JPH06181743A

JPH06181743A - 生菌数測定装置

Info

Publication number: JPH06181743A
Application number: JP5140215A
Authority: JP
Inventors: Bunji Hiruta; 文治蛭田; Fukuo Iwatani; 福雄岩谷; Shinpei Suzuki; 新平鈴木; Koichi Takachi; 光一高地; Isao Endo; 勲遠藤; Teruyuki Nagamune; 輝行長棟; Hajime Asama; 一浅間; Yoshimi Benno; 義己辨野
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Hitachi Electronics Engineering Co Ltd
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 1987-11-16
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 1994-07-05
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: JP2588113B2

Abstract

(57)【要約】【目的】広範な分野で使用でき、高精度かつ低コスト
で、検査時間が数時間程度で済む生菌数測定装置を提供
する。【構成】本発明の生菌数測定装置は、被測定微生物を
含む検体を液体選択培地により複数の段階に希釈し、攪
拌する自動希釈・攪拌装置と、該希釈検体中の微生物に
ピーク波長が３６６ｎｍの励起光を照射し、該微生物か
ら発せられる波長４３０〜４９０ｎｍの蛍光の強度を測
定する自動蛍光測定装置と、既知の微生物種について予
め測定された蛍光強度と生菌数とに関するデータベース
が記憶された外部記憶装置と、前記自動蛍光測定装置に
よる検出値に基づき外部記憶装置のデータベースを検
索、参照し、データ処理を行うと同時に自動希釈・攪拌
装置と自動蛍光測定装置を制御するプロセッサとからな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生菌数測定装置に関す
る。更に詳細には、本発明は液体選択培地を用いて検体
中の特定の微生物を増殖させ、該微生物から発せられる
蛍光を捕捉することからなる生菌数測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、このような微生物種の同定は生理
学的、生化学的性状に基づいて行われており、一方、生
菌数はサンプルを１０^-1，１０^-2，・・・・，１０^-8倍
に希釈し、この希釈液の一定量を寒天平板培地上に接種
塗抹し、一定時間（２４〜４８時間）の培養後に、この
寒天平板上に出現したコロニー数に希釈倍率を乗じて求
められていた。

【０００３】しかし、このような全くの手作業による微
生物検査法では、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟
練技術とを必要とし、また、技術者あるいは検査員によ
る測定差が生じることも知られている。更に、大量の培
地およびシャーレの使用および熟練技術者の高価な人件
費のため、検査に要する費用は高価格になっている。

【０００４】微生物種の同定、生菌数の測定などの微生
物検査は、臨床検査、食品検査、医薬品検査等の部門で
必須であり、迅速化、省人化、自動化に対するニーズは
高い。

【０００５】このため、臨床検査部門では各種の自動化
機械の開発が行われている。例えば、５０rpm で回転し
ている寒天平板培地に、サンプル液を中心から外側に向
かって塗抹するプレータ、塗抹された寒天培地を培養
し、平板培地上に形成されたコロニーをHe-Ne レーザ光
で計数するコロニーカウンタおよびデータプロセッサの
３機器からなる生菌数測定装置、あるいは、性状検査用
の各種培地が入ったカートリッジを用いて微生物種の同
定と、比濁法による菌量測定を完全自動で行える生菌数
測定装置または、このカートリッジの代わりにマイクロ
プレートを用いた同様な装置が試作されている。

【０００６】しかし、これらの機器の大部分は尿路感染
などの微生物検査に用いられているにすぎず、食品検査
のようにサンプルが混濁物であることが多い場合には測
定が不可能であり、また、十分な精度が得られなかった
りする。更に、いずれの方法も２４〜４８時間の培養期
間を必要とするので、迅速な測定は不可能であり、緊急
に検査しなければならないようなニーズには対応できな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は広範な分野で
使用でき、高精度かつ低コストで、検査時間が数時間程
度で済む生菌数測定装置を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らが長年にわた
り広範な実験と研究を続けた結果、液体選択培地中の微
生物に励起光を照射し、該微生物から発せられる蛍光の
強度を測定し、次いで、該液体選択培地中の微生物を培
養し、増殖した微生物に励起光を照射し、該微生物から
発せられる蛍光の強度を測定し、培養前後の蛍光強度の
差を求めることにより微生物種を同定し、かつ該微生物
の生菌数を高精度で、しかも、短時間に計測できること
が発見された。本発明は斯かる知見に基づき完成され
た。

【０００９】

【作用】微生物の生細胞は補酵素ＮＡＤＨ（ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドの還元型）およびＮＡＤＰ
Ｈ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還
元型）を普遍的に有する。これらの補酵素に励起光を照
射すると蛍光を発生する。

【００１０】蛍光の強度は各微生物種、生菌数、生細胞
１個当りに含まれる補酵素の量に依存するので、微生物
種および培養前の生菌数が予めわかっている検体につい
て培養前および培養後の蛍光強度を測定し、その差（Δ
Ｉ）を求める。培養前の生細胞１個当りに含まれる補酵
素の量は、前記培養前の蛍光強度から液体選択培地由来
のバックグラウンド蛍光強度を差し引き、これを前記の
既知生菌数で除した値と比例関係にあるので、この値を
培養前の生菌数１個当りの補酵素量とみなすことができ
る。

【００１１】従って、既知試料に基づき蛍光強度差ΔＩ
ｓのデータベースを作成する場合、例えば、二次元記憶
テーブルを使用する。このテーブルにおいて、縦の欄に
生菌数を取り、横の欄に前記の方法によって求めた培養
前の生菌数１個当りの補酵素量を取る。既知生菌数を例
えば、１０¹ ，１０² ，１０³ ，・・・・，１０ⁿ に区
分し、補酵素量をその最大値で規格化し、例えば、0,0.
1,0.2,0.3,・・・・・,0.9,1.0に区分する。そして、例
えば、生菌数１０¹ で補酵素量０の既知微生物種をｎ段
階（例えば、１１段階）に等倍希釈し、各希釈段階につ
いて培養前および培養後の蛍光強度を測定し、その蛍光
強度差ΔＩｓ₁ ，ΔＩｓ₂ ，・・・・・，ΔＩｓ₁₁を求
める。このデータ収集を各生菌数と各補酵素量について
行いデータベースとする。希釈段階は使用されるマイク
ロプレートに応じて変化する。例えば、９６穴マイクロ
プレートならば、可能な希釈段階は最大１１段階であ
る。

【００１２】同一の微生物種で菌数が未知の検体につい
て、同一希釈段階で培養前および培養後の蛍光強度を測
定し、その蛍光強度差ΔＩｕ₁ ，ΔＩｕ₂ ，・・・・，
ΔＩｕ₁₁を求める。

【００１３】未知検体中の微生物の生菌数を求めるに
は、前記既知試料の標準データと未知検体の実測データ
との“へだたり（距離）”を定義しておき、それが０も
しくは０に最も近い標準データに対応する菌数をもって
未知検体中の微生物の生菌数と推定する。

【００１４】例えば、いま特徴（ΔＩｕ₁ ，ΔＩｕ₂ ，
・・・・，ΔＩｕ_n ）をもった一つの未知検体Ｕを、特
徴が（ΔＩｓ₁ ，ΔＩｓ₂ ，・・・・・，ΔＩｓ_n ）で
ある既知標準試料Ｓと比較すると、その“へだたり（距
離）”Ｄは次の関係式により求められる。

【００１５】各微生物種について前記のようなデータマ
トリックスを作成し、データベース化しておけば、未知
検体の測定値からデータベースを検索、参照することに
より生菌数を正確、かつ、迅速に推定できる。従って、
データベースのデータ量が豊富になるほど本発明の測定
装置の信頼性が高まる。

【００１６】微生物の生育過程は一般的に、誘導期，対
数期，停止期および死滅期に区分できるが、各段階で微
生物が有する細胞１個当りの補酵素量も変化する。前記
データベースは、微生物種、生菌数および培養前の補酵
素量が既知の検体を用いて作成されている。従って、未
知検体中の微生物種が同定され、その生菌数が推定され
るとともに、副次的にその補酵素量も推定され、検体中
の微生物の生育段階を予測することも可能となる。

【００１７】本発明による未知検体中の微生物種の同定
と、その生菌数の測定は、特定の微生物種のみを生長・
増殖させることができる選択培地を使用することにより
可能となる。選択培地とは特定の基質，抗生物質などを
添加することにより、特定の微生物種を他の微生物種よ
りも有利に生長できるようにした培地である。

【００１８】例えば、未知検体中にビヒドバクテリウム
(Bifidobacterium) 属の菌（いわゆるビフィズス菌）が
存在するか否か、存在するとすれば、その生菌数は幾ら
かという場合、選択培地として次の組成を有するものを
使用する。ラブ−レムコ(Lab-lemco) 粉末(Oxoid社製）
２．４ｇ／ｌ，プロテオースペプトンＮｏ．３(Difco
社製) １０．０ｇ／ｌ，トリプチケース(BBL社製) ５ｇ
／ｌ, 酵母エキス(Difco社製) ５．０ｇ／ｌ, 肝臓浸出
液（光岡，１９６９）１５０ｍｌ／ｌ, ラフィノース４
ｇ／ｌ, 塩類溶液Ａ（光岡ら，１９６５）１０ｍｌ／
ｌ，塩類溶液Ｂ（光岡ら，１９６５）５ｍｌ／ｌ, 消泡
剤（ダウコーニング社製，１０％）５ｍｌ／ｌ, ツイー
ン８０１ｇ／ｌ，Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ０．
５ｇ／ｌ，プロピオン酸ナトリウム１５ｇ／ｌ，コリマ
イシン(10⁶単位，１％）１２ｍｌ／ｌ。この選択培地を
作製する場合、コリマイシン以外の成分を混合し、１１
５℃で２０分間滅菌する。コリマイシンは使用直前に無
菌的に添加する。この選択培地中ではビヒドバクテリウ
ム属の菌しか生育できないので、未知検体が蛍光を発す
れば、未知検体中の微生物種はビヒドバクテリウム属の
菌と同定される。

【００１９】前記のように特定の微生物種のみしか生育
できない選択培地に未知検体を接種し、培養し、蛍光強
度を測定し、培養の前後で蛍光強度に差が出れば、該当
する微生物種が未知検体中に存在し増殖したためであ
り、容易に未知検体中の微生物種を同定することができ
る。

【００２０】実際には、未知検体中にどのような微生物
種が存在しているか予測することは困難なので、未知検
体を全ての選択培地に接種し、培養し、どの選択培地で
生育したか、培養前後の蛍光強度差に基づき確認し、微
生物種を同定することとなる。

【００２１】本発明者らの研究によれば、下記の組成の
選択培地を使用することにより大腸菌のみを特異的に生
育させることができる。肉エキス３．０ｇペプトン１０．０ｇカゼイン５．０ｇ乳糖１５．０ｇ白糖１０．０ｇデオキシコール酸ナトリウム１．０ｇチオ硫酸ナトリウム２．５ｇクエン酸ナトリウム１．０ｇクエン酸アンモニウム１．０ｇ精製水１０００ｍｌ

【００２２】サルモネラ菌の場合、下記の組成の選択培
地中で特異的に生育する。肉エキス３．０ｇプロテオーズペプトン１２．０ｇ乳糖１２．０ｇ白糖１２．０ｇサリシン２．０ｇ胆汁酸塩１５．０ｇ塩化ナトリウム５．０ｇチオ硫酸ナトリウム６．８ｇクエン酸アンモニウム０．８ｇデオキシコール酸ナトリウム２．０ｇ精製水１０００ｍｌ

【００２３】黄色ブドウ状球菌について使用される選択
培地は下記の組成を有する。酵母エキス２．５ｇペプトン１０．０ｇケラチン３０．０ｇ乳糖２．０ｇマンニット１０．０ｇ塩化ナトリウム７５．０ｇリン酸２カリウム５．０ｇ塩化リチウム５．０ｇフェノールエチルアルコール２５ｍｌ精製水１０００ｍｌ

【００２４】キャンピロバクター用の選択培地は下記の
組成を有する。プロテオーズペプトン１５．０ｇ酵母エキス５．０ｇ肝臓エキス２．５ｇ塩化ナトリウム５．０ｇヴァンコマイシン１０ｍｇポリミキシンＢ２５００単位トリムトブリム５ｍｇセファロシン１５ｍｇアンフォテリシンＢ２ｍｇ精製水１０００ｍｌ

【００２５】また、酵母菌については下記の組成の選択
培地が使用される。バクトポテトデキストロースブイヨン(Difco社製) ３９．０ｇ１０％酒石酸１４．０ｍｌ精製水１０００ｍｌ

【００２６】選択培地は液体培地であることが好まし
い。液体培地ならば、マイクロピペット等により定量を
自動分注することが可能である。

【００２７】

【実施例】以下、図面を参照しながら本発明の一実施例
について更に詳細に説明する。

【００２８】図１は本発明の生菌数測定装置の一例のブ
ロック図である。この装置は基本的にマイクロプレート
希釈・測定部１０とデータ処理部２０とからなる。図１
のマイクロプレート希釈・測定部１０において、マイク
ロプレートは図中の実線矢印で示されるようにローダカ
セット３０から自動希釈・攪拌装置４０に送られ、ここ
で検体（サンプル）の接種，希釈，攪拌が同時に行わ
れ、アンローダカセット３２へ移送される。このアンロ
ーダカセット３２は隣接する自動蛍光測定装置５０へマ
イクロプレートを供給するローダカセットも兼ねてい
る。蛍光測定の済んだマイクロプレートは別のアンロー
ダカセット３４に移送される。自動蛍光測定装置５０に
よる蛍光強度測定は、培養前のマイクロプレートについ
て行い、次いでインキュベータ３６に移送して所定時間
培養し、培養後再び蛍光強度測定を行う。インキュベー
タは特に装置自体に組込む必要はなく、通常の実験室等
に備え付けられている常用の恒温器等を利用することも
できる。図１において、太線矢印は培養後のマイクロプ
レートの移動を示す。マイクロプレートの移送にはコン
ベヤ等の慣用手段が使用される。アンローダ／ローダ兼
用カセット３２およびアンローダカセット３４とインキ
ュベータ３６との間のカセットの移送には所望により、
ロボット等を使用できる。

【００２９】自動蛍光測定装置５０からの培養前蛍光強
度測定信号（図中、一点鎖線矢印）および培養後蛍光強
度測定信号（図中、太一点鎖線矢印）はデータ処理部２
０のプロセッサ６０へ送信される。この測定信号と使用
した選択培地の種類に関する情報とから外部記憶装置７
０に記憶されているデータベースを検索、参照すること
により検体内に存在する微生物種の同定と、その微生物
種の生菌数を推定する。プロセッサ６０は外部記憶装置
７０と、ＣＲＴおよびキーボードを有するコンソール８
０に接続されている。全てのオペレーションはコンソー
ル８０からの命令入力によって行える。図中の破線矢印
は制御信号およびデータの流れを示す。

【００３０】培養前蛍光強度測定を行い、培養後蛍光強
度測定値からその値を引くことにより、バックグランド
が除かれると共に、選択培地中で増殖した特定の微生物
種の生菌数の増加量に対応する信号が得られる。一方、
培養前後の蛍光強度に差がなければ、その選択培地に該
当する微生物種が未知検体内に存在していないことを意
味する。

【００３１】図２は本発明の装置で使用されるマイクロ
プレート９０の斜視図である。マイクロプレート９０は
例えば、ポリカーボネイトのような高分子材料またはガ
ラス等の透明な素材から構成されている。マイクロプレ
ート９０は不透明なプラスチック類，セラミック類また
は陶器などから構成されていてもよい。

【００３２】マイクロプレート９０のおもて面には９６
個（８行ｘ１２列）の穴９２が設けられている。穴の形
状は特に限定されない。スリバチ状，Ｖ字状または円柱
状もしくは角柱状など任意の形状を使用できる。言うま
でもなく、９６穴以外のマイクロプレートも使用でき
る。マイクロプレート手前側１列は検体液を注入してお
くスペースであり、希釈用の残列には予め液体選択培地
が一定量注入されている。

【００３３】図３は本発明の生菌数測定装置の一例の平
面図であり、図４は図３におけるＡ矢視図である。自動
希釈・攪拌装置４０の搬送系４１の両端にローダカセッ
ト３０（図中、左側）およびアンローダ／ローダ兼用カ
セット３２が配設されている。搬送系４１の駆動伝達系
は例えば、コンベヤ，チェーン，ベルト等の慣用手段に
より構成できる。それぞれのカセットはマイクロプレー
ト９０を例えば、１０枚収納でき、ミニチュア倉庫型構
造になっている。図１のアンローダカセット３４も同一
構造である。マイクロプレートはカセットごとインキュ
ベータ３６に入れることができる。カセットはボールス
クリュー機構またはエレベータ等の慣用手段を使用する
ことにより上下動させることができる。図３において、
４８はベースであり、４９は架台である。

【００３４】ガイドレール４２に沿って前後進可能な駆
動系４３の先端部にはマイクロプレート９０の検体穴数
に対応する本数の例えば、マイクロシリンジ等の極微量
分注器４４が取り付けられている。この極微量分注器４
４の先端には滅菌済みの使い捨てチップ４５が装着され
る。チップ４５はチップ供給部４６から供給される。マ
イクロプレート９０は図３に示されるような横送りだけ
でなく、縦送りも可能である。横送りの場合、最大８検
体を１０^-11 倍まで希釈することが可能であり、縦送り
の場合には最大１２検体を１０^-7倍まで希釈することが
可能である。偏心モータ４７により極微量分注手段４４
の先端のチップ４５を振動させることにより穴内の液体
を攪拌し濃度を均一化させる。偏心モータ以外の攪拌手
段も当然使用できる。例えば、シリンジで穴内の液体を
吸引・吐出する操作を数回繰り返すことによっても攪拌
の目的は達せられる。

【００３５】各穴に注入されている選択培地の量に合わ
せて、所定の希釈倍率になるように検体液の分注器のシ
リンジストロークが設定され、分注器が前後移動を繰返
しながら滅菌済チップの装填，設定段階の希釈と攪拌、
最後のチップ廃棄までを自動的に行う。希釈方法は例え
ば、選択培地列の各穴内に４５μｌの選択培地を注入し
ておき、検体列の穴から５μｌの検体を分注器で採取
し、これを最初の選択培地穴に注ぎ込み、攪拌する。得
られた１０^-1倍希釈液から５μｌ採取し、次の選択培地
穴に注ぎ込み、攪拌する。すると１０^-2倍希釈液が得ら
れる。この１０^-2倍希釈液から５μｌ採取し、次の選択
培地穴に注ぎ込み、攪拌する。かくして、１０^-3倍希釈
液が得られる。この操作を繰返すことにより、１０^-7ま
たは１０^-1 ¹ 倍までの希釈液を調製することができる。
このように、１検体について多数の希釈倍率を設けて試
験するのは、未知検体中に存在する測定対象とする菌の
生菌数レベルが１０¹ 〜１０¹¹／ｍｌの広範囲の場合に
ついて検出可能とするとともに、生菌数の大体の値を予
測するためである。例えば、１０^-9倍以上の希釈検体に
ついて蛍光強度差が検出されない場合、未知検体中の生
菌数は大体１０⁸ 〜１０⁹ 程度と予測される。

【００３６】図５は自動蛍光測定装置５０内の光学系に
よる蛍光検出原理を示す概要図である。蛍光検出の原理
自体は公知であり、基本的には照明系に励起フィルタ，
観察系に吸収フィルタを有し、ハーフミラーの代わりに
ダイクロイックミラーが使用されている。

【００３７】図５に示されているように、光源５１から
発せられた様々な波長の光を含む照明光は、励起フィル
タ５２により、蛍光を発生させるのに必要な波長域の光
だけが抽出され透過する。この透過光はダイクロイック
ミラー５３により９０°下方に反射後、対物レンズ５４
ａを通常とは逆の方向で通過し、励起光としてマイクロ
プレート９０の穴内の検体に達する。励起光照射により
任意方向に発光した蛍光の一部は対物レンズ５４ａに入
る。ダイクロイックミラー５３は励起光より長波長の蛍
光は反射せずにこれを透過する。従って、対物レンズ５
４ａに入った蛍光はダイクロイックミラー５３を透過
し、吸収フィルタ５５ａを通る。吸収フィルタ５５ａは
励起光の僅かな迷光もカットし、蛍光のみを光電子増倍
管５６ａに到達させる。

【００３８】マイクロプレート９０が透明な光透過性材
料で構成されているため、励起光照射により任意方向に
発光した蛍光はマイクロプレート９０の上方および下方
の両方向へ向かう。従って、マイクロプレート９０の下
側にも対物レンズ５４ｂと吸収フィルタ５５ｂおよび光
電子増倍管５６ｂを配設する。微生物から発生する蛍光
は極めて微弱なため、マイクロプレートの表側および裏
側の両側で蛍光を捕捉し、測定することにより検出精度
が向上する。しかし、光透過性マイクロプレートの使用
は本発明の必須要件ではない。従って、光不透過性のマ
イクロプレートを使用し、上方だけで蛍光を捕捉し測定
することもできる。

【００３９】光源５１としては例えば、超高圧水銀灯が
用いられる。主として、波長が３６５nm〜５４６nmの範
囲内の輝線スペクトルが励起光として利用されるが、本
発明では約３４０nm〜約３９０nmの範囲内でピーク波長
が３６６nmの励起光を使用する。光源としてはその他
に、キセノンランプ，ハロゲンランプ等も使用できる。
光源から発せられた照明光の４００nm以上の波長は励起
フィルタ５２でカットされ、約３４０nm〜約３９０nmの
範囲内でピーク波長が約３６６nmとなる励起光を得る。

【００４０】ダイクロイックミラー５３は光軸に対して
４５度の角度に配置したときに、ある波長より短波長の
光は反射し、長波長の光は透過するような特性を持った
干渉フィルタである。本発明では短波長側に励起波長
域，長波長側に蛍光波長域がくるように設定した。

【００４１】吸収フィルタ５５ａおよび５５ｂは微生物
により吸収されずに反射・透過した励起光が光電子増倍
管５６に入射することを防ぐため、および、蛍光の中で
も特定の波長のみを透過させるために配設されている。
本発明では約４３０nm〜４９０nm、好ましくは約４４０
nm〜約４８０nm、一層好ましくは４５０nm〜４７０nm、
最も好ましくは４５５nm〜４６５nmの範囲内の波長を有
する蛍光を捕捉する。

【００４２】光電子増倍管５６ａおよび５６ｂからの測
定信号はプロセッサ６０へ送信される。プロセッサのＡ
／Ｄ変換器（図示されていない）により測定信号をデジ
タル値に変換し、演算回路（図示されていない）で蛍光
強度を算出する。この算出結果に基づき、外部記憶装置
に記憶されているデータベースを、前記の“へだたり
（距離）”Ｄを算出しつつ、検索、参照し、前記Ｄが最
も０に近くなる標準データを見出すことにより生菌数が
求められる。この結果はコンソールのＣＲＴ画面に表示
するか、あるいは、所望により、プリンタ（図示されて
いない）に出力することができる。

【００４３】本発明の装置は好気性菌および嫌気性菌の
何れにも使用できる。嫌気性菌について本発明の装置を
使用する場合、測定装置は例えば、炭酸ガスまたは窒素
ガス等の不活性ガス雰囲気下で運転することが必要とな
る場合もある。

【００４４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の装置によ
れば、液体選択培地中の微生物に励起光を照射し、該微
生物が有する補酵素から発せられる蛍光の強度を測定
し、増殖した微生物に励起光を照射し、該微生物が有す
る補酵素から発せられる蛍光の強度を測定し、培養前後
の蛍光強度の差を求め、この値を予め既知の生菌数と蛍
光強度とについて作成されたデータベースに当てはめる
ことにより、未知検体中の微生物種を同定し、かつ、該
微生物の生菌数を迅速に測定することができる。

【００４５】このように、蛍光標識を全く使用せず、微
生物が有する補酵素から発せられる蛍光から微生物の生
菌数を測定する装置は本発明が初めてである。実際、蛍
光標識を使用することにより微生物量を測定する方法お
よび装置は多数知られている。例えば、特開昭６１−１
８６８５４号、同６１−２１０８４号、同６０−１６５
８６号および同５７−１３２８９９号公報に開示されて
いる。蛍光標識を使用すると検出感度が上昇するという
利点があるが、反面、蛍光標識使用に伴う測定誤差も発
生する。例えば、微生物によっては添加された蛍光標識
と結合しないものもあり、使用に不確実性が伴う。ま
た、微生物ばかりか、培地成分と結合してしまう蛍光標
識もあり、測定誤差の大きな原因となっていた。このた
め、測定前に培地の除去作業を行うなどの余計な負担が
強いられる。更に、存在する微生物数に対する蛍光標識
の化学的量論的量を測定前に決定することができないの
で、必然的に蛍光標識は過剰量添加しなければならな
い。すると、微生物と結合しないで残った蛍光標識から
も蛍光が発生し、これも測定誤差を構成する大きな原因
となる。また、蛍光標識には不安定なものもあり、測定
前または測定中に空気中の酸素などの物質または温度な
どの影響を受けて分解してしまい、測定を誤らせること
がある。従って、本発明の装置では、このような従来の
蛍光標識の使用に伴う測定誤差の問題は全く生じない。

【００４６】また、本発明の生菌数測定装置によれば、
生菌を含む検体液の正確な希釈ならびに微生物種の同定
と生菌数の測定を人手を介することなく、完全に自動的
に行うことができる。

【００４７】本発明の装置ではマイクロプレートを使用
するため、少量の培地で多量の検体を同時に処理できる
ので従来の寒天平板法に比べて、１検体あたりの検査コ
ストが約１／２０まで軽減される。

【００４８】液体選択培地を使用し、かつ、カセットで
運搬しているため、空気中の浮遊雑菌による雑菌汚染の
恐れは少ない。このため、本発明の装置ではクリーンル
ームあるいはクリーンベンチは特に必要とせず、簡便，
迅速，正確，安価に微生物種を同定し、該微生物種の生
菌数を測定できる。

【００４９】本発明の装置は臨床検査分野に限らず、食
品関係，化粧品関係，流通関係，保健所関係．医薬品関
係等の広範囲な分野で微生物種の同定および該微生物種
の生菌数の測定に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の生菌数測定装置の一例のブロック図で
ある。

【図２】本発明で使用されるマイクロプレートの斜視図
である。

【図３】本発明の生菌数測定装置の一例の平面図であ
る。

【図４】図３におけるＡ矢視図である。

【図５】自動蛍光測定装置内の光学系による蛍光検出原
理を示す概要図である。

【符号の説明】

１０…マイクロプレート希釈・測定部，２０…データ処
理部，３０…ローダカセット，３２…アンローダ／ロー
ダ兼用カセット，３４…アンローダカセット，３６…イ
ンキュベータ，４０…自動希釈装置，４１…搬送系，４
２…ガイドレール，４３…駆動系，４４…分注器，４５
…使い捨てチップ，４６…チップ供給部，４７…偏心モ
ータ，４８…ベース，４９…架台，５０…自動蛍光測定
装置，５１…光源，５２…励起フィルタ，５３…ダイク
ロイックミラー，５４ａおよび５４ｂ…対物レンズ，５
５ａおよび５５ｂ…吸収フィルタ，５６ａおよび５６ｂ
…光電子増倍管，６０…プロセッサ，７０…外部記憶装
置，８０…コンソール，９０…マイクロプレート

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/10 6807−4Ｂ 1/14 6807−4Ｂ (72)発明者鈴木新平東京都千代田区大手町二丁目６番２号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者高地光一東京都千代田区大手町二丁目６番２号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者遠藤勲埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者長棟輝行埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者浅間一埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者辨野義己埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定微生物を含む検体を液体選択培地
により複数の段階に希釈し、攪拌する自動希釈・攪拌装
置と、該希釈検体中の微生物にピーク波長が３６６ｎｍの励起
光を照射し、該微生物から発せられる波長４３０〜４９
０ｎｍの蛍光の強度を測定する自動蛍光測定装置と、既知の微生物種について予め測定された蛍光強度と生菌
数とに関するデータベースが記憶された外部記憶装置
と、前記自動蛍光測定装置による検出値に基づき外部記憶装
置のデータベースを検索、参照し、データ処理を行うと
同時に自動希釈・攪拌装置と自動蛍光測定装置を制御す
るプロセッサとからなり、前記液体選択培地として、ラブ−レムコ，プロテオースペプトンNo.3, トリプチケ
ース，酵母エキス，肝臓浸出液，ラフィノース，塩類溶
液Ａ，塩類溶液Ｂ，消泡剤，ツイーン８０，Ｌ−システ
インＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ，プロピオン酸ナトリウムおよびコ
リマイシンからなるビヒドバクテリウム属菌用液体選択
培地，肉エキス，ペプトン，カゼイン，乳糖，白糖，デ
オキシコール酸ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，クエ
ン酸ナトリウム，クエン酸アンモニウムおよび精製水か
らなる大腸菌用液体選択培地，肉エキス，プロテオーズ
ペプトン，乳糖，白糖，サリシン，胆汁酸塩，塩化ナト
リウム，チオ硫酸ナトリウム，クエン酸アンモニウム，
デオキシコール酸ナトリウムおよび精製水からなるサル
モネラ菌用菌液体選択培地，酵母エキス，ペプトン，ケ
ラチン，乳糖，マンニット，塩化ナトリウム，リン酸２
カリウム，塩化リチウム，フェノールエチルアルコール
および精製水からなる黄色ブドウ状球菌用液体選択培
地，プロテオーズペプトン，酵母エキス，肝臓エキ
ス，塩化ナトリウム，ヴァンコマイシン，ポリミキシン
Ｂ，トリムトブリム，セファロシン，アンフォテリシン
Ｂおよび精製水からなるキャンピロバクター用液体選択
培地，および、バクトポテトデキストロースブイヨン，１０％酒石酸お
よび精製水からなる酵母菌用液体選択培地，を使用する
ことを特徴とする生菌数測定装置。
【請求項２】ビヒドバクテリウム属菌用液体選択培地
は、ラブ−レムコ２．４ｇ／ｌ，プロテオースペプトン
No.3１０．０ｇ／ｌ, トリプチケース５ｇ／ｌ，酵母エ
キス５．０ｇ／ｌ，肝臓浸出液１５０ｍｌ／ｌ，ラフィ
ノース４ｇ／ｌ，塩類溶液Ａ１０ｍｌ／ｌ，塩類溶液Ｂ
５ｍｌ／ｌ，消泡剤５ｍｌ／ｌ，ツイーン８０１ｇ／
ｌ，Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ０．５ｇ／ｌ，プロ
ピオン酸ナトリウム１５ｇ／ｌおよびコリマイシン（１
０⁶ 単位，１％）１２ｍｌ／ｌからなり、大腸菌用液体選択培地は、肉エキス３．０ｇ／ｌ，ペプ
トン１０．０ｇ／ｌ，カゼイン５．０ｇ／ｌ，乳糖１
５．０ｇ／ｌ，白糖１０．０ｇ／ｌ，デオキシコール酸
ナトリウム１．０ｇ／ｌ，チオ硫酸ナトリウム２．５ｇ
／ｌ，クエン酸ナトリウム１．０ｇ／ｌ，クエン酸アン
モニウム１．０ｇ／ｌおよび精製水１０００ｍｌからな
り、サルモネラ菌用菌液体選択培地は、肉エキス３．０ｇ／
ｌ，プロテオーズペプトン１２．０ｇ／ｌ，乳糖１２．
０ｇ／ｌ，白糖１２．０ｇ／ｌ，サリシン２．０ｇ／
ｌ，胆汁酸塩１５．０ｇ／ｌ，塩化ナトリウム５．０ｇ
／ｌ，チオ硫酸ナトリウム６．８ｇ／ｌ，クエン酸アン
モニウム０．８ｇ／ｌ，デオキシコール酸ナトリウム
２．０ｇ／ｌおよび精製水１０００ｍｌからなり、黄色ブドウ状球菌用液体選択培地は、酵母エキス２．５
ｇ／ｌ，ペプトン１０．０ｇ／ｌ，ケラチン３０．０ｇ
／ｌ，乳糖２．０ｇ／ｌ，マンニット１０．０ｇ／ｌ，
塩化ナトリウム７５．０ｇ／ｌ，リン酸２カリウム５．
０ｇ／ｌ，塩化リチウム５．０ｇ／ｌ，フェノールエチ
ルアルコール２５ｍｌ／ｌおよび精製水１０００ｍｌか
らなり、キャンピロバクター用液体選択培地は、プロテオーズペ
プトン１５．０ｇ／ｌ，酵母エキス５．０ｇ／ｌ，肝臓
エキス２．５ｇ／ｌ，塩化ナトリウム５．０ｇ／ｌ，ヴ
ァンコマイシン１０ｍｇ／ｌ，ポリミキシンＢ２５００
単位，トリムトブリム５ｍｇ／ｌ，セファロシン１５ｍ
ｇ／ｌ，アンフォテリシンＢ２ｍｇ／ｌおよび精製水１
０００ｍｌからなり、酵母菌用液体選択培地は、バクトポテトデキストロース
ブイヨン３９．０ｇ／ｌ，１０％酒石酸１４ｍｌ／ｌお
よび精製水１０００ｍｌからなることを特徴とする請求
項１の生菌数測定装置。
【請求項３】検体の希釈と培養にマイクロプレートを
使用する請求項１の生菌数測定装置。
【請求項４】自動蛍光測定装置が、ピーク波長が３６
６ｎｍの励起光を発生する発光手段と；前記励起光を受
けて微生物に励起光を照射し、該微生物から発せられる
蛍光を受けて前記励起光とは相違する方向に前記蛍光を
分離するダイクロイックミラーと；蛍光と共に進入して
くる迷光励起光をカットする吸収フィルタと；前記吸収
フィルタを通過した波長４３０〜４９０ｎｍの蛍光を捕
捉する光電子増倍管とを有することを特徴とする請求項
１の生菌数測定装置。
【請求項５】マイクロプレートが透明な光透過性材料
により構成されていて、マイクロプレートの表側および
裏側の両側で蛍光を捕捉する請求項３の生菌数測定装
置。