ES2089009T5 - Aparato y metodos para ensayar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. - Google Patents
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Abstract
METODO Y APARATO PARA PROBAR LA SUSCEPTIBILIDAD CUALITATIVA DE UN MICROORGANISMO A LA INHIBICION DE CRECIMIENTO POR UN PRODUCTO ANTIMICROBIANO UTILIZANDO UN PANEL DE PRUEBAS (100-1). LOS MODULOS DE PRUEBA (107, 108, 109) ESTAN EN UN POZO DE CONTROL DE CRECIMIENTO NEGATIVA (101), UN POZO DE CONTROL DE CRECIMIENTO POSITIVA (102) Y UN POZO DE PRUEBA (103). LOS MODULOS DE PRUEBA TIENEN UN VOLUMEN SOLIDO SECO DE UN SUBGRUPO DE LOS CONSTITUYENTES DE UN GRUPO DE COMPUESTOS QUIMICOS DE PRUEBA QUE CONTIENEN RESAZURINA Y UN MEDIO DE CRECIMIENTO. EL MODULO DE PRUEBA (109) QUE SE ENCUENTRA EN EL POZO DE PRUEBA TIENE ADEMAS UN VOLUMEN DE PRODUCTO ANTIMICROBIANO. EL MODULO DE PRUEBA (107) QUE SE ENCUENTRA EN EL POZO DE CONTROL DE CRECIMIENTO NEGATIVA SE REHIDRATA CON UN VOLUMEN DE LIQUIDO ESTERIL (110) QUE CONTIENE EL RESTO DE TODOS LOS COMPONENTES QUIMICOS DE PRUEBA QUE NO SE ENCUENTRAN EN EL MODULO DE PRUEBA. LOS MODULOS DE PRUEBA (108, 109) QUE SE ENCUENTRAN EN EL POZO DE CONTROL DE CRECIMIENTO POSITIVA Y EN EL POZO DE PRUEBA SE VUELVEN A HIDRATAR CON UN VOLUMEN DE INOCULO LIQUIDO (112, 113) QUE CONTIENE EL RESTO DE LOS CONSTITUYENTES JUNTO CON UNA CONCENTRACION DE MICROORGANISMOS . EL PANEL DE PRUEBA (100-1) ES INCUBADO Y LEIDO A CONTINUACION UTILIZANDO UN PROTOCOLO DE LECTURA DE LUZ VISIBLE O UN PROTOCOLO DE LECTURA DE EXCITACION FLUORESCENTE PARA DETERMINAR EL CRECIMIENTO O NO CRECIMIENTO QUE TIENE LUGAR EN LOS POZOS. EL PROTOCOLO DE LECTURA DE LUZ VISIBLE DETERMINA EL CRECIMIENTO DEL ORGANISMO ANTE LA PRESENCIA DE UN CAMBIO DE COLOR DE AZUL A ROJO. LOS MODULOS DE PRUEBA SON PREFERIBLEMENTE , DISCOS DE PAPEL CON REACTIVOS DE PRUEBA ABSORBIDOS EN SU INTERIOR Y LA CONCENTRACION DEL PRODUCTO ANTIMICROBIANO IMPRESO SOBRE EL.
Description
Aparato y métodos para ensayar la
susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos.
Esta invención se refiere de un modo general a
un aparato y a métodos para ensayar la susceptibilidad de un
microorganismo para la inhibición del crecimiento mediante un
producto antimicrobiano. Esta invención se refiere tanto al ensayo
de la susceptibilidad cualitativa como al de la susceptibilidad
cuantitativa de microorganismos.
Las muestras de microorganismos a ensayar pueden
ser suministradas al laboratorio desde diversas fuentes. Las
muestras pueden ser recogidas por médicos en sus consultas y
enviadas a un laboratorio central de ensayos, o las muestras pueden
ser recogidas de pacientes en un hospital con el que esté asociado
el laboratorio. Las muestras pueden proceder de diversas partes del
cuerpo, por ejemplo del fluido cerebro-espinal, de
un absceso, una herida infectada, una infección genital, etc. Las
muestras recogidas se cultivan en una placa de agar primaria, de
acuerdo con la práctica normal de laboratorio. A partir de las
colonias bacterianas de la placa de cultivo primaria, se prepara un
inóculo de acuerdo con un procedimiento establecido, que produce
una suspensión bacteriana de una concentración preestablecida. El
posterior tratamiento del inóculo depende del aparato y del método
a emplear para el ensayo de la susceptibilidad.
La finalidad del ensayo de la susceptibilidad es
proporcionar información al médico consultor acerca del probable
éxito de una farmacoterapia con antibióticos que ya ha sido
iniciada. El médico prescribirá generalmente un producto
antimicrobiano, denominado comúnmente un fármaco antibiótico, que
se va a administrar antes de conocerse los resultados del ensayo,
pero frecuentemente es importante para el médico saber si un
producto antimicrobiano y la concentración administrada va a tener
éxito en la destrucción del microorganismo que está provocando la
infección. Una vez que están los resultados del ensayo, el médico
puede cambiar la farmacoterapia si los resultados del ensayo
indican que hay una razón para hacerlo así.
El documento
US-A-4.385.115 describe un método de
identificación para microorganismos en el que se desarrollan
microorganismos sobre un sustrato que comprende un indicador del
crecimiento, tal como resazurina.
La expresión "ensayo de la susceptibilidad
cualitativa" se refiere a aparatos y métodos de ensayo que
producen unos resultados de ensayo que indican generalmente si un
organismo es sensible o resistente a un producto antimicrobiano en
particular. Dependiendo del método implicado, se utilizan solamente
una o dos concentraciones de producto antimicrobiano. En el ensayo
de susceptibilidad cualitativa, no se informa del grado de
sensibilidad o resistencia.
La expresión "ensayo de susceptibilidad
cuantitativa" se refiere a aparatos y métodos de ensayo que
producen unos resultados de ensayo que proporcionan datos acerca de
la concentración de producto antimicrobiano que será suficiente
para inhibir el crecimiento del microorganismo. Típicamente se
utilizan seis o más diluciones del producto antimicrobiano, que
cubren el margen terapéutico de concentraciones de producto
antimicrobiano. La expresión "concentración inhibidora mínima"
(MIC: Minimun Inhibitory Concentration) se usa
frecuentemente para referirse al resultado proporcionado por el
ensayo de susceptibilidad cuantitativa, y se define como la
concentración mínima de producto antimicrobiano que produce la
inhibición del crecimiento del microorganismo.
La expresión "producto antimicrobiano" se
utilizará en el presente texto para designar un producto que
contiene un conjunto de agentes antimicrobianos (es decir,
antibióticos individuales) en concentraciones preestablecidas, y es
por tanto una designación general para un fármaco con un solo
antibiótico o para una formulación de amplio espectro que contiene
más de un agente antibiótico.
La difusión en disco es un método de ensayo de
la susceptibilidad cualitativa que utiliza una placa 10 cubierta
con un medio de crecimiento para el microorganismo, típicamente
llamada placa de Kirby/Bauer, un caldo de inóculo, y una diversidad
de discos de papel 11 sobre los cuales se ha almacenado un producto
antimicrobiano. La placa puede ser de ciento cincuenta milímetros
de diámetro, y los discos de seis milímetros de diámetro. El caldo
de inóculo que contiene el microorganismo se aplica como
recubrimiento sobre la placa formando un césped uniforme del
microorganismo. Entonces se dejan caer los discos de papel sobre la
placa en posiciones separadas, y después se pone la placa en un
incubador para permitir el crecimiento del microorganismo. La Fig.
1A ilustra un ejemplo del aspecto de la placa después de la
incubación. La zona de inhibición que rodea a los discos puede
variar desde cero hasta veinticinco o treinta milímetros.
Durante la incubación, el producto
antimicrobiano del disco difundirá al césped de microorganismo y
formará una distribución continua de diferentes concentraciones de
producto antimicrobiano. El crecimiento del microorganismo se
inhibirá típicamente en la región central de la zona difundida, en
la que la concentración de producto antimicrobiano es mayor, a
menos que el microorganismo sea muy resistente al producto
antimicrobiano. A un cierto radio desde el centro del disco, se
verá el crecimiento del microorganismo. El tamaño de la zona de
inhibición alrededor de un disco concreto ofrece una indicación de
la susceptibilidad del microorganismo frente al producto
antimicrobiano en particular que está sobre el mismo.
La Fig. 1A y la Tabla I (que se encuentran al
final de esta memoria descriptiva) ilustran un ejemplo típico de
algunos de los productos antimicrobianos usados, y los resultados
de la lectura de un ensayo de difusión en disco.
Las principales ventajas del método de difusión
en disco son la flexibilidad en la selección de productos
antimicrobianos para el ensayo, y la facilidad para efectuar el
ensayo. Los sistemas de almacenamiento de los discos y de
distribución han sido diseñados para distribuir simultáneamente
varios discos que contienen diferentes productos antimicrobianos
sobre la placa, en posiciones separadas apropiadamente. El sistema
de distribución puede ser cargado con diferentes módulos de
almacenamiento de discos, dando al usuario una total flexibilidad
en la elección de los productos antimicrobianos a usar en cada
situación de ensayo de una muestra.
El principal inconveniente es que la
interpretación de "sensible" y "resistente" de los
resultados del ensayo se basa en niveles alcanzables de antibiótico
en el suero, que pueden no correlacionarse bien con los niveles
alcanzables de antibiótico del sitio de la infección distinto de la
sangre. Este es el caso para todos los métodos de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa. Otros inconvenientes son el difícil y
prolongado proceso de lectura e interpretación del ensayo, usando
una regla para medir el tamaño de la zona y consultando una tabla
para la interpretación. Otra es que frecuentemente la diferencia en
la interpretación de "Sensible" y "Resistente" es tan
solo cuestión de algunos milímetros, por lo que pueden tener lugar
errores debidos a variaciones en la metodología del ensayo
resultantes de un inóculo pesado u otras variaciones. La
metodología de la difusión en disco limita también el número de
productos antimicrobianos que pueden ser ensayados en una
placa.
Otra opción para el ensayo de la susceptibilidad
cualitativa implica el uso de sistemas de panel de ensayo en
pocillos múltiples, que se denominan sistemas de panel de ensayo de
punto de corte o sistema de panel de ensayo de
Kirby-Bauer. Como se muestra en la Fig. 1B, los
sistemas de panel de ensayo de punto de corte utilizan típicamente
un panel de ensayo de pocillos múltiples 20 con un pocillo testigo
de crecimiento negativo 21, un pocillo testigo de crecimiento
positivo 22, una primera sección 23 del panel en la que se usan dos
diluciones distintas de múltiples productos antimicrobianos, y una
segunda sección 24 del panel en la que está presente solamente una
dilución de cada uno de los diversos productos antimicrobianos. Los
pocillos de ensayo del panel están marcados con una abreviatura del
producto antimicrobiano asociado, y la concentración en el pocillo
se da en microgramos por mililitro. La Tabla II, al final de la
memoria descriptiva, da los productos antimicrobianos y las
concentraciones del punto de corte usadas en este ejemplo de un
panel de punto de corte de la técnica anterior.
El pocillo testigo de crecimiento negativo 21
contiene solamente medio de crecimiento y no está inoculado con el
microorganismo. Se usa principalmente para vigilar la contaminación
del panel. Si después de la incubación se detecta crecimiento de
organismos en el pocillo testigo de crecimiento negativo, el panel
es rechazado y se ha de repetir el ensayo. El pocillo testigo de
crecimiento positivo 22 contiene medio de crecimiento pero no
producto antimicrobiano, y se inocula con el microorganismo. El
pocillo testigo de crecimiento positivo sirve al propósito de
demostrar que el medio de crecimiento del panel es capaz de hacer
desarrollar al microorganismo, excluyendo la presencia de un
producto antimicrobiano. Si no hay crecimiento del microorganismo
en el pocillo testigo de crecimiento positivo, el ensayo no es
válido y ha de repetirse en otro panel de ensayo.
Cada uno de los pocillos de ensayo asociados con
los productos antimicrobianos contiene medio de crecimiento y una
concentración conocida del producto antimicrobiano asociado. Estos
productos químicos de ensayo se depositan sobre los pocillos y
después se congelan o bien se secan. Los paneles congelados se
descongelan inmediatamente antes de la inoculación. Los paneles
secados se rehidratan en el momento de la inoculación con el
microorganismo, usando una rehidratación separada del pocillo
testigo de crecimiento negativo con una solución rehidratante
estéril.
Las dos concentraciones distintas de cada
producto antimicrobiano en la sección 23 del panel se eligen para
proporcionar información acerca de si un microorganismo en
particular es sensible o resistente a ese producto antimicrobiano.
Las concentraciones se basan en la correlación de los resultados de
ensayo con los métodos y resultados del ensayo de difusión en disco
descrito anteriormente.
Cada uno del pocillo testigo de crecimiento
positivo y de los pocillos asociados con cada producto
antimicrobiano, se inoculan con una concentración de microorganismo
uniforme preestablecida. Después se incuba el panel, típicamente
durante la noche, y después se lee visualmente. Si el pocillo
testigo de crecimiento negativo y el pocillo testigo de crecimiento
positivo indican que el panel está cualificado para la lectura,
entonces se inspeccionan cada uno de los pares de pocillos de
ensayo de la sección 23 del panel, o el pocillo de ensayo
individual de la sección 24 del panel asociada con los productos
antimicrobianos, para determinar qué pocillos muestran crecimiento
del microorganismo.
Con referencia a la sección 23 del panel de dos
diluciones, Si el microorganismo está creciendo en cada uno de los
dos pocillos, el resultado del ensayo para ese producto
antimicrobiano es "resistente". Si el microorganismo no está
creciendo en ninguno de los pocillos, el resultado del ensayo es
"sensible". Si el microorganismo está creciendo en el pocillo
de concentración más baja y no está creciendo en el pocillo de
concentración más alta, el resultado del ensayo es
"indeterminado". Si el organismo estuviese creciendo en el
pocillo de concentración más alta y no en el de concentración más
baja, esto indicaría un ensayo fallado.
En la sección 24 del panel de dilución única,
los resultados del ensayo se llaman "sensible" y
"resistente" dependiendo del crecimiento o no crecimiento en
el pocillo único. Si hay crecimiento, el microorganismo es
resistente a ese nivel de producto antimicrobiano; y si no hay
crecimiento, el microorganismo es sensible a ese nivel.
La ventaja principal de los paneles de ensayo de
la susceptibilidad cualitativa sobre los ensayos de difusión en
disco y los paneles de ensayo de la susceptibilidad cuantitativa
discutidos anteriormente, es que puede usarse un mayor número de
productos antimicrobianos en el panel de ensayo ya que solamente se
requieren una o dos diluciones por cada producto antimicrobiano.
Otra ventaja es que el panel es relativamente más fácil y rápido de
leer que los resultados del ensayo de difusión en disco.
El principal inconveniente de los paneles de
ensayo de punto de corte es la misma que la que se discutió
anteriormente para el ensayo de difusión en disco. Además, los
paneles de ensayo de la susceptibilidad cualitativa actualmente
disponibles no proporcionan flexibilidad en el ensayo de la muestra
con productos antimicrobianos elegidos por el usuario, a menos que
el usuario adquiera cantidades suficientes como para que el
fabricante acepte preparar un panel personalizado. Generalmente, el
fabricante ha preseleccionado los productos antimicrobianos que
pone en el panel, y el usuario toma el panel tal como se le
suministra. El fabricante puede retirar un fármaco para el que el
usuario tiene una sustancial demanda de ensayo. Normalmente hay un
retardo hasta que se ponen fármacos de nueva disponibilidad en
paneles de ensayo comerciales. En ambos casos, el usuario ha de
emprender otras disposiciones de ensayo si se requiere ensayar el
microorganismo contra esos productos antimicrobianos.
La mayor parte de los ensayos de la
susceptibilidad cuantitativa realizados actualmente en laboratorios
clínicos, utilizan paneles de ensayo de varios pocillos con
diluciones múltiples de doce a veintitrés productos antimicrobianos
diferentes, junto con un pocillo testigo de crecimiento negativo y
un pocillo testigo de crecimiento positivo. La mayor parte de la
lectura de tales paneles se realiza manualmente mediante lectura
visual del panel. La lectura visual implica observar si hay
turbidez en el pocillo de ensayo, como un indicador del crecimiento
del organismo. Se inspeccionan todos los pocillos de ensayo para
cada producto antimicrobiano, y el pocillo que tiene la
concentración más baja de producto antimicrobiano en el que no hay
turbidez presente es la MIC.
