JPH04502707A - 微生物の抗菌感受性試験のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 微生物の抗菌感受性試験のための装置および方法発明の背景 技術分野 この発明は、広くは、抗菌生成物による成長阻害に対する微生物の感受性を試験 するための装置および方法に関する。

この発明は、微生物の定性的感受性および定量的感受性試験の両方に関する。

一般的な従来技術 微生物の出所および試験のための培養 試験しようとする微生物標本は、多くの出所から研究所に供給されるであろう。

標本は、博士により彼等の部屋から採集されて中央試験研究所に送られるかもし れないし、研究所が提携している病院の患者から採集されるかもしれない。標本 は、身体の多（の部分、例えば、大脳髄液、膿瘍、感染した傷、生殖器感染症等 から得ることができる。採集した標本は、通常の研究所の実務に従って一部寒天 プレート上で培養する。−次培養プレート上の細菌コロニーから、予め設定し） ；濃度の細菌懸濁液を調製する確立された手順に従って接種物を調製する。この 接種物のさらなる処理は、感受性試験に用いようとする装置および方法に依存す る。

感受性試験装置および方法 感受性試験の目的は、既に始まっている抗生物薬剤（ａｎｔｉｂｉｏｊｉｃ　ｄ ｒｕｇ　）治療の予想される成功についての情報を関係する医師に提供すること にある。一般に医師は、投与しようとする、通常抗生物薬剤と呼ばれる抗菌生成 物を、試験結果が分かる前に処方するであろう。しかしながら、医師にとって、 抗菌生成物および与えられた濃度が、感染を引き起こす微生物をうまく殺すかど うかを学ぶことはしばしば重要である。試験結果が入った後、試験結果がそうす る理由を示しているならば、医師は薬物治療を変えることができる。

定性的対定量的感受性試験 定性的感受性試験という用語は、一般に、生物が特定の抗菌生成物に対して感受 性であるかあるいは耐性であるかを示す試験結果を生み出す試験装置および方法 を意味する。抗菌生成物のただ１種もしくは２種の濃度を含む方法への依存性が 用いられる。定性的感受性試験においては、感受性もしくは耐性の程度は報告さ れない。

定量的感受性試験という用語は、微生物の増殖を阻害するに十分であろう抗菌生 成物の濃度についてのデータを提供する試験結果を生み出す試験装置および方法 を意味する。典型的には、治療範囲の抗菌生成物濃度をカバーする、抗菌生成物 の６種以上の異なる希釈が用いられる。最小阻止濃度（ＭＩＣ）という用語は、 しばしば定量的感受性試験により与えられる結果を示す意味で用いられ、微生物 の増殖の阻害を生み出すであろう抗菌生成物の最小濃度と定義される。

抗菌生成物という用語は、ここでは、予め設定された濃度の抗菌剤（すなわち、 個別の抗生物質）のセットを含む生成物を示し、したがって、単一の抗生物薬剤 もしくは２種以上の抗生物剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｇｅｎｔ）を含む広ス ペクトル処方に対する一般的な名称である。

定性的感受性試験装置および方法 キルビー／バウアー（Ｋｉｒｂ７　／Ｂａｕｅｒ　）プレート（第１Ａ図）上で のディスク拡散 ディスク拡散は定性的感受性試験の方法であり、微生物の増殖培地で被覆された 、典型的にはキルビー／バラアープレートと呼ばれるプレート１０、接種ブロス 、および抗菌生成物が貯蔵されている複数のペーパーディスク１１を使用する。

プレートは直径１５０１、ディスクは直径６開である。微生物を含む接種ブロス をプレート上に塗布し、微生物の均一なローン（ｌａｗｎ）を形成する。次いで 、ベーパーディスク−をプレート上の離れた地点に落とし、その後プレートをイ ンキュベーターに入れて微生物を増殖させる。第１Ａ図はインキュベーション後 のプレートの外観の一例を示す。ディスクを取り巻く阻止域は、ゼロないし２５ もしくは３０ｍｍの間で変化する。

インキュベーションの間に、ディスク中の抗菌生成物は微生物ローンに拡散し、 抗菌生成物の異なる濃度の連続（、た分布を形成する。微生物が抗菌生成物に対 して高度に耐性でなければ、典型的には、抗菌生成物の濃度が最大である拡散域 の中心領域において微生物の増殖は阻止される。ディスクの中心から一定の範囲 で、微生物の増殖が見られる。特定のディスク周囲の阻止域のサイズが、そこに 存在する特定の抗菌生成物に対する微生物の感受性を示す。

第１Ａ図および第１表（この明細書の末尾にある）は、使用されるいくつかの抗 菌生成物の典型的な例およびディスク拡散試験の読取り結果を示す。

ディスク核酸試験の主な利点は、試験のための抗菌生成物の選択における柔軟性 および試験の設定の容易さである。プレート上の適当に離れた地点に、異なる抗 菌生成物を含有する複数のディスクを同時に分配するためのディスク貯蔵および 分配システムが開発されている。この分配システムは、異なるディスク貯蔵モジ ュールを積載することができる。これは、使用者に、各標本の試験状況で使用す るための抗菌生成物の選択における完全な柔軟性を与える。

主たる不都合な点は、試験結果の「感受性」および「耐性」の解釈が、血液以外 の感染部位で達し得る抗生物質レベルとあまりよい相関を示さない、達し得る抗 生物質の血清レベルに基づいていることである。これは、全ての定性的感受性試 験法の真実である。他の不都合な点は、域のサイズを測定するために定規を用い 、解釈のためにチャートを参照する、試験の読取りおよび解釈の困難で時間のか かる工程である。他の点は、「感受性」および「耐性」の解釈における差異がし ばしばわずか数ミリメーターであり、そのため大きな接種物から得られた試験法 における変化もしくは他の変化によって誤りが生じることがある。また、ディス ク拡散方法では、１枚のプレート上で試験し得る抗菌生成物の数が限定される。

ブレークポイント試験プレート（第１Ｂ図）定性的感受性試験の他の試みには、 ブレークポイント（ｂｒｅｘｋｐｏｉｎｔ）試験パネルシステムもしくはキルビ ー−バウアー試験パネルシステムと呼ばれるマルチウェル試験パネルの使用が含 まれる。第１Ｂ図に示すように、ブレークポイント試験プレートはマルチウェル 試験パネル２０を典型的に用いる。

このパネルは、陰性増殖対照ウェル２１、陽性増殖対照ウェル２２、複数の抗菌 生成物の異なる２種の希釈物が用いられる第１パネル区画２３および数種の抗菌 生成物の各々のただ１種の希釈物が存在する第２パネル区画２４を有する。パネ ルの試験ウェルは関係付けられた抗菌組成物の略語でラベルされており、ウェル 内の濃度はｍｇ／ｍｌで与えられている。この明細書の末尾の第１１表は、この 従来のブレークポイントパネルの例において用いられる抗菌生成物およびブレー クポイント濃度を示す。

陰性増殖対照ウェル２１は増殖培地を有するのみであり、微生物は接種されてい ない。これは、主として、パネルの汚染を監視するために用いられる。インキュ ベーションの後、陽性増殖対照ウェル内に微生物の増殖が検出される場合には、 このパネルを廃棄して試験を繰り返さなければならない。陽性増殖対象ウェル２ ２は抗菌生成物を含有しない増殖培地を有しており、微生物が接種されている。

陽性増殖対照ウェルは、抗菌生成物の非存在下で、パネル内の増殖培地が微生物 を増殖させることが可能であることを示すことを目的とする。陽性増殖対照ウェ ル内で微生物の増殖がない場合には、その試験を無効とし、他の試験プレート上 で試験を繰り返さなければならない。

抗菌生成物と関係付けられた各試験ウェルは、増殖培地および既知濃度の対応す る抗菌生成物を有する。これらの試験化学物質はウェル内に入れられ、凍結もし くは乾燥される。

凍結パネルは、接種の直前に解凍する。乾燥パネルは、無菌再水化溶液を用いる 陰性増殖対照ウェルの分離再水化により、微生物の接種時に再水化する。

パネル区画２３の各抗菌生成物の異なる２種の濃度は、特定の微生物がその抗菌 生成物に対して感受性であるか、もしくは耐性であるかについての情報が得られ るように選択される。

この濃度は、ディスク核酸試験法を用いた試験結果と上述の結果との相関に基づ く。

各陽性増殖対照ウェルおよび各抗菌生成物に関係付けられたウェルには、予め調 製された微生物の濃縮物が接種される。

その後、典型的には一晩、パネルをインキュベートし、視覚により読み取る。陰 性増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェルが、このパネルが読み取りに適格で あることを示すならば、抗菌生成物に関係付けられたパネル区域２３の試験ウェ ルの各組もしくはパネル区域２４の単一の試験ウェルを検査して、どのウェルが 微生物の増殖を示しているかを決定する。

パネル区画２３の２種の希釈物を参照して、２つのウェルの各々において微生物 が増殖している場合には、その抗菌生成物に対する試験結果は「耐性」である。

微生物がいずれのウェルにおいても増殖しない場合には、試験結果は「感受性」 である。微生物が低濃度ウェルで増殖し、高濃度ウェルで増殖しない場合には、 試験結果は「不確定」である。微生物が高濃度ウェルで増殖し、低濃度ウェルで 増殖しない場合には、試験が失敗したことを示す。

単一希釈パネル区画２４において、感受性および耐性は、単一ウェルにおける増 殖もしくは非増殖に依存する試験結果として呼ばれる。増殖している場合には、 微生物はその抗菌生成物レベルで耐性であり、増殖していない場合には、そのレ ベルで感受性である。

