WO2016147313A1 - 薬剤感受性試験装置及び薬剤感受性試験キット並びに薬剤感受性試験方法 - Google Patents

薬剤感受性試験装置及び薬剤感受性試験キット並びに薬剤感受性試験方法 Download PDF

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WO2016147313A1
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culture
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culture solution
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野田　英之
博子 多田
植松　千宗
雅弘 岡野定
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株式会社日立製作所
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    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Definitions

  • the present invention relates to a test apparatus, a test kit, and a drug sensitivity test method for performing a drug sensitivity test for bacteria.
  • ATP bioluminescence method that uses a change amount of ATP (Adenosine Triphosphate) present as an energy source in the bacterium as an index of microbial growth as a method for quickly performing a drug sensitivity test.
  • the ATP method is a method for detecting ATP present as an energy source in a bacterium using a firefly-derived enzyme luciferase. Luciferase oxidizes luciferin as a substrate in the presence of ATP and Mg 2+ in the bacterium, and the amount of luminescence generated at that time is proportional to the amount of ATP. Therefore, the growth of the bacterium can be evaluated from the change in the amount of luminescence.
  • Patent Document 1 A method for determining the number of bacteria using the ATP method is disclosed in Patent Document 1, for example.
  • Patent Document 1 is a technique for counting viable bacteria by ATP measurement, counting total bacteria by DNA method, and subtracting viable bacteria from this total bacteria to obtain viable and dead cell counts.
  • Infectious disease-causing bacteria that are subject to drug susceptibility testing can be broadly classified into aerobic bacteria, facultative anaerobic bacteria, and obligate anaerobic bacteria. Among these, aerobic bacteria and facultative anaerobic bacteria can grow in the presence of oxygen, but organized anaerobic bacteria are killed by exposure to oxygen.
  • the object of the present invention is to provide a drug sensitivity test apparatus and a drug sensitivity test method capable of performing a drug sensitivity test by the ATP method for both aerobic bacteria and anaerobic bacteria.
  • a preferred embodiment of the present invention includes a reaction tank, a reagent holding part for holding a reagent to be supplied to the reaction tank, and a culture liquid holding part for holding a culture liquid to be supplied to the reaction tank.
  • An ATP test culture plate having a contactable / separable layer, a gas supply path for supplying gas into the ATP test culture plate, a heater for heating the culture medium holding unit, and detecting light emission in the reaction vessel
  • a plurality of layers of the ATP test culture plate, wherein the plurality of layers of the ATP test culture plate comprises: a light detection unit; When joined, at least the culture solution holding unit and the reaction vessel are in a sealed state so that they can communicate with each other.
  • the present invention has a reaction tank, a reagent holding part for holding a reagent to be supplied to the reaction tank, and a culture liquid holding part for holding a culture liquid to be supplied to the reaction tank. And an ATP test culture plate having a plurality of contactable / separable layers, and a gas supply path for supplying gas into the ATP test culture plate, wherein the plurality of layers of the ATP test culture plate are joined together.
  • the drug sensitivity test kit is such that at least the culture solution holding unit and the reaction vessel are in a sealed state so that they can communicate with each other.
  • the present invention has a reaction tank, a reagent holding part for holding a reagent to be supplied to the reaction tank, and a culture liquid holding part for holding a culture liquid to be supplied to the reaction tank.
  • the ATP test culture plate having a plurality of layers is sealed so that at least the culture solution holding unit and the reaction tank can communicate with each other, and gas is supplied from the gas supply unit into the ATP test culture plate to which the plurality of layers are joined.
  • a drug sensitivity test by the ATP method can be carried out for both aerobic bacteria and anaerobic bacteria.
  • H It is a figure which shows the change of the light-emission quantity with progress of the culture
  • E It is a figure which shows the change of the light-emission quantity with progress of the culture
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a drug sensitivity test apparatus according to an embodiment.
  • the drug sensitivity test apparatus includes an ATP test culture plate 12, a heater 11, a photodetector 13, and a determination unit 14.
  • the heater 11 is installed so as to be adjacent in the vicinity of the surface of the ATP inspection plate 12 opposite to the installation surface of the photodetector 13.
  • the shape and quantity of the heater 11 are not specifically limited,
  • the installation position can also be suitably changed according to a usage form.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the configuration of the ATP test culture plate 12 shown in FIG.
  • the ATP test culture plate 12 is composed of two layers, a first plate 21 and a second plate 22.
  • a bonding portion 23 for bonding to the first plate 21 is formed on the upper surface of the second plate 22, a bonding portion 23 for bonding to the first plate 21 is formed.
  • the first plate 21 and the second plate 22 are configured to be freely joined (see FIG. 2B) and separated (see FIG. 2A) via a joining portion 23.
  • FIG. 3 is a view showing the internal structure of the first plate 21 shown in FIG. 2 together with the peripheral structure of the first plate 21, and
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing the configuration of the second plate 22 shown in FIG. FIG.
  • the first plate 21 includes a culture solution holding unit 47, an extract solution holding unit 43, and a luminescent reagent holding unit 46 (see FIG. 3), and the second plate 22 is formed as a bottomed hole.
  • the reaction tank 44 is provided (see FIG. 4). The detailed configuration of the first plate 21 and its periphery and the detailed configuration of the second plate 22 will be described later.
  • the first plate 21 is joined to the second plate 22 via the joint portion 23, so that the culture solution holding portion 47, the extract solution holding portion 43, and the light emission of the first plate 21.
  • the reagent holding unit 46 is configured to fit into the reaction tank 44 of the second plate 22.
  • the culture solution supply unit 470 includes a culture solution holding unit 47 that holds the culture solution supplied to the reaction tank 44, a nozzle 37 connected to one end of the culture solution holding unit 47, and a culture solution holding unit. And a syringe 31 connected to the other end of the portion 47 via a connecting pipe 471.
  • a bacterial suspension obtained by mixing a bacterium to be tested in a drug sensitivity test separated from a specimen and a drug such as an antibiotic is provided in a valve 34 provided at the tip of the syringe 31.
  • the nozzle 37 sucks from the external container.
  • the bacterial suspension sucked into the culture solution holding part 47 is supplied again to the reaction tank 44 of the second plate 22 through the nozzle 37 as a culture solution cultured at a predetermined temperature.
  • a first gas supply unit 40 is connected to the culture solution holding unit 47 via a supply pipe 401.
  • the first gas supply unit 40 has a gas concentration meter and a gas pressure adjustment mechanism, and controls the inside of the culture solution holding unit 47 to a gas atmosphere suitable for culturing the cells to be tested in the drug sensitivity test. Is possible.
  • the extract supply unit 430 includes an extract solution holding unit 43 that holds the extract solution supplied to the reaction tank 44, a nozzle 38 connected to one end of the extract solution holding unit 43, and the other end side of the extract solution holding unit 43. It has an extract bottle 42 connected via a connection pipe 431 and a syringe 32 provided between the extract bottle 42 and the extract holder 43.
  • the extract is a reagent that extracts ATP from bacteria, and the extract contained in the extract bottle 42 is switched to the extract holder 43 by switching the flow path of the valve 35 provided at the tip of the syringe 32. It is filled and supplied to the reaction tank 44 of the second plate 22 through the nozzle 38.
  • the luminescent reagent supply unit 460 includes a luminescent reagent holding unit 46 that holds the luminescent reagent supplied to the reaction tank 44, a nozzle 39 connected to one end of the luminescent reagent holding unit 46, and the other end side of the luminescent reagent holding unit 46. It has a luminescent reagent bottle 45 connected via a connecting tube 461, and a syringe 33 provided between the luminescent reagent bottle 45 and the luminescent reagent holding part 46.