Las Fig. 2A y 2B ilustran un sistema de registro
de datos de lectura del panel de ensayo, que está protegido por la
patente de EE.UU. n° 4.453.220 de Lancaster et al. Este
sistema global es típico de sistemas de lectura visual y
adquisición de datos basados en ordenador de la técnica anterior.
Los productos antimicrobianos y las diluciones mostradas en la Fig.
2A son típicos de la tecnología del panel de ensayo de MIC en la
época en la que se presentó dicha patente n° 4.453.220. En la
tecnología de los paneles de ensayo de MIC actuales pueden usarse
diferentes productos antimicrobianos y diluciones.
Las Figuras 2A y 2B ilustran que un panel de
ensayo de MIC 30 puede ser combinado con un panel de identificación
40 para el microorganismo. Una hoja superpuesta de teclado 50,
mostrada en la Fig. 2A, se corresponde con el patrón de pocillos de
ensayo en el panel MIC 30 y el panel ID 40 y encaja sobre la
sección de teclado 70 del sistema de introducción de datos 60. Los
paneles 30 y 40 encajan en una sección de lector 80 iluminada por
detrás, que ilumina los pocillos de ensayo desde la parte posterior
para que sea más fácil determinar si hay turbidez presente en los
pocillos de ensayo. Mientras lee el panel MIC 30, el técnico oprime
la tecla de la sección de teclado 70 que corresponde al pocillo que
tiene la más baja concentración del producto antimicrobiano
asociado, en el que no está creciendo el microorganismo. Este es el
valor de la MIC para ese producto antimicrobiano. El instrumento 60
registra este valor de la MIC para ese producto antimicrobiano y
después lo imprime en un formulario de informe del ensayo. En la
patente antes citada pueden encontrarse más detalles acerca de este
lector manual y este sistema de introducción de datos y de
impresión.
La ventaja principal de los paneles de ensayo de
la susceptibilidad cuantitativa es la información cuantitativa que
proporcionan los resultados del ensayo. Se determina la
concentración real de producto antimicrobiano que inhibe el
crecimiento del microorganismo, y puede ser empleada por el médico
para escoger un producto antimicrobiano y una dosificación
adecuados para la infección en cuestión, o para confirmar una
farmacoterapia inicial ya iniciada.
Los principales inconvenientes de los paneles de
ensayo de la MIC son el número limitado de productos
antimicrobianos y de concentraciones disponibles para ser ensayados
en el panel, y la selección fija de productos antimicrobianos hecha
por el fabricante. Aunque un usuario importante puede encargar
paneles personalizados, con los productos antimicrobianos elegidos,
la mayor parte de los usuarios no tienen control sobre los
productos antimicrobianos del panel.
Un inconveniente adicional es la dificultad que
se encuentra frecuentemente en la determinación de si hay o no hay
crecimiento en un pocillo de ensayo concreto. Algunas veces la
magnitud de la turbidez es pequeña y difícil de ver, y en otros
casos el patrón de crecimiento del organismo puede hacer difícil
detectar el crecimiento.
Se dispone de sistemas de lectura automática
para determinar el crecimiento o no crecimiento del microorganismo
en paneles de ensayo de la susceptibilidad cuantitativa. La lectura
se basa en la detección de la turbidez en los pocillos de ensayo
del panel, o bien en la detección de la producción de enzimas
específicas por el microorganismo, usando sustratos fluorescentes
específicos.
Hay dos tipos básicos de sistemas de lectura
automática: los que implican la incubación del panel de ensayo
durante la noche antes de la lectura, y los que implican la lectura
después de cuatro a seis horas de incubación. Estos últimos se
denominan generalmente sistemas rápidos. Los sistemas de lectura
automática para paneles de ensayo que requieren incubación durante
la noche emplean lectura turbidimétrica con alguna forma de medida
óptica que emplea transmisión de luz. Por tanto todos necesitan un
panel de ensayo transparente y medios transparentes en los pocillos
de ensayo del panel. Una vía óptica consistente requiere material
plástico de alta calidad y el control del líquido en el pocillo de
ensayo en cuanto al volumen y consistencia de los parámetros
ópticos.
En este tipo de lectura automática, el panel de
ensayo puede ser leído visualmente, así como automáticamente.
Los sistemas de lectura rápida automática
utilizan la lectura turbidimétrica o bien la lectura de
fluorescencia. Los paneles de ensayo implicados en estos sistemas
no pueden ser leídos visualmente, como respaldo de la lectura
automática o para confirmar los resultados si se sospecha un mal
funcionamiento del sistema automático.
La única ventaja de los lectores automáticos
para paneles de ensayo durante la noche, es el ahorro de trabajo en
la lectura y en el informe de los datos del panel de ensayo. Los
resultados del ensayo no son más precisos que los obtenidos en la
lectura visual por una persona experimentada. El principal
inconveniente de estos sistemas de lectura es el coste del sistema
y la posibilidad de errores de la máquina al leer e interpretar
patrones de crecimiento de algunos microorganismos que son
difíciles.
La ventaja de los sistemas de lectura rápida
automática es el ahorro de trabajo en la lectura y el informe de
los datos, la obtención más rápida del informe de los resultados
del ensayo. Como se hizo observar anteriormente, un inconveniente
de estos sistemas es que los paneles de ensayo no pueden leerse
manualmente, como respaldo para la lectura de la máquina.
El principal objeto de esta invención es
proporcionar un aparato y métodos mejorados, para el ensayo de la
susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
aparato y métodos para el ensayo de la susceptibilidad
antimicrobiana de microorganismos, con una facilidad de lectura del
panel de ensayo mejorada.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
aparato y métodos para el ensayo de la susceptibilidad
antimicrobiana de microorganismos, con lectura colorimétrica y de
fluorescencia de los paneles de ensayo mejorada.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
aparato y métodos para el ensayo de la susceptibilidad cualitativa
de microorganismos con flexibilidad de selección de productos
antimicrobianos mejorada.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
aparato y métodos para el ensayo de la susceptibilidad cuantitativa
de microorganismos con flexibilidad de selección de productos
antimicrobianos mejorada.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
aparato y métodos para el ensayo de la susceptibilidad de
microorganismos, en los que los paneles de ensayo pueden ser leídos
manualmente o automáticamente.
Un aspecto de esta invención se dirige a un
método para ensayar la susceptibilidad de un microorganismo para la
inhibición del crecimiento mediante una concentración previamente
elegida de un producto antimicrobiano, que comprende las etapas
de:
- a.
- disponer en cada uno de un receptáculo testigo de crecimiento negativo y un receptáculo testigo de crecimiento positivo, una concentración preestablecida de un medio de crecimiento para microorganismos y una concentración preestablecida de resazurina, predeterminada para que esté en un intervalo de concentración caracterizado por la baja toxicidad para los microorganismos y la sustancial sensibilidad a la reducción a resorufina por productos metabólicos del crecimiento del microorganismo; y un estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho medio de crecimiento durante la etapa (g);
- b.
- disponer en dicho receptáculo testigo de crecimiento positivo una concentración preestablecida de dicho microorganismo;
- c.
- disponer en un receptáculo de ensayo dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano;
- d.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de resazurina; y un estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho medio de crecimiento durante la etapa (g);
- e.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de medio de crecimiento;
- f.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo;
- g.
- incubar la totalidad de dichos receptáculos juntos, durante un periodo de tiempo de incubación asociado con un protocolo de lectura previamente elegido, que comprende uno entre un protocolo de lectura de luz visible o un protocolo de lectura de excitación de fluorescencia; y
- h.
- después de dicho periodo de tiempo de incubación, leer dichos receptáculos de acuerdo con dicho protocolo de lectura previamente elegido, para determinar la presencia o ausencia de crecimiento de dicho microorganismo en dicho receptáculo de ensayo, sobre la base de las concentraciones relativas de resazurina y resorufina en el mismo, incluyendo dicho protocolo de lectura de luz visible un algoritmo de decisión basado en al menos una combinación funcional predeterminada del color de reflectancia de la luz visible detectado en cada uno de dichos receptáculos, incluyendo dicho protocolo de lectura de excitación de fluorescencia un algoritmo de decisión basado en al menos una combinación funcional predeterminada, de los valores de la señal de emisión de fluorescencia producida por el producto de reacción resorufina en cada uno de dichos receptáculos.
Una de las ventajas del método de esta invención
es la disponibilidad de los dos distintos protocolos de lectura a
partir de la misma metodología de ensayo. Tanto el protocolo de
lectura de luz visible como el protocolo de lectura de excitación
por luz fluorescente pueden ser automatizados, y el último de ellos
puede ser empleado en un protocolo de ensayo rápido para determinar
crecimiento o no crecimiento en un periodo de tiempo de incubación
de cuatro a seis horas. Otra ventaja es que la lectura visual de
acuerdo con el protocolo de lectura de luz visible se facilita en
gran medida usando el cambio de color, desde el color azul original
de la resazurina al color rojo de la resorufina, cuando el
microorganismo ha crecido en el pocillo de ensayo. En comparaciones
directas con lectura visual de la turbidez, se ha demostrado que la
lectura del crecimiento con el cambio de color es más rápida y más
fácil.
En una realización del método de esta invención,
las etapas de preparación del receptáculo de ensayo comprenden
formar primero en el receptáculo de ensayo un módulo de ensayo que
comprende un volumen sólido seco de una cantidad preestablecida del
producto antimicrobiano, y un volumen sólido seco de un subconjunto
de los constituyentes de un conjunto de productos químicos de
ensayo que comprende resazurina y el medio de crecimiento; y
después distribuir en el pocillo de ensayo un volumen de líquido
que tiene la concentración del microorganismo preestablecida, y
todos los constituyentes del conjunto de productos químicos de
ensayo que no están en el módulo de ensayo, para rehidratar el
módulo de ensayo antes de la incubación. Preferentemente, el
conjunto de productos químicos incluye un tampón previamente
elegido para controlar el pH final de la solución química de ensayo
rehidratada, y un estabilizante redox previamente elegido
caracterizado por la disminución sustancial de la reducción de la
resazurina por el medio de crecimiento durante la etapa de
incubación.
Es también preferible usar un medio portador tal
como un disco de papel absorbente en los receptáculos, con los
productos químicos de ensayo en cada receptáculo secados en el
medio portador. El método de esta invención proporciona
flexibilidad en cuanto a la posibilidad de poner varios componentes
del conjunto de productos químicos de ensayo en el medio portador o
en el líquido de rehidratación, pero generalmente se prefiere poner
todos estos componentes químicos de ensayo en el medio portador,
de manera que el líquido de rehidratación no necesite llevar nada
más que el microorganismo que hay que poner en el pocillo testigo
de crecimiento positivo y en el pocillo de ensayo.
El método de esta invención permite
ventajosamente el uso de medios de crecimiento estándar en el
conjunto de productos químicos de ensayo, y el uso del medio
portador proporciona flexibilidad en la selección de los productos
antimicrobianos a utilizar cuando el método de la invención se
emplea junto con paneles de ensayo de la susceptibilidad
cualitativa o paneles de ensayo de la susceptibilidad cuantitativa.
Tales paneles pueden ser paneles totalmente precargados y
proporcionan la ventaja de la facilidad de lectura de esta
invención. Los paneles pueden ser totalmente cargables usando el
medio portador seco, preferentemente en forma de discos de papel
absorbente con el producto antimicrobiano y la concentración
impresos sobre los mismos, para dar una total flexibilidad al
usuario en la selección de los productos antimicrobianos y de las
concentraciones. Además, pueden proporcionarse paneles de ensayo
con una combinación de módulos de ensayo precargados y pocillos de
ensayo vacíos para cargar módulos de ensayo elegidos por el
usuario.
Pueden suministrarse equipos ("kits") de
ensayo con distribuidores de discos y otros componentes del ensayo
de acuerdo con esta invención, para hacer que la carga de discos en
los pocillos de ensayo sea un proceso fácil.
Otros objetivos, características y ventajas de
esta invención se harán evidentes considerando la descripción
detallada que se da a continuación, junto con los figuras de los
dibujos adjuntos.
La Fig. 1A ilustra los resultados de un ensayo
de difusión en disco en una placa de Kirby-Bauer
según la técnica anterior.
La Fig. 1B ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa según la técnica anterior.
Las Fig. 2A y 2B ilustran un panel de ensayo de
la susceptibilidad cuantitativa y un sistema manual de lectura y de
introducción de datos, según la técnica anterior.
La Fig. 3 ilustra el método general y el aparato
para determinar la susceptibilidad de un microorganismo para la
inhibición del crecimiento por un producto antimicrobiano, según
esta invención.
Las Fig. 4 a 8 ilustran un protocolo de lectura
de luz visible según esta invención.
Las Fig. 9 a 12 ilustran varias realizaciones
alternativas del método y el aparato para determinar la
susceptibilidad de un microorganismo para la inhibición del
crecimiento por un producto antimicrobiano, según esta
invención.
La Fig. 13 ilustra el uso del método y el
aparato de esta invención en un panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa.
Las Fig. 14 a 16 ilustran un protocolo de
lectura de luz visible para el panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa de la Fig. 13.
La Fig. 17 ilustra el uso del método y el
aparato de esta invención en un panel de ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa.
Las Fig. 18 y 19 ilustran ejemplos de un
protocolo de lectura de luz visible para el panel de ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa de la Fig. 17.
Las Fig. 20A y 20B ilustran componentes de
realizaciones alternativas de equipos para el ensayo de la
susceptibilidad cualitativa según esta invención.
La Fig. 21 ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa según esta invención, con módulos de
ensayo precargados para productos antimicrobianos múltiples.
La Fig. 22 ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa según esta invención, con pocillos de
ensayo cargables con módulos de ensayo elegidos por el usuario para
productos antimicrobianos múltiples.
La Fig. 23 ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa según esta invención, con pocillos de
ensayo tanto precargados como vacíos, para productos
antimicrobianos múltiples.
Las Fig. 24A y 24B ilustran componentes de
realizaciones alternativas de equipos para ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa según esta invención.
La Fig. 25 ilustra un conjunto alternativo de
componentes del equipo para ensayo, para cargar módulos de ensayo
en pocillos de ensayo de un panel de ensayo vacío, para el ensayo
de la susceptibilidad cuantitativa.
La Fig. 26 ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa según esta invención, que tiene
precargados módulos de ensayo para productos antimicrobianos
múltiples.
La Fig. 27 ilustra un panel de ensayo
cuantitativo de la susceptibilidad según esta invención, que tiene
pocillos de ensayo vacíos para la carga con módulos de ensayo
elegidos por el usuario, para productos antimicrobianos
múltiples.
\newpage
La Fig. 28 ilustra componentes del equipo para
ensayo, para cargar módulos de ensayo para productos
antimicrobianos múltiples en pocillos de ensayo vacíos de un panel
de ensayo según esta invención.
La Fig. 29 ilustra un panel de ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa según esta invención, que tiene una
sección de módulos de ensayo precargados para productos
antimicrobianos múltiples previamente elegidos, y una sección de
pocillos de ensayo vacíos para cargar módulos de ensayo para
productos antimicrobianos múltiples elegidos por el usuario.
La Fig. 30 es una ilustración esquemática de un
sistema de lector automático del panel, útil según esta
invención.
La Fig. 31 ilustra un sistema de lectura de luz
visible, útil junto con un protocolo de lectura de luz visible para
un panel de ensayo según esta invención.
La Fig. 32 ilustra un sistema de lectura de
excitación de fluorescencia útil junto con un protocolo de lectura
de excitación de fluorescencia para un panel de ensayo según esta
invención.
La Fig. 33 es una gráfica que muestra los
resultados de lectura de fluorescencia del crecimiento del
microorganismo en un pocillo de ensayo según el método de esta
invención, en comparación con otros métodos de lectura de la
técnica anterior.
La Fig. 34 es una gráfica que muestra la lectura
de fluorescencia del crecimiento del microorganismo en un pocillo
de ensayo según el método de esta invención, con diferentes
microorganismos.
El método básico de esta invención implica
ensayar la susceptibilidad de un microorganismo para la inhibición
del crecimiento por una concentración previamente elegida de un
producto antimicrobiano, utilizando un panel de ensayo 100 con un
pocillo o receptáculo testigo de crecimiento negativo 101, un
pocillo o receptáculo testigo de crecimiento positivo 102, y un
pocillo de ensayo o receptáculo de ensayo 103. Los términos
"pocillo" o "receptáculo" se utilizarán indistintamente en
esta memoria descriptiva, entendiéndose que el término
"receptáculo" es general para cualquier estructura apropiada
para albergar los productos químicos de ensayo. El método no
depende del uso de un panel de pocillos múltiples, y podrían usarse
receptáculos individuales distintos. La opción del panel se
prefiere por razones de sencillez de manipulación dentro y fuera
del incubador, y por otras razones que son bien conocidas por los
expertos en esta técnica. Ahora se describirán los pasos generales
del método.
Se dispone una concentración preestablecida de
un medio de crecimiento para microorganismos en los dos
receptáculos testigo del crecimiento 101 y 102, también se dispone
una concentración preestablecida de resazurina en ambos
receptáculos testigo del crecimiento, y un estabilizante redox
previamente elegido caracterizado por la disminución sustancial de
la reducción de la resazurina por dicho medio de crecimiento
durante la etapa (g). El medio de crecimiento puede ser, por
ejemplo, caldo Mueller-Hinton estándar, y la
concentración de este medio de crecimiento puede estar en el
intervalo estándar de concentraciones usado corrientemente en la
industria de los ensayos de la susceptibilidad. La concentración de
resazurina utilizada está en un intervalo predeterminado
caracterizado por la baja toxicidad para los microorganismos y la
sustancial sensibilidad a la reducción a resorufina por los
productos metabólicos del crecimiento del microorganismo.
Se dispone en el pocillo testigo de crecimiento
positivo 102 una concentración preestablecida del microorganismo a
ensayar. Así, como se indica en la Fig. 3, el pocillo testigo de
crecimiento negativo 101 contiene medio de crecimiento y
resazurina, mientras que el pocillo testigo de crecimiento positivo
contiene medio de crecimiento, resazurina y el microorganismo.
En el pocillo de ensayo 103 se disponen los
siguientes productos químicos de ensayo: el producto antimicrobiano
en la concentración previamente elegida, la misma concentración
preestablecida de medio de crecimiento que en los dos pocillos
testigo del crecimiento, la misma concentración de resazurina y la
misma concentración de microorganismo que en el pocillo testigo de
crecimiento positivo.
Una vez que todos los productos químicos de
ensayo están dispuestos en los tres receptáculos, se incuban juntos
durante un periodo de tiempo de incubación asociado con un
protocolo de lectura previamente elegido. Generalmente los
protocolos de lectura que están disponibles para ser usados con
esta invención son un protocolo de lectura de luz visible y un
protocolo de lectura de excitación de fluorescencia. Más adelante
se dan más detalles de estos diversos protocolos de lectura.
Después del periodo de tiempo de incubación, los tres receptáculos
se leen de acuerdo con el protocolo de lectura previamente elegido,
para determinar la presencia o ausencia de crecimiento del
microorganismo en el pocillo de ensayo, sobre la base de las
concentraciones relativas de resazurina y resorufina del mismo. El
protocolo de lectura de luz visible incluye un algoritmo de
decisión basado en al menos una combinación funcional
predeterminada del color de reflectancia de la luz visible
detectado en cada uno de los tres pocillos de ensayo. El protocolo
de lectura de excitación de fluorescencia incluye un algoritmo de
decisión basado en al menos una combinación funcional
predeterminada de los valores de la señal de emisión de
fluorescencia producida por el producto de reducción resorufina en
cada uno de los pocillos de ensayo. Los detalles de los protocolos
de lectura según esta invención se dan más adelante.
En el método y el aparato de esta invención, se
utiliza resazurina como indicador de reducción/oxidación. Cuando
los microorganismos crecen en un medio de crecimiento, convierten
nutrientes en energía, con el resultado de una reducción química de
su entorno. Esto es válido para todos los microorganismos. Si está
presente un indicador de oxidación/reducción en el entorno del
microorganismo en crecimiento, también se reducirá. Así, el uso de
un indicador de oxidación/reducción proporciona un ensayo del
crecimiento de todos los microorganismos universalmente aplicable.
La resazurina es uno de estos indicadores de oxidación/reducción, y
se reduce a resofurina. La resazurina es de color reflejado azul
oscuro y no fluorescente. La resorufina es roja es muy
fluorescente. Esta reducción de la resazurina a resorufina es la
base para el protocolo de lectura de luz visible y el protocolo de
lectura de excitación de fluorescencia utilizados en el método de
esta invención.
Los sistemas de lectura de fluorescencia de la
técnica anterior, para el ensayo de la susceptibilidad, no
incorporan un indicador universal del crecimiento de
microorganismos. En su lugar, usan sustratos fluorescentes que
miden la producción de enzimas específicas y no hay ningún sustrato
fluorescente que sea utilizado por todos los microorganismos. La
reducción de la resazurina no es una reacción basada en enzimas
sino una reacción química que depende de un cambio en el estado de
oxidación/reducción del entorno. Es independiente de la reacción
enzimática.
La resazurina es también un indicador de pH, y
tiene un color azul por encima de un pH de aproximadamente 6,5 a
6,8, y rojo por debajo de ese intervalo de valores del pH. Por esta
razón, es importante controlar el pH del grupo de productos
químicos de ensayo en los receptáculos testigo de crecimiento y de
ensayo, para proporcionar las condiciones iniciales apropiadas,
especialmente cuando el producto antimicrobiano tiene un pH
relativamente alto. Por ello se prefiere añadir un tampón de pH
seleccionado, tal como una mezcla de
dihidrógeno-fosfato sódico e
hidrógeno-fosfato sódico, al conjunto de productos
químicos de ensayo de los pocillos. La cantidad de este tampón se
mantiene preferentemente baja para evitar que se exacerben las
tendencias a la autorreducción del medio de crecimiento. Además, se
ha descubierto que, durante la incubación, el propio medio de
crecimiento tiende a reducir a la resazurina y por esta razón se
incluye un estabilizante redox, tal como ferrocianuro potásico, en
el conjunto, de productos químicos de ensayo dispuestos en los tres
pocillos. El estabilizante redox utilizado no ha de ser tóxico para
el microorganismo con el fin de no interferir en el proceso de
crecimiento.
El protocolo de lectura de luz visible empleado
de acuerdo con esta invención se basa en el desplazamiento del
color del azul al rojo, que se produce durante la reducción de la
resazurina en el pocillo de ensayo a resorufina, como resultado del
crecimiento del microorganismo. Si hay crecimiento del
microorganismo en el pocillo de ensayo 103, a pesar de la presencia
de la concentración preestablecida de producto antimicrobiano
dispuesto en el mismo, la solución química de ensayo presente en el
pocillo de ensayo virará del azul al rojo, y una simple inspección
visual del pocillo de ensayo proporciona una base para determinar
un resultado del ensayo positivo o negativo. Los pocillos testigo
del crecimiento proporcionan una base para la comparación de las
condiciones de crecimiento y de no crecimiento para ayudar a
identificar el estado del pocillo de ensayo.
Las Fig. 4 a 8 ilustran con más detalle el
protocolo de lectura de luz visible. La Fig. 4 ilustra el estado
inicial del panel de ensayo 100A antes de la incubación. Los tres
pocillos son de color azul, como se indica mediante el sombreado de
las áreas que representan a los pocillos.
El protocolo de lectura de luz visible incluye
algoritmos de cualificación de la lectura del panel, que se usan
para determinar si el propio panel ha fallado en proporcionar una
base apropiada para un ensayo preciso, o si algo ha ido mal e
impide conseguir una determinación precisa del crecimiento o no
crecimiento en el pocillo de ensayo. La Fig. 5 ilustra un ensayo
fallado debido a un cambio de color del azul al rojo en el pocillo
testigo de crecimiento negativo. Dado que en ese pocillo no se ha
distribuido ningún microorganismo, no debería haber en el mismo
crecimiento alguno que produjese el desplazamiento del color azul
al rojo por la reducción de la resazurina a resorufina. El pocillo
testigo de crecimiento negativo puede cambiar ligeramente en la
intensidad del color azul debido a cierta autorreducción de la
resazurina por el medio de crecimiento durante la incubación, pero
el cambio a un color rosa o rojo indica que presumiblemente el
ensayo ha fallado y ha de repetirse. El color del pocillo testigo
de crecimiento positivo y el del pocillo de ensayo no se indican en
la Fig. 5, ya que el color de estos pocillos no interviene en este
aspecto del algoritmo de cualificación del panel.
La Fig. 6 ilustra un ensayo fallado debido al
fallo del pocillo testigo de crecimiento positivo en mostrar un
cambio de color del azul al rojo, después de la incubación. El
fallo del microorganismo en crecer en el pocillo testigo de
crecimiento positivo, en el que se supone que no están presentes
productos químicos de ensayo que inhiban el crecimiento, significa
que no hay una base fiable para enjuiciar si el crecimiento del
microorganismo en el pocillo de ensayo ha sido inhibido o no por la
concentración de producto antimicrobiano presente en el mismo.
Las Fig. 7 y 8 ilustran dos paneles de ensayo
que han pasado los ensayos de cualificación del panel, e ilustran
también el algoritmo para determinar el resultado final del ensayo.
En la Fig. 7, la inspección del pocillo testigo de crecimiento
negativo indica que se ha quedado de color azul, como debe ser dado
que se supone que no hay ningún microorganismo presente en ese
pocillo. El color del pocillo testigo de crecimiento positivo se ha
desplazado del azul al rojo, como debe ser ya que el
microorganismo distribuido en el mismo debe crecer sin ninguna
inhibición. En el pocillo de ensayo 103, el color de la solución de
ensayo es también azul todavía, lo que indica que no hay
crecimiento de microorganismos en el pocillo de ensayo. En
consecuencia, el resultado del ensayo es negativo, es decir, no hay
crecimiento de organismos en el receptáculo o pocillo de
ensayo.
En la Fig. 8, el pocillo testigo de crecimiento
negativo y el pocillo testigo de crecimiento positivo tienen los
colores apropiados y el color rojo indicado en el pocillo de ensayo
produce un resultado del ensayo positivo, es decir, hay
crecimiento del organismo en el pocillo de ensayo, que produjo el
desplazamiento del color en el mismo, igual que en el pocillo
testigo de crecimiento positivo.
Se apreciará que el panel de ensayo 100 puede
ser fácilmente leído manualmente, mirando los pocillos a simple
vista para determinar los resultados del ensayo, admitiendo que la
persona que hace la lectura tiene la agudeza visual normal para el
reconocimiento de los colores.
En la mayoría de los casos de lectura visual del
panel de ensayo, el panel habrá sido incubado durante un periodo de
tiempo suficiente para que la reducción de la resazurina del
pocillo de ensayo a resorufina haya tenido lugar hasta tal punto
que el desplazamiento de color del azul al rojo sea drástica y
fácilmente discernible. Sin embargo, en algunos casos de un
organismo de crecimiento débil, o bajo condiciones en las que la
concentración del producto antimicrobiano en el pocillo de ensayo
está precisamente en el límite de la MIC, el crecimiento del
organismo puede retardarse hasta el punto de que el grado de
desplazamiento del azul al rojo no es elevado. Puede proporcionarse
una guía de colores para ayudar a interpretar los resultados del
ensayo, que ilustre el grado de desplazamiento de color que ha de
existir para calificar el resultado del ensayo como positivo o
negativo.
La ventaja de esta invención sobre la lectura
visual de los paneles de ensayo de la susceptibilidad que se basan
en la detección de la turbidez, es que se ha determinado que el
cambio de color desde el azul al rojo es mucho más fácil de
detectar que pequeñas cantidades de turbidez. Se ha demostrado en
comparaciones directas que magnitudes de crecimiento de
microorganismos que producen una turbidez difícil de detectar
después de incubar el panel durante la noche, producen normalmente
un grado de desplazamiento del color del azul al rojo que es fácil
de detectar como indicador del crecimiento del organismo. En
consecuencia, se precisa menos experiencia y concentración para
leer manualmente un panel de ensayo que utiliza el método de esta
invención. Esto tiene por resultado una lectura más rápida y exacta
de los resultados del ensayo y proporciona al técnico más confianza
en el informe de los resultados del ensayo.
La lectura automática de un panel de ensayo
usando el protocolo de lectura de luz visible puede también
conseguirse fácilmente por medio de una instrumentación que sea
capaz de hacer determinaciones colorimétricas. Un diagrama
esquemático de un sistema automático de lectura colorimétrica se
muestra en las Fig. 30 y 31 para el caso en que el panel de ensayo
es un material opaco y la fuente de luz blanca está sobre el panel.
También podría usarse un sistema alternativo en el que el panel es
transparente y la fuente de luz blanca y el filtro están debajo del
panel.
Como se ha ilustrado, en cada caso el panel de
ensayo 100 es explorado en relación con la fuente de luz y el
detector, de manera que se lee cada uno de los pocillos en
secuencia. Después de haberse obtenido datos acerca del color de la
solución de ensayo de cada uno de los tres pocillos, se aplican a
los datos los algoritmos del protocolo de lectura de luz visible.
Primero se aplican los algoritmos de cualificación del panel de la
misma manera que en la opción de lectura visual anterior, y después
se examina el dato del pocillo de ensayo para determinar el
resultado final del ensayo si se pasan los ensayos de cualificación
del panel. Con la lectura automática, puede ser posible determinar
cuantitativamente con precisión los correspondientes grados de
diferencia de color entre el pocillo de ensayo y el pocillo testigo
de crecimiento negativo, y entre el pocillo de ensayo y el pocillo
testigo de crecimiento positivo, y usar los datos cuantificados
como base para determinar el resultado del ensayo. El algoritmo en
este caso puede ser muy similar al protocolo de lectura de
excitación de fluorescencia que se discute más adelante.
Dado que la resazurina es no fluorescente,
mientras que la resorufina es fuertemente fluorescente a una
longitud de onda de 580 nanómetros, el panel de ensayo 100 puede ser
leído usando un fluorómetro de acuerdo con un protocolo de lectura
de la excitación de fluorescencia, usando un sistema de lectura
ilustrado esquemáticamente en la Fig. 31. Una fuente de excitación
que tiene una longitud de onda a 560 o menos se usa para excitar la
emisión de fluorescencia de la resorufina de los pocillos. Se ha de
mantener la adecuada separación de las longitudes de onda de
excitación y emisión. El panel 100 se explora con respecto a la
fuente de luz de excitación y detector de forma que se obtiene el
valor de la excitación de fluorescencia de la resorufina en cada uno
de los tres pocillos. Para los fines de esta exposición, el valor
obtenido del pocillo testigo de crecimiento negativo se denomina N,
el valor del pocillo testigo de crecimiento positivo se denomina P,
y el valor del pocillo de ensayo se denomina T. Esta lectura del
panel se hace después de haberse hecho la incubación del panel de
ensayo durante un periodo de tiempo suficiente para provocar una
sustancial producción de resorufina en los pocillos en los que está
teniendo lugar crecimiento del organismo. Los valores de N y P se
examinan después para determinar si los datos corresponden a un
ensayo válido. Se compara el valor de N, y para un panel válido los
datos han de estar por debajo de un valor umbral Nf que se ha
determinado que es indicativo de ensayo fallado debido a la
presencia de demasiada resorufina en el pocillo testigo de
crecimiento negativo a causa de la contaminación del panel o por
alguna otra razón. Se compara el valor de P, y para un panel válido
los valores han de estar por encima de un valor umbral Pf que se ha
determinado que es indicativo de ensayo fallado debido a la
presencia de demasiado poca cantidad de resorufina en el pocillo
testigo de crecimiento positivo después del periodo de incubación,
debido a un fallo del medio de crecimiento para promover el
crecimiento del organismo, u otras causas. Si los datos del panel
pasan estos ensayos de validación, los datos del pocillo de ensayo
pueden seguir siendo elaborados de acuerdo con el resto del
protocolo de lectura de excitación de fluorescencia.
Preferentemente se calcula un parámetro de
control del crecimiento Gc como la diferencia entre los valores de P
y los de N. Del mismo modo, preferentemente se calcula un parámetro
de ensayo corregido Tc como la diferencia entre los valores de T y
N. El valor N obtenido a partir del pocillo testigo de crecimiento
negativo es tratado así como un valor de fondo de la resorufina que
puede estar presente en los otros dos pocillos debido a cierta
autorreducción de la resazurina durante el proceso de
incubación.
La etapa siguiente en este protocolo de lectura
es calcular el valor de una variable de ensayo I usando una
combinación funcional preestablecida de los valores de Gc y Tc.
Esta combinación funcional podría ser simplemente la diferencia
entre los dos valores, pero es preferible usar una función que
incluya la relación de Tc y Gc. Después de haberse calculado el
valor de la variable de ensayo I, se la somete a un algoritmo de
decisión y se presenta un resultado del ensayo basado en la salida
de la aplicación del algoritmo de decisión.
El algoritmo de decisión se basa en datos
obtenidos de ensayos controlados sobre paneles de ensayo que
utilizan organismos que producen resultados de ensayo conocidos.
Por ejemplo, el algoritmo de decisión puede implicar un valor
predeterminado de decisión positiva XP y un valor predeterminado de
decisión negativa XN. Estos valores de decisión se basan en datos
recogidos de organismos que se comportan de una manera conocida,
con el valor de XP elegido de forma que todos estos organismos
conocidos produzcan un valor de la variable de ensayo I que es
mayor que o igual a XP si el organismo está creciendo en el pocillo
de ensayo, o que es menor que o igual a XN si el organismo no está
creciendo en el pocillo de ensayo. El margen entre los valores de
decisión positiva y negativa es un intervalo indeterminado y se
presentará un resultado del ensayo indeterminado si el valor de I
está entre estos dos valores de decisión.
El protocolo de lectura de excitación de
fluorescencia anteriormente descrito es básicamente un protocolo
estático de lectura simple, que se hace después de un periodo de
tiempo de incubación predeterminado asociado con el protocolo. Un
protocolo de lectura de excitación de fluorescencia más complejo y
potencialmente más preciso, implicaría el uso de un ensayo
preliminar de cualificación de la lectura del panel, que requeriría
una diferencia de valor mínima entre P y N, es decir, un valor
mínimo de Gc antes de ser calculado el parámetro del ensayo I. Si
el panel pasó los otros ensayos de cualificación de datos acerca de
los valores P y N discutidos anteriormente, pero el valor de Gc
está por debajo del límite preajustado, entonces el panel sería
incubado durante un periodo de tiempo adicional para permitir que
el valor de Gc aumente (si puede hacerlo) con el paso del tiempo.
Tal solución modificada dará resultados del ensayo de mayor
precisión y con mayor posibilidad de evitar un resultado de ensayo
indeterminado para organismos que están creciendo lentamente en el
pocillo testigo de crecimiento positivo, a pesar de que no hay
producto antimicrobiano presente.
El método de esta invención es adaptable a una
determinación rápida del crecimiento de microorganismos en el
pocillo de ensayo usando un protocolo de lectura de excitación de
fluorescencia que está basado en la determinación de las
características dinámicas de los cambios en el contenido de
resorufina de los pocillos testigo del crecimiento y en el pocillo
de ensayo. Estas características dinámicas pueden incluir la
velocidad de cambio de la cantidad de resorufina en estos pocillos
(es decir, la velocidad de producción de resorufina) y la velocidad
de cambio en esta velocidad de cambio con el tiempo (es decir, la
aceleración de la producción de resorufina) en los pocillos.
En los pocillos de ensayo en los que está
creciendo el microorganismo, el número de tales microorganismos
aumentará exponencialmente con el tiempo produciendo un
correspondiente aumento exponencial de la cantidad de resorufina en
el pocillo de ensayo. En los pocillos de ensayo en los que no está
creciendo el microorganismo, puede estar teniendo lugar una cierta
autorreducción de la resazurina a resorufina, pero esto ocurre a
velocidad lineal y es por tanto fácilmente distinguible de una
producción de resorufina asociada al crecimiento.
La etapa de incubación en este método implica
incubar los tres pocillos o receptáculos de ensayo juntos, durante
un periodo de tiempo suficiente para producir un valor de una
característica dinámica de producción de resorufina en el pocillo
testigo de crecimiento positivo que exceda de un valor de
cualificación del panel predeterminado. El valor de esta
característica dinámica se determina leyendo el valor de la
excitación de fluorescencia de la resorufina tanto en el pocillo
testigo de crecimiento positivo como en el pocillo testigo de
crecimiento negativo, para al menos dos períodos de tiempo
separados (velocidad), requiriéndose al menos tres medidas a
períodos de tiempo diferentes para determinar ambas características
de velocidad y aceleración. Si el valor está por debajo del valor
de cualificación, el panel se devuelve durante otro periodo de
tiempo de incubación predeterminado, después del cual se obtienen
de nuevo los valores de la excitación de fluorescencia de la
resorufina y se vuelve a realizar la prueba de cualificación del
panel. Esto continúa hasta que el panel se cualifica para la
lectura o hasta que, a partir de los datos, se determina que el
panel es defectuoso y nunca se cualificará para su lectura.
Después de haber pasado las pruebas de
cualificación de la lectura del panel, los valores de las
características dinámicas de la producción de resorufina ya medidos
se utilizan para calcular valores de la producción dinámica de
resorufina en el pocillo testigo de crecimiento positivo y en el
pocillo de ensayo, realizando medidas adicionales después de un
periodo de tiempo más, o usando los valores de los datos ya
obtenidos. El valor para el pocillo de ensayo se denomina T' y el
valor para los pocillos testigo de crecimiento se denominan G'. No
se pretende que el uso de estas denominaciones con los signos
"prima" limiten las características dinámicas a determinaciones
de la velocidad, como podría sugerir una interpretación matemática
estricta del uso de la notación "prima". Se ha de entender que
pueden usarse tanto la velocidad de cambio como la aceleración de
la velocidad de cambio en los valores T' y G'.
Después de haberse determinado estos valores, se
calcula el valor de una variable de ensayo I como combinación
funcional preestablecida de T' y G', preferentemente una función
que incluye la relación de estos dos parámetros. Después se reporta
un resultado del ensayo usando el valor de la variable de ensayo
en un algoritmo de decisión previamente elegido. El algoritmo de
decisión puede utilizar valores de decisión positiva y negativa XP
y XN predeterminados, como se usan en el protocolo de lectura de
luz visible. También aquí, estos valores se determinan
empíricamente a partir de datos obtenidos en ensayos controlados,
usando organismos que producen resultados de ensayo conocidos.
La Fig. 9 ilustra que el método general de esta
invención se lleva a cabo preferentemente formando un módulo de
ensayo en cada uno de los pocillos testigo de crecimiento 101 y
102, y el pocillo de ensayo 103. Como se indica, los módulos de
ensayo 107 y 108 se forman en cada uno de los pocillos testigo de
crecimiento, siendo el módulo de ensayo en cada caso un tipo TMA.
Un módulo de ensayo 109 se forma en el pocillo de ensayo 103 y es
del tipo TMB, lo que indica que tiene en el mismo un conjunto
diferente de productos químicos de ensayo. Cada uno de los módulos
de ensayo 107 y 108 tiene un subconjunto de productos químicos de
ensayo TCB1 en los mismos, y el módulo de ensayo 109 tiene este
mismo subconjunto de productos químicos de ensayo, más el producto
antimicrobiano. Los subconjuntos de productos químicos de ensayo
comprenden volúmenes sólidos secos de un subconjunto de los
constituyentes de un conjunto de productos químicos de ensayo que
preferentemente incluyen todos los productos químicos de ensayo
descritos anteriormente, a saber, resazurina, medio de crecimiento,
tampón y un estabilizante redox.
Después de que los módulos de ensayo se han
formado en los pocillos, se rehidratan distribuyendo un volumen de
líquido en cada pocillo. El pocillo testigo de crecimiento negativo
101 se rehidrata con un volumen de líquido 110 que contiene
solamente el subconjunto de productos químicos de ensayo TCB2.
Tanto el pocillo testigo de crecimiento positivo como el pocillo de
ensayo se rehidratan con volúmenes de líquido 112 y 113 en el
inoculador 111 que contiene el microorganismo, así como el
subconjunto de productos químicos de ensayo TCB2. La división de
los productos químicos de ensayo entre los módulos de ensayo y el
líquido de rehidratación ilustra que hay una sustancial
flexibilidad en el método de esta invención en el proceso de
conseguir la solución química de ensayo final en cada uno de los
pocillos antes de la etapa de incubación. El conjunto preferido de
productos químicos de ensayo puede ser dividido entre varios
subconjuntos, con un subconjunto en el módulo de ensayo y el otro
subconjunto en la solución de rehidratación. El método preferido
implica poner todos los productos químicos de ensayo en los módulos
de ensayo de los pocillos, de forma que el líquido de rehidratación
es solamente un volumen de líquido estéril para el pocillo testigo
de crecimiento negativo, y un volumen del mismo líquido con una
dispersión del microorganismo en el mismo como inóculo para los
otros pocillos. Ha de entenderse que los módulos de ensayo podrían
ser rehidratados e inoculados en etapas distintas.
En el método preferido, el subconjunto de
productos químicos de ensayo en cada uno de los módulos de ensayo
en los pocillos testigo de crecimiento es el mismo. Sin embargo, se
ha de entender que el método de esta invención podría ser
implementado usando un subconjunto de productos químicos de ensayo
en el pocillo testigo de crecimiento negativo distinto que el del
pocillo testigo de crecimiento positivo. También sería posible usar
diferentes subconjuntos de productos químicos de ensayo en el
pocillo testigo de crecimiento positivo y en el pocillo de ensayo,
pero esto complicaría la preparación del líquido de inóculo
rehidratante, y por ello no es la opción preferida.
Como se ilustra en la Fig. 10, los módulos de
ensayo en los pocillos pueden adoptar la forma de un volumen sólido
seco de los productos químicos de ensayo, formado directamente
sobre las paredes de los pocillo del propio panel
100-2. Esto puede implementarse distribuyendo los
constituyentes del subconjunto de productos químicos de ensayo TCB1
en cada uno de los pocillos testigo de crecimiento, y ese
subconjunto más el producto antimicrobiano en el pocillo de ensayo,
y secando después el panel, por ejemplo en un liofilizador, para
capturar los productos químicos de ensayo como un volumen sólido
seco sobre las paredes de los pocillos.
La Fig. 11 ilustra que los módulos de ensayo
formados en los pocillos pueden tomar la forma de un medio portador
tal como los medios portadores 117, 118 y 119. La forma preferida
del medio portador en cada caso es un disco de papel absorbente del
mismo tipo que el utilizado en el ensayo de difusión en disco
descrito anteriormente. También pueden usarse otras formas de
medios portadores si tienen unas características comparables de un
modo general con las de los discos de papel absorbente. Es
necesario que el medio portador pueda ser distribuido de manera
cómoda para la fabricación de los paneles de ensayo.
A continuación se describe un procedimiento para
preparar módulos de ensayo usando discos de papel absorbente. En la
Fig. 11 se usa un sólo medio portador en cada pocillo, mientras que
en la Fig. 12 se usan dos medios portadores en cada pocillo,
teniendo cada medio portador una porción del subconjunto de
productos químicos de ensayo formada en el módulo de ensayo portado
en el mismo. Esto ilustra que es posible, por ejemplo, implementar
el método de esta invención usando dos discos de papel absorbente,
uno que lleva la resazurina y el otro el medio de crecimiento. Esta
opción evita las interacciones entre estos dos constituyentes
químicos de ensayo en el proceso de formación de los módulos de
ensayo en los pocillos, y especialmente durante el secado de los
discos.
Las Fig. 13 a 16 ilustran la aplicación de los
principios de esta invención en un aparato de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa, es decir, el ensayo de la
susceptibilidad cualitativa de un microorganismo para la inhibición
del crecimiento por un producto antimicrobiano, utilizando un
protocolo de ensayo de la susceptibilidad cualitativa
preestablecido que implica una primera y una segunda cantidades del
producto antimicrobiano. Un panel de ensayo 200 define un pocillo
testigo de crecimiento negativo 201, un pocillo testigo de
crecimiento positivo 202, y un par de pocillos de ensayo 203 y 204.
Un módulo de ensayo 205 es portado en cada uno de los pocillos
testigo de crecimiento. Los módulos de ensayo 206 y 207 son
portados en el par de pocillos de ensayo.
La Fig. 13 ilustra la forma preferida de la
invención, en la que los módulos de ensayo tienen todos los
constituyentes químicos del conjunto de productos químicos de
ensayo de los mismos, pero se ha de entender que los productos
químicos de ensayo se pueden dividir entre los módulos de ensayo y
los volúmenes de líquido de rehidratación como se describió con
anterioridad. La Fig. 13 ilustra también el uso de un disco de
papel absorbente individual como medio portador formando la base de
cada módulo de ensayo, pero ha de entenderse que también podría
usarse cualquiera de las formas de módulos de ensayo anteriormente
discutidas en el aparato para el ensayo de la susceptibilidad
cualitativa de acuerdo con esta invención.
Cada módulo de ensayo se etiqueta, según su
contenido, con R para resazurina, B para tampón (Buffer), G
para medio de crecimiento (Growth) y S para estabilizante
redox (Stabilizer). Además, el módulo de ensayo 206 contiene
una primera cantidad del producto antimicrobiano denominada Al y el
módulo de ensayo 207 contiene una segunda cantidad del producto
antimicrobiano denominada A2. Para esta memoria descriptiva, se
considerará A2 como la más elevada de las dos concentraciones de
producto antimicrobiano en el protocolo de ensayo de la
susceptibilidad cualitativa.
El módulo de ensayo 201 en el pocillo testigo de
crecimiento negativo es rehidratado con un volumen de la porción de
líquido de rehidratación 208 que forma parte de un sistema global
de inoculación 210. Cada uno de los módulos de ensayo 205, 206 y
207 está adaptado para ser rehidratado con un volumen de líquido de
rehidratación, junto con una suspensión del microorganismo para
formar el inóculo para esos pocillos. Después de la rehidratación,
el panel de ensayo 200 se pone en un incubador durante un periodo
de tiempo de incubación preestablecido asociado con un protocolo de
lectura previamente elegido que se usará con el panel.
Las Fig. 14 a 16 ilustran el protocolo de
lectura de luz visible para el panel de ensayo 200. Se ha de
entender que todos los protocolos de lectura manual y automática
descritos anteriormente podrían ser aplicados a la lectura del
panel 200.
Con referencia de nuevo a las Fig. 4 a 6, se ha
de entender que el color de pre-incubación en todos
los pocillos del panel de ensayo es azul. También se aplican los
mismos ensayos de cualificación de la lectura del panel, usando el
pocillo testigo de crecimiento negativo y el pocillo testigo de
crecimiento positivo. Estos no se repiten aquí para evitar la
reiteración, y en esta memoria descriptiva se supone que el panel
ha pasado los ensayos de cualificación para una lectura precisa,
mostrando color azul el pocillo testigo de crecimiento negativo y
color rojo el pocillo testigo de crecimiento positivo.
En la Fig. 14, el panel 200A muestra color rojo
en los dos pocillos de ensayo 203 y 204, lo que indica crecimiento
del organismo en ambos pocillos. El correspondiente resultado de
este ensayo de la susceptibilidad cualitativa es que el
microorganismo ensayado es resistente, es decir, no es susceptible
a la inhibición del crecimiento por la concentración más elevada A2
del producto antimicrobiano del pocillo de ensayo 207. En la Fig.
15, el panel 200B muestra color rojo en el pocillo de ensayo 203,
indicativo de crecimiento del organismo, pero color azul en el
pocillo de ensayo 204, indicativo de la inhibición del crecimiento.
En este caso el resultado es indeterminado ya que el microorganismo
no es sensible ni resistente. El uso del término
"indeterminado" no debe ser malinterpretado como ensayo que
falla en cuanto a dar información acerca de la susceptibilidad
cualitativa del microorganismo. Este resultado del ensayo significa
simplemente que el organismo no es altamente susceptible ni
altamente resistente, y esto da el médico consultor una indicación
de que puede conseguirse éxito con una farmacoterapia con el
producto antimicrobiano, en concentraciones razonablemente
elevadas.
En la Fig. 16, el panel 200C muestra color azul
en los dos pocillos de ensayo 203 y 204, indicativo de inhibición
del crecimiento del microorganismo en ambos pocillos. El
correspondiente resultado del ensayo es "susceptible", que
indica que el microorganismo puede ser inhibido en su crecimiento
por concentraciones relativamente bajas de producto
antimicrobiano.
Las Fig. 17 a 19 ilustran la aplicación de los
principios de esta invención en un aparato para el ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa, es decir, el ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa de un microorganismo para la inhibición
del crecimiento por un producto antimicrobiano, utilizando un
protocolo de ensayo de la susceptibilidad cuantitativa
preestablecido, que implica N cantidades diferentes de un producto
antimicrobiano, siendo N mayor que dos, típicamente seis o más. La
actual norma de la FDA para el ensayo de la susceptibilidad
cuantitativa es un mínimo de cinco diluciones del producto
antimicrobiano, cubriendo cierta porción del intervalo de
dosificación terapéutica
humana.
humana.
El panel de ensayo 230 define un pocillo testigo
de crecimiento negativo 231, un pocillo testigo de crecimiento
positivo 232, y, en este caso, cuatro pocillos de ensayo 233 a 236.
Se usan aquí cuatro pocillos de ensayo por razón de comodidad al
hacer la ilustración. El uso de un mayor número de pocillos de
ensayo se discutirá más adelante en relación con equipos para
ensayo que incorporan los principios del ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa de esta invención. Un módulo de ensayo
237 es portado en cada uno de los pocillos testigo de crecimiento.
Cuatro módulos de ensayo diferentes 238 a 241 son portados en los
cuatro pocillos de ensayo. Al igual que con la anterior descripción
del ensayo de la susceptibilidad cualitativa, estos módulos de
ensayo ilustran la forma preferida de la invención usando un único
medio portador en forma de un disco de papel absorbente con todos
los constituyentes del conjunto de productos químicos de ensayo
portados en cada uno de los módulos de ensayo, y portando también
los módulos de ensayo de los pocillos de ensayo cuatro cantidades
diferentes del producto antimicrobiano, a saber Al a A4. Para los
fines de esta memoria descriptiva, se considerará que las
cantidades del producto antimicrobiano crecen de Al a A4. Se ha de
entender que también podría usarse aquí cualquiera de las formas
alternativas de la invención, como se describió antes en relación
con las Fig. 9 a 12.
El módulo de ensayo 231 se rehidrata con un
volumen de líquido de rehidratación 242, que forma una porción de
un sistema global de inoculación 245. Cada uno de los módulos de
ensayo en los otros pocillos se rehidrata con un volumen de líquido
de rehidratación al que ha sido añadido uno de los microorganismos
con volúmenes de inoculación individuales 246 a 250 para los
pocillos. Una forma específica de sistema de inoculación se
describirá más adelante en relación con una realización de un
equipo para ensayos de esta invención. Después de la rehidratación
y la inoculación, el panel 230 se pone en un incubador durante un
periodo de tiempo de incubación preestablecido, asociado con un
protocolo de lectura previamente elegido, que se usa con el
panel.
Las Fig. 18 a 19 ilustran un protocolo de
lectura de luz visible para el panel de ensayo 230. Se ha de
entender que todos los protocolos de lectura manual y automática
descritos anteriormente podrían aplicarse a la lectura del panel
230.
Con referencia de nuevo a las Fig. 4 a 6, se ha
de entender que el color de pre-incubación en todos
los pocillos del panel de ensayo es azul. También se aplican los
mismos ensayos de cualificación de la lectura del panel usando el
pocillo testigo de crecimiento negativo y el pocillo testigo de
crecimiento positivo. Estos no se repiten aquí para evitar la
reiteración, y en esta memoria descriptiva se supone que el panel
ha pasado los ensayos de cualificación para una lectura precisa,
mostrando color azul el pocillo testigo de crecimiento negativo y
color rojo el pocillo testigo de crecimiento
positivo.
positivo.
Como se muestra en la Fig. 18, el panel 230A
muestra un desplazamiento del color del azul al rojo en cada uno de
los tres primeros pocillos 233 a 235, indicativo del crecimiento
del microorganismo en cada uno de estos pocillos de ensayo. El
pocillo de ensayo 236 muestra el color azul original, indicativo de
la ausencia de crecimiento del microorganismo en ese pocillo de
ensayo. El resultado del ensayo obtenido de esta lectura es que la
MIC del producto antimicrobiano usado en el panel de ensayo es la
concentración A4. Se ha de entender que la concentración A4 se
refiere tanto a la cantidad de producto antimicrobiano en el módulo
de ensayo como a la concentración del producto antimicrobiano en la
solución de ensayo final, después de la inoculación y la
rehidratación de los productos químicos de
ensayo.
ensayo.
Como se muestra en la Fig. 19, el panel 230B
muestra un desplazamiento del color del azul al rojo solamente en
el primer pocillo 233, y el color azul original está presente en los
otros tres pocillos de ensayo 234 a 236. Esto indica crecimiento
del microorganismo solamente en el primer pocillo de ensayo, e
inhibición del crecimiento en los otros tres, para un valor de MIC
resultante de A2. A2 es el valor de la MIC, ya que el ensayo
muestra A2 como la concentración más baja de producto
antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microorganismo.
Las Fig. 20 a 23 ilustran equipos para el ensayo
de la susceptibilidad cualitativa de acuerdo con esta invención, y
también muestran cómo se usan los componentes de los equipos para
ensayo al llevar a cabo el método de esta invención. Para
completar, la Fig. 20 muestra una placa de cultivo primaria 255
sobre la cual crecen colonias del microorganismo que se ensaya,
pero esta placa de cultivo primaria no se considera como una parte
del equipo para ensayo de esta invención. Los componentes del
equipo para ensayo 260 mostrados en la Fig. 20A son un recipiente
261 de líquido de rehidratación, una bandeja 262 de preparación del
inóculo, un sistema inoculador 263, y un panel de ensayo 264, en el
que los pocillos de ensayo son precargados con módulos de ensayo
apropiados, como se describieron anteriormente.
El líquido de rehidratación del recipiente 261
contiene el subconjunto de productos químicos de ensayo TCB2 que no
están en los módulos de ensayo en los pocillos del panel 264, como
se describió anteriormente. En la realización preferida, todos los
productos químicos de ensayo del conjunto están en los módulos de
ensayo, y el líquido de rehidratación es un líquido estéril
previamente elegido, tal como agua destilada. También puede
comprender solución de cloruro sódico al 0,9 por ciento y puede
incluir una diversidad de agentes humectantes para ayudar a
producir una suspensión de los microorganismos uniforme.
La bandeja 262 de preparación del inóculo puede
estar conformada con una forma conveniente para la mezcladura del
líquido de rehidratación con microorganismos procedentes de la
colonias que crecen en la placa de cultivo primaria, para formar el
inóculo para el pocillo testigo de crecimiento positivo y los
pocillos de ensayo T1 y T2. La configuración de la bandeja de
preparación del inóculo necesita ser adaptada a la estructura y al
funcionamiento del sistema inoculador 263. El sistema inoculador
263 puede comprender un sistema de pipeteador de puntas múltiples
estándar, o puede estar diseñado especialmente para distribuir
inóculo en los pocillos del panel de ensayo. Como se ha indicado,
el sistema inoculador incluye un medio inoculador para distribuir
líquido de rehidratación en el pocillo testigo de crecimiento
negativo, y medios para distribuir inóculo en el pocillo testigo de
crecimiento
positivo.
positivo.
El panel de ensayo 264 lleva módulos de ensayo
precargados, como se ha indicado, usando dos pocillos de ensayo
para el ensayo de la susceptibilidad cualitativa un sólo producto
antimicrobiano, en este caso. El equipo para ensayo se denomina
QLS-1-A, indicando ensayo de la
susceptibilidad cualitativa con un producto antimicrobiano. La Fig.
21 ilustra un panel de ensayo 275 precargado, útil para la
susceptibilidad cualitativa de un microorganismo, que usa M
productos antimicrobianos diferentes con un par de pocillos de
ensayo asociados con cada producto antimicrobiano y precargados con
módulos de ensayo que tienen concentraciones apropiadas del
producto antimicrobiano. Como se indica en la Fig. 21, cada uno de
los módulos de ensayo es preferentemente un simple disco de papel
absorbente que está marcado con una leyenda legible visualmente,
que expresa el nombre del producto antimicrobiano que está en el
módulo de ensayo, y la concentración en el mismo de ese producto
antimicrobiano. La designación Al representa el nombre del primer
producto antimicrobiano impreso en el disco, y la designación K1
representa la concentración impresa en el disco.
La Fig. 20B ilustra un equipo de ensayo 270
denominado QLS-1-B, en el que se usa
un panel de ensayo 274 vacío en vez de un panel de ensayo
precargado como en el equipo 260. Otros componentes del equipo 270
comprenden un distribuidor 271 de módulos de ensayo testigos de
crecimiento, para distribuir módulos de ensayo TMA 272 en el
pocillo testigo de crecimiento negativo y en el pocillo testigo de
crecimiento positivo del panel 274, y un distribuidor 273 de
módulos de ensayo AP para distribuir módulos de ensayo TMB1 y TMB2
en los pocillos de ensayo T1 y T2. El distribuidor 273 almacena los
dos diferentes módulos de ensayo de una manera intercalada
alternada, de forma que dos actuaciones secuenciales del mecanismo
de distribución de los discos intervienen en la carga de los dos
pocillos de ensayo. Los distribuidores 271 y 273 pueden ser
distribuidores de discos de antibióticos estándar cargados con
módulos de ensayo de acuerdo con esta invención, en forma de discos
de papel absorbente. Como alternativa al distribuidor simple de
discos intercalados mostrado en la Fig. 20B, será evidente que
podrían emplearse dos distribuidores distintos, almacenando y
distribuyendo cada uno de ellos uno de los módulos de ensayo AP en
un pocillo de ensayo asociado. También se ha de entender que el
equipo 270 puede comprender una diversidad de paneles de ensayo 274
para ir con los distribuidores que son capaces de distribuir
módulos de ensayo en un cierto número de paneles de
ensayo.
ensayo.
El panel de ensayo 274 está configurado para el
ensayo con un producto antimicrobiano. Como se muestra en la Fig.
22, en los equipos para ensayo de esta invención podría emplearse
también un panel de ensayo 276 que define un pocillo testigo de
crecimiento negativo, un pocillo testigo de crecimiento positivo, y
una diversidad de pares de pocillos de ensayo para una diversidad
de productos antimicrobianos. Para cargar el panel de ensayo 276,
se emplean un distribuidor del tipo 271 para los pocillos testigos
del crecimiento, y un distribuidor del tipo 273 para cada uno de
los productos antimicrobianos, para cargar los pocillos de ensayo
para cada producto antimicrobiano. Para el panel de ensayo 276,
sería preferible proporcionar un distribuidor de módulos de ensayo
que fuese capaz de cargar una fila completa de pocillos a la
vez.
La Fig. 23 ilustra que los equipos de ensayo de
esta invención para el ensayo de la susceptibilidad cualitativa de
un microorganismo frente a múltiples productos antimicrobianos,
puede utilizar un panel 277 que incluye tanto una sección del panel
precargada como una sección del panel cargable. Un equipo de ensayo
con este tipo de panel de ensayo combina la comodidad de los
pocillos de ensayo precargados para productos antimicrobianos que
se usan convencionalmente en prácticamente todas las situaciones de
ensayo, con la flexibilidad de productos antimicrobianos elegidos
por el usuario con el fin de personalizar una porción del panel de
ensayo con productos antimicrobianos preparados a medida de las
necesidades del usuario, en relación con situaciones de ensayo
concretas. Los equipos de ensayo con pocillos de ensayo cargables
son especialmente ventajosos en cuanto a proporcionar la
posibilidad de configurar paneles de ensayo que incluyan productos
antimicrobianos más modernos a medida que se desarrollan, sin
esperar a que tales productos antimicrobianos sean incluidos en
paneles precargados del fabri-
cante.
cante.
Las Fig. 24 a 29 ilustran equipos de ensayo de
la susceptibilidad cuantitativa de acuerdo con esta invención. Con
referencia a la Fig. 24A, el equipo de ensayo 280 ilustrado en la
misma comprende un recipiente 281 de líquido de rehidratación, una
bandeja 282 de preparación de inóculo, un sistema inoculador 283 y
un panel de ensayo 284 precargado. La forma y la función de estos
componentes del equipo de ensayo son generalmente las mismas que
las de los correspondientes componentes ya descritos en relación
con el equipo de ensayo en la Fig. 20A, y no es preciso repetir
aquí la descripción.
La Fig. 24B ilustra un equipo de ensayo 290
similar al equipo 280 de la Fig. 24A, pero que emplea un panel de
ensayo 294 vacío y que incluye distribuidores 291 y 293 de módulos
de ensayo. El distribuidor 291 distribuye módulos de ensayo
testigos de crecimiento, en los pocillos testigos de crecimiento
del panel 294. El distribuidor 293 distribuye módulos de ensayo AP
en los pocillos de ensayo del panel 294. Como se ha indicado, el
distribuidor 293 tiene los módulos de ensayo para los cuatro
pocillos de ensayo apilados por orden, de forma que se usan cuatro
actuaciones secuenciales del distribuidor para distribuir cuatro
módulos de ensayo diferentes en forma de discos en los cuatro
pocillos de ensayo. La Fig. 25 ilustra la alternativa de usar
cuatro distribuidores distintos 295 a 298, conteniendo cada uno de
ellos un tipo individual de módulo de ensayo AP con una sola
concentración de producto antimicrobiano en el mismo. Estos cuatro
distribuidores pueden hacerse funcionar individualmente, o pueden
combinarse en un sistema global de distribución que mantiene a los
cuatro distribuidores en posición para distribuir cuatro discos al
mismo tiempo, y tiene un único mecanismo actuador que hace
funcionar al cursor de distribución en cada distribuidor al mismo
tiempo.
La Fig. 26 ilustra un panel de ensayo precargado
300, que define un pocillo testigo de crecimiento negativo, un
pocillo testigo de crecimiento positivo y una matriz de M columnas
por N filas de pocillos de ensayo, con cada columna asociada a un
producto antimicrobiano, de una diversidad de ellos, y estando
precargado con módulos de ensayo que tienen productos
antimicrobianos apropiados y diferentes concentraciones, como se ha
indicado.
La Fig. 27 ilustra un correspondiente panel de
ensayo cargable 301, que tiene la misma capacidad de ensayo global.
Como se indica en la Fig. 28, para cargar el panel de ensayo 301
pueden usarse M distribuidores individuales 302 a 306, teniendo
cada uno un apilamiento secuencial de módulos de ensayo AP
asociados con productos antimicrobianos seleccionables por el
usuario.
La Fig. 29 ilustra un panel de ensayo 310 que
tiene una matriz de M1 por N de pocillos de ensayo precargados, y
una matriz de M2 por N de pocillos de ensayo cargables. Los
distribuidores de módulos de ensayo indicados en la Fig. 28 pueden
usarse para distribuir módulos de ensayo AP en la sección de
pocillos de ensayo cargables del panel 310. El panel de ensayo 310
proporciona las mismas ventajas en el área del ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa que el panel de ensayo 277 para el
área de ensayo de la susceptibilidad cualitativa, como se describió
anterior-
mente.
mente.
Los paneles de ensayo de pocillos múltiples
usados en relación con esta invención están formados
preferentemente a partir de un material plástico opaco blanco.
Tales paneles permiten el uso de menores concentraciones de
resazurina, tanto para la lectura de luz visible como para la de
fluorescencia. Las concentraciones de resazurina más bajas resultan
menos tóxicas para los microorganismos, y de esta forma se reduce
al mínimo la influencia potencial de la resazurina sobre los
resultados del ensayo. La intensidad de la luz reflejada por las
paredes blancas del panel hace aumentar la señal disponible en
ambas lecturas, de luz visible y de fluorescencia. El panel blanco
proporciona un fondo de lectura uniforme que elimina cualquier
necesidad de equipo de iluminación de fondo para leer el panel, y
tiene por resultado unas interpretaciones visuales más consistentes
y precisas. Con el fondo blanco pueden distinguirse diferencias de
color más pequeñas. Pueden fabricarse paneles blancos con
materiales plásticos y con una tecnología de conformación de
paneles plásticos más baratos, dado que no es un requisito la
claridad óptica.
Si esta invención se utiliza en paneles
congelados, los pocillos de ensayo pueden ser simplemente
inoculados con dispositivos de transferencia de inóculos de puntas
múltiples que transfieren un pequeño volumen (5-10
ml) desde una siembra de inóculo a cada pocillo de ensayo del
panel.
Si esta invención se usa en paneles secos, hay
dos planteamientos opcionales para la inoculación. Todos los
pocillos del panel pueden ser rehidratados primero con un volumen
de líquido de rehidratación que no contiene microorganismos.
Después se realiza la inoculación de los pocillos de ensayo como se
describió anteriormente en relación con el panel congelado.
Alternativamente, la rehidratación y la
inoculación pueden hacerse simultáneamente poniendo primero una
concentración preestablecida del microorganismo en el líquido de
rehidratación y distribuyendo después un volumen constante de este
líquido de inóculo en cada pocillo de ensayo. Esto puede hacerse
con un pipeteador de punta única, un pipeteador de puntas
múltiples, o con un sistema especial de suministro diseñado para el
cliente con este
fin.
fin.
La forma preferida de esta invención implica
poner todos los componentes del conjunto de productos químicos de
ensayo, es decir resazurina, medio de crecimiento, tampón (si se
necesita), y estabilizante redox, en un módulo de ensayo en los
módulos de ensayo del panel. Para simplificar la presente memoria
descriptiva global, la discusión de los procesos para preparar los
módulos de ensayo y los paneles que incorporan los módulos de
ensayo se limitará a esta opción.
Para incorporar el método y el aparato de esta
invención en paneles de ensayo congelados, la resazurina, junto con
componentes estabilizantes apropiados del grupo de productos
químicos de ensayo, se distribuyen en los pocillos de ensayo, junto
con el medio de crecimiento y con las diluciones de producto
antimicrobiano, o por separado.
El proceso de formar módulos de ensayo en
paneles secos es el mismo que para los paneles congelados, excepto
que los constituyentes químicos de ensayo se secan en los pocillos
para formar un módulo de ensayo en forma de un volumen sólido seco
sobre las paredes de los propios pocillos. El secado puede hacerse
con aire forzado o bajo vacío. La formulación de los componentes
químicos de ensayo es más crítica cuando el módulo de ensayo está
en forma seca, ya que las concentraciones de resazurina, producto
antimicrobiano y medio de crecimiento, se hacen muy elevadas a
medida que el secado se acerca a su finalización. El adecuado
tamponamiento del pH de la solución, y la estabilización de la
acción reductora del medio de crecimiento son importantes bajo
estas circunstancias. Las formulaciones químicas descritas más
adelante para ser usadas en el proceso de fabricación de módulos de
ensayo en forma de discos de papel absorbente, se usan
preferentemente en paneles secos para reducir el volumen de
líquido, en los pocillos de ensayo, que ha de ser secado.
Hay varias opciones que pueden emplearse para
fabricar discos de papel con los componentes del conjunto de
productos químicos de ensayo capturados en forma seca en el disco.
Generalmente, para fabricar grandes volúmenes, las láminas de medio
de discos de papel, previamente impresas con la leyenda que
identifica el producto antimicrobiano y la concentración, se
impregnarán por lotes con la solución química de ensayo, se secarán
y después se cortarán en discos y se envasarán. En el caso del
envasado de discos de diluciones en serie apilados, los montones de
medio de papel con las diferentes concentraciones del producto
antimicrobiano se cortan preferentemente en forma de discos en una
operación, y después se envasan.
Para fabricar discos en pequeños volúmenes,
pueden emplearse los procedimientos siguientes. Se aporta un
volumen de la solución de carga de discos. Dado que los discos de
papel son capaces de retener solamente 25 microlitros de la
solución, y el volumen final del líquido de rehidratación en los
pocillos de ensayo es convenientemente 100 microlitros, se usa una
concentración de los productos químicos de ensayo de cuatro veces,
en la solución de carga de los discos.
Específicamente, se prepara la siguiente
solución de carga de los discos. La solución portadora básica es
tampón de fosfato de pH 7,4 en concentración 0,1 molar. El medio de
crecimiento, que es caldo Mueller-Hinton estándar
en forma de polvo seco, se añade a razón de 88,0 gramos por litro.
Se añade resazurina hasta alcanzar una concentración de 0,02 gramos
por litro. Se añade ferrocianuro potásico para servir como
estabilizante redox, a una concentración de 0,004 molar. Esta
solución se usa después como diluyente para el producto
antimicrobiano a incluir en el disco del módulo de ensayo. La
concentración inicial del producto antimicrobiano es por tanto
cuatro veces la concentración final deseada en el pocillo testigo
después de la rehidratación, pero se ajusta para corregir la unión
irreversible del producto antimicrobiano al disco. En otras
palabras, cuando se rehidratan los productos químicos de ensayo
secos en el disco, en el líquido de rehidratación no entra la
cantidad completa de producto antimicrobiano. El producto
antimicrobiano unido en el disco no es activo contra el
microorganismo.
La concentración de resazurina se elige para que
produzca un color inicial azul brillante para tener un elevado
contraste visual entre el crecimiento positivo y el negativo del
microorganismo. Una concentración de resazurina más alta tendría
una mayor toxicidad para algunos microorganismos y disminuiría o
retrasaría el cambio de color distinguible visualmente en respuesta
al crecimiento del microorganismo. Concentraciones de resazurina más
bajas tendrían por resultado un escaso contraste entre las
reacciones de los pocillos de ensayo positivos y negativos, es
decir, el color de los pocillos en los que el microorganismo está
creciendo en pequeña medida no sería tan fácilmente distinguible
como un cambio de color. Todas estas afirmaciones se refieren a la
lectura visual de los paneles de ensayo, y la concentración de
resazurina es menos crítica para los protocolos de lectura de la
excitación de fluo-
rescencia.
rescencia.
La concentración de medio de crecimiento es la
concentración estándar usada en estos tipos de paneles de ensayo, y
no hay razones para cambiarla. Una disminución de la concentración
haría disminuir las velocidades de crecimiento, y un aumento no
haría aumentar la velocidad de crecimiento sino que exacerbaría la
tendencia a la autorreducción del medio de crecimiento durante la
incubación y el secado. Se ha de entender que podrían usarse
también otras formulaciones de medios de crecimiento distintas del
medio de Mueller-Hinton estándar, pero han de
cumplir las características de comportamiento del caldo de
Mueller-Hinton ahora estándar.
El tampón se usa en concentraciones suficientes
para evitar desplazamientos del pH y la falta de uniformidad del
color entre pocillos de ensayo o módulos de ensayo que acompaña a
tales desplazamientos, debido a altas concentraciones de productos
ácidos antimicrobianos, especialmente durante el proceso de secado.
Se usa el pH 7,4 porque es el pH recomendado para el caldo de
Mueller-Hinton cuando se usa en esta aplicación. La
concentración de tampón se mantiene al mínimo requerido para
proporcionar la estabilidad del pH, especialmente durante el
secado. Se ha de evitar una concentración molar excesivamente
elevada porque puede retrasar la reducción de la resazurina a
resorufina y afectar adversamente a la consistencia de los
resultados del ensayo.
El estabilizante redox se utiliza en
concentración suficiente para reprimir la autorreducción de la
resazurina durante los procesos de secado e incubación hasta
niveles aceptables. Se eligió el ferrocianuro potásico por su
relativamente baja toxicidad hacia los microorganismos, y su
capacidad de estabilización en el intervalo de potencial de
oxidación/reducción apropiado. La concentración se elige evitando la
excesiva estabilización de la reacción de oxidación/reducción
debida al crecimiento del microorganismo, ya que esto retardaría
y/o afectaría adversamente a la precisión de los resultados del
ensayo.
El proceso de carga de la solución de carga de
los discos en los discos implica tratamiento aséptico usando
materias primas estériles. Un grupo de discos se pone en una capa
individual, sin tocarse los bordes, en un recipiente plano estéril
que pueda ser tapado, tal como una placa Petrie con tapa. Se usa
una micropipeta para distribuir 25 mililitros de la solución de
carga de los discos en cada disco.
Después se tapa el recipiente y se le pone en un
congelador a -70ºC durante la noche. Después se pasa el recipiente a
una cámara de liofilización y se secan los discos bajo vacío. A
continuación se sacan, se ponen en frascos con tapón que contienen
una cápsula desecante y se almacenan en un entorno refrigerado
oscuro.
Para cargar los discos en receptáculos de
ensayo, los discos se transfieren individualmente de una forma
aséptica. Se ha de entender que este método puede ser usado para la
producción de pequeños volúmenes de paneles de ensayo para su uso
en ensayos clínicos y similares, pero que, para fabricar grandes
cantidades de paneles de ensayo precargados, se emplearía la
producción de discos automatizada a gran escala y la tecnología
para la carga automatizada de
paneles.
paneles.
La Fig. 30 ilustra los componentes generales
empleados en un sistema de lector automático para la lectura de
paneles de ensayo, que incorpora los métodos y aparatos de esta
invención, usando el protocolo de lectura de luz visible o bien el
protocolo de lectura de excitación de fluorescencia. Después de la
incubación, el panel de ensayo se pone en una mesa de exploración
que sitúa a cada pocillo de ensayo en posición para ser leído por
la fuente y el detector de lectura, junto con el sistema
electrónico del lector. Los datos del sistema electrónico del
lector son comunicados preferentemente a un ordenador de análisis
de datos, en el que los algoritmos del protocolo de lectura
asociado se aplican a los datos de cada pocillo del panel de
ensayo.
La Fig. 31 muestra que, en el caso de la lectura
de reflectancia de luz visible para implementar un protocolo de
lectura de luz visible, puede usarse un solo filtro para la
selección de la longitud de onda de lectura que se utilizará para
determinar las características del color reflejado del líquido del
pocillo de ensayo. También podría usarse, si se desea, el análisis
de longitudes de onda múltiples. La Fig. 32 ilustra que, en el caso
de la lectura de excitación de fluorescencia para implementar un
protocolo de lectura de excitación de fluorescencia, se emplean
filtros distintos para seleccionar la longitud de onda de
excitación y la longitud de onda de emisión. Tanto la lectura de
luz visible del color reflejado, como la lectura de fluorescencia,
pueden ser implementadas con instrumentos que en la actualidad están
disponibles comercialmente y que son conocidos por las personas
familiarizadas con esta
tecnología.
tecnología.
La Fig. 33 ilustra que la lectura de excitación
de fluorescencia del crecimiento de microorganismos, usando la
reacción redox de la resazurina de acuerdo con esta invención,
proporciona datos generalmente comparables a la lectura
fluorogénica usada en los sistemas de detección rápida del
crecimiento de microorganismos de la técnica anterior, en casos en
los que el microorganismo en particular está bien adaptado para la
detección por el sistema fluorogénico de detección. La opción de
lectura de excitación de fluorescencia de esta invención será
superior a la lectura fluorogénica de la técnica anterior, para
microorganismos que no son fácilmente detectados por tales métodos
de la técnica anterior.
La Fig. 34 muestra los datos obtenidos a partir
de la lectura de emisión de fluorescencia del crecimiento de una
diversidad de microorganismos, e ilustra la aplicabilidad general
del método de esta invención a la determinación rápida del
crecimiento usando un protocolo de lectura de excitación de
fluorescencia. Las gráficas muestran la detección de cantidades
significativas de resorufina debida al crecimiento de
microorganismos, dentro de un periodo de tiempo de incubación de
cuatro a seis horas. El diseño de un protocolo de lectura de
excitación de fluorescencia en particular y los algoritmos de ensayo
y decisión asociados con el mismo, implica la recogida de datos
acerca de varios microorganismos que producen respuestas conocidas,
y después la construcción de los algoritmos de ensayo y de
decisión, de forma que puede ser detectado el crecimiento o el no
crecimiento de organismos desconocidos con un elevado nivel de
confianza. Los expertos en esta técnica están familiarizados con
los diversos métodos para diseñar y construir tales protocolos de
lectura, y la implementación de los mismos en conexión con esta
invención implica una aplicación directa de recogida de datos y
principios de generación de protocolos
conocidos.
conocidos.
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Claims (36)
1. Un método para ensayar la susceptibilidad de
un microorganismo para la inhibición del crecimiento mediante una
concentración previamente elegida de un producto antimicrobiano,
que comprende las etapas de:
- a.
- disponer en cada uno de un receptáculo testigo de crecimiento negativo y un receptáculo testigo de crecimiento positivo, una concentración preestablecida de un medio de crecimiento para microorganismos y una concentración preestablecida de resazurina, predeterminada para que esté en un intervalo de concentración caracterizado por la baja toxicidad para los microorganismos y la sustancial sensibilidad a la reducción a resorufina por productos metabólicos del crecimiento del microorganismo; y un estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho medio de crecimiento durante la etapa (g);
- b.
- disponer en dicho receptáculo testigo de crecimiento positivo una concentración preestablecida de dicho microorganismo;
- c.
- disponer en un receptáculo de ensayo dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano;
- d.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de resazurina; y un estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho medio de crecimiento durante la etapa (g);
- e.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de medio de crecimiento;
- f.
- disponer en dicho receptáculo de ensayo dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo;
- g.
- incubar la totalidad de dichos receptáculos juntos, durante un periodo de tiempo de incubación asociado con un protocolo de lectura previamente elegido, que comprende uno entre un protocolo de lectura de luz visible o un protocolo de lectura de excitación de fluorescencia; y
- h.
- después de dicho periodo de tiempo de incubación, leer dichos receptáculos de acuerdo con dicho protocolo de lectura previamente elegido, para determinar la presencia o ausencia de crecimiento de dicho microorganismo en dicho receptáculo de ensayo, sobre la base de las concentraciones relativas de resazurina y resorufina en el mismo, incluyendo dicho protocolo de lectura de luz visible un algoritmo de decisión basado en al menos una combinación funcional predeterminada del color de reflectancia de la luz visible detectado en cada uno de dichos receptáculos, incluyendo dicho protocolo de lectura de excitación de fluorescencia un algoritmo de decisión basado en al menos una combinación funcional predeterminada, de los valores de la señal de emisión de fluorescencia producida por el producto de reacción resorufina en cada uno de dichos receptáculos.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dichas etapas c. a f. se llevan a cabo:
- j1)
- formando en dicho receptáculo de ensayo un módulo de ensayo que comprende un volumen sólido seco de una cantidad preestablecida de dicho producto antimicrobiano y un volumen sólido seco de un subconjunto previamente elegido de los constituyentes de un conjunto de productos químicos de ensayo, que comprende dicha resazurina y dicho medio de crecimiento; y
- j2)
- distribuyendo en dicho pocillo de ensayo un volumen de líquido que tiene dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo, y todos los constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de ensayo que no están en dicho módulo de ensayo, para rehidratar dicho módulo de ensayo antes de llevar a cabo dicha etapa g.
3. El método según la reivindicación 2a, en el
que dicho conjunto de productos químicos de ensayo incluye un
tampón previamente elegido para controlar el pH final de la
solución química de ensayo rehidratada, y un estabilizante redox
previamente elegido, caracterizado por la disminución
sustancial de la reducción de la resazurina por dicho medio de
crecimiento durante la etapa g.
4. El método según la reivindicación 3a, en el
que dicha etapa j1) se lleva a cabo:
- k1)
- distribuyendo sobre un medio portador un volumen preestablecido de líquido que tiene dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano, dicha concentración preestablecida de resazurina, dicho tampón previamente elegido y dicho estabilizante redox previamente elegido,
- k2)
- secando dicho medio portador para capturar en el mismo dicho producto antimicrobiano, dicha resazurina, dicho tampón y dicho estabilizante redox, en forma de componentes sólidos secos; y
- k3)
- poniendo dicho medio portador en dicho receptáculo de ensayo, bien sea antes o después de llevar a cabo dichas etapas k1) y k2),
y dicha etapa j2) se lleva a cabo
- l1)
- distribuyendo en dicho receptáculo de ensayo un volumen de líquido que tiene dicha concentración preestablecida de dicho medio de crecimiento y dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo, para rehidratar dichos componentes sólidos secos en dicho medio portador.
5. El método según la reivindicación 3a, en el
que dicha etapa jl) se lleva a cabo
- k1)
- distribuyendo en un medio portador un volumen preestablecido de líquido que tiene dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano, dicha concentración preestablecida de dicha resazurina, dicha concentración preestablecida de dicho medio de crecimiento, dicho tampón previamente elegido y dicho estabilizante redox previamente elegido,
- k2)
- secando dicho medio portador para capturar en el mismo dicho producto antimicrobiano, dicha resazurina, dicho tampón y dicho estabilizante redox, en forma de componentes sólidos secos; y
- k3)
- poniendo dicho medio portador en dicho receptáculo de ensayo, bien sea antes o después de llevar a cabo dichas etapas k1) y k2),
y dicha etapa j2) se lleva a cabo
- l1)
- distribuyendo en dicho receptáculo de ensayo un volumen de líquido que comprende dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo, para rehidratar dichos componentes sólidos secos en dicho medio portador.
6. El método según la reivindicación la, en el
que dicha etapa a. se lleva a cabo
- j1)
- distribuyendo en cada uno de un par de medios portadores un volumen preestablecido de líquido que tiene dicha concentración preestablecida de dicha resazurina, dicha concentración preestablecida de dicho medio de crecimiento, un tampón previamente elegido, y un estabilizante redox previamente elegido, teniendo dicho tampón previamente elegido una concentración preestablecida para controlar el pH de dicho líquido;
- j2)
- secando cada uno de dichos medios portadores para capturar en los mismos dicha resazurina, dicho medio de crecimiento, dicho tampón y dicho estabilizante redox en forma de componentes sólidos secos;
- j3)
- poniendo uno de dichos medios portadores en cada uno de dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo y de dicho receptáculo testigo de crecimiento positivo, bien sea antes o después de llevar a cabo dichas etapas jl) y j2); y
- j4)
- distribuyendo en dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo un volumen de líquido estéril, para rehidratar dichos componentes sólidos secos;
y las etapas c., d. y e. se llevan a cabo
- k1)
- distribuyendo en dicho medio portador un volumen preestablecido de líquido que tiene dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano, dicha concentración preestablecida de dicha resazurina, dicha concentración preestablecida de dicho medio de crecimiento, dicho tampón previamente elegido y dicho estabilizante redox previamente elegido,
- k2)
- secando dicho medio portador para capturar en el mismo dicho producto antimicrobiano, dicha resazurina, dicho medio de crecimiento, dicho tampón y dicho estabilizante redox, en forma de componentes sólidos secos;
- k3)
- poniendo dicho medio portador en dicho receptáculo de ensayo, bien sea antes o después de llevar a cabo dichas etapas jl) y j2),
y dichas etapas b. y f. se llevan a cabo
- l1)
- distribuyendo en dicho receptáculo testigo de crecimiento positivo y dicho receptáculo de ensayo un volumen de líquido que comprende dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo, para rehidratar dichos componentes sólidos secos en dicho medio portador.
7. El método según la reivindicación la, en el
que dicha etapa g. comprende incubar dichos receptáculos juntos
durante un periodo de tiempo de incubación predeterminado, asociado
con un protocolo de lectura de excitación de fluorescencia;
y dicha etapa h. comprende leer dichos
receptáculos de acuerdo con dicho protocolo de lectura de
excitación de fluorescencia, que incluye las etapas de
- h1)
- leer el valor de la excitación de fluorescencia de la resorufina en cada uno de dichos receptáculos, denominándose N a dicho valor para dicho pocillo testigo de crecimiento negativo, denominándose P a dicho valor para dicho pocillos testigo de crecimiento positivo, y denominándose T a dicho valor para dicho receptáculo de ensayo;
- h2)
- calcular los valores de un parámetro testigo de crecimiento Gc y un parámetro corregido de ensayo Tc, como diferencia entre los valores de P y N y los valores de T y N, respectivamente;
- h3)
- calcular el valor de una variable de ensayo I que comprende una combinación funcional preestablecida de dicho parámetro testigo de crecimiento Gc y un parámetro corregido de ensayo Tc; y
- h4)
- reportar un resultado del ensayo usando dicha variable de ensayo I en un algoritmo de decisión previamente elegido.
8. El método según la reivindicación 7a, en el
que dicha etapa h3) comprende calcular dicha variable de ensayo I
como función preestablecida que incluye la relación de Tc y Gc; y
dicha etapa h4) comprende reportar un resultado entre
- un resultado de ensayo positivo (crecimiento del organismo) si I es mayor que o igual a un valor de decisión positiva predeterminado XP,
- un resultado de ensayo negativo (no crecimiento del organismo) si I es menor que o igual a un valor de decisión negativa predeterminado XL, y
- un resultado de ensayo indeterminado si I está entre XP y XL,
- en el que dichos valores de decisión XL y XP se determinan empíricamente a partir de datos obtenidos en ensayos controlados usando organismos que producen resultados de ensayo conocidos.
9. El método según la reivindicación la, en el
que dicha etapa g. se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo de
lectura rápida de excitación de fluorescencia, e incluye incubar
dichos receptáculos juntos durante un periodo de tiempo suficiente
para producir una velocidad predeterminada de crecimiento de dichos
microorganismos en dicho receptáculo testigo de crecimiento
positivo, que se determina leyendo el valor de la excitación de
fluorescencia de la resorufina en dicho receptáculo testigo de
crecimiento negativo y en dicho receptáculo testigo de crecimiento
positivo, para al menos dos tiempos distintos durante dicho periodo
de tiempo;
y dicha etapa h. comprende leer dichos
receptáculos de acuerdo con dicho protocolo de lectura rápida de la
excitación de fluorescencia, que incluye las etapas de
- h1)
- determinar los valores de características dinámicas preestablecidas de producción de resorufina en cada uno de dicho receptáculo de ensayo y dicho receptáculo testigo de crecimiento positivo, midiendo los valores de excitación de fluorescencia de resorufina en los mismos y en dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo, para al menos dos periodos de tiempo distintos, usando los valores medidos a partir de dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo para corrección, y denominando a dichos valores T' y G', respectivamente;
- h2)
- calcular el valor de una variable de ensayo denominada I, y que comprende una combinación funcional preestablecida de T' y G'; y
- h3)
- reportar un resultado del ensayo usando el valor de dicha variable de ensayo I en un algoritmo de decisión previamente elegido.
10. El método según la reivindicación 9a, en el
que dicha etapa h2) comprende calcular dicha variable de ensayo I
como una función preestablecida que incluye la relación de T' y
G';
y dicha etapa h3) comprende reportar un
resultado entre
- un resultado de ensayo positivo (organismo) si I es mayor que o igual a un valor de decisión positiva predeterminado XP,
- un resultado de ensayo negativo (no crecimiento del organismo) si I es menor que o igual a un valor de decisión negativa predeterminado XL, y
- un resultado de ensayo indeterminado si I está entre XP y XL,
- en donde dichos valores de decisión XL y XP se determinan empíricamente a partir de datos obtenidos en ensayos controlados usando organismos que producen resultados de ensayo conocidos.
11. El método según la reivindicación la, en el
que dicha etapa g. comprende incubar dichos receptáculos juntos
durante un periodo de tiempo de incubación predeterminado, asociado
con un protocolo de lectura de luz visible; y
dicha etapa h. comprende las etapas de
- h1)
- cualificar dichos receptáculos para la lectura basándose en detectar la ausencia de un desplazamiento distinguible en el color azul inicial atribuible a la resazurina en dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo, que indica que no hay crecimiento de dicho microorganismo en el mismo, y la presencia de un desplazamiento sustancial del color de dicho pocillo testigo de crecimiento positivo desde el color azul inicial de dicha resazurina, hacia un color rojo atribuible a la producción de dicho producto de reducción resorufina, producción que es provocada por el crecimiento del microorganismo en el mismo;
- h2)
- reportar ensayo fallado si dichos receptáculos no se cualifican para la lectura de acuerdo con la etapa hl); y
- h3)
- reportar un resultado de ensayo si dichos receptáculos se cualifican para la lectura de acuerdo con la etapa il) detectando la presencia o la ausencia de un desplazamiento sustancial del color de dicho receptáculo de ensayo, desde un color azul inicial de la resazurina hacia el color rojo de la resorufina, siendo dicho resultado del ensayo positivo (crecimiento del organismo) si está presente dicho desplazamiento del color, y siendo dicho resultado del ensayo negativo (no crecimiento del organismo) si está ausente dicho desplazamiento del color.
12. El método según la reivindicación 3a, en el
que dicha etapa jl) se lleva a cabo:
- k1)
- distribuyendo en dicho receptáculo de ensayo un volumer preestablecido de liquido que tiene dicha concentración previamente elegida de dicho producto antimicrobiano, dicha concentración preestablecida de dicha resazurina, dicha concentración preestablecida de dicho medio de crecimiento, dicho tampón previamente elegido y dicho estabilizante redox previamente elegido, y
- k2)
- secando dicho volumen de liquido para capturar dicho producto antimicrobiano, dicha resazurina, dicho medio de crecimiento, dicho tampón y dicho estabilizante redox, el forma de componentes sólidos secos;
y dicha etapa j2) se lleva a cabo
- l1)
- distribuyendo en dicho receptáculo de ensayo un volumen de líquido que comprende dicha concentración preestablecida de dicho microorganismo, para rehidratar dichos componentes sólidos secos.
13. El método según la reivindicación 5ª, en el
que dicha medio portador comprende un disco de papel absorbente y
dicho componentes sólidos secos están capturados en dicho
disco.
14. El método según la reivindicación 5ª, en el
que dicho medio portador comprende al menos un primer y un segundo
disco de papel absorbente, teniendo dicho primer disco dicha
resazurina en el mismo, teniendo dicho segundo disco dicho medio d
crecimiento en el mismo, y siendo distribuidos dicho tampón dicho
estabilizante redox en uno de dichos primer y segundo discos.
15. El método según la reivindicación 5ª, en el
que dicha etapa g. comprende incubar dichos receptáculos juntos
durante un periodo de tiempo de incubación predeterminado, asociado
con un protocolo de lectura de luz visible; y
dicha etapa h. comprende las etapas de
- h1)
- cualificar dichos receptáculos para la lectura basándose en detectar la ausencia de un desplazamiento distinguible en el color azul inicial atribuible a la resazurina en dicho receptáculo testigo de crecimiento negativo, que indica que no hay crecimiento de dicho microorganismo en el mismo, y la presencia de un desplazamiento sustancial del color de dicho pocillo testigo de crecimiento positivo, desde el color azul inicial de dicha resazurina hacia un color rojo atribuible a la producción de dicho producto de reducción resorufina, provocada por el crecimiento del microorganismo en el mismo;
- h2)
- reportar un ensayo fallado si dichos receptáculos no se cualifican para la lectura de acuerdo con la etapa hl); y
- h3)
- reportar un resultado de ensayo si dichos receptáculos se cualifican para la lectura de acuerdo con la etapa 11) detectando la presencia o la ausencia de un desplazamiento sustancial del color de dicho receptáculo de ensayo, desde un color azul inicial de la resazurina hacia el color rojo de la resorufina, siendo dicho resultado del ensayo positivo (crecimiento del organismo) si está presente dicho desplazamiento del color, y siendo dicho resultado del ensayo negativo (no crecimiento del organismo) si está ausente dicho desplazamiento del color.
16. Aparato para ensayar la susceptibilidad
cualitativa de un microorganismo para la inhibición del crecimiento
por un producto antimicrobiano, que utiliza un protocolo
preestablecido de ensayo de la susceptibilidad cualitativa que
implica una primera y una segunda cantidades de dicho producto
antimicrobiano, que comprende
un panel de ensayo que define un pocillo testigo
de crecimiento negativo, un pocillo testigo de crecimiento
positivo, y un par de pocillos de ensayo;
un módulo de ensayo portado en cada uno de dicho
pocillo testigo de crecimiento negativo, dicho pocillo testigo de
crecimiento positivo y dicho par de pocillos de ensayo,
comprendiendo cada uno de dichos módulos de ensayo un volumen
sólido seco de un subconjunto de los constituyentes de un conjunto
de productos químicos de ensayo, que comprende una cantidad de
resazurina y una cantidad de medio de crecimiento para
microorganismos, y un estabilizante redox previamente elegido
caracterizado por la disminución sustancial de la reducción
de la resazurina por dicho medio de crecimiento, comprendiendo
además cada uno de dichos módulos de ensayo de dicho par de
pocillos de ensayo, un volumen sólido seco de una de dichas primera
y segunda cantidades de dicho producto antimicrobiano;
estando dicho módulo de ensayo de dicho pocillo
testigo de crecimiento negativo adaptado para ser rehidratado
mediante un volumen de líquido estéril que contiene todos los
constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de ensayo
que no están incluidos en dicho subconjunto;
estando dichos módulos de ensayo de cada uno de
dicho pocillo testigo de crecimiento positivo y dicho par de
pocillos de ensayo adaptados para ser rehidratados mediante un
volumen de líquido de inóculo que contiene todos los constituyentes
de dicho conjunto de productos químicos de ensayo no incluidos en
dicho subconjunto, junto con una concentración preestablecida de
dicho microorganismo;
teniendo dicho volumen de líquido estéril y
dicho volumen de líquido de inóculo la cantidad de volumen
previamente elegida, siendo previamente elegida dicha cantidad de
resazurina en relación con dicha cantidad de volumen previamente
elegido, para producir una concentración previamente elegida de
resazurina en cada uno de dichos pocillos, en un intervalo
caracterizado por la baja toxicidad para el crecimiento del
microorganismo y una sustancial sensibilidad para la reducción a
resorufina por productos metabólicos del crecimiento del
microorganismo, y siendo previamente elegida dicha cantidad de
medio de crecimiento para producir una concentración previamente
elegida de medio de crecimiento en cada uno de dichos pocillos;
estando dicho panel de ensayo y dichos módulos
de ensayo rehidratados portados en el mismo, adaptados para ser
incubados durante un periodo de tiempo de incubación asociado con un
protocolo de lectura previamente elegido, que comprende uno entre
un protocolo de lectura de luz visible y un protocolo de lectura de
excitación de fluorescencia, y a continuación ser leído de acuerdo
con dicho protocolo de lectura previamente elegido, para determinar
la presencia o ausencia de crecimiento de dicho microorganismo en
dichos pocillos de ensayo.
17. Aparato para ensayar la susceptibilidad
cuantitativa de un microorganismo para la inhibición del
crecimiento por un producto antimicrobiano, que utiliza un
protocolo preestablecido de ensayo de la susceptibilidad
cuantitativa que implica N cantidades diferentes de dicho producto
antimicrobiano, siendo N > 2, que comprende
un panel de ensayo que define un pocillo testigo
de crecimiento negativo, un pocillo testigo de crecimiento positivo
y N pocillos de ensayo
un módulo de ensayo portado en cada uno de dicho
pocillo testigo de crecimiento negativo, dicho pocillo testigo de
crecimiento positivo y dichos N pocillos de ensayo, comprendiendo
cada uno de dichos módulos de ensayo un volumen sólido seco de un
subconjunto de los constituyentes de un conjunto de productos
químicos de ensayo, que comprende una cantidad de resazurina y una
cantidad de medio de crecimiento para microorganismos, y un
estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la
disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho
medio de crecimiento, comprendiendo además cada uno de dichos
módulos de ensayo de dichos N pocillos de ensayo un volumen sólido
seco de un cantidad diferente de dicho producto antimicrobiano
previamente elegida de acuerdo con dicho protocolo de ensayo de la
susceptibilidad cuantitativa;
estando dicho módulo de ensayo de dicho pocillo
testigo de crecimiento negativo adaptado para ser rehidratado
mediante un volumen de líquido estéril que contiene todos los
constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de ensayo
que no están incluidos en dicho subconjunto;
estando dichos módulos de ensayo de cada uno de
dicho pocillo testigo de crecimiento positivo y de dichos N
pocillos de ensayo adaptados para ser rehidratados mediante un
volumen de líquido de inóculo que contiene todos los constituyentes
de dicho conjunto de productos químicos de ensayo no incluidos en
dicho subconjunto, junto con una concentración preestablecida de
dicho microorganismo;
teniendo dicho volumen de líquido estéril y
dicho volumen de líquido de inóculo la misma cantidad de volumen
previamente elegida, siendo previamente elegida dicha cantidad de
resazurina en relación con dicha cantidad de volumen previamente
elegida, para producir una concentración previamente elegida de
resazurina en cada uno de dichos pocillos, en un intervalo
caracterizado por la baja toxicidad para el crecimiento del
microorganismo y una sustancial sensibilidad para la reducción a
resorufina por productos metabólicos del crecimiento del
microorganismo, y siendo previamente elegida dicha cantidad de
medio de crecimiento para producir una concentración previamente
elegida de medio de crecimiento en cada uno de dichos pocillos;
estando dicho panel de ensayo y dichos módulos
de ensayo rehidratados adaptados para ser incubados durante un
periodo de tiempo de incubación asociado con un protocolo de
lectura previamente elegido, que comprende uno entre un protocolo
de lectura de luz visible y un protocolo de lectura de excitación
de fluorescencia, y a continuación ser leído de acuerdo con dicho
protocolo de lectura previamente elegido, para determinar la
presencia o ausencia de crecimiento de dicho microorganismo en
dichos pocillos de ensayo.
18. Aparato según las reivindicaciones 16ª o
17ª, en el que cada uno de dichos módulos de ensayo comprende un
medio portador portado en un pocillo asociado, y cada uno de dichos
módulos de ensayo porta dicho subconjunto de los constituyentes de
dicho conjunto de productos químicos de ensayo.
19. Aparato según la reivindicación 18ª, en el
que dicho medio portador comprende un disco de papel absorbente, y
cada uno de dichos discos de papel absorbente en dichos pocillos de
ensayo está impreso con una denominación, legible visualmente, del
nombre y de la concentración de dicho producto antimicrobiano
almacenado en los mismos.
20. Aparato según la reivindicación 18ª, en el
que dicho medio portador comprende al menos un primer y un segundo
discos de papel absorbente, portando dicho primer disco dicha
resazurina, y portando dicho segundo disco dicho medio de
crecimiento, portando uno de dichos primer y segundos discos de
papel de cada uno de dichos pocillos de ensayo dicha cantidad
asociada de dicho producto antimicrobiano, y estando impresos con
una denominación, legible visualmente, del nombre y de la
concentración de dicho producto antimicrobiano almacenado en
los
mismos.
mismos.
21. Equipo para ensayar la susceptibilidad
cualitativa de un microorganismo para la inhibición del crecimiento
por un producto antimicrobiano, utilizando un protocolo de ensayo
de la susceptibilidad cualitativa preestablecido, que implica una
primera y una segunda cantidades de dicho producto antimicrobiano,
que comprende
un panel de ensayo que define un pocillo testigo
de crecimiento negativo, un pocillo testigo de crecimiento
positivo, y un par de pocillos de ensayo;
un módulo de ensayo portado en cada uno de dicho
pocillo testigo de crecimiento negativo, dicho pocillo testigo de
crecimiento positivo y dicho par de pocillos de ensayo,
comprendiendo cada uno de dichos módulos de ensayo un volumen
sólido seco de un subconjunto de los constituyentes de un conjunto
de productos químicos de ensayo, que comprende una cantidad de
resazurina y una cantidad de medio de crecimiento para
microorganismos, y un estabilizante redox previamente elegido
caracterizado por la disminución sustancial de la reducción
de la resazurina por dicho medio de crecimiento;comprendiendo
además cada uno de dichos módulos de ensayo de dicho par de
pocillos de ensayo, un volumen sólido seco de una de dichas primera
y segunda cantidades de dicho producto antimicrobiano;
un recipiente de líquido de rehidratación que
contiene todos los constituyentes de dicho conjunto de productos
químicos de ensayo que no están incluidos en dicho subconjunto;
un sistema de almacenamiento de inóculo para
almacenar un volumen de dicho líquido de rehidratación con dicho
microorganismo incorporado al mismo, para formar un líquido de
inóculo que tiene una concentración preestablecida de microorganismo
en el mismo;
un sistema inoculador que incluye un sistema
para distribuir una cantidad preestablecida de dicho líquido de
rehidratación en dicho pocillo testigo de crecimiento negativo, un
sistema para distribuir una cantidad preestablecida de dicho
líquido de inóculo en dicho pocillo testigo de crecimiento
positivo, y dicho par de pocillos de ensayo para rehidratar los
productos químicos de ensayo de dichos módulos de ensayo en los
mismos;
siendo previamente elegida dicha cantidad de
resazurina en relación con dicha cantidad preestablecida, para
producir una concentración previamente elegida de resazurina en
cada uno de dichos pocillos, en un intervalo caracterizado
por la baja toxicidad para el crecimiento del microorganismo y una
sustancial sensibilidad para la reducción a resorufina por
productos metabólicos del crecimiento del microorganismo, y siendo
previamente elegida dicha cantidad de medio de crecimiento para
producir una concentración previamente elegida de medio de
crecimiento estándar en cada uno de dichos pocillos;
estando dicho panel de ensayo y dichos módulos
de ensayo rehidratados, adaptados para ser incubados durante un
periodo de tiempo de incubación asociado con un protocolo de
lectura previamente elegido, que comprende uno entre un protocolo
de lectura de luz visible y un protocolo de lectura de excitación
de fluorescencia, y a continuación ser leído de acuerdo con dicho
protocolo de lectura previamente elegido, para determinar la
presencia o ausencia de crecimiento de dicho microorganismo en
dichos pocillos de ensayo.
22. Equipo para ensayar la susceptibilidad
cuantitativa de un microorganismo para la inhibición del
crecimiento por un producto antimicrobiano, utilizando un protocolo
de ensayo de la susceptibilidad cuantitativa preestablecido, que
implica N cantidades diferentes de dicho producto antimicrobiano,
siendo N>2, que comprende
un panel de ensayo que define un pocillo testigo
de crecimiento negativo, un pocillo testigo de crecimiento
positivo, y N pocillos de ensayo;
\global\parskip0.930000\baselineskip
un módulo de ensayo portado en cada uno de dicho
pocillo testigo de crecimiento negativo, dicho pocillo testigo de
crecimiento positivo y dichos N pocillos de ensayo, comprendiendo
cada uno de dichos módulos de ensayo un volumen sólido seco de un
subconjunto de los constituyentes de un conjunto de productos
químicos de ensayo, que comprende una cantidad de resazurina y una
cantidad de medio de crecimiento de microorganismos, y un
estabilizante redox previamente elegido caracterizado por la
disminución sustancial de la reducción de la resazurina por dicho
medio de crecimiento; comprendiendo además cada uno de dichos
módulos de ensayo de dichos N pocillos de ensayo, un volumen sólido
seco de una de dichas N cantidades diferentes de dicho producto
antimicrobiano;
un recipiente de líquido de rehidratación que
contiene todos los constituyentes de dicho conjunto de productos
químicos de ensayo que no están incluidos en dicho subconjunto;
un sistema de almacenamiento de inóculo para
almacenar un volumen de dicho líquido de rehidratación con dicho
microorganismo incorporado al mismo, para formar un líquido de
inóculo que tiene una concentración preestablecida de
microorganismo en el mismo;
un sistema inoculador que incluye un sistema
para distribuir una cantidad preestablecida de dicho líquido de
rehidratación en dicho pocillo testigo de crecimiento negativo, un
sistema para distribuir una cantidad preestablecida de dicho
líquido de inóculo en dicho pocillo testigo de crecimiento
positivo, y cada uno de dichos N pocillos de ensayo, para
rehidratar en los mismos los productos químicos de ensayo de dichos
módulos de ensayo;
siendo previamente elegida dicha cantidad de
resazurina en relación con dicha cantidad preestablecida, para
producir una concentración previamente elegida de resazurina en
cada uno de dichos pocillos en un intervalo caracterizado
por la baja toxicidad para el crecimiento del microorganismo y una
sustancial sensibilidad para la reducción a resorufina por
productos metabólicos del crecimiento del microorganismo, y siendo
previamente elegida dicha cantidad de medio de crecimiento para
producir una concentración previamente elegida de medio de
crecimiento estándar en cada uno de dichos pocillos;
estando dicho panel de ensayo y dichos módulos
de ensayo rehidratados portados en el mismo, adaptados para ser
incubados durante un periodo de tiempo de incubación asociado con
un protocolo de lectura previamente elegido, que comprende uno
entre un protocolo de lectura de luz visible y un protocolo de
lectura de excitación de fluorescencia, y a continuación ser leído
de acuerdo con dicho protocolo de lectura previamente elegido, para
determinar la presencia o ausencia de crecimiento de dicho
microorganismo en dichos pocillos de ensayo.
23. Un equipo según las reivindicaciones 21ª o
22ª, en el que cada uno de dichos módulos de ensayo comprende un
disco de papel absorbente, y cada uno de dichos discos de papel
absorbente de dichos pocillos de ensayo está impreso con una
denominación, legible visualmente, del nombre y de la concentración
de dicho producto antimicrobiano almacenado en el mismo.
24. Un equipo según las reivindicaciones 21ª o
22ª, en el que cada uno de dichos módulos de ensayo comprende al
menos un primer y un segundo discos de papel absorbente, portando
dicho primer disco dicha resazurina, y portando dicho segundo disco
dicho medio de crecimiento, portando uno de dichos primer y
segundos discos de papel de cada uno de dichos pocillos de ensayo
dicha cantidad asociada de dicho producto antimicrobiano, y estando
impresos con una denominación, legible visualmente, del nombre y la
concentración de dicho producto antimicrobiano almacenado en el
mismo.
25. Un equipo que comprende un primer módulo de
ensayo según la reivindicación 21ª, un segundo módulo de ensayo que
comprende un medio portador para portar en forma sólida seca dicha
segunda cantidad de dicho producto antimicrobiano y dicho grupo de
productos químicos de ensayo; y
un sistema de distribución para distribuir
dichos primer y segundo módulos de ensayo en dicho par de pocillos
de ensayo.
26. Un equipo según la reivindicación 25ª, que
comprende además
un par de módulos de ensayo de crecimiento,
comprendiendo cada uno de ellos un medio portador para portar en
forma sólida seca dicho grupo de productos químicos de ensayo,
y
un recipiente de dicho líquido de
rehidratación;
incluyendo dicho sistema de distribución un
sistema para distribuir uno de dicho par de módulos de ensayo de
crecimiento en cada uno de dicho pocillo testigo de crecimiento
negativo y dicho pocillo testigo de crecimiento positivo; e
incluyendo dicho sistema de inoculador un
sistema para distribuir una cantidad preestablecida de dicho
líquido de rehidratación en dicho pocillo testigo de crecimiento
negativo y una cantidad preestablecida de dicho inóculo en dicho
pocillo testigo de crecimiento positivo.
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27. Un equipo según la reivindicación 25ª, que
comprende una multiplicidad de paneles de ensayo para el ensayo de
múltiples organismos, y una multiplicidad de cada uno de dicho
primer módulo de ensayo y dicho segundo módulo de ensayo; y
comprendiendo dicho sistema de distribución un primer y segundo
sistemas de almacenamiento para almacenar dicha diversidad de
primer y segundo módulos de ensayo, respectivamente, y un
distribuidor asociado operativamente con dicho sistema de
almacenamiento, para distribuir simultáneamente uno de dichos
primeros módulos de ensayo desde dicho primer sistema de
almacenamiento, en uno de dichos pocillos de ensayo, y uno de
dichos segundos módulos de ensayo de dicho segundo sistema de
almacenamiento en el otro de dichos pocillos de ensayo en un panel
de ensayo de dicha diversidad de paneles de ensayo.
28. Un equipo según la reivindicación 25ª, que
comprende una multiplicidad de paneles de ensayo para el ensayo de
múltiples organismos y una multiplicidad de cada uno de dicho
primer módulo de ensayo y dicho segundo módulo de ensayo;
comprendiendo dicho sistema de distribución un
sistema de almacenamiento para almacenar dicha multiplicidad de
primer y segundo módulos de ensayo de una manera intercalada, y un
distribuidor asociado operativamente con dicho sistema de
almacenamiento para distribuir alternativamente un primer módulo de
ensayo en uno de dichos pocillos de ensayo de uno de dichos paneles
de ensayo, y un segundo módulo de ensayo en el otro de dichos
pocillos de ensayo de dicho uno de dichos paneles de ensayo.
29. Un equipo según la reivindicación 23ª, en el
que dicho conjunto de productos químicos de ensayo comprende además
un tampón previamente elegido para el control del pH, y en el que
todos los constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de
ensayo son portados en dicho disco de papel absorbente, conteniendo
dicho líquido de inóculo solamente dicho microorganismo.
30. Un equipo según la reivindicación 25ª,
adaptado para el ensayo de la susceptibilidad cualitativa de dicho
microorganismo para la inhibición del crecimiento por M productos
antimicrobianos diferentes, en el que
dicho panel de ensayo define M pares de pocillos
de ensayo, estando cada par asociado con uno de dichos M productos
antimicrobianos;
se proporcionan M de dichos primeros módulos de
ensayo y M de dichos segundos módulos, estando cada uno asociado
con uno de dichos productos antimicrobianos;
dicho sistema de distribución comprende un
sistema para distribuir cada uno de dichos M primeros módulos de
ensayo y cada uno de dichos M segundos módulos de ensayo en los
asociados de dichos M pares de pocillos de ensayo; y
dicho sistema de inoculador distribuye una
cantidad preestablecida de dicho líquido de inóculo en cada pocillo
de dichos M pares de pocillos de ensayo.
31. Un equipo según la reivindicación 30ª, en el
que cada uno de dichos M primeros y segundos módulos de ensayo
comprende un disco de papel absorbente impreso con una
denominación, legible visualmente, del nombre y de la concentración
de dicho producto antimicrobiano asociado portado en el mismo.
32. Un equipo según la reivindicación 31ª, en el
que dicho conjunto de productos químicos de ensayo comprende además
un tampón previamente elegido para el control del pH, y un
estabilizante redox previamente elegido para disminuir la reducción
de la resazurina por dicho medio de crecimiento y dicho tampón
durante la incubación de dicho panel de ensayo, y en el que todos
los constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de
ensayo son portados en cada uno de dichos discos de papel
absorbente, y dicho líquido de inóculo contiene solamente dicho
microorganismo.
33. Un equipo según la reivindicación 22ª, que
comprende al menos N módulos de ensayo, comprendiendo cada uno de
ellos un medio portador para portar en forma sólida seca una de
dichas N cantidades diferentes de dicho producto antimicrobiano y
un grupo de productos químicos de ensayo que comprende un
subconjunto de los constituyentes de un conjunto de productos
químicos de ensayo que comprende una cantidad de resazurina y una
cantidad de un medio de crecimiento para microorganismos; y
un sistema de distribución para distribuir
dichos N módulos de ensayo en dichos N pocillos de ensayo, en un
orden de acuerdo con la cantidad de dicho producto antimicrobiano
en los mismos.
34. Un equipo según la reivindicación 33ª, que
comprende una multiplicidad de paneles de ensayo para el ensayo de
múltiples organismos, y una multiplicidad de conjuntos de dichos N
módulos de ensayo;
comprendiendo dicho sistema de distribución un
sistema de almacenamiento para almacenar dicha multiplicidad de
conjuntos de N módulos de ensayo, y un sistema para distribuir
dichos módulos de ensayo de uno en uno desde dicho sistema de
almacenamiento, estando organizados dichos N módulos de ensayo en
cada uno de dicha multiplicidad de conjuntos, en dicho sistema de
almacenamiento, en un orden preestablecido de acuerdo con la
cantidad de dicho producto antimicrobiano en los mismos, de forma
que dicho sistema de distribución puede hacerse funcionar para
distribuir N módulos de ensayo por dicho orden en dichos N pocillos
de ensayo, en cada uno de dichos paneles de ensayo.
35. Un equipo según la reivindicación 23ª, en el
que dicho conjunto de productos químicos de ensayo comprende además
un tampón previamente elegido para el control del pH, y en el que
todos los constituyentes de dicho conjunto de productos químicos de
ensayo son portados en dicho disco de papel absorbente, conteniendo
dicho líquido de inóculo solamente dicho microorganismo.
36. Un equipo según la reivindicación 34ª,
adaptado para el ensayo de la susceptibilidad cuantitativa de dicho
microorganismo para la inhibición del crecimiento por M productos
antimicrobianos diferentes, en el que
dicho panel de ensayo define M conjuntos de N
pocillos de ensayo, estando cada conjunto asociado con uno de
dichos productos antimicrobianos;
dicho sistema de distribución comprende los M
separados de dicho sistema de almacenamiento asociado cada uno de
ellos con uno de dichos M productos antimicrobianos y teniendo un
sistema asociado para distribuir N módulos de ensayo almacenados en
el mismo en uno asociado de dichos M conjuntos de N pocillos de
ensayo; distribuyendo dicho sistema de inoculador dicha cantidad
preestablecida de dicho líquido de inóculo en cada uno de dichos N
pocillos de ensayo en cada uno de dichos M conjuntos de pocillos de
ensayo, de manera secuencial de un conjunto cada vez.
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