后，通过注射器驱动装置使柱塞21向下方移动，使注射器20内的ATP溶液9排出，与发光试剂8混合。由此，发光试剂8与ATP反应，得到发光。
在步骤S7中，光检测器30在预定的一定时间内测量所产生的发光，并将检测出的发光量输出到运算装置31。
在步骤S8中，运算装置31判断当前的测量是否是第一次的测量。在当前的测量是第一次测量的情况下(是)，移至步骤S13。
在步骤S13中，运算装置31根据测量出的发光量计算下次的发光测量时刻。在步骤S13中算出的下次的发光测量时间也可以不在每次测量时变更，例如设定为每次1小时后等。另外，作为下次的发光测量时间，例如也可以以第一次的发光测量为培养开始1小时后、第二次的发光测量为从第一次的测量起2小时后、第三次的发光测量为从第二次的测量起3小时后的方式，针对每次测量进行变更。
之后，在步骤S14中，运算装置31停止注射器20及柱塞21的驱动，直至到达下一次的发光测量时刻为止，并在适于菌增殖的温度下进行培养。在到达下次发光测量时刻时，运算装置31再次返回步骤S4，与上述同样地执行步骤S4～S8。
在第二次以后的测量(在步骤S8中为“否”)中，在步骤S9中，运算装置31判定发光量是否为设定值以上。
在发光量为设定值以上的情况下(是)，移至步骤S10，运算装置31判断为检测出菌的增殖并输出阳性判定。此时，运算装置31也可以使显示部32显示判定结果。
在发光量小于设定值的情况下(否)，移至步骤S11，运算装置31判定培养时间是否为设定值以上。
在培养时间为设定值以上的情况下(是)，移至步骤S12，运算装置31判断为没有菌增殖并输出阴性判定。
在培养时间小于设定值的情况下(否)，移至步骤S13，运算装置31根据测量出的发光量的推移来计算下次发光测量时刻。然后，在步骤S14中进一步进行培养。以下，通过重复进行该操作，进行发光测量。
需说明的是，作为密闭容器210，在使用培养部206和提取试剂部207的位置相反的密闭容器的情况下，也可以使步骤S4和S5的顺序相反，先吸引ATP提取试剂。
<技术效果>
如上所述，第二实施方式采用自动实施如下动作的构成：在密闭容器210内将培养液的一部分及ATP提取试剂混合而获得ATP溶液，并添加至发光试剂中。由此，能够起到与第一实施方式相同的效果，并且减轻用户的操作的负担。
另外，在以往的自动化的细胞检测装置中，需要有吸引、排出培养液或者一次性使用移液器吸头等进行复杂的分取操作的机构，存在装置变得复杂的问题。与此相对，本实施方式如上述的构成那样不需要进行分取操作的机构，能够成为简单的构成的装置。
[第三实施方式]
<细胞检测装置的构成>
图4是示出第三实施方式涉及的细胞检测装置3的构成的示意图。本实施方式的细胞检测装置3与第一实施方式的不同点在于，在密闭容器310的内部，在隔膜13及14之间进一步具备隔膜15，在隔膜15上导入有ATP消去试剂16。对于与第一实施方式相同的构成，省略说明。
如图4所示，密闭容器310的内部被隔膜13～15分离成4个空间。在隔膜13上方的空间(培养部)导入有培养基，在隔膜15上方的空间(消去试剂部)导入有ATP消去试剂16，在隔膜14上方的空间(提取试剂部)导入有ATP提取试剂7，在隔膜14下方的空间(发光试剂部)导入有发光试剂8。这样，培养部、消去试剂部、提取试剂部以及发光试剂部从上方向下方依次配置，培养液6、ATP消去试剂16、ATP提取试剂7以及发光试剂8在密闭容器310内位于分离的位置。
ATP消去试剂16是消去菌体外的游离ATP的试剂。通过ATP消去试剂16消去培养液6中的游离ATP后，通过ATP提取试剂7提取菌体内ATP，由此能够仅测定活菌的ATP。
需说明的是，在本实施方式中，也可以构成为在隔膜13上配置ATP消去试剂16，在隔膜15上配置培养液6。
<细胞检测方法>
接着，对使用了本实施方式涉及的细胞检测装置3的细胞检测方法的一例进行说明。本方法是用户使用细胞检测装置3手动进行发光测量的方法。
在本实施方式的细胞检测方法中，在通过注射器20吸引培养液6的一部分之后，或者在吸引之前，通过注射器20吸引ATP消去试剂16的一部分并与培养液6混合。然后放置一定时间，消去培养液6中的菌体外的ATP。其他方面与第一实施方式相同，因此省略说明。
<技术效果>
如上所述，本实施方式具有通过与培养液6、ATP提取试剂7及发光试剂8分离的ATP消去试剂16来消去培养液6中的菌体外的ATP的步骤。由此，能够降低发光测量的背景，灵敏度良好地检测菌的ATP，因此能够在短时间内检测菌的增殖。
[第四实施方式]
<细胞检测装置的构成>
图5是示出第四实施方式涉及的细胞检测装置4的构成的示意图。本实施方式的细胞检测装置4在密闭容器410由注射器406(培养部)、容器407(提取试剂部)以及容器408(发光试剂部)构成这一点上与第一实施方式不同。
注射器406(第一容器)嵌合于容器407(第二容器)的内部，能够相对于容器407上下移动。在注射器406中嵌合有能够在注射器406内上下移动的柱塞420。在注射器406中设置有用于将培养液6向容器407滴加的流路421。
容器407嵌合于容器408(第三容器)的内部，在容器408的内部形成有空间的位置被固定。在容器407中设置有用于将ATP溶液向容器408滴加的流路422。
在注射器406中容纳有培养基，在容器407中容纳有ATP提取试剂7，在容器408中容纳有发光试剂8。样本通过取下柱塞420而从开口部411(样本导入部)添加到注射器406内的培养基中，由此得到培养液6。这样，培养液6、ATP提取试剂7以及发光试剂8在密闭容器410内位于分离的位置。
流路421及422设定为仅在对注射器406及容器407内施加一定以上的压力的情况下使溶液通过的材料、孔径。由此，培养液6、ATP提取试剂7、发光试剂8能够在密闭容器410内保持分离的状态。
<细胞检测方法>
接着，对使用了本实施方式涉及的细胞检测装置4的细胞检测方法的一例进行说明。本方法是用户使用细胞检测装置4手动进行发光测量的方法。
首先，用户将柱塞420从注射器406取下，将由样本用注射器采集的样本添加到培养基中，得到培养液6。通过再次将柱塞420嵌合于注射器406，注射器406被密闭。
接着，用户通过降下柱塞420，从流路421滴加一定量的培养液6的一部分，混合到ATP提取试剂7中。由此，培养液6中的菌被破坏、ATP被提取。
接着，用户通过降下注射器406，将包含所提取的ATP的ATP提取试剂7(ATP溶液9)从流路422向发光试剂8滴加一定量。由此，得到与ATP溶液9中的ATP量相应的发光。
用户每隔规定的时间重复进行上述的操作，测定发光量的经时变化。本实施方式的细胞检测方法的其他方面与第一实施方式相同，因此省略说明。
<技术效果>
在第一实施方式中，通过注射器20吸引、排出培养液6、ATP提取试剂7以及发光试剂8，使注射器针22贯通隔膜13以及14而将它们混合。但是，通过重复进行注射器针22的贯通，隔膜13以及14的贯通孔扩展而液体漏出，有可能引起不希望的反应。另一方面，在本实施方式中，培养液6、ATP提取试剂7和发光试剂8的混合只要从流路421滴加培养液6、从流路422滴加ATP溶液9即可，因此能够防止由培养液6、ATP提取试剂7和发光试剂8的漏出引起的不希望的反应。因此，能够进一步提高发光测量的可靠性。
[第五实施方式]
<细胞检测装置的构成>
图6是示出第五实施方式涉及的细胞检测装置5的构成的示意图。如图6所示，细胞检测装置5是对多个密闭容器10同时自动地进行发光测量的装置。在图6中，配置有4个密闭容器10，但数量没有限定。
细胞检测装置5具备多个密闭容器10、嵌合于各密闭容器10的多个注射器20及注射器驱动装置41(接触机构)、覆盖各密闭容器10的多个腔室40(温度调节单元)、气体供给管43、阀46及阀驱动装置47以及运算装置31。关于密闭容器10及注射器20，使用与第一实施方式(图1)相同的构成，因此省略各构成的说明。另外，作为密闭容器，也可以采用第三实施方式(图4)或第四实施方式(图5)的密闭容器。
运算装置31控制光检测器30、注射器驱动装置41及阀驱动装置47。
腔室40进行各密闭容器10的温度调节。由此，能够在适合于各个样本的温度下培养菌，在最佳的条件下进行增殖。
注射器驱动装置41按照来自运算装置31的指示来控制各注射器20及柱塞21的驱动。注射器驱动装置41具有用于分别驱动注射器20及柱塞21的致动器。作为致动器，例如能够使用滚珠丝杠式的致动器等。
气体供给管43是用于向各腔室40内导入气体44或气体45的管。气体45例如是含氧的气体。气体44例如是不含氧的气体。在气体供给管43中可以设置有用于防止污染的过滤器，也可以通过过滤器向腔室40供给气体44或45。
阀46通过其开闭来变更气体44或45向气体供给管43的通过及不通过。阀驱动装置47按照来自运算装置31的指示来控制各阀46的开闭。虽然省略了图示，但阀驱动装置47与各阀46连接，控制它们的开闭。
通过利用阀46控制气体44及气体45向腔室40的导入，能够按每个腔室40管理气体浓度。密闭容器10的一部分可以是不透过菌而透过气体的材料(例如膜过滤器等)。由此，能够在每个密闭容器10中培养厌氧菌或好氧菌，厌氧菌及好氧菌均能够同时检测。或者，在检测对象为动物细胞的情况下，通过调整二氧化碳浓度，能够将培养基的pH保持为适当的值。
也可以对各密闭容器10附加条形码等识别编号，使运算装置31的存储部预先存储每个密闭容器10的识别编号、样本的种类等信息。运算装置31也可以基于存储于存储部的信息，分别以相同或不同的时间间隔进行发光测量，针对多个密闭容器10并行地取得发光量的经时变化。
阳性化所需的时间根据初始浓度、菌种的不同而不同。为了防止来自外部的菌混入，需要在将密闭容器10密闭后不从外部进行样本的出入，因此发光测量的次数受测量初期的培养液量限制。因此，在每隔规定的时间测量发光量时，运算装置31在判断为从上次的测量起发光量的变化小且增殖慢的情况下，能够以自动地扩大发光测量的时间间隔的方式进行编程。由此，能够测量与增殖慢的菌相应的长期的经时变化。
细胞检测装置5也可以具备将密闭容器10和光检测器30中的任一方或双方移动到能够进行发光测量的位置的输送机构。需说明的是，也可以准备多个光检测器30，对各密闭容器10设置。由此，不需要用于使密闭容器10或光检测器30移动的搬送机构，能够减小细胞检测装置5的尺寸。或者，如图6所示，光检测器30也可以是1个，通过将密闭容器10搬送到光检测器30能够检测发光的位置、或者使光检测器30移动到密闭容器10，不需要设置多个光检测器30，能够削减成本。
<细胞检测方法>
使用了本实施方式的细胞检测装置5的细胞检测方法例如能够采用与第二实施方式的细胞检测方法(图3)同样的方法，因此省略说明。
<技术效果>
如上所述，在本实施方式中，采用了具备多个密闭容器10并对多个样本同时进行发光测量的构成，因此能够缩短测量时间。而且，本实施方式采用能够向多个密闭容器10分别供给不同组成的气体的构成，因此能够同时进行厌氧菌及好氧菌等不同菌种的发光测量。
[变形例]
本公开并不限定于上述的实施方式，包括各种变形例。例如，上述的实施方式是为了易于理解地说明本公开而详细地进行了说明的实施方式，不一定必须具备所说明的全部构成。另外，能够将某实施方式的一部分置换为其他实施方式的构成。另外，也可以在某实施方式的构成中添加其他实施方式的构成。另外，对于各实施方式的构成的一部分，也能够追加、删除或置换其他实施方式的构成的一部分。
符号说明
1～5…细胞检测装置、6…培养液、7…ATP提取试剂、8…发光试剂、9…ATP溶液、10、210、310、410…密闭容器、11…开口部、12～15…隔膜、16…ATP消去试剂、17…搅拌子、20…注射器、21…柱塞、22…注射器针、23…罩、24…衬垫、30…光检测器、31…运算装置、32…显示部、206…培养部、207…提取试剂部、208…发光试剂部、211…样本导入部、220…接触机构、406…注射器、407…容器、408…容器、411…开口部、420…柱塞、421、422…流路、40…腔、41…注射器驱动装置、43…气体供给管、44、45…气体、46…阀、47…阀驱动装置。

Claims (13)

1.一种细胞检测装置，其特征在于，是检测样本中的细胞的细胞检测装置，具备：
密闭容器，其具有能够密闭的样本导入部、容纳培养液的培养部、容纳提取试剂的提取试剂部以及容纳发光试剂的发光试剂部，
接触机构，其控制所述培养液、所述提取试剂和所述发光试剂的接触，
光检测器，其检测来自所述发光试剂部的发光，和
运算部，其根据所述光检测器的检测信号计算发光量，并基于所述发光量的经时变化来判定所述细胞的增殖；
所述提取试剂是从所述细胞提取与所述发光试剂的发光反应所需的物质而得到提取溶液的试剂，
所述发光试剂是通过与所述提取溶液接触而发光的试剂，
所述培养液、所述提取试剂和所述发光试剂在所述密闭容器内分离地配置，
所述接触机构在使添加有所述样本的所述培养液的一部分与所述提取试剂接触来取得所述提取溶液后，使所述提取溶液与所述发光试剂接触，并且断续地重复进行所述提取溶液的取得以及所述提取溶液与所述发光试剂的接触。
2.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述发光试剂部具有荧光素酶作为所述发光试剂，
所述发光试剂部和所述提取试剂部中的一者或两者具有荧光素，
所述提取试剂是从所述细胞提取ATP的试剂，
所述光检测器检测通过所述荧光素酶催化从所述细胞提取的所述ATP与所述荧光素的反应而产生的发光。
3.根据权利要求2所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述培养部进一步包含ATP消去试剂。
4.根据权利要求2所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述密闭容器进一步具有容纳ATP消去试剂的消去试剂部，
所述消去试剂部在所述密闭容器内与所述培养部、所述提取试剂部、所述发光试剂部分离地配置。
5.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
具备多个所述密闭容器。
6.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
进一步具备控制所述接触机构的驱动的驱动装置，
所述驱动装置控制由所述接触机构进行的所述培养液与所述提取试剂的接触、所述提取溶液与所述发光试剂的接触。
7.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述运算部根据所述提取溶液和所述发光试剂的接触前后的发光量计算来自所述样本的发光量，判断来自所述样本的发光量是否为规定的阈值以上，由此判定所述细胞的增殖。
8.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述培养部、所述提取试剂部以及所述发光试剂部是由在所述密闭容器内配置的第一隔膜以及第二隔膜分离的空间，
所述接触机构是具有能够贯通所述第一隔膜以及所述第二隔膜的注射器针的注射器。
9.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
所述培养部、所述提取试剂部以及所述发光试剂部是由容纳所述培养液的第一容器、容纳所述提取试剂部的第二容器以及容纳所述发光试剂的第三容器分离的空间，
所述第一容器具备用于将所述培养液滴加到所述第二容器的流路，
所述第二容器具备用于将所述提取溶液滴加到所述第三容器的流路，
所述接触机构具有控制所述培养液的滴加的柱塞和控制所述提取溶液的滴加的柱塞。
10.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
进一步具备显示部，其显示由所述运算部进行判定的结果。
11.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
进一步具备对所述密闭容器进行温度调节的温度调节单元。
12.根据权利要求1所述的细胞检测装置，其特征在于，
进一步具备搅拌所述培养部的搅拌单元。
13.一种非诊断、治疗的细胞检测方法，其特征在于，是检测样本中的细胞的细胞检测方法，包括：
向密闭容器内导入发光试剂的步骤，
在所述密闭容器中与所述发光试剂分离的位置导入提取试剂的步骤，
向所述密闭容器中与所述发光试剂和所述提取试剂分离的位置导入培养基的步骤，
在所述培养基中添加所述样本而得到培养液的步骤，
将所述密闭容器密闭的步骤，
使所述培养液的一部分与所述提取试剂接触而取得提取溶液的步骤，
使所述取得的所述提取溶液和所述发光试剂接触、测量发光量的步骤，
断续地重复进行所述提取溶液的取得以及所述提取溶液与所述发光试剂的接触、基于所述发光量的经时变化来判定所述细胞的增殖的步骤。
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