  • the luminescent reagent is a reagent that emits light when mixed with ATP extracted from cells such as bacteria, and the luminescent reagent contained in the luminescent reagent bottle 45 is a flow path of the valve 36 provided at the tip of the syringe 33. , The luminescent reagent holding part 46 is filled and supplied to the reaction tank 44 of the second plate 22 through the nozzle 39.
  • the nozzle 37 connected to the culture solution holding unit 47 is longer than the nozzle 38 connected to the extract holding unit 43 and the nozzle 39 connected to the luminescent reagent holding unit 46.
  • the reaction tank 44, the culture solution holding unit 47, the extract solution holding unit 43, and the luminescent reagent holding unit 46 are connected to the reaction vessel 44, the culture solution holding unit 47, the extract solution holding unit 43, and the In a state where the luminescent reagent holding part 46 is in communication with each other, it is in a sealed state.
  • FIG. 3 and FIG. 5 a configuration in which one extract holding part 43 and one luminescent reagent holding part 46 are inserted into one reaction tank 44 is shown. It is also possible to adopt a configuration in which a plurality of extraction liquid holding units 43 and luminescent reagent holding units 46 are inserted in accordance with the contents of the examination. In this case, the extraction liquid holding unit 43 and the luminescent reagent holding unit 46 may have the same shape, or may have different shapes as long as they can be installed on the first plate 21.
  • the reaction tank 44 formed on the second plate 22 includes the culture solution supplied from the culture solution holding unit 47 of the first plate 21 and the extract supplied from the extract holding unit 43. , And the luminescent reagent supplied from the luminescent reagent holding unit 46, and the culture solution, the extract, and the luminescent reagent supplied from the first plate 21 are mixed in the reaction tank 44.
  • the reaction tank 4 is provided with a depth that allows the first plate 21 and the second plate 22 to be joined in a state where the nozzles 37, 38, and 39 are inserted.
  • the second plate 22 needs to have at least the bottom of the reaction tank 44 so that light emission can be detected by the photodetector 13. For this reason, as the second plate 22, for example, it is preferable that the second plate 22 itself is made of a transparent material because the photodetector 13 can detect light. Further, when the second plate 22 is made of a material that does not have translucency, the bottom region of the reaction tank 44 is cut out, and a member made of a translucent material is fitted into the cutout portion. Light can be detected by the detector 13.
  • the photodetector 13 is not particularly limited, and for example, a photomultiplier tube, a CCD camera, a photodiode, or the like can be used.
  • a gas supply path 41 is provided through the second plate 22 so as to communicate with the reaction tank 44.
  • a second gas supply section 48 is connected to the gas supply path 41 via a supply pipe 481, and the gas supplied from the second gas supply section 48 passes through the gas supply path 41 to the reaction tank 44. Supplied.
  • the second gas supply unit 48 has a gas control mechanism such as a gas concentration meter and a gas pressure control mechanism, and the gas in the reaction tank 44 is suitable for the type of bacterial cell to be tested in the drug sensitivity test.
  • the atmosphere can be controlled.
  • the joint 23 is formed so as to cover the entire upper surface of the second plate 22 including the open end side of the reaction tank 44. Thereby, the gas atmosphere inside the reaction tank 44 is maintained by the joint 23.
  • the first plate 21 and the second plate 22 are joined in a state where the nozzles 37, 38, 39 are inserted into the reaction tank 44.
  • , 38, 39 are preferably provided with holes having a diameter similar to the nozzle diameter, for example.
  • any material can be used without particular limitation as long as it can join the first plate 21 and the second plate 22 and is a non-breathable material.
  • a silicone resin or a thermosetting resin can be used.
  • the drug sensitivity test apparatus may have a configuration in which a plurality of reaction tanks 44 are provided on the second plate 22, and the plurality of reaction tanks 44 are connected to one gas supply path 41.
  • each set of the culture solution holding unit 47, the extract solution holding unit 43, and the luminescent reagent holding unit 46 is fitted into one reaction tank 44, and the first plate 21 and It is comprised so that the 2nd plate 22 may join.
  • the structure similar to FIG. 3 is each provided in the periphery of the 1st plate 21, the structure of the periphery of the 1st plate 21 is abbreviate
  • the ATP test culture plate 12 and the gas supply path 41 provided in the second plate 22 can be provided as a drug sensitivity test kit.
  • the drug sensitivity kit includes a first plate 21 including a culture solution holding unit 47 having a nozzle 37, an extract holding unit 43 having a nozzle 38, and a luminescent reagent holding unit 46 having a nozzle 39; A second plate 22 having a reaction tank 44; a joining portion 23 for joining the first plate 21 and the second plate 22; and a gas supply path 41 provided in the second plate 22. It is configured.
  • the drug sensitivity test kit unit can be replaced.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a drug sensitivity test process according to the embodiment.
  • the infectious disease origin microbe used as the measuring object of this invention will not be specifically limited if ATP is contained in a microbial cell.
  • specimens such as blood, throat swab, sputum and the like are collected from an infectious disease patient (S501), and isolation culture is performed all day and night in order to obtain infectious disease-causing bacteria as a single colony from a specimen in which resident bacteria are mixed (S502).
  • the bacteria forming a single colony are collected (S503), adjusted to a constant concentration (S504), and distributed to AST panels in which various concentrations of drugs and antibiotics are arranged (S505).
  • the material and shape of the AST panel are not particularly limited, but a plate-like one having a plurality of holes (wells) on a plane is desirable.
  • a 96-well microplate in which 96 wells are integrated into 8 wells ⁇ 12 wells Alternatively, a 384-well microplate in which a total of 384 wells are integrated by 16 wells ⁇ 24 wells, a 1532-well microplate in which a total of 1532 wells are integrated by 32 wells ⁇ 48 wells, or the like can be used.
  • Drugs and antibiotics applicable to this embodiment are not particularly limited. Examples include antibiotics having bactericidal activity such as penicillin, cephem, aminoglycoside, new quinolone, and fosfomycin, and drugs having bacteriostatic activity such as macrolide and tetracycline.
  • sulfonamide examples include sulfonamide, aminibenzylpnicillin, and tetracycline.
  • drugs such as antibiotics, those suitable for the bacterial species can be appropriately selected and used, and the type is not particularly limited.
  • gas is supplied from the first gas supply unit 40 to the culture solution holding unit 47 of the first plate 21 through the supply pipe 401, and the gas atmosphere in the culture solution holding unit 47 is controlled, and the AST panel is supplied.
  • the distributed bacterial suspension is collected using the first plate 21 of the ATP test culture plate 12 (S506).
  • the tip of the nozzle 37 of the culture solution holding unit 47 is brought into contact with the bacterial suspension accommodated in the hole of the AST panel and sucked with the syringe 31, so that the bacterial suspension in the AST panel is Then, it is sucked into the culture solution holding part 47.
  • the first plate 21 and the second plate 22 of the ATP test culture plate 12 are joined by the joining part 23 (S507), and the culture solution holding part 47.
  • the extraction liquid holding part 43, the luminescent reagent holding part 46, and the reaction tank 44 are sealed (see FIG. 5).
  • a gas supply is further supplied from the first gas supply unit 40 to the sealed culture solution holding unit 47, and the gas atmosphere in the culture solution holding unit 47 is controlled.
  • the whole is heated by the heater 11 and drug sensitive culture is performed (S508).
  • gas is supplied from the second gas supply unit 48 to the sealed reaction tank 44 through the gas supply path 41 to control the gas atmosphere in the reaction tank 44.
  • the heater 11 has a temperature sensor and a temperature adjustment function, and controls the temperature of the culture solution holding unit 47 of the first plate 21 to a desired temperature according to the bacterial species to be tested in the drug sensitivity test.
  • the drug-sensitive culture of the culture solution sucked into the culture solution holding unit 47 is performed (S508).
  • the temperature at the time of culturing is appropriately set according to the bacterial species, but is generally 35 to 37 ° C.
  • the culture solution held in the culture solution holding part 47 of the first plate 21 is dispensed into the reaction vessel 44 controlled in atmosphere by the nozzle 37 inserted into the reaction vessel 44 and continued.
  • the extract in the extract holding part 43 was dispensed into the reaction tank 44 by the nozzle 38 inserted in the reaction tank 44
  • the luminescent reagent in the luminescent reagent holding part 46 was inserted into the reaction tank 44. Dispense into the reaction tank 44 by the nozzle 39 (S509).
  • ATP is extracted from the bacteria by mixing with the extract.
  • the extract is not particularly limited as long as ATP can be extracted from bacteria.
  • benzalkonium chloride, benzyl chloride, formaldehyde, or the like can be used.
  • the mixed solution containing ATP extracted from bacteria emits light when mixed with the luminescent reagent dispensed in the reaction tank 44.
  • the luminescent reagent is not particularly limited as long as it emits light when mixed with ATP.
  • a lucifer HS set can be used.
  • the light emission amount (ATP light emission amount) in the reaction tank 44 is detected by the photodetector 13 (S510).
  • the luminescence measurement can be performed a plurality of times.
  • the culture solution, the extract, and the luminescent reagent are dispensed into the reaction tank 44 (S511), and the luminescence amount in the luminescence tank 44 (ATP luminescence amount). Is detected by the photodetector 13 (S512).
  • the drug sensitive culture is continued, and after 24 hours from the start of the culture, the culture solution, the extract, and the luminescent reagent are dispensed into the reaction tank 44 (S513), and the amount of luminescence in the reaction tank 44 24 hours after the start of the culture. (ATP emission amount) is detected (S514).
  • the timing for performing the luminescence measurement can be set as appropriate. That is, by controlling the timing of dispensing the culture solution, the extract and the luminescent reagent into the reaction tank 44 by a controller (not shown) that controls the operation of each syringe 31, 32, 33, at a desired timing, It becomes possible to determine the sensitivity to a drug. In this case, a more flexible drug sensitivity test can be performed.
  • FIG. 8 shows an internal configuration of the determination unit 14.
  • the determination unit 14 includes an ATP calculation unit (S601), a database storage unit (S602), and a comparison calculation unit (S603). Specifically, the result of the luminescence measurement obtained in step (S510), step (S512) or step (S514) (see FIG. 7) is stored in the ATP calculator (S601) and displayed as a result.
  • the database storage unit (S602) that performs drug sensitivity result determination creates a database for each bacterial species based on the detection results so far.
  • the calculated calculation criteria are stored.
  • the comparison calculation unit (S603) obtains an accurate value as the threshold for the ATP luminescence amount by selecting and reading out the calculation criteria for the corresponding bacterial species from the database storage unit (S602). Therefore, the drug sensitivity test can be determined more accurately.
  • the first plate 21 having the culture solution holding unit 47 and the second plate 22 having the reaction tank 44 are detachably installed, and the first plate 21 and the first plate 21 A configuration in which a gas supply path for supplying gas is provided on the ATP test culture plate configured so that the culture solution holding unit 47 and the reaction tank 44 are hermetically sealed when the two plates 22 are joined to each other.
  • ATP extraction and luminescence detection can be performed continuously.
  • the drug sensitivity test of the present invention is not necessarily limited to the procedure described above, and can be performed by changing the order as appropriate.
  • the bacterial suspension held outside the ATP culture plate 12 in a state where the first plate 21 and the second plate 22 are separated from each other is transferred to the culture solution holding unit 47 by the nozzle 37.
  • the bacterial suspension can be sucked in a state where the first plate 21 and the second plate 22 are joined.
  • a medicine bottle (not shown) containing a medicine and a bacteria liquid bottle (not shown) containing a liquid containing bacterial cells are connected to the culture liquid holding unit 47 (see FIG. 3), and these bottles and the culture liquid are connected.
  • This can be performed using an apparatus in which a syringe 31 is provided between the holder 47 and the holder 47.
  • the medicine contained in the medicine bottle and the bacteria solution contained in the bacteria solution bottle are sucked by the syringe 31.
  • the mixture is once supplied to the reaction tank 44, and the medicine and the bacterial solution are mixed in the reaction tank 44 to obtain a bacterial suspension.
  • the bacterial suspension is sucked into the culture solution holding unit 47 by the nozzle 37, and heated. 11 and incubate.
  • the culture solution thus obtained is supplied again to the reaction tank 44 through the nozzle 37, and thereafter, the drug sensitivity test can be performed by performing the steps after step (S509) of the above-described embodiment.
  • the light emission amount is represented by the integration of the photon count value of 60 seconds, and the unit is the light emission amount (Amount of luminescence (au)). Since the light emission amount and the ATP amount are in a proportional relationship, an increase in the light emission amount and an increase in the ATP amount are expressed in the same meaning.
  • the drug susceptibility test apparatus described above can be applied mainly to the test of the susceptibility of bacteria to drugs, and in particular to the test of the susceptibility of infectious disease-causing bacteria.
  • H. influenzae Haemophilus influenzae
  • sulfonamide was used as the antibiotic, and the final concentration of antibiotic was 0.125 to 512 ⁇ g / mL, and a 2-fold dilution series was prepared and used.
  • Benzalkonium chloride was used for the extract, and Lucifer HS set (Kikkoman) was used for the luminescent reagent.
  • H. Influenzae was cultured overnight on a chocolate agar medium in a 5-10% carbon dioxide atmosphere, and the next day the colonies were suspended in Mueller-Hinton (hereinafter referred to as MH) medium to prepare 0.5 McFarland. A turbid liquid was prepared.
  • MH Mueller-Hinton
  • 50 ⁇ L each of the bacterial suspension diluted 500 times with MH medium was distributed on a plate in which 50 ⁇ L each of MH medium containing antibiotics at twice the final concentration was dispensed in advance to prepare an AST panel. .
  • the gas was supplied from the first gas supply unit 40 to the culture solution holding unit 47 of the first plate 21 of the ATP test culture plate 12 and prepared in advance in a 5 to 10% carbon dioxide atmosphere. From the AST panel using the first plate 21 prepared with the gas atmosphere, the H.P. 90 ⁇ L of a bacterial suspension of influenza was collected.
  • the first plate 21 and the second plate 22 are joined to each other through the joining portion 23, and the temperature of the ATP test culture plate 12 is maintained at 37 ° C. by the heater 11, and after a predetermined time has passed, the gas atmosphere is previously set to 5 to In the reaction vessel of the second plate 22 prepared to 10% carbon dioxide gas, 10 ⁇ L of H.P. Dispense the influenzae bacterial culture into the reaction vessel, then dispense 10 ⁇ L of extract from the extract holder 43 into the reaction vessel, and then dispense 50 ⁇ L of the luminescent reagent from the luminescent reagent holder 46 into the reaction vessel. Noted.
  • the photodetector 13 After the luminescent reagent was dispensed, the amount of luminescence in the reaction vessel was detected by the photodetector 13. The photodetector 13 performed photon counting for 1 minute, and the obtained light emission amount RLU (relative light unit) was used as an index of the ATP amount.
  • RLU relative light unit
  • FIG. 9 shows the change in the amount of luminescence with the passage of the incubation time of influenza.
  • the number of cells in the culture solution is uniform, so the RLU is constant under all antibiotic concentrations.
  • the antibiotic (sulfonamide) concentration was 0 ⁇ g / mL
  • the RLU was higher than that at the start of the culture. You can see that it has proliferated.
  • the antibiotic (sulfonamide) concentration is 1 ⁇ g / mL
  • the amount of increase is small compared to the antibiotic (sulfonamide) concentration of 0 ⁇ g / mL, but the RLU is higher than that at the start of the culture, indicating that the bacteria have grown.
  • Example 2 Escherichia coli (ATCC 25922 strain, hereinafter referred to as E.
  • Example 2 Bacillus coli
  • ampicillin is used as the antibiotic
  • the gas in the culture solution holding part 47 and the reaction tank 44 of the ATP test culture plate 21 is used.
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the atmosphere was an air atmosphere.
  • Antibiotic (ampicillin) concentrations were 0, 2, 4, and 8 ⁇ g / mL.
  • FIG. The change in the amount of luminescence with the passage of the E. coli culture time, that is, the change in the amount of ATP is shown.
  • RLU increased exponentially until 4 hours from the start of the culture, and thereafter remained at a constant value.
  • the same tendency was observed when the ampicillin concentration was 2 ⁇ g / mL.
  • E.I. It can be determined that E. coli is resistant to ampicillin at 2 ⁇ g / mL and sensitive at 4 ⁇ g / mL and 8 ⁇ g / mL. In other words, E.I. It can be determined that E. coli is sensitive to ampicillin at least at 4 ⁇ g / mL or more.

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Abstract

　反応槽４４と、反応槽４４に供給する試薬を保持する試薬保持部４３、４６と、反応槽４４に供給する培養液を保持する培養液保持部４７と、を有し、複数の接離可能な層を持つＡＴＰ検査培養プレート１２と、ＡＴＰ検査培養プレート１２内にガス供給を行うガス供給路４１と、ヒータ１１と、光検出部１３と、光検出部１３の検出結果に応じて培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性を判定する判定部１４とを有しており、ＡＴＰ検査培養プレート１２の複数の層が接合したときに、少なくとも培養液保持部４７及び反応槽４４が互いに連通可能に密閉状態となる薬剤感受性試験装置である。

Description

薬剤感受性試験装置及び薬剤感受性試験キット並びに薬剤感受性試験方法
　本発明は、細菌の薬剤感受性試験を行う試験装置及び試験キット並びに薬剤感受性試験方法に関する。
　感染症による死亡者数の増加や、薬剤耐性菌の出現に伴い、感染症起因菌の薬剤感受性試験の迅速化が注目されている。
　従来は、薬剤感受性試験は培養法に基づき実施されてきた。培養法に基づく薬剤感受性試験は、まず感染症患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰などの検体を採取後、常在菌が混在する検体から感染症起因菌を単独コロニーで得るため分離培養を一昼夜行なう。単独コロニーを形成した菌を一定濃度に調製後、各種各濃度の薬剤・抗生物質が配置された容器に分配し、薬剤感受性培養を一昼夜行う。培養後、菌の増殖の有無を基に感染症起因菌の薬剤感受性試験の結果が得られ、その結果を受けて患者に対し適切な投薬が行われる。そのため感染症患者に対し適切な投薬が行われるのは、検体採取後３日目以降である。
　これに対して、薬剤感受性試験を迅速に行なう方法として、菌内にエネルギー源として存在するＡＴＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：アデノシン三リン酸）の変化量を菌の増殖の指標とするＡＴＰ生物発光法がある。ＡＴＰ法は、菌内にエネルギー源として存在するＡＴＰを、ホタル由来の酵素ルシフェラーゼを利用して検出する方法である。ルシフェラーゼが、菌内のＡＴＰとＭｇ２＋存在下において基質であるルシフェリンを酸化し、その際に生じる発光量がＡＴＰ量に比例するため、発光量の変化から菌の増殖を評価可能である。
　ＡＴＰ法を利用した菌数の判定方法は、例えば特許文献１に開示されている。特許文献１は、ＡＴＰ測定により生菌を計数し、ＤＮＡ法により総菌を計数し、この総菌から生菌を減算して生菌数と死菌数を得る技術である。
特開平０８－３０４４０２号公報
　薬剤感受性試験の対象となる感染症起因菌は、好気性菌、通性嫌気性菌、偏性嫌気性菌に大別できる。このうち好気性菌、通性嫌気性菌は酸素存在下で生育可能であるが、編成嫌気性菌は酸素に暴露させることで死滅する。
　好気性菌、通性嫌気性菌に関しては、通常の大気下において培養が可能であるため、培養液の酸素への暴露の有無を考慮することなく、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を行う装置を構成することが可能である。
　一方、偏性嫌気性菌の培養は、酸素への暴露を回避した状態で行う必要がある。また、ＡＴＰ法による測定では、培養だけでなく、例えば菌体中のＡＴＰ抽出等のための試薬反応も必要であり、これらの工程も、酸素への暴露を回避した状態で行う必要がある。このため、薬剤感受性試験全体を、自動化した装置で実施するためには、培養から測定までの工程を全て、培養液を酸素に暴露しないようにして行えるようにする必要がある。このため、偏性嫌気性菌に関しては、酸素存在環境下では、薬剤感受性試験を行う装置及びシステムの開発が困難であった。
　本発明は、好気性菌及び嫌気性菌のいずれについても、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を実施することができる薬剤感受性試験装置及び薬剤感受性試験方法を提供することを目的とする。
　本発明の好ましい実施形態としては、反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の接離可能な層を持つＡＴＰ検査培養プレートと、前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給を行うガス供給路と、前記培養液保持部を加熱するヒータと、前記反応槽内部の発光を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果に応じて培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性を判定する判定部と、を有しており、前記ＡＴＰ検査培養プレートの前記複数の層が接合したときに、少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽が互いに連通可能に密閉状態となる薬剤感受性試験装置である。
　また、本発明の好ましい実施形態としては、反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の接離可能な層を持つＡＴＰ検査培養プレートと、前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給を行うガス供給路と、を有しており、前記ＡＴＰ検査培養プレートの前記複数の層が接合したときに、少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽が互いに連通可能に密閉状態となる薬剤感受性試験キットである。
　また、本発明の好ましい実施形態としては、反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の層を持つＡＴＰ検査培養プレートの少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽を互いに連通可能に密閉状態とし、前記複数の層が接合された前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給部からガス供給を行い、密閉状態の前記培養液保持部をヒータで加熱して、菌と薬剤とを混合してなる菌懸濁液を培養し、前記菌懸濁液を培養して得られた培養液を密閉状態の前記反応槽に供給するとともに、該反応槽に前記試薬保持部から前記試薬を供給し、前記培養液と前記試薬との反応液を保持する前記反応槽内部の発光を光検出部により検出し、前記光検出部の検出結果に応じて、前記培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性を判定部により判定する薬剤感受性試験方法である。
　本発明によれば、好気性菌及び嫌気性菌のいずれについても、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を実施することができる。
実施形態に係る薬剤感受性試験装置の構成を示す概略図である。 図１に示すＡＴＰ検査培養プレートの構成を説明するための図である。 図２に示す第１のプレートの内部構造を、第１のプレートの周辺構造とともに示す図である。 図２に示す第２のプレートの内部構造を示す断面図である。 第１のプレートと第２のプレートとを接合した状態を、第１のプレートの周辺構造とともに示す図である。 複数の反応槽が設けられた第２のプレートと第１のプレートとを接合した状態を示す図である。 実施形態に係る薬剤感受性試験の工程を示すフロー図である。 判定部の内部構成を示す図である。 Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの培養時間の経過に伴う発光量の変化を、抗生物質濃度毎に示す図である。 Ｅ．ｃｏｌｉの培養時間の経過に伴う発光量の変化を示す図である。
　以下、図面を通して本発明の好適な実施形態について、以下の実施例において例示的に詳しく説明する。但し、この実施例に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その他の相対的な配置等は特に特定的な記載がない限りは、この発明の範囲をそれに限定する趣旨ではなく、単なる説明例に過ぎない。
　図１は実施形態に係る薬剤感受性試験装置の構成を示す概略図である。薬剤感受性試験装置は、ＡＴＰ検査培養プレート１２、ヒータ１１、光検出器１３、判定部１４を備えている。
　図１に示す例では、ヒータ１１はＡＴＰ検査プレート１２の光検出器１３の設置面と反対側の面の近傍において隣接するように設置されている。なお、ヒータ１１の形状及び数量は特に限定されず、その設置位置も、使用形態に応じて適宜変更可能である。
　図２は、図１に示すＡＴＰ検査培養プレート１２の構成を説明するための図である。図２（ａ）に示すように、ＡＴＰ検査培養プレート１２は第１のプレート２１、第２のプレート２２の２層から構成されている。第２のプレート２２の上面には、第１のプレート２１と接合するための接合部２３が形成されている。
第１のプレート２１と第２のプレート２２とは、接合部２３を介して接合（図２（ｂ）参照。）、離間（図２（ａ）参照。）が自在に構成されている。
　図３は、図２に示す第１のプレート２１の内部構造を、第１のプレート２１の周辺構造とともに示す図であり、図４は、図２に示す第２のプレート２２の構成を示す断面図である。
　第１のプレート２１は、培養液保持部４７、抽出液保持部４３、発光試薬保持部４６を有しており（図３参照。）、第２のプレート２２は、有底の孔部として形成された反応槽４４を有している（図４参照。）。第１のプレート２１及びその周辺の詳細な構成、並びに第２のプレート２２の詳細な構成については後述する。
　図５に示すように、第１のプレート２１は、接合部２３を介して第２のプレート２２と接合することで、第１のプレート２１の培養液保持部４７、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６が、第２のプレート２２の反応槽４４に嵌合するように構成されている。
　以下、図３により、第１のプレート２１及びその周辺構造について詳細に説明する。
　図３に示すように、培養液供給部４７０は、反応槽４４に供給する培養液を保持する培養液保持部４７と、培養液保持部４７の一端に接続されたノズル３７と、培養液保持部４７の他端側に接続管４７１を介して接続されたシリンジ３１と、を有している。
　培養液保持部４７には、検体から分離された、薬剤感受性試験の検査対象となる菌と、抗生物質等の薬剤とを混合した菌懸濁液が、シリンジ３１先端に設けられたバルブ３４の流路を切り替えることで、外部の容器からノズル３７により吸引される。培養液保持部４７内に吸引された菌懸濁液は、所定温度で培養された培養液として、再びノズル３７を経て、第２のプレート２２の反応槽４４へ供給される。
　培養液保持部４７には、供給管４０１を介して第１のガス供給部４０が連結されている。第１のガス供給部４０は、ガス濃度計及びガス圧力調節機構を有しており、培養液保持部４７内を、薬剤感受性試験の検査対象となる菌体の培養に適した気体雰囲気に制御可能である。
　抽出液供給部４３０は、反応槽４４に供給する抽出液を保持する抽出液保持部４３と、抽出液保持部４３の一端に接続されたノズル３８と、抽出液保持部４３の他端側に接続管４３１を介して接続された抽出液ボトル４２と、抽出液ボトル４２と抽出液保持部４３との間に設けられたシリンジ３２とを有している。
　抽出液は、細菌からＡＴＰを抽出する試薬であり、抽出液ボトル４２に収容されている抽出液は、シリンジ３２先端に設けられたバルブ３５の流路を切り替えることで、抽出液保持部４３へ充填され、ノズル３８を経て、第２のプレート２２の反応槽４４へ供給される。
　発光試薬供給部４６０は、反応槽４４に供給する発光試薬を保持する発光試薬保持部４６と、発光試薬保持部４６の一端に接続されたノズル３９と、発光試薬保持部４６の他端側に接続管４６１を介して接続された発光試薬ボトル４５と、発光試薬ボトル４５と発光試薬保持部４６との間に設けられたシリンジ３３とを有している。
　発光試薬は、細菌等の細胞から抽出されたＡＴＰと混合されることで発光する試薬であり、発光試薬ボトル４５に収容されている発光試薬は、シリンジ３３先端に設けられたバルブ３６の流路を切り替えることで、発光試薬保持部４６へ充填され、ノズル３９を経て、第２のプレート２２の反応槽４４へ供給される。
　培養液保持部４７に接続されたノズル３７は、抽出液保持部４３に接続されたノズル３８及び発光試薬保持部４６に接続されたノズル３９より長く設けられている。
　このように構成することで、ＡＴＰ検査培養プレート１２の外部の容器から菌懸濁液を吸引する際に、ノズル３８及びノズル３９の先端を菌懸濁液に接触させず、ノズル３７の先端のみを菌懸濁液に接触させることができ、ノズル３７から培養液保持部４７に菌懸濁液を吸引する時の作業性を向上させることができる。
　以上説明した図３に示す第１のプレート２１を、接合部２３を介して第２のプレート２２と接合すると、図５に示すように、反応槽４４内には、ノズル３７、ノズル３８、ノズル３９が挿入されて、反応槽４４と培養液保持部４７、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６とが嵌合する。
　これにより、反応槽４４、培養液保持部４７、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６は、ノズル３７、３８、３９により、反応槽４４と培養液保持部４７、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６とが互いに連通した状態で、密閉状態となる。
　なお、図３及び図５に示す例では、一つの反応槽４４に対して、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６がそれぞれ一つずつ挿入される構成を示したが、薬剤感受性試験の検査内容に応じて、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６が、それぞれ複数個ずつ挿入される構成とすることも可能である。この場合、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６は、同様の形状であってもよいし、第１のプレート２１に設置可能な範囲で互いに異なる形状であってもよい。
　図４に示すように、第２のプレート２２に形成された反応槽４４は、第１のプレート２１の培養液保持部４７から供給される培養液、抽出液保持部４３から供給される抽出液、及び発光試薬保持部４６から供給される発光試薬を保持するものであり、第１のプレート２１から供給された培養液、抽出液、及び発光試薬は、反応槽４４内で混合される。
　図５に示すように、第１のプレート２１と第２のプレート２２とは、反応槽４４内にノズル３７、３８、３９が挿入された状態で接合される。このため、反応槽４は、ノズル３７、３８、３９が挿入された状態で、第１のプレート２１と第２のプレート２２とが接合可能な深さを有して設けられている。
　第２のプレート２２は、光検出器１３による発光検出ができるように、少なくとも反応槽４４の底部が透光性を有していることが必要である。このため、第２のプレート２２としては、例えば第２のプレート２２自体を透明な素材で構成することで、光検出器１３により光検出が可能となるため好ましい。また、第２のプレート２２が透光性を有しない素材で構成される場合には、反応槽４４の底部の領域を切り抜き、切り抜き部分に透光性材料からなる部材を嵌め込むことで、光検出器１３により光検出が可能となる。
　なお、光検出器１３としては、特に限定されないが、例えば光電子増倍管，ＣＣＤカメラ、フォトダイオード等が使用可能である。
　第２のプレート２２には、反応槽４４に連通するように、ガス供給路４１が貫設されている。ガス供給路４１には第２のガス供給部４８が供給管４８１を介して連結されており、第２のガス供給部４８から供給されるガスは、ガス供給路４１を通って反応槽４４に供給される。
　第２のガス供給部４８は、ガス濃度計及びガス圧力調節機構等のガス調節機構を有しており、反応槽４４内を、薬剤感受性試験の検査対象とする菌体の種類に適した気体雰囲気に制御可能である。
　接合部２３は、反応槽４４の開放端側を含む第２のプレート２２の上面全体を覆うように形成されている。これにより、反応槽４４内部の気体雰囲気は、接合部２３により維持される。
　図５に示すように、第１のプレート２１と第２のプレート２２とは、反応槽４４内にノズル３７、３８、３９が挿入された状態で接合されため、結合部２３には、ノズル３７、３８、３９を反応槽４４内に挿入できるように、例えばノズル径と同様の径を有する孔が設けられていることが好ましい。
　接合部２３の素材としては、第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合することができ、かつ非通気性の素材であれば特に限定することなく用いることができる。具体的には、例えばシリコーン樹脂や熱硬化性樹脂を用いることができる。
　なお、接合部２３には、第１のプレート２１と第２のプレート２２との接合性を高めるため、適宜Ｏリング等を設けることも可能である。
　図４及び図５に示す例では、第２のプレート２２に一つの反応槽４４が設けられており、ガス供給路４１に単独の反応槽４４が接続されている構成を示したが、本発明の薬剤感受性試験装置は、第２のプレート２２に複数の反応槽４４が設けられ、これら複数の反応槽４４が、一のガス供給路４１に接続された構成であってもよい。
　この場合、図６に示すように、それぞれ一組の培養液保持部４７、抽出液保持部４３及び発光試薬保持部４６が、一の反応槽４４に嵌合して、第１のプレート２１と第２のプレート２２とが接合するように構成される。なお、第１のプレート２１の周辺には、それぞれ図３と同様の構成が設けられているが、図６では、第１のプレート２１の周辺の構造は省略する。
　以上説明した薬剤感受性試験装置には、ＡＴＰ検査培養プレート１２と、第２のプレート２２に設けられたガス供給路４１とを、薬剤感受性試験キットとして設けることができる。
　すなわち、薬剤感受性キットは、ノズル３７を有する培養液保持部４７と、ノズル３８を有する抽出液保持部４３と、ノズル３９を有する発光試薬保持部４６と、を備えた第１のプレート２１と、反応槽４４を有する第２のプレート２２と、第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合する接合部２３と、第２のプレート２２に設けられたガス供給路４１と、を備えて構成されている。
　これにより、例えばＡＴＰ検査培養プレート１２やガス供給路４１に破損が生じたり、長期間の使用で劣化したりした場合には、薬剤感受性試験キット単位で交換することが可能となる。
　図７は、実施形態に係る薬剤感受性試験の工程を示すフロー図である。なお、本発明の測定対象となる感染症起因菌は、菌体内にＡＴＰを含有するものであれば特に限定されない。
　まず、感染症患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰等の検体を採取し（Ｓ５０１）、常在菌が混在する検体から感染症起因菌を単独コロニーで得るため分離培養を一昼夜行なう（Ｓ５０２）。分離培養後、単独コロニーを形成した菌を採取し（Ｓ５０３）、一定濃度に調製後（Ｓ５０４）、各種各濃度の薬剤・抗生物質が配置されたＡＳＴパネルに分配する（Ｓ５０５）。
（ＡＳＴパネル）
　ＡＳＴパネルの材質及び形状は特に限定されないが、平面上に複数の穴（ウェル）を有するプレート状のものが望ましく、例えば８ウェル×１２ウェルで合計９６ウェルが一体となった９６穴マイクロプレート、又は、１６ウェル×２４ウェルで合計３８４ウェルが一体となった３８４穴マイクロプレート、３２ウェル×４８ウェルで合計１５３２ウェルが一体となった１５３２穴マイクロプレート等を用いることができる。
　本実施形態に適用可能な薬剤・抗生物質は特に限定されない。例としてペニシリン系、セフェム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系、ホスホマイシン系等の殺菌作用を有する抗生物質や、マクロライド系、テトラサイクリン系等の静菌作用を有する薬剤が挙げられる。
　具体的には、例えば、スルホンアミド、アミニベンジルプニシリン、テトラサイクリンが挙げられる。なお、抗生物質等の薬剤は、菌種に適したものを適宜選択して用いることができ、その種類は特に限定されない。
　次いで、第１のガス供給部４０から、供給管４０１により第１のプレート２１の培養液保持部４７にガス供給を行い、培養液保持部４７内の気体雰囲気を制御した状態で、ＡＳＴパネルに分配した菌懸濁液を、ＡＴＰ検査培養プレート１２の第１のプレート２１を用いて分取する（Ｓ５０６）。
　具体的には、ＡＳＴパネルの穴に収容された菌懸濁液に、培養液保持部４７のノズル３７の先端を接触させ、シリンジ３１で吸引することで、ＡＳＴパネル内の菌懸濁液を、培養液保持部４７内に吸引する。
　次いで、ノズル３７、３８、３９を反応槽４４に挿入した状態で、ＡＴＰ検査培養プレート１２の第１のプレート２１及び第２のプレート２２を接合部２３により接合し（Ｓ５０７）、培養液保持部４７、抽出液保持部４３、発光試薬保持部４６及び反応槽４４を密閉状態とする（図５参照。）。
　密閉状態とされた培養液保持部４７には、第１のガス供給部４０からさらにガス供給を行い、培養液保持部４７内の気体雰囲気を制御した状態で、接合後のＡＴＰ検査培養プレート１２全体を、ヒータ１１により加熱し、薬剤感受性培養を実施する（Ｓ５０８）。これと並行して、密閉状態とされた反応槽４４には、第２のガス供給部４８から、ガス供給路４１によりガス供給して、反応槽４４内の気体雰囲気を制御する。
　ヒータ１１は温度センサと温度調節機能を有しており、第１のプレート２１の培養液保持部４７の温度を、薬剤感受性試験の検査対象とする菌種に応じた所望の温度に制御し、培養液保持部４７内に吸引された培養液の薬剤感受性培養を実施する（Ｓ５０８）。培養時の温度は菌種に応じて適宜設定されるが、概ね３５～３７℃である。
　一定時間経過後、第１のプレート２１の培養液保持部４７内に保持された培養液を、反応槽４４内に挿通されたノズル３７により、雰囲気制御された反応槽４４に分注し、続けて抽出液保持部４３内の抽出液を、反応槽４４内に挿通されたノズル３８により反応槽４４に分注後、発光試薬保持部４６内の発光試薬を、反応槽４４内に挿通されたノズル３９により反応槽４４に分注する（Ｓ５０９）。
　反応槽４４に供給された培養液に細菌が含まれている場合には、抽出液と混合されることにより、細菌からＡＴＰが抽出される。抽出液としては、細菌からＡＴＰを抽出できるものであれば、特に限定されないが、例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジル又はホルムアルデヒド等を用いることができる。
　細菌から抽出されたＡＴＰを含む混合液は、反応槽４４内に分注された発光試薬と混合されることで発光する。発光試薬としては、ＡＴＰと混合して発光するものであれば、特に限定されず、例えばルシフェールＨＳセットを用いることができる。
　発光試薬分注後、反応槽４４内の発光量（ＡＴＰ発光量）を光検出器１３により検出する（Ｓ５１０）。発光測定は複数回実施可能であり、上記（Ｓ５０９）と同様に、培養液，抽出液、発光試薬を反応槽４４に分注し（Ｓ５１１）、発光槽４４内の発光量（ＡＴＰ発光量）を光検出器１３により検出する（Ｓ５１２）。さらに，薬剤感受性培養を継続し培養開始から２４時間経過後、培養液、抽出液、発光試薬を反応槽４４に分注し（Ｓ５１３）、培養開始から２４時間後の反応槽４４内の発光量（ＡＴＰ発光量）を検出する（Ｓ５１４）。
　なお、発光測定を行うタイミングは、適宜設定することが可能である。すなわち、培養液、抽出液及び発光試薬の反応槽４４への分注のタイミングを、各シリンジ３１、３２、３３の動作を制御する不図示のコントローラにより制御することで、所望のタイミングでの、薬剤に対する感受性を判定することが可能となる。この場合、よりフレキシブルな薬剤感受性試験を行うことが可能である。
　図８に、判定部１４の内部構成を示す。判定部１４は、ＡＴＰ算出部（Ｓ６０１）、データベース記憶部（Ｓ６０２）、比較演算部（Ｓ６０３）で構成される。
具体的には、ステップ（Ｓ５１０）、ステップ（Ｓ５１２）又はステップ（Ｓ５１４）（図７参照。）で得られた発光測定の結果がＡＴＰ算出部（Ｓ６０１）に記憶され、結果として表示される。
　また、薬剤感受性の結果判定（すなわち、培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性の判定）を行うデータベース記憶部（Ｓ６０２）には、これまでの検出結果をもとに菌種ごとにデータベース化された算出基準が記憶されている。
　菌種が同定されていれば、比較演算部（Ｓ６０３）において、データベース記憶部（Ｓ６０２）から該当する菌種の算出基準を選んで読み出すことで、ＡＴＰ発光量の閾値として、的確な値を得ることができ、薬剤感受性試験の判定をより正確に行うことができる。
　以上、実施形態の薬剤感受性試験では、培養液保持部４７を有する第１のプレート２１と、反応槽４４を有する第２のプレート２２とを接離可能に設置し、第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合したときに、培養液保持部４７及び反応槽４４が密閉状態とされるように構成したＡＴＰ検査培養プレートに、ガス供給を行うガス供給路を設けた構成とすることで、培養液保持部４７及び反応槽４４内を、菌体に適した気体雰囲気に制御した状態で、すなわち、培養液に含まれる菌を酸素に暴露することなく、菌体の培養、菌からのＡＴＰの抽出、及び発光検出を、連続的に行うことができる。
　このため、好気性菌や通性嫌気性菌だけでなく、編成嫌気性菌も、上記した装置を用いた試験の試験対象とすることができる。このため、好気性、嫌気性の区別なく、広範囲の菌種について、効率的かつ簡便な薬剤感受性試験を行うことができる。
　なお、本発明の薬剤感受性試験は、必ずしも上記した手順に限られず、適宜順序を変更して行うことが可能である。例えば、上記した実施形態では、第１のプレート２１と第２のプレート２２とが分離した状態で、ＡＴＰ培養プレート１２の外部に保持された菌懸濁液を、ノズル３７により培養液保持部４７に吸引する形態を示したが、菌懸濁液は、例えば第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合した状態で吸引することも可能である。
　この場合、薬剤を収容した不図示の薬剤ボトルと菌体を含む液を収容した不図示の菌液ボトルとを培養液保持部４７（図３参照。）に接続し、これらのボトルと培養液保持部４７との間にシリンジ３１を設けた形態の装置を用いて行うことができる。
　具体的には、第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合した状態で、薬剤ボトルに収容されている薬剤と、菌液ボトルに収容されている菌液とを、シリンジ３１により吸引して一旦反応槽４４に供給し、反応槽４４内で薬剤と菌液とを混合して菌懸濁液とした後、ノズル３７により菌懸濁液を培養液保持部４７に吸引し、ヒータ１１で加熱して培養する。このようにして得られた培養液を、ノズル３７により再度反応槽４４に供給し、その後は上記した実施形態のステップ（Ｓ５０９）以降の工程を行うことで、薬剤感受性試験を行うことができる。
　本実施例では，発光量を６０ｓｅｃのフォトンカウント値の積算で表わし，単位を発光量（Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　（ａ．ｕ．））とする。発光量とＡＴＰ量は比例関係にあるため，発光量の増加とＡＴＰ量の増加を同じ意味あいで表現することとする。
　以上説明した薬剤感受性試験装置は、主に細菌の薬剤に対する感受性の検査に適用することができ、特に感染症起因菌の薬剤に対する感受性の検査に適用することができる。
　以下に、本発明の具体的な実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（以下Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとする）を菌体として使用し、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を実施した例を示す。抗生物質としては、スルホンアミドを用い、抗生物質の終濃度は０．１２５～５１２μｇ／ｍＬの間で２倍希釈系列を作製し使用した。
　抽出液には塩化ベンザルコニウムを使用し、発光試薬にはルシフェールＨＳセット（キッコーマン）を使用した。
　まず、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅをチョコレート寒天培地上で５～１０　％の炭酸ガス雰囲気下で一晩培養し、翌日コロニーをＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ（以下ＭＨとする）培地中に懸濁し０．５マクファーランドに調製した菌懸濁液を作製した。次に、予め終濃度の２倍濃度の抗生物質入りＭＨ培地を５０　μＬずつ分注したプレートに、ＭＨ培地で５００倍に希釈した菌懸濁液を５０　μＬずつ分配し、ＡＳＴパネルを用意した。
　ＡＴＰ検査培養プレート１２の第１のプレート２１の培養液保持部４７に、第１のガス供給部４０からガスを供給することで、５～１０　％の炭酸ガス雰囲気下に予め調製した。気体雰囲気を調製した第１のプレート２１を用いてＡＳＴパネルからＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの菌懸濁液を９０　μＬ分取した。
　第１のプレート２１と第２のプレート２２とを接合部２３を介して接合し、ヒータ１１によりＡＴＰ検査培養プレート１２の温度を３７℃に保持して一定時間経過後、予め気体雰囲気を５～１０　％炭酸ガスに調製した第２のプレート２２の反応槽内に、第１のプレート２１の培養槽から１０　μＬのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの菌培養液を反応槽に分注し、続けて抽出液保持部４３から１０　μＬの抽出液を反応槽に分注後、発光試薬保持部４６から５０　μＬの発光試薬を反応槽に分注した。
　発光試薬分注後、反応槽内の発光量を光検出器１３により検出した。光検出器１３では１分間のフォトンカウンティングを行い、得られた発光量ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｕｎｉｔ）をＡＴＰ量の指標として用いた。
　Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの培養時間の経過に伴う発光量の変化を、図９に示す。
　培養開始時（０　ｈｒ）には、培養液中の菌体数が均一であるため、全ての抗生物質濃度下でＲＬＵは一定である。一定時間培養後（図９では例として３　ｈｒ経過後）、抗生物質（スルホンアミド）濃度０　μｇ／ｍＬでは、ＲＬＵが培養開始時より高くなったことから、ＡＴＰ量が増加した、つまり菌が増殖したことがわかる。抗生物質（スルホンアミド）濃度１　μｇ／ｍＬでは、抗生物質（スルホンアミド）濃度０　μｇ／ｍＬと比較すると増加量は少ないが、培養開始時よりＲＬＵが高くなり、菌が増殖したことがわかる。一方、抗生物質（スルホンアミド）濃度２　μｇ／ｍＬでは、培養開始時よりＲＬＵが低くなり、抗生物質（スルホンアミド）の作用により菌が減少したことがわかる。つまり、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、この抗生物質（スルホンアミド）に対し、１　μｇ／ｍＬでは耐性を示し、２　μｇ／ｍＬでは感受性を示すと判定できる。換言すれば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、抗生物質（スルホンアミド）に対し、少なくとも２　μｇ／ｍＬ以上では感受性を示すと判定できる。
〔実施例２〕
　実施例２は、菌体としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２株、以下Ｅ．ｃｏｌｉとする）を用い、抗生物質はアンピシリンを使用し、ＡＴＰ検査培養プレート２１の培養液保持部４７及び反応槽４４内の気体雰囲気を大気雰囲気としたこと以外は、実施例１と同様にして行った。抗生物質（アンピシリン）濃度は、０、２、４、８　μｇ／ｍＬとした。図１０に、Ｅ．ｃｏｌｉの培養時間の経過に伴う発光量の変化、すなわちＡＴＰ量の変化を示す。
アンピシリン濃度が０　μｇ／ｍＬのとき、培養開始から４時間まではＲＬＵが指数関数的に増加し、その後一定値で推移した。アンピシリン濃度が２　μｇ／ｍＬのときも、同様の傾向を示した。一方、アンピシリン濃度が４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬのときは、培養開始から２時間まではＲＬＵが増加するが、その後は一定値で推移した。ＲＬＵの値は、アンピシリン濃度０　μｇ／ｍＬのときと比較すると約１／２０と低く、アンピシリンの作用によりＥ．ｃｏｌｉの増殖が抑制されたことがわかる。
　つまり、Ｅ．ｃｏｌｉは、アンピシリンに対し２　μｇ／ｍＬでは耐性を示し、４　μｇ／ｍＬ、８　μｇ／ｍＬでは感受性を示すと判定できる。換言すれば、Ｅ．ｃｏｌｉは、アンピシリンに対し、少なくとも４　μｇ／ｍＬ以上では感受性を示すと判定できる。
　以上より、気体雰囲気を制御した状態で菌の培養工程と、菌からＡＴＰを抽出する工程を連続的に行うことで、好気性菌と嫌気性菌のいずれも、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を簡便に実施できることが確認された。
１１…ヒータ、１２…ＡＴＰ検査培養プレート、１３…光検出器、１４…判定部、２１…第１のプレート、２２…第２のプレート、２３…接合部、３１、３２、３３…シリンジ、３４、３５、３６…バルブ、３７、３８、３９…ノズル、４０…第１のガス供給部、４１…ガス供給路、４２…抽出液ボトル、４３…抽出液保持部、４４…反応槽、４５…発光試薬ボトル、４６…発光試薬保持部、４７…培養液保持部、４８…第２のガス供給部、４３０…抽出液供給部、４３１…接続管、４６０…発光試薬供給部、４６１…接続管、４７０…培養液供供給部、４７１…接続管、Ｓ６０１…ＡＴＰ算出部、Ｓ６０２…データベース記憶部、Ｓ６０３…比較演算部

Claims (15)

  1. 　反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の接離可能な層を持つＡＴＰ検査培養プレートと、
    　前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給を行うガス供給路と、
    　前記培養液保持部を加熱するヒータと、
    　前記反応槽内部の発光を検出する光検出部と、
    　前記光検出部の検出結果に応じて培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性を判定する判定部と、を有しており、
    　前記ＡＴＰ検査培養プレートの前記複数の層が接合したときに、少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽が互いに連通可能に密閉状態となることを特徴とする薬剤感受性試験装置。
  2. 　前記ＡＴＰ検査培養プレートは、前記試薬保持部及び前記培養液保持部を有する第１のプレートと、前記反応槽を有する第２のプレートと、前記第１のプレートと前記第２のプレートとを接合する接合部とを有することを特徴とする請求項１に記載の薬剤感受性試験装置。
  3. 　前記試薬保持部及び前記培養液保持部の前記反応槽側には、それぞれノズルが設けられており、前記第２のプレートは、前記ノズルを前記反応槽に挿入可能に構成され、かつ前記反応槽が、前記ノズルが挿入された状態で前記第１のプレートと前記第２のプレートとが接合可能な深さを保って設けられていることを特徴とする請求項２に記載の薬剤感受性試験装置。
  4. 　前記第１のプレートには、前記培養液保持部にガスを供給する第１のガス供給部が接続されていることを特徴とする請求項２に記載の薬剤感受性試験装置。
  5. 　前記第２のプレートは、前記反応槽にガスを供給する第２のガス供給部に接続された前記ガス供給路を有していることを特徴とする請求項２に記載の薬剤感受性試験装置。
  6. 　前記培養液保持部に設けられたノズルの長さは、前記試薬保持部に設けられたノズルの長さより長い、ことを特徴とする請求項３に記載の薬剤感受性試験装置。
  7. 　前記ガス供給路には、前記反応槽が複数個接続されていることを特徴とする請求項１に記載の薬剤感受性試験装置。
  8. 　反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の接離可能な層を持つＡＴＰ検査培養プレートと、
    　前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給を行うガス供給路と、を有しており、
    　前記ＡＴＰ検査培養プレートの前記複数の層が接合したときに、少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽が互いに連通可能に密閉状態となることを特徴とする薬剤感受性試験キット。
  9. 　反応槽と、前記反応槽に供給する試薬を保持する試薬保持部と、前記反応槽に供給する培養液を保持する培養液保持部と、を有し、複数の層を持つＡＴＰ検査培養プレートの少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽を互いに連通可能に密閉状態とし、
    　前記複数の層が接合された前記ＡＴＰ検査培養プレート内にガス供給部からガス供給を行い、
    　密閉状態の前記培養液保持部をヒータで加熱して、菌と薬剤とを混合してなる菌懸濁液を培養し、
    　前記菌懸濁液を培養して得られた培養液を密閉状態の前記反応槽に供給するとともに、該反応槽に前記試薬保持部から前記試薬を供給し、
    　前記培養液と前記試薬との反応液を保持する前記反応槽内部の発光を光検出部により検出し、
    　前記光検出部の検出結果に応じて、前記培養液に含まれる菌種の薬剤に対する感受性を判定部により判定することを特徴とする薬剤感受性試験方法。
  10. 　前記ＡＴＰ検査培養プレートは、前記試薬保持部及び前記培養液保持部を有する第１のプレートと、前記反応槽を有する第２のプレートとが互いに接離可能に設けられており、
    　前記菌懸濁液の培養を行う前に、前記第１のプレートと前記第２のプレートとを接合部を介して接合して、少なくとも前記培養液保持部及び前記反応槽を互いに連通可能に密閉状態とすることを特徴とする請求項９に記載の薬剤感受性試験方法。
  11. 　前記試薬保持部及び前記培養液保持部に設けられたノズルを前記反応槽に挿入した状態で、前記第１のプレートと前記第２のプレートとを接合することを特徴とする請求項１０に記載の薬剤感受性試験方法。
  12. 　前記第１のプレートと前記第２のプレートとを接合した状態で、前記培養液保持部に設けられたノズルから前記培養液を前記反応槽に供給するとともに、前記試薬保持部に設けられたノズルからＡＴＰ抽出試薬を前記反応槽に供給し、該反応槽内で前記培養液と前記ＡＴＰ抽出試薬とを混合して該培養液からのＡＴＰ抽出を行い、
    　次いでＡＴＰとの混合により発光する発光試薬を前記試薬保持部に設けられたノズルから前記反応槽に供給し、前記反応槽に保持されているＡＴＰ抽出後の培養液と前記発光試薬とを混合し、
    　前記発光試薬とＡＴＰ抽出後の培養液とを保持する前記反応槽内の発光量の増減を、前記光検出部により検出することを特徴とする請求項１１に記載の薬剤感受性試験方法。
  13. 　前記第１のプレートと、前記第２のプレートとを接合した前記ＡＴＰ培養プレートの少なくとも前記培養液保持部と前記反応槽に、前記ガス供給部からガス供給を行い、前記培養液保持部内及び前記反応槽内の気体雰囲気を制御した状態で、前記培養液保持部内で前記菌懸濁液の培養を行った後、連続して、前記反応槽内で、前記菌懸濁液の培養液のＡＴＰ抽出を行うことを特徴とする請求項１２に記載の薬剤感受性試験方法。
  14. 　前記第１のプレートと前記第２のプレートとが離間した状態で、前記ＡＴＰ検査培養プレートの外部に保持されている前記菌懸濁液を、前記培養液保持部に設けられたノズルから該培養液保持部に供給する、ことを特徴とする請求項１０に記載の薬剤感受性試験方法。
  15. 　前記第１のプレートと前記第２のプレートとを接合した状態で、前記ＡＴＰ検査培養プレートの外部に保持されている前記菌懸濁液を、一旦前記反応槽に供給し、前記反応槽内の前記菌懸濁液を前記培養液保持部に吸引した後、該培養液保持部を前記ヒータで加熱して前記菌懸濁液を培養し、得られた培養液を再度前記反応槽に供給することを特徴とする請求項１０に記載の薬剤感受性試験方法。
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