ディスク拡散試験に対する定性的感受性試験パネルおよび下記定量的感受性試験 パネルの主な利点は、抗菌生成物当りただ１種もしくは２種の希釈物を必要とす るだけであるため、より多数の抗菌生成物を使用することができることである。

他の利点は、このパネルは、ディスク拡散試験結果よりも読み取りが比較的容易 かつ迅速であることである。

ブレークポイント試験パネルの主な不都合は、ディスク拡散試験に対して上で論 じたことと同様である。加えて、現在利用し得る定性的感受性試験パネルは、使 用者が、製造者がカスタムパネルを製造する気になるに十分な量を購入しない限 りは、使用者が選択した抗菌生成物を用いた標本の試験に対する柔軟性がない。

一般に、製造者は抗菌生成物を予め選択してパネル上に載置しており、使用者は そのパネルを供給されたままで受け取る。製造者は、使用者が実質的な試験を望 んでいる薬物を除くことができる。市販の試験プレートに新規に利用し得る薬物 を載せることには、通常遅れが出る。

これらの両方の場合において、これらの抗菌生成物に対する微生物の試験が必要 な場合には、使用者は他の試験配置を作らなければならない。

定量的感受性試験 手動読み取りシステム 今日の臨床研究所において行われている定量的感受性試験のほとんどは、陰性増 殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェルの他に、１２ないし２３種の異なる抗菌 生成物の複数の希釈物を有するマルチウェル試験プレートを用いる。そのような パネルのほとんどの読み取りは、パネルの視覚的な読み取りにより手動で行われ ている。視覚的な読み取りには、微生物の増殖の指標としてウェル内の濁りを探 すことも含まれる。各抗菌生成物に対する全ての試験ウェルを調査し、濁りが存 在しない、最小濃度の抗菌生成物を有するウェルがＭＩＣである。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、ランカスター（Ｌａｎｃｇｓｔｅｒ　）らの米国特 許４．４５３．２２０によりカバーされている、試験パネル読み取りデータ記録 システムを示す。この全体的なシステムは、従来の視覚読み取りおよびコンピュ ータベースのデータロギングシステムの典型である。第２Ａ図に示す抗菌生成物 および希釈物は、＝２２、特許が出願された時点におけるＭＩＣ試験パネル技術 の典型である。現在のＭＩＣ試験パネル技術においては、異なる抗菌生成物およ び希釈物を使用することもできる。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、ＭＩＣ試験パネル３０を微生物同定パネル４０と合 体させることも可能であることを示している。第２Ａ図に示すキーボード上敷き ５０は、ＭＩＣパネル３０およびＩＤパネル４０における試験ウェルパターンに 一致し、データ入力システム６０のキーボード部７０の上に取り付けられる。パ ネル３０および４０は、試験ウェルを背後から照らして試験ウェル内に濁りが存 在するかどうかの決定を容易にする、バックライト読み取り部８０内に取り付け られる。ＭＩＣパネル３０を読み取る間、技術者は、微生物が増殖しない最小濃 度の関連抗菌生成物を有するウェルに対応する、キーボード部７０のキーを押す 。これが抗菌生成物のＭＩＣ値である。装置６０がこの抗菌生成物のＭＩＣ値を 記録し、後に試験報告書式上にそれを印刷する。この手動読取り機およびデータ 入力および印刷システムのさらなる詳細は、上で参照した特許に見出すことがで きる。

定量的感受性試験パネルの主な利点は、試験結果により提供される量的情報であ る。微生物の増殖を阻止する実際の抗菌生成物濃度が決定され、医師が、引き起 こされた感染に対する適切な抗菌生成物および投与量の選択もしくは既に開始さ れている初期薬物治療の確定に用いることができる。

ＭＩＣ試験パネルの主な不都合は、パネル上の試験に利用し得る抗菌生成物の数 および濃度が限定され、製造者により抗菌生成物の選択が固定されていることで ある。多数の使用者が選択された抗菌生成物を有するカスタムパネルを注文する ことができるものの、はとんどの使用者はパネル上の抗菌生成物を制御すること ができない。

さらなる不都合は、特定の試験ウェルにおける増殖の有無の決定においてしばし ば遭遇する困難である。濁りの量はしばしば小さくて検出が困難であり、他の場 合においては、微生物の増殖パターンが増殖の検出を困難にする。

自動読み取りシステム 自動読み取りシステムは、定量的感受性試験パネルにおける微生物の増殖もしく は非増殖の決定に利用することができる。読み取りは、パネルの試験ウェルにお ける濁りの検出に基づくか、もしくは特定の蛍光基質を用いて微生物による特定 の酵素の産生を検出することによる。

自動読み取りシステムには２種類の基本型がある。読み取り前の試験パネルの一 晩のインキュベージシンを含むものと、４ないし６時間のインキュベーションの 後の読み取りを含むものである。後者は、普通、迅速システムと呼ばれている。

−晩のインキュベーションを必要とする、試験プレートの自動読取り機システム は、光の透過を用いる工学測定の形態のいくつかを利用する濁り測定的な読み取 りを使用する。このため、全て、透明試験パネルおよびパネルの試験ウェル内に 透明培地を必要とする。一定の光路は、高品質プラスチックおよび試験ウェル液 の容量の制御および光学パラ−メータの首尾一貫性を必要とする。この型の自動 読み取りにおいては、自動的に行なう他に、試験パネルを視覚的に読み取ること ができる。

迅速自動読み取りシステムは、濁り読み取りもしくは蛍光読み取りのいずれかを 用いる。これらのシステムに含まれる試験パネルは、自動読み取りもしくは自動 システムが故障した疑いがある場合の結果の確認の援助として視覚的に読み取る ことはできない。

オーバーナイト試験パネルの自動読取り機の唯一の利点は、試験パネルからのデ ータの読み取りおよび報告における労力の節約である。試験結果は、熟練者の視 覚的な読み取りにより生み出されるものより正確ではない。これらのシステムの 主な不都合は、システムにかかる費用と、読み取りおよび特定の微生物の難しい 増殖パターンの解釈における機械誤差の可能性である。

迅速自動読み取りシステムの利点は、データの読み取りおよび報告における労力 節減と試験結果の迅速な報告である。

上述のように、これらのシステムの不都合な点は、機械の読み取りの援助として 試験パネルを視覚的に読み取ることができないことである。

発明の目的 この発明の主な目的は、微生物の抗菌感受性試験のための改良された装置および 方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、試験パネルの読み取りの容易さが改良された、微生物の 抗菌感受性試験のための装置および方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、試験パネルの測色および蛍光読み取りが改良された、微 生物の抗菌感受性試験のための装置および方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、抗菌生成物選択の柔軟性が改良された、微生物の定性的 感受性試験のための装置および方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、抗菌生成物選択の柔軟性が改良された、微生物の定量的 感受性試験のための装置および方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、試験パネルを手動で、もしくは自動的に読み取ることが 可能な、微生物の感受性試験のための装置および方法を提供することにある。

発明の特徴および利点 この発明の一面は、予め設定された濃度の抗菌生成物による増殖阻止に対する、 微生物の感受性を試験するための方法であって、陰性増殖対照ウェルもしくは容 器（ｒｅｃｅｐｊｉｃｌｅ）および陽性増殖対照ウェルもしくは容器を用意する ことを包含し、 各陰性増殖対照容器および陽性増殖対照容器内に、予め設定された濃度の微生物 の増殖培地、および予め設定された濃度のレザズリンであって、微生物に対する 低毒性および微生物増殖の代謝生成物によるレゾルフィンへの還元に対する実質 的な感受性を特徴とする濃度範囲となるように予め設定されたレザズリンを入れ る工程と、 陽性増殖対照容器内に、予め設定された濃度の微生物を入れる工程と、 を用いる方法であることを特徴とする。

この方法において、試験容器は、 試験容器内に予め選択された濃度の抗菌生成物を入れる工程と、 試験容器内に予め設定された濃度のレザズリンを入れる工程と、 試験容器内に予め設定された濃度の増殖培地を入れる工程と、 試験容器内に予め設定された濃度の微生物を入れる工程と、 により作成される。

その後、可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み取りプロトコルを含む、 予め選択された読み取りプロトコルに関連付けられたインキュベーション時間の 間、全ての容器を一緒にインキュベートする。インキュベーション時間の経過後 、予め選択した読み取りプロトコルに従って容器を読み取り、レザズリンおよび レゾルフィンの相対濃度に基づいて、試験容器内の微生物の増殖の有無を決定す る。

可視光読み取りプロトコルには、各々の容器において検出された可視光レフレフ タンスの色の予め決められた関数的な組み合わせの少なくとも１つを基にした決 定アルゴリズムが含まれる。蛍光励起読み取りプロトコルには、各々の容器にお いて、還元生成物であるレゾルフィンにより発生する蛍光放射信号の値の予め決 められた関数的な組み合わせの少なくとも１つを決定アルゴリズムが含まれる。

この発明の方法の利点の１つは、同一の試験方法論から２つの異なる読み取りプ ロトコルを利用し得ることである。可視光読み取りプロトコルおよび蛍光放射読 み取りプロトコルの両者とも自動化することが可能であり、後者は迅速試験プロ トコルに使用して４ないし６時間のインキュベーション時間内に増殖の有無を決 定することができる。他の利点は、試験ウェル内において微生物が増殖した際の レザズリンの元来の青色からレゾルフィンの赤色への色変化を利用することによ り、可視光読み取りプロトコルによる視覚的読み取りが非常に容易になることで ある。濁りの視覚的読み取りと隣に並べての比較において、色変化による増殖の 読み取りがより早くより容易であることが示されている。

この発明の方法の一態様において、試験容器の作製工程は、まず予め設定された 量の抗菌生成物の乾燥固体ｆｉ　（ｄｒ７．ｇｏｌｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）　、お よびレザズリンおよび増殖培地を含む試験化学物質セットを構成する成分のうち の予め設定されたサブセットの乾燥固体量を含む試験モジュールを試験容器内に 形成し、次いで、予め設定された濃度の微生物および試験化学物質セットの全て の構成成分であって試験モジュールに含まれない成分を含有する大量の液体を試 験ウェル内に入れてインキュベーションの前に試験モジュールを再水化すること を包含する。好ましくは、試験化学物質セットには、再水化した試験化学物質溶 液の最終ｐＨを制御するための予め選択された緩衝液、およびインキュベーショ ン工程中の増殖培地によるレザズリンの還元を実質的に抑制することを特徴とす る予め選択されたレドックス安定化剤が含まれる。

吸着紙ディスクのような担持媒体であって、その内部に各々の容器の試験化学物 質が乾燥して含まれる担持媒体を容器内に用いることも好ましい。この発明の方 法は、担持媒体および再水化液における試験化学物質セットの種々の成分の分与 については柔軟性を与える。しかしながら、全ての試験化学物質成分は担持媒体 に分与され、再水化液は陽性増殖対照ウェルおよび試験ウェル内に入れられる微 生物のみを担持することを必要とすることが一般に好ましい。

この発明の方法においては、この発明の方法が定性的感受性試験パネルもしくは 定量的感受性試験パネルに関（、て使用される際に、試験化学物質セット中への 標準増殖培地の使用、および利用する抗菌生成物の選択おける柔軟性を与える担 持媒体の使用を有利に行ない得る。このようなパネルは予め十分に載置して、こ の発明の読み取りが容易であるという利点を提供するものでもよい。パネルは、 乾燥担持媒体、好ましくは、抗菌生成物を有する濃度の印刷された吸着紙ディス クを用いることにより十分に載置可能であって、使用者に抗菌生成物および濃度 の選択の柔軟性を与えるものでもよい。加えて、予め載置された試験モジュール と使用者が選択する試験モジュールを載置するための空の試験ウェルとの組み合 わせを有する試験パネルを提供することもできる。

この発明に従って、ディスク分配器および他の試験成分を有する試験キットを提 供し、簡単な方法で試験ウェルにディスクを装填させることもできる。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、従来技術によるキルビー−バラアープレート上におけるディスク拡 散試験の結果を示す。

第１Ｂ図は、従来技術による定性的感受性試験パネルを示す。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、従来技術による定量的感受性試験パネル、および手 動読み取りおよびデータ入力システムを示す。

第３図は、この発明による、抗菌生成物による増殖阻止に対する微生物の感受性 を決定するための一般的な方法および装置を示す。

第４図ないし第８図は、この発明による可視光読み取りプロトコルを示す。

第９図ないし第１２図は、この発明による、抗菌生成物による増殖阻止に対する 微生物の感受性を決定するための方法および装置の種々の代用態様を示す。

第１３図は、定性的感受性試験パネルにおける、この発明の方法および装置の使 用を示す。

第１４図ないし第１６図は、第１３図に示す定性的感受性試験パネルの可視光読 み取りプロトコルを示す。

第１７図は、定量的感受性試験パネルにおける、この発明の方法および装置の使 用を示す。

第１８図および第１９図は、第１７図に示す定量的感受性試験パネルの可視光読 み取りプロトコルの例を示す。

第２０Ａ図および第２０Ｂ図は、この発明による定性的感受性試験キットの代用 態様の構成要素を示す。

第２１図は、この発明による、複数の抗菌生成物用の試験モジュールが予め載置 されている定性的感受性試験パネルを示す。

第２２図は、この発明による、使用者が選択する複数の抗菌生成物用の試験モジ ュールを載置可能な試験ウェルを有する定性的感受性試験パネルを示す。

第２３図は、この発明による、複数の抗菌生成物用の予め載置された試験ウェル および空の試験ウェルの両者を有する定性的感受性試験パネルを示す。

第２４Ａ図および第２４Ｂ図は、この発明による定量的感受性試験キットの代用 態様の構成要素を示す。

第２５図は、定量的感受性試験の空の試験パネルの試験ウェル内に試験モジュー ルを載置するための、試験キット構成要素の代用セットを示す。

第２６図は、この発明による、複数の抗菌生成物用の予め載置された試験モジュ ールを有する定量的感受性試験パネルを示す。

第２７図は、この発明による、使用者が選択する複数の抗菌生成物用の試験モジ ュールを載置するための空の試験ウェルを有する定量的感受性試験パネルを示す 。

第２８図は、この発明による試験パネルの空の試験ウェル内に、複数の抗菌生成 物用の試験モジュールを載置するための試験キット構成要素を示す。

第２９図は、予め選択された複数の抗菌生成物用の予め載置された試験モジュー ルの区画および使用者が選択する複数の抗菌生成物用の試験モジュールを載置す るための空の試験ウェルの区画を有する、この発明による定量的感受性試験パネ ルを示す。

第３０図は、この発明による、有用な自動化パネルリーダーシステムを模式的に 示す。

第３１図は、この発明による試験パネルの可視光読み取りプロトコルに関して有 用な可視光読み取りシステムを示す。

第３２図は、この発明による試験パネルの蛍光励起読み取りプロトコルに関して 有用な蛍光励起読み取りシステムを示す。

第３３図は、この発明の方法による試験ウェル内の微生物増殖の蛍光読み取りの 結果を他の従来の読み取り法と比較して示すグラフである。

第３４図は、異なる微生物を用いる、この発明の方法による試験ウェル内の微生 物増殖の蛍光読み取りを示すグラフである。

発明の態様の詳細な説明 生成物による増殖阻止に対する微生物の感受性を、陰性増殖対照ウェルを有する 試験パネル２００もしくは容器１０１、陽性増殖対照ウェルもしくは容器＋０２ 、および試験ウェルもしくは容器１０３を使用して試験することが含まれる。こ の説明において、「ウェル」もしくは「容器」という用語は、「容器」という用 語が試験化学物質を保持するための適切な構造に対して一般的であるという理解 と共に、交換可能に用いられる。

この方法はマルチウェルパネルの使用には依存せず、分離した個別の容器を用い ることができる。パネルを用いる試みは、インキュベーター内外での取扱いの容 易さ、および当業者によく知られている他の理由により好ましい。この方法の一 般的な工程を以下に説明する。

予め設定された濃度の微生物用増殖培地を２つの増殖制御容器１０１および１０ ２に入れ、予め設定された濃度のレザズリンも両方の増殖制御容器に入れる。増 殖培地は、例えば、標準ムエラーーヒントン（ＭＢｌｌ！ｒ−旧ｎｔｏｎ）ブロ スであってもよく、この増殖培地の濃度は、感受性試験産業において今日用いら れている濃度の標準範囲であってもよい。使用されるレザズリンの濃度は、微生 物に対する低毒性と、微生物増殖の代謝生成物によるレゾルフィンへの還元に対 する実質的な感受性とを特徴とする、予め決められた範囲内にある。

予め設定された濃度の試験しようとする微生物を陽性増殖対照ウェル１０２内に 入れる。したがって、第３図に示すように、陰性増殖対照ウェル１０２が増殖培 地およびレザズリンを有するのに対し、陽性増殖対照ウェルは増殖培地、レザズ リンおよび微生物を有する。

試験ウェル１０３内には以下の試験化学物質が入れられる。

予め選択された濃度の抗菌生成物、２つの増殖対照ウェル内と同一の予め設定さ れた濃度の増殖培地、陽性増殖対照ウェル内と同一濃度のレザズリンおよび同一 濃度の微生物。全ての試験化学物質を３つの容器内に分与した後、それらを−緒 に、予め選択された読み取りプロトコルに関連するインキュベーション時間でイ ンキュベートする。一般に、この発明と共に使用される読み取りプロトコルは、 可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み取りプロトコルである。これらの 種々の読み取りプロトコルの詳細は以下に記す。

インキュベーション時間の経過後、３つの容器を予め選択された読み取りプロト コルに従い、レザズリンおよびレゾルフィンの相対濃度に基づいて読み取り、試 験ウェル内の微生物増殖の有無を決定する。可視光読み取りプロトコルには、３ つの試験ウェルの各々において検出された可視光レフレフタンスの色の予め決め られた関数的な組み合わせ少なくとも１つに基づく決定アルゴリズムが含まれる 。蛍光励起読み取りプロトコルには、各試験ウェルにおいて還元生成物で、ある レゾルフィンにより生じる蛍光放射信号の値の予め決められた関数的な組み合わ せの少なくとも１つに基づく決定アルゴリズムが含まれる。この発明による読み 取りプロトコルの詳細は以下に示す。

レザズリンの還元／酸化反応 この発明の方法及び装置において、レザズリンは還元／酸化指示薬として用いら れる。増殖培地中で微生物が増殖する場合には、それらは栄養物をエネルギーに 変換し、これはそれらの周囲を化学的に還元する結果を招く。これは、全ての微 生物において真実である。増殖する微生物の周囲に酸化／還元指示薬が存在する 場合には、それも還元される。したがって、酸化／還元指示薬の使用は、微生物 の増殖に普遍的に適用可能な試験を提供する。レザズリンはそのような酸化／還 元指示薬であり、還元されてレゾルフィンになる。レザズリンは、反射色（ｒｅ ｆｌｅｃｔｅｄ　ｃｏｌｏｒ　）が深い青であり、非蛍光性である。レゾルフィ ンは赤であり、かつ高度な蛍光性である。レザズリンのこの還元は、この発明の 方法において用いられる可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み取りプロ トコルの基礎である。

感受性試験のための従来の蛍光読み取りシステムには、微生物増殖の一般的な指 示薬は組み込まれていない。代わりに、それらは、特定の酵素の産生を測定する 蛍光基質を用いており、全ての微生物によって利用される蛍光基質は存在しない 。

レザズリンの還元は酵素を基礎とする反応ではなく、周囲の酸化／還元状態の変 化に依存する化学反応である。これは酵素反応の影響を受けない。

レザズリンはまた、ｐＨが約６．５ないし６．８より上で青色であり、そのｐＨ 値の下では赤であるｐＨ指示薬である。このため、増殖制御および試験容器内の 試験化学物質群のｐＨが、適切な初期条件、特に抗菌生成物が比較的高いｐＨ（ 酸性）を有する条件を与えるように制御されることが重要である。そのような理 由により、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸−水素ナトリウムの混合物のよ うな選択されたｐＨ緩衝液をウェル内の試験化学物質のセットに添加することが 好ましい。この緩衝液の量は、増殖培地の自己還元の傾向を悪化させることを避 けるために、少なく保つことが好ましい。

加えて、インキュベーションの間、増殖培地自身がレザズリンを還元する傾向に あり、このため３つのウェル内に分与された試験化学物質のセットがフェロシア ン酸カリウムのようなレドックス安定化剤を含むことが好ましいことが見出され ている。使用されるレドックス安定化剤は、増殖過程を妨げないように、微生物 に対して毒性であってはならない。

可視光読み取りプロトコル（第４図ないし第８図）この発明に従い使用される可 視光読み取りプロトコルは、青から赤への色の移動に基づいており、これは試験 ウェル内における微生物増殖の結果としてのレザズリンのレゾルフィンへの還元 の間に発生する。試験ウェル１０３において、そこに分与された予め選択された 濃度の抗菌生成物が存在するにもかかわらず、微生物が増殖する場合には、試験 ウェル内に存在する試験化学物質溶液が青から赤に変化し、試験ウェルの簡単な 視覚検査が、陽性もしくは陰性試験結果を決定するための基礎を提供する。増殖 対照ウェルは、試験ウェルの状態の同定に助力するための、増殖および非増殖の 比較の基礎を提供する。

第４図ないし第８図は、可視光読み取りプロトコルをより詳細に示す。第４図は 、インキュベーション前の試験パネル１００Ａの初期状態を示す。３つのウェル の全ては、ウェルを表わす領域における影によって示されるように、色が青であ る。

可視光読み取りプロトコルには、パネル読み取り適格性アルゴリズムが含まれる 。これは、パネル自体が正確な試験に対する適正な基礎を提供できないのか、ま たは何かが失敗して試験ウェル内における微生物の増殖もしくは非増殖の決定の 達成を妨げているのかを決定するために用いられる。第５図は、陰性増殖対照ウ ェルの色が青から赤に変化することにより失敗した試験を示す。そのウェルには 微生物は分与されていないので、そこで何かが増殖して、レザズリンのレゾルフ ィンへの還元による青から赤への色の移動が生じてはならない。陰性増殖対照ウ ェルは、インキュベーションの間の増殖培地によるレザズリンのいくらかの自己 還元により、青色の深さが僅かに変化することはかまわない。しかし、ピンクも しくは赤色への変化は、試験が失敗したようであり、繰り返さなければならない ことを示している。陽性増殖対照ウェルおよび試験ウェルの色は第５図には示し ていない。これは、これらのウェルの色は、パネル適格性アルゴリズムのこの面 には含まれていないためである。

第６図は、陽性増殖対照ウェルがインキュベーションの後に青から赤への色変化 を示すことができなかったことによって失敗した試験を示す。増殖を阻止する試 験化学物質が存在しないと仮定されている陽性増殖対照ウェルにおいて微生物が 増殖できないことは、試験ウェル内における微生物の増殖がそこに存在する濃度 の抗菌生成物により阻害されているのか、あるいは阻害されていないのかを判定 するための信頼し得る基礎がないことを意味している。

第７図および第８図は、パネル適格性試験を通過した２つの試験パネルを示し、 かつ最終試験結果を決定するためのアルゴリズムをも示している。第７図におい て、陰性増殖対照ウェルの検査は、このウェルには微生物が存在しないと仮定さ れているためにそうあらねばならない青色のままであることを示している。陽性 増殖対照ウェルは、その中に分与された微生物が阻害されることなく増殖してい るはずであるためにそうであらねばならない青から赤への色変化がある。試験ウ ェル１０３においては、試験溶液の色は青のままであり、これは試験ウェルにお いて微生物の増殖がないことを示している。したがって、試験結果は陰性、すな わち、試験ウェルもしくは試験容器内に微生物の増殖はない。

第８図において、陰性増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェルは適正な色を有 しており、試験ウェルが示す赤色は陽性試験結果を示すものである。すなわち、 試験ウェル内には、陽性増殖対照ウェルとまさに同様の色変化を生じる、微生物 の増殖がある。

手動読み取り 読み取りを行う人間が色認識に対する正常な視覚的鋭敏さを有していると仮定し て、試験パネル１００を手動で、すなわちウェルを裸眼で見ることにより容易に 読み取って試験結果を決定することは認識されるであろう。試験パネルの視覚的 読み取りの多くの場合において、パネルは、試験ウェル内のレザズリンのレゾル フィンへの還元が、青から赤への色変化が劇的で容易に識別可能な点まで行なわ れるに十分な時間インキュベートされている。しかしながら、力なく増殖する微 生物、もしくは試験ウェル内の抗菌生成物の濃度がＭＩＣの境界上にある条件の 下でのある場合においては、青から赤への色変化の程度は強くないと言ってよい ほど微生物の増殖はゆっくりである。試験結果の解釈を助けるために色のガイド を提供することもでき、これは試験結果を陽性もしくは陰性であると呼ぶために 存在しなければならない色変化の程度を示すであろう。

濁りの検出に頼る感受性試験パネルの視覚的読み取りに対するこの発明の利点は 、青から赤への色変化を決定することが少量の濁りを検出するよりも非常に容易 であることである。

パネルを一晩インキユベートした後に検出が困難な濁りを生じる程度の微生物の 増殖が、通常、微生物の増殖の指標として容易に検出し得る程度の青から赤への 色変化を生じることが、隣り合わせの比較により示されている。結果として、こ の発明の方法に用いられるパネルを手動で読み取るのに、技術および集中力はそ れ程必要とされない。これは、試験結果をより迅速に、かつより正確に読み取り 、技術者に試験結果の報告に対して深い自信を与える結果となる。

自動読み取り 可視光読み取りプロトコルを用いる試験パネルの自動読み取りも、比色決定が可 能な計器を使用することにより容易に達成することができる。試験パネルが不透 明材料であり白色光源がパネル上にある場合の自動比色読み取りシステムの模式 図を第３０図および第３１図に示す。パネルが透明であり、白色光源およびフィ ルターがパネルの下にある代わりのシステムを使用することも可能である。

図示したように、各々の場合において、試験パネル１００は、各々のウェルが順 に読み取られるように光源および検出器に関して走査される。３つのウェルの各 々における試験溶液の色についてのデータが得られた後、可視先読み取りプロト コルのアルゴリズムをデータに適用する。まず、パネル適格性アルゴリズムを上 述の視覚的読み取りの試みと同様の方法で適用し、次いで、適格性試験に合格し たならば、試験ウェルデータを試験して最終試験結果を決定する。自動読み取り によると、試験ウェルと陰性増殖対照ウェル、および試験ウェルと陽性増殖対照 ウェルとのそれぞれの色の差の程度を正確に定量することが可能となり、かつそ の定量化したデータを試験結果の決定の基礎として用いることができる。この場 合のアルゴリズムは、以下に論じる蛍光励起読み取りプロトコルに非常に類似し ている。

蛍光励起読み取りプロトコル 単−読み取り一静的試験プロトコル レゾルフィンが波長５８０ｎｍで強い蛍光を発するのに対してレザズリンは非蛍 光であるので、第３１図に模式的に示す読み取りシステムを用いる蛍光励起読み 取りプロトコルに従って、蛍光光度計を用いて試験パネル１００を読み取ること ができる。

ウェル内においてレゾルフィンからの蛍光放射を励起するために、５６０以下の 波長を有する励起源が用いられる。励起および放射波長の適度な分離が維持され るべきである。パネル１００は、３つのウェルの各々におけるレゾルフィンの蛍 光励起の値が得られるように、励起光源および検出器に関して走査される。これ を説明するために、陰性増殖対照ウェルから得られた値をＮとし、陽性増殖対照 ウェルから得られた値をＰとし、かつ試験ウェルから得られた値をＴとする。こ のパネルの読み取りは、微生物の増殖が起こるウェルにおけるレゾルフィンの実 質的な生成が起こるに十分な時間パネルのインキュベーションを行った後に行な う。その後、ＮおよびＰの値を調べ、そのデータが妥当な試験に相当するかどう かを決定する。Ｎの値は、パネルの汚染もしくは他の原因による陰性増殖対照ウ ェルにおける大量のレゾルフィンの存在により失敗した試験を表わすものである と決定されている閾値Ｎｆと比較され、有効なパネルデータであるためにはそれ 未満でなければならない。Ｐの値は、増殖培地が微生物増殖の促進に失敗したか もしくは他の原因により、インキュベーション時間の後に陽性増殖対照ウェルに 存在するレゾルフィンの量が少なすぎるために失敗した試験を表わすものである と決定されている閾値Ｐｆと比較され、有効なパネルデータであるためにはそれ を越えなければならない。パネルデータがこれらの有効性試験に合格した場合に は、残りの蛍光励起読み取りプロトコルに従って試験ウェルデータを操作する。

増殖対照パラメータＧｃは、好ましくは、ＰおよびＮの値の差として計算される 。同様に、補正試験パラメータＴｃは、ＴおよびＮの値の差として計算される。

このように、陰性増殖対照ウェルから得られる値Ｎは、インキュベーション工程 中のレザズリンの自己還元により他の２つのウェル内に存在することがある、レ ゾルフィンのバックグランド値として扱われる。

この読み取りプロトコルの次の工程は、予め設定されたＧＣおよびＴｃの値の関 数的な組み合わせを用いて試験変数Ｉの値を計算することである。この関数的な 組み合わせは単に２つの値の差であってもよいが、ＴｃおよびＧｃの比を含む関 数を用いることが好ましい。試験変数Ｉの値が計算された後、それを決定アルゴ リズムにかけ、決定アルゴリズムの適用の結果に基づいて試験結果を報告する。

決定アルゴリズムは、既知の試験結果を生じる微生物を用いる試験パネルについ ての制御された試験から得られるデータに基づく。例えば、決定アルゴリズムは 予め決められた陽性決定値ＸＰおよび予め決められた陰性決定値ＸＮを含むこと もできる。これらの決定値は、既知の方法で振る舞う微生物から、そのような全 ての既知の微生物が試験ウェルにおいて増殖する場合にはＸＰ以上であり、試験 ウェルにおいて増殖しない場合にはＸＮ以下である試験変数Ｉの値を生じるよう に選択された値ＸＰを用いて採集されたデータに基づいている。陽性および陰性 決定値の間の広がりは不確定領域であり、■の値がこれら２つの決定値の間にあ るならば不確かな試験結果が報告されるであろう。

単−読み取り一動的試験プロトコル 上述の蛍光励起読み取りプロトコルは、基本的には静的単−読み取りプロトコル であり、プロトコルにより予め決定されたインキュベーション時間の後に行なわ れるものである。

より複雑であり、潜在的によりより正確な蛍光励起読み取りプロトコルは、試験 パラメータＩを計算する前にＰおよびＮの差の最小値、すなわちＧｃの最小値を 必要とする予備パネル読み取り適格性試験の使用を含む。パネルが、Ｇｃ値は予 め設定した限界未満ではあるが、上述したＰおよびＮ値に対する他のデータ適格 性試験に合格する場合には、（可能であるならば）時間の経過と共にＧｃ値が増 加するように、さらに時間を追加してパネルをインキュベートする。

そのような変形された試みにより、非常に正確で、抗菌生成物が存在していない としても陽性増殖対照ウェルにおける増殖が遅い微生物に対する不確かな試験結 果を回避し得る試験結果が得られる。

迅速蛍光励起読取りプロトコール 本発明の方法は、試験ウェル内における微生物増殖の迅速測定に適用可能である 。その際、増殖対照ウェルおよび試験ウェルのレゾルフィン含量変化の動的特徴 を測定すること基づく蛍光励起読取りプロトコールが用いられる。これらの動的 特徴には、ウェル内におけるレゾルフィン量の変化速度（即ち、レゾルフィンの 生成速度）およびウェル内における該速度の経時変化（即ち、レゾルフィン生成 の加速）が含まれる。

微生物が増殖している試験ウェル内では、このような微生物の数は時間と共に指 数関数的に増大し、試験ウェル内において、これに対応したレゾルフィン含量の 指数関数的増大をもたらす。微生物が増殖していない試験ウェル内では、レザズ リンのレゾルフィンへの自己還元が起こり得るが、これは直線的速度で生じ、従 って増殖に関連したレゾルフィン生成から容易に区別し得る。

この方法におけるインキュベーションステップには、三つの試験ウェルまたは容 器を、陽性増殖対照ウェル内において、所定のパネル確認値を越える有為なレゾ ルフィン生成の動的特徴を生じるに十分な時間だけ、−緒にインキュベートする ことが含まれる。この動的特徴の値は、陽性増殖対照ウェルおよび陰性増殖対照 ウェルの両者におけるレゾルフィンの蛍光励起を、少なくとも二つの脱離された 時点（速度）で読むことによって測定される。また、速度および加速度の両者を 測定することが必要なときは、異なった時点で少なくとも三つの測定が行われる 。もし、この測定値が前記確認値よりも低いならば、該パネルは更に所定時間の インキュベーションに戻され、その後に再度レゾルフィンの蛍光励起値がめられ 、またパネル確認試験が繰り返される。これは、パネルが読みを確認し、または パネルが欠陥品で読みを確認できないことがデータから判明するまで続けられる 。

パネル読取り確認試験をバスした後、既に測定されたレゾルフィン生成の動的特 徴の値は、更に所定時間後に追加の測定を行うことによって、または既に得られ たデータ値を用いることによって、陽性増殖対照ウェルおよび試験ウェル内での レゾルフィンの動的生成値を算出するために用いられる。

試験ウェルの値はＴ′で示され、増殖対照ウェルの値はＧ′で示される。厳格な 数学的解釈によれば「ダッシュ」表示は速度を意味するが、ここでの「ダッシュ 」を付した表示の使用は、動的特徴を速度測定に限定しようとする意図からでは ない。変化速度および変化速度の加速度の両者について、Ｔ′およびＧ′の値に 用いられ得るものと理解されなければならない。

これらの値が測定された後、Ｔ′およびＧ′の所定の関数的組合わせとして、好 ましくはこれら二つのパラメータの比を含む関数として、試験変数工の値が計算 される。次いで、あらかじめ選択された判定アルゴリズムにおける試験変数の値 を用いて、試験結果が報告される。判定アルゴリズムは、可視光読取りプロトコ ールで用いられるような所定の正および負の判定値ＸＰ及びＸＮを利用する。再 び、これらの値は公知の試験結果を生じる微生物を用いた対照試験で得られたデ ータから、経験的に決定される。

試験モジュール及び試験化学物質サブセット（図９−１２）図９は、増殖対照ウ ェル１０１および１０２と試験ウェル１０３の夫々において試験モジュールを形 成することによって、本発明の一般的方法が好まし〈実施されることを示してい る。図示のように、増殖対照ウェルの夫々に試験モジュール１０７及び１０８が 形成され、夫々のケースにおける試験モジュールはＴＭＢ型である。試験モジュ ール１０９は試験ウェル１０３に形成される。そのタイプはＴＭＢ型であり、こ れはその中に異なった試験化学物質セットを有することを示している。試験モジ ュール１０７及び１０８の夫々は、その中に試験化学物質サブセットＴＣＢＩを 有し、また試験モジュール１０９はこれと同じ試験化学物質サブセットに加えて 抗菌生成物を有する。この試験化学物質サブセットは、試験化学物質セット構成 成分のサブセット乾燥固体を具備しており、好ましくは上記試験化学物質、即ち レザズリン、増殖培地、緩衝液およびレドックス安定剤の全てを含んでいる。

ウェル内に試験モジュールを形成した後、各ウェルに所定容量の液体を分注する ことにより、これらは再水化される。

陰性増殖対照ウェル１０１は、試験化学物質サブセットＴＣＢ２のみを含有する 液１１０の所定容量で再水化される。陽性増殖対照ウェルおよび試験ウェルは、 試験化学物質サブセットＴＣＢ２と共に微生物を含有する、接種器１１１内の所 定容量の液１１２．１１３で再水化される。試験化学物質を試験モジュールおよ び再水化液に分割することは、インキュベーションに先立って各ウェル内に最終 的な試験化学物質溶液を達成するプロセスにおいて、本発明の方法が実質的なフ レキシビリティ−をゆうすることを示している。試験化学物質の好ましいセット は種々のサブセットに分割され得、一つのサブセットは試験モジュールに、他の サブセットは再水化溶液に用いられる。好ましい方法には、試験モジュールの全 ての試験化学物質をウェル内に置き、これによって再水化液は陰性増殖対照ウェ ルのための所定容量の単純な滅菌液とし、また他のウェルのための接種用として は微生物が懸濁された所定容量の同じ液体とすることが含まれる。なお、試験モ ジュールは異なったステップで再水化および接種され得ることが理解されなけれ ばならない。

好ましい方法において、増殖対照ウェルの夫々の試験モジュールにおける試験化 学物質サブセットは同一である。しかし、本発明の方法は、陰性増殖対照ウェル に陽性増殖対照ウェルとは異なった試験化学物質サブセットを用いて実施できる ことを理解すべきであるまた、陽性増殖対照ウェルおよび試験ウェルに異なった 試験化学物質サブセットを用いることも可能であるが、これは再水化接種液の調 整を複雑にするから、好ましいアプローチではない。

試験モジュールの別の形態 図１０に示したように、ウェルの試験モジュールはパネル１００−２自体のウェ ル壁に直接形成された、試験化学物質の所定容積の乾燥固体の形をとり得る。こ れは次のようにして行うことができる。即ち、試験化学物質サブセットＴＣＢ１ の成分を増殖対照ウェルの夫々に分注し、また該サブセットに加えて抗菌生成物 を試験ウェルに分注し、次いで例えば凍結乾燥によりパネルを乾燥して、所定容 積の乾燥固体として試験化学物質をウェル壁に捕獲する。

図１１は、ウェルに形成された試験モジュールが、担体１１７．１１８及び１１ ９のような担体の形をとり得ることを示している。夫々の場合における該担体の 好ましい形は、既述したディスク拡散試験に用いたのと同じ型の吸着紙ディスク である。もし、それらが一般的に吸着紙ディスクに被検し得る特性を有するなら ば、他の形の担体も使用し得る。この担体は、試験パネルの製造に便利な方法で 配設できることが必要である。

吸着紙ディスクを用いて試験モジュールを調製する方法を、以下に説明する。

図１１では各ウェルに単一の担体が用いられるが、図１２ａでは夫々のウェルに 二つの担体が用いられ、各担体はそこに担持された試験モジュール中に形成され た試験化学物質のサブセット部分を有している。これは、例えば本発明の方法が 二つの吸着紙ディスク（一方はレザズリンを担持し、他方は増殖培地を担持する ）を用いて実施できることを示している。この方法は、ウェル内に試験モジュー ルを形成するプロセス中、特にディスクを乾燥する間に、これら二つの試験化学 物質成分間における相互作用を回避する。

定性的感受性試験装置（図１３−１６）図１３−１６は定性的感受性試験装置、 即ち、抗菌剤の第−量および第二量を含む所定の定性的感受性試験プロトコール を利用して、抗菌剤物質による増殖阻害に対する微生物の定性的感受性試験に、 本発明を適用する原理を示している。

試験パネル２００は陰性増殖対照ウェル２０１、陽性増殖対照ウェル２０２およ び一対の試験ウェル２０３，２０４を定義している。試験モジュール２０５は、 増殖対照ウェルの夫々に担持される。試験モジュール２０６及び２０７は、前記 一対の試験ウェルに担持される。

図１３は、試験モジュールの中に試験化学物質セットの全ての化学成分が含まれ るような、本発明の好ましい形を例示している。しかし、先に述べたように、試 験化学物質は試験モジュール及び再水化液の間に分割してもよいことが理解され るべきである。また、図１３は単一の吸着紙ディスクを各試験モジュールのベー スを形成する担体として使用することを示している。しかし、先に議論した試験 モジュールの何れの形も、本発明に従う定性的感受性試験装置に使用し得ること を理解すべきである。

例えばレザズリンを含むものにはＲ１緩衝液にはＢ１増殖培地にはＧルドックス 安定剤にはＳのように、夫々の試験モジュールにはラベルが施される。加えて、 試験モジュール２０６にはＡ１で示される第一の量、の抗菌生成物が含まれ、ま た試験モジュール２０７にはＡ２で示される第二の量の抗菌生成物が含まれる。

説明のために、Ａ２は定性的感受性試験プロトコールにおける抗菌剤の二つの濃 度のうちの高い方の濃度を表わすものとする。

陰性増殖対照ウェルにおける試験モジュール２０１は、全体の接種システム２１ ０の一部を形成する所・定容量の再水化液２０８で再水化される。試験モジュー ル２０５，２０６゜２０７の夫々には、微生物の懸濁液と共に所定容量の再水化 液で再水化が適用され、これらのウェルに接種が形成される。

再水化の後、試験パネル２００は該パネルについて用いられる予め選択された読 取りプロトコールに関連した所定の培養時間の間、インキュベータ中におかれる 。

試験結果の読取り 図１４−１６は、試験パネル２００のための可視光読取りプロトコールを示して いる。なお、既述した全てのマニュアル及び自動読取りプロトコールは、パネル ２００の読取りに適用し得る。

図４−６に戻って説明すると、試験パネルの全てのウェルにおける前インキュベ ーションの色は青である。また、陰性増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェル を用いて、同じパネル読取り確認試験が適用される。ここでは重複を避けるため に、これらについては繰り返さない。またこの説明において、該パネルは陰性増 殖対照ウェルが青色を示し、陽性増殖対照ウェルが赤色を示す正確な読取り確認 試験をパスしたと仮定している。

図１４において、パネル２００Ａは試験ウェル２０３゜２０４の両者において赤 色を呈し、両方のウェルでの微生物増殖を示す。この定性的感受性試験の対応試 験結果は、試験された微生物は耐性であること、即ち、試験ウェル２０７でのよ り高い抗菌生成物濃度Ａ２による増殖阻害に対して感受性でないことである。図 １５において、パネル２００Ｂは試験ウェル２０３で赤色を呈して微生物増殖を 示すが、試験ウェル２０４では青色を呈して増殖阻害を示す。この場合、微生物 が感受性でも耐性でもないから、その結果は決定不能で受性に関する情報を与え 得ないものと誤解してはならない。

この試験結果は、単に微生物が高度に感受性でも高度に耐性でもないことを意味 するだけであり、これは関連の医者に対して、著しく高濃度の当該抗菌生成物に よって上首尾の薬物療法が達成され得ることを指示するものである。

図１６において、パネル２００Ｃは試験ウェル２０３゜２０４の両者において青 色を呈し、両方のウェルで微生物増殖が阻害されたことを示す。これに対応する 結論は、比較的低濃度の抗菌生成物によって微生物増殖が阻害されることを示す 「感受性あり」である。

定量的感受性試験装置（図１７−１０）図１７−１９は定量的感受性試験装置、 即ち、抗菌剤の異なったＮ個の量（Ｎは２よりも大きい数、典型的には６以上） を含む所定の定量的感受性試験プロトコールを利用した、抗菌剤物質による増殖 阻害に対する微生物の定量的感受性試験における、本発明の原理の適用を示して いる。定量的感受性試験のための現在のＦＤＡ標準は、治療的ヒト投与量範囲の 幾つかの部分をカバーする、抗菌生成物の最小限５個の稀釈液である。

試験パネル２３０は陰性増殖対照ウェル２３１、陽性増殖対照ウェル２３２、並 びにこの場合には四つの試験ウェル２３３−２３６を定義している。ここでは、 説明の便利のために四つの試験ウェルが用いられている。多数の試験ウェルを用 いることについては、本発明の定量的感受性試験の原理を組み込んだ試験キット に関連して後述する。試験モジュール２３７は、増殖対照ウェルの夫々に担持さ れる。四つの異なった試験モジュール２３８−２４１が、四つの試験ウェル内に 担持される。上記の定性的感受性試験の説明と同様に、ここでの試験モジュール は、単一の吸着紙ディスクの形の担体を用いた本発明の好ましい形を示している 。この好ましい形において、試験化学物質セットの全ての成分は試験モジュール の夫々に担持され、また試験ウェル内の試験モジュールは抗菌生成物の四つの異 なった量（即ちＡ　Ｉ−Ａ４）を担持する。この説明のために、抗菌生成物の量 はＡ１からＡ４にまで順次増大しているものとする。なお、本発明のどのような 別の形態も、図９−１２に関連して既述したように、ここでも用いられ得る。

試験モジュール２３１は、全体の接１種システム２４５の一部を形成する所定容 量の再水化液２４２で再水化される。他のウェル内の夫々の試験モジュールは、 ウェルについて個々の接種容量２４６−２５０で微生物が添加された所定容量の 再水化液で再水化される。特定の接種システムについては、本発明の試験キット に関連して後述する。再水化および接種の後、パネル２３０は、該パネルについ て用いられる予め選択された読取りプロトコールに関連した所定の培養時間だけ 培養器内に置かれる。

ＭＩＣ値としての読取り試験結果 図１８及び１９は、試験パネル２３０のための可視光読取りプロトコールを示す 。なお、既述した全てのマニュアル及び自動読取りプロトコールは、パネル２３ ０の読取りにも適用され得ることを理解すべきである。

図４−６に戻って説明すると、試験パネルの全てのウェルにおける前培養色は青 であることを理解しなければならない。

また、同じパネル読取り確認試験は、陰性増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウ ェルを用いて適用される。これらについては、重複を回避するために、ここでは 繰り返さない。またこの説明は、該パネルが陰性増殖対照ウェルが青色を呈し、 陽性増殖対照ウェルが赤色を呈する正確な読取りのための確認試験をパスしたと 仮定している。図１８に示すように、パネル２３０Ａは最初の三つの試験ウェル ２３３−２３５の夫々において青から赤への色変化を示し、これは三つの夫々の 試験ウェルにおける微生物の増殖を示す。試験ウェル２３６は元の青色を示し、 この試験ウェルでは微生物が増殖しないことを示す。この読取りから得られる試 験結果は、該試験パネルに用いられた抗菌生成物のＭＩＤが濃度Ａ４であること を示している。なお、濃度Ａ４は、接種および試験化学物質の再水化後の最終試 験溶液中における、試験モジュール中の抗菌生成物の量および抗菌生成物濃度の 両方に関係する。

図１９に示すように、パネル２３０Ｂは最初の試験ウェル２３３においてのみ青 から赤への色変化を示し、他の三つの試験ウェル２３４−２３６では元の青色で ある。これは最初の試験ウェルでのみ微生物が増殖し、他の三つのウェルでは増 殖が阻害されること、即ち、この場合のＭＩＣ値はＡ２であることを示す。この 試験は微生物の増殖を阻害する抗菌生成物の最低濃度がＡ２であることを示して いるから、Ａ２はＭＩＣ値である。

定性的感受性試験キット（第２０図〜第２３図）第２０図〜第２３図は、本発明 に従う定性的感受性試験キットを示し、また、本発明の方法を実施する上で、本 試験キットの部品が、いかに使用されるかを示すものである。完全のために、第 ２０図は、主要培養プレート２５５を示し、その上に試験すべき微生物のコロニ ーが増殖されるものであるが、この主要培養プレートは、本発明の試験キットの 部分とは見なされない。第２０Ａ図に示される試験キットの部品は、再水化液体 の容器２６１．接種物調製トレー２６２、接種システム２６３、および前述した ように適切な試験モデュールで試験ウェルがあらかじめ充填されているところの 試験パネル２６４である。

容器２６１中の再水化液体は、前述したようなパネル２６４のウェル内の試験モ デュール中にはない試験薬品ＴＣＢ２のサブセットを含有する。このましい態様 において、セット中のすべての試験薬品は、試験モデュール内にあり、再水化液 体は、蒸留水のような予め選択された殺菌した液体である。

これは、また、０．９％塩化ナトリウム溶液を含んでいてもよく、微生物の均一 な懸濁物を作る上で助けとなる種々の湿副剤を含んでいてもよい。

接種物調製トレー２６２は、主要培養プレート上に増殖しているコロニーからの 微生物を再水化液体と混合して、陽性増殖対象ウェルおよび試験ウェルＴ１およ びＴ２用の接種物を生成させるために都合のよい形状に成形され得る。接種物調 製トレーの形状は、接種システム２６３の構造および操作に適合する必要がある 。接種システム２６３は、標準的な多チツプピペットシステムを備えていてもよ いし、接種物を試験パネル中に分配するために特別に設計されてもよい。図示の ように、接種システムは、再水化液体を陰性増殖対象ウェル中に分配するための 接種手段、および接種物を陽性増殖対象シェル中に分配するための手段を含む。

試験パネル２６４は、図示のように予め充填された試験モデュールを担い、定性 的感受性試験のための２つの試験ウェルは、この場合、単一の抗菌生成物を用い ている。試験キットは、ｌの抗菌生成物での定性的感受性試験を示すＱＬＳ−１ −Ａと表示される。第２１図は、それぞれ抗菌生成物と関連する一対の試験ウェ ルでＭの異なる抗菌生成物を用いて微生物の定性的感受性に有用であり、適切な 濃度の抗菌生成物を有する試験モデュールで予め充填された予備充填試験パネル ２７５を示す。第２１に示されているように、試験モデュールのそれぞれは、好 ましくは、試験モデュール中の抗菌生成物の名称と、その中の抗菌生成物の濃度 を表示する視覚的に読取り可能な説明文で標識された単一の吸収紙ディスクであ る。表示Ａ１は、ディスク上に印刷された第１の抗菌生成物の名称を表し、表示 に１は、ディスク上に印刷された濃度を表す。

第２０Ｂ図は、ＱＬＳ−１−Ｂと表示された試験キット２７０を示し、そこにお いて、キット２６０における予備充填試験パネルの代わりに裸の試験パネルが用 いられている。キット２７０の付加的な部品は、試験モデュールＴＭＡ　２７２ をパネル２７４の陰性増殖対象ウェルおよび陽性増殖対象ウェル中に分配するた めの増殖対象試験モデュール分配器２７１、および試験モデュールＴＭＢ１およ びＴＭＢ２を試験ウェルＴ１およびＴ２に分配するためのＡＰ試験モデュール分 配器２７３を含む。分配器２７３は、この２つの異なる試験モデュールを、交互 に間に差し込むように収容し、ディスク分配機構の２つの連続的作動が２つの試 験ウェルの充填に関与するようにする。分配器２７１および２７３は、吸収紙デ ィスクの形態にある、本発明に従って試験モデュールで充填された標準的な抗生 物質ディスク分配器であり得る。

間に差し込まれるディスクの代わりとして、第２０Ｂ図に示される単一分配器が ある。一方が１のＡＰ試験モデュールを貯蔵し、これをそれに関連する試験ウェ ル中に分配する２つの別々の分配器を使用できることは明らかである。また、キ ット２７０は、試験モデュールをいくつかの試験パネル中に分配できる分配器と 協働する複数の試験パネル２７４を包含してもよい。

試験パネル２７４は、１の抗菌生成物での試験のために構成されている。第２２ に示すように、陰性増殖対象ウェル、陽性増殖対象ウェルおよび複数の抗菌生成 物のための複数対の試験ウェルを規定する試験パネル２７６も、また、本発明の 試験キットに使用できる。試験パネルを充填するために、タイプ２７１の一方の 分配器が増殖対象ウェルのために使用され、抗菌生成物のそれぞれのためのタイ プ２７３の一方の分配器が各抗菌生成物のために試験ウェルを充填するために使 用される。試験パネル２７６に対し、一度にウェルの全列を充填できる試験モデ ュール分配器を提供することが好ましい。

第２３図は、複数の抗菌生成物に対して微生物の定性的感受性を試験するための 本発明の試験キットは、予備充填パネルセクションおよび充填可能なパネルセク ションの両者を含むパネルを使用できることを示している。このタイプの試験パ ネルを有する試験キットは、実質的にすべての試験状況において通常使用されて いる抗菌生成物のための予備充填試験ウェルの好都合性と、個々の試験状況に関 した使用者の要求に合わせた抗菌生成物を有する試験パネルの一部を受注製産す る目的のために使用者が抗菌生成物を選定するという柔軟性を併せ持つ。充填可 能な試験ウェルを有する試験キットは、より新たな抗菌生成物を、それが開発さ れるにつれ、その様な抗菌生成物が製造者からの予備充填パネルに含められるこ とを待つことなく、含めるように試験パネルを構成する上で特に有利である。

定量的感受性試験キット（第２４図〜第２９図）第２４図〜第２９図は、本発明 に従う定量的感受性試験キットを示す。第２４Ａ図を参照して、そこに示されて いる試験キット２８０は、再水化液体の容器２８１、接種物調製トレー２８２、 接種システム２８３、および予備充填試験パネル２８４を備えている。これら試 験キット部品の形状および機能は、第２０Ａ図における試験キットに関して既に 説明した対応する部品と一般的に同じであり、その説明はここで繰り返す必要は ない。

第２４Ｂ図は、第２４Ａ図におけるキット２８０と同様のものであるが、裸の試 験パネル２９４を使用し、試験モデュール分配器２９１および２９３を含む試験 キット２９０を示す。分配器２９１は、増殖対象試験モデュールをパネル２９４ の増殖対象ウェル中に分配する。分配器２９３は、ＡＰ試験モデュールをパネル ２９４の試験ウェル中に分配する。図示のように、分配器２９３は、分配器の４ つの順次の作動が、ディスクの形態の４つの異なる試験モデュールを４つの試験 ウェル中に分配するために使用されるように積重された４つの試験ウェルのため の試験モデュールを有する。第２５図は、それぞれがその中に単一濃度の抗菌生 成物を有する単一タイプのＡＰ試験モデュールを含有する４つの別々の分配器２ ９５〜２９８を用いた他の例を示している。これら４つの分配器は、独立に動作 される得るか、あるいは、それらが、４つのディスクを同時に分配するために４ つのすべての分配器を保持しかつ各分配器における分配フィンガーを同時に動作 させる単一の作動機構を有する総合分配システム中に結合されてもよい。

第２６図は、陰性増殖対象ウェル、陽性増殖対象ウェル、および各列が複数の抗 菌生成物の１と関連しかつ指示された適切な抗菌生成物および異なる濃度を有す る試験モデュールで予め充填されたＭ列ｘＮ行アレーの試験ウェルを規定する予 備充填試験パネル３００を示す。

第２７図は、同一の総合試験能力を有する対応する充填可能な試験パネル３０１ を示す。第２８図に示されているように、Ｍの独立の分配器３０２〜３０６は、 それぞれ、使用者が選択できる抗菌生成物に関連するＡＰ試験モデュールの順次 の積重を有し、試験パネル３０１の充填に使用できる。

第２９図は、ＭＩＸＮアレーの予備充填試験ウェルおよびＭ　２　ｘ　Ｎアレー の充填可能な試験ウェルを有する試験パネル３１０を示す。第２８図に示される 試験モデュール分配器は、ＡＰ試験モデュールをパネル３１０の充填可能な試験 ウェルセクションに分配するために使用できる。試験パネル３１０は、上記した 定性的感受性試験エリアのための試験パネル２７７と同じ利点を定量的感受性試 験エリアにおいて提供する。

部品の特徴および製造プロセス 試験パネル 本発明に環して使用されるマルチウェル試験パネルは、好ましくは、白色の不透 明プラスチック材料から形成される。

そのようなパネルは、光読取りおよび蛍光読取りの双方に対しより低濃度のりザ ズリンの使用を許容する。より低濃度のりザズリンは、微生物により毒性が少な く、したがって試験結果に対するリザズリンの潜在的影響を最小限にする。パネ ルの白色壁から反射した光強度は、可視光および蛍光読取りの双方に利用できる 信号を増大させる。白色パネルは、パネルの読取り用の背景照射装置の必要性を 排除し、より堅実で正確な視覚的判断をもたらすところの均一な読取り背景を提 供する。色のより小さな差異が、白色背景により識別できる。

白色パネルは、光学的透明性が要件でないので、より安価なプラスチック材料と プラスチックパネル成形技術により製造できる。

接種および再水化システム 本発明を凍結パネル中で用いる場合、試験パネルは、単に、少体積（５〜１０ｍ １）を接種シードトラフからパネル中の各試験ウェルへ移送するマルチプロング 接種物移送装置で接種され得る。

本発明を乾燥したパネル中で用いる場合、接種には２つの任意の方法がある。ま ず、パネルのすべてのウェルを、その中に微生物を持たないある体積量の再水化 液体で再水化することができる。次ぎに、試験ウェルの接種を、凍結パネルに関 して上に述べたように実施する。

あるいは、まず、予め調節した濃度の微生物を再水化液体中に置き、ついでこの 接種物液体の一定体Ｍｌｋを各試験ウェル中に分配することにより、再水化と接 種とを同時に行うことができる。

試験モデュール 本発明の好ましい態様は、試験薬品のセットのすべての成分、すなわち、リザズ リン、増殖培地、バッファー（必要により）、およびレドックス安定剤をパネル の試験ウェル中の試験モデュール中に置くことを含む。ここでの全体の記述を簡 単にするために、試験モデュールおよび試験モデュールを含むパネルを製造する プロセスの説明は、この方法に限定することにする。

凍結パネル 本発明の方法および装置を凍結パネル中に含めるためには、リザズリンを試験薬 品群の適切な安定化成分と共に、増殖培地および抗菌生成物希釈と一緒または別 々に、試験ウェル中に分配する。

乾燥パネル 乾燥したパネル中で試験モデュールを作る方法は、試験薬品成分がウェルの壁に おいて乾燥されてウェル自体の壁上に乾燥固体体積の形態の試験モデュールを形 成すること以外は、凍結パネルに対するものと同じである。乾燥は、強制空気ま たは真空中で行うことができる。試験薬品成分の調整は、試験モデュールが乾燥 形態にある場合は、より重要である。リザズリン、抗菌生成物、および増殖培地 の濃度が、乾燥が完結近くなるにつれ非常に高くなるからである。これらの状況 下では、溶液のｐＨの適切な緩衝、および増殖培地の還元作用の安定化が重要で ある。吸収紙ディスクの形態の試験モデュールを製造するプロセスに使用するた めの以下記載する薬品調製が、乾燥させなければならない試験ウェル中の液体の 体積を減少させるために乾燥パネル中に好ましく使用される。

吸収紙ディスク ディスク中に乾燥した形態で捕捉される試験薬品セットの成分を用いて紙ディス クを製造するために、種々の方法が採用できる。一般に、大量生産のためには、 抗菌生成物および濃度を同定する銘をあらかじめ印刷した紙デイスク媒体のシー トをバッチ式に試験薬品溶液で含浸し、乾燥し、ついでディスクに切断し、包装 する。重ねた連続希釈ディスク包装の場合には、異なる濃度の抗菌生成物を有す る紙媒体のスタックを一回の操作でディスクに切断し、ついで包装することが好 ましい。

少量のディスクを製造するためには、以下の方法を採用できる。ある体積量のデ ィスク充填溶液を作る。紙ディスクは、わずか２５マイクロリツトルの溶液しか 保持できず、試験ウェル中の再水化液体の最終体積は、１００マイクロリツトル が都合がよいので、ディスク充填溶液中には、４倍濃度の試験薬品を使用する。

具体的には、以下のディスク充填溶液を準備する。ベースの担体溶液は、０．１ モル濃度のｐＨ７，４のホスフェートバッファーである。乾燥粉末の形態にある 標準ミューラーーヒントンブロスである増殖培地を１リットル当り８８．０グラ ム加える。リザズリンを加えて１リットル当り０．０２グラムの濃度を達成する 。レドックス安定剤として作用するフェロシアン化カリウムを０．００４モル濃 度まで加える。ついで、この溶液を試験モデュールディスク中に含めるべき抗菌 生成物用の希釈剤として使用する。抗菌生成物の初期濃度は、再水化後の試験ウ ェル中に望む最終濃度の４倍であるが、抗菌生成物のディスクへの不可逆結合を 補正するために調節される。換言すると、ディスク中の乾燥試験薬品を再水化す る場合、抗菌生成物の全量は、再水化液体に入らない。ディスク中に結合した抗 菌生成物は、微生物に対して活性でない。

リザズリンの濃度は、微生物の陽性および陰性増殖間の高い視覚的コントラスト のために、明るい青色出発色を生じさせるように選択される。より高い濃度のリ ザズリンは、幾つかの微生物に対して毒性を高め、微生物の増殖に応答した識別 できる視覚的色変化を減少または遅延させる。より低い濃度のりザズリンは、陽 性および陰性試験ウェル反応間に劣ったコントラストをもたらす、すなわち、微 生物がわずかな程度に増殖しているウェルの色が、色変化として容易に識別でき ない。これらの記述は、全て、試験パネルの視覚的読取りに関するものであり、 リザズリンの濃度は、蛍光励起読取りプロトコルにとっては、さほど重要でない 。

増殖培地の濃度は、これらタイプの試験パネルに使用されている標準的濃度であ り、これを変える理由はない。濃度の低下は、増殖速度を遅くし、増加は、増殖 速度を早めずに、接種および乾燥中に増殖培地の自動還元傾向を悪化させる。

標準的ミューラーーヒントン以外の増殖培地も使用できるが、それらは、今や標 準的なミューラーーヒントンブロスの性能特性に合致すべきであることを理解す べきである。。

バッファーは、ｐＨのシフトと、それに伴う、特に乾燥プロセス中で高濃度の酸 性抗菌生成物による試験ウェルまたは試験モデュール間の色の不均一を防止する ために十分な濃度で使用される。ｐＨ７，４が使用される。これが、この用途に 使用される場合にミューラーーヒントンブロスに推奨されたｐＨであるからであ る。バッファーの濃度は、特に乾燥中にｐＨの安定性を提供するために要する最 小に維持される。

高すぎるモル濃度は、リザズリンのりゾルフィンへの還元を遅らせ得、試験結果 の一貫性に悪影響を及ぼすので、避けるべきである。

レドックス安定剤は、乾燥および接種プロセス中のりザズリンの自己還元を許容 できるレベルに抑制するために十分な濃度で使用される。フェロシアン化カリウ ムが、微生物への比較的低い毒性と、適切な酸化／還元電位範囲での安定化能力 故に選択された。濃度は、微生物増殖による酸化／還元反応の過剰の安定化を避 けるように選択される。これは、試験結果を遅延させおよび／またはその正確さ に悪影響を及ぼすからである。

ディスク重点溶液をディスク中に充填するプロセスは、殺菌した原料を用いた無 菌処理を含む。一群のディスクを蓋付きペトリ皿のような蓋のできる容器内で、 端部が触れないように単一層に置く。各ディスクにディスク充填溶液２５マイク ロリツトルを分配するためにマイクロピペッタ−を使用する。

ついで、容器に蓋をし、−７０℃の冷凍話中に一装置く。

次に、容器を凍結乾燥室に移し、ディスクを真空中で乾燥する。ついでこれらを 取り出し、乾燥剤カプセルを収容する蓋付きバイアル中に置き、暗い冷凍環境下 に貯蔵する。

ディスクを試験クセブチクル中に充填するために、ディスクをここに無菌的に移 す。この方法は、臨床試験等に使用される試験パネルの少量生産に使用できるが 、予備充填試験パネルを多量に製造するためには、ディスクの大規模自動製造お よび自動パネル充填技術が用いられる。

試験パネルの自動読取り（第３０図〜第３４図）第３０図は、可視光読取りプロ トコルまたは蛍光励起読取りプロトコルのいずれかを用いた、本発明の方法およ び装置を含む試験パネル読取りのための自動化読取りシステムに使用される一般 の部品を示す。接種後、試験パネルを、各試験ウェルを読取り装置電子機器と共 に読取り源および検出器によって読み取られるように設定する走査テーブル上に 置く。

電子機器からのデータは、好ましくは、データ解析コンピューターに接続し、そ こで、関連する読み取りプロトコルのアルゴリズムを試験パネル中の各ウェルか らのデータに適用する。

第３１図は、可視光読み取りプロトコルを実施するための可視光反射読み取りの 場合において、そのような読み取りプロトコルを設計および構築するための方法 に単一のフィルターが使用でき、本発明に関係するその実施化は、既知のデータ 収集およびプロトコル発生原理の単純な適用を含むことを示すものである。

本発明の方法および装置を種々の態様にしたがって説明したが、以下の請求の範 囲に記載した本発明の範囲を逸脱することなく多くの変更および適合化を行うこ とができることを理解すべきである。

表１ ディスク拡散試験の結果の例 ディスク　抗菌剤の　測定直径　試験結果ラベル　フルネーム Ｅ　エリスロマイシン　Ｏｍｍ　耐性 ＣＬ　セファロチン　２９ｍｍ　感受性３０　３０グラム ＶＡ　バンコマイシン　１８ｍｍ　感受性３０　３０グラム ＣＺ　セファゾリン　２４ｍｍ　感受性３０　３０グラム Ｐ　ペニシリン　１０ｍｍ　耐性 １０　１０単位 表２ 抗菌生成物の例および濃度 ウェル　抗菌剤の　ウェル内の濃度 ラベル　フルネーム　（ｍｃｇ／ｍｌ）低　高 ２希釈区画 Ａｍ　アンピシリン　０．５８ Ｃｆｍ　セフ７マンドール　８　１６ Ｃｆｚ　セファゾリン　８　１６ Ｃｚ　セフチゾキシム　８　３２ Ｃｆ　セファロチン　８　１６ Ｃクロラムフェニコール　８　１６ Ｃｐ　シブロフロキサチン　１２ Ｃｄ　クリンダマイシン　０．５　４ Ｅ　エリスロマイシン　０．５４ Ｃｍ　ジエンタマイシン　４８ Ｐ　ペニシリン　０．５８ Ｒｉｆ　リフアンピン　２４ Ｔｅ　テトラサイクリン　４８ Ｔ／Ｓ　トリメトプリン／ スルフ７メトキサゾール　２　３８ Ｔ／Ｓ　トリメトプリン／ スルファメトキサゾール　３８　１５２単一希釈区画　希　釈 Ｇｍｓ　ジエンタマイシン シナギーースクリーン　５００ ０ｘ　オキザシリン　２ Ｃｐ−Ｕ　シプロフロキサチンー ウリナリ　８ Ｆｄ　ニトロフラントイン　６４ Ｎｘｎ　ノルフロキサチン　１６ Ｓｘ　スルファメトキサゾール　２５６、ＬＬ−ｔ、ベフイルケー ＣＦＬＪ　、ノ１す、東り臘、ｌ、Ｌｒウク人＋＝Ｊ−ソ、ｙｔ４先しヒ　ξ、 　Ｃ０ＬＩ　Ａ地會Ｉ（竹　驕　（吟　） ＦＩＧＵＲＥ　３３ しはア７人応渣し」すＪ・ＩＬＩヒ 、ヌー久二ｙｂｌＬの７僧ンＬ１ベレ簸唸　Ｔ　（竹　） 国際調査報告

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．予め選択された濃度の抗菌生成物による増殖阻害に対する微生物の感受性を 試験する方法において、ａ．陰性増殖対照容器および陽性増殖対照容器の各々に 、予め設定された濃度の微生物用増殖培地・および予め設定された濃度のレザズ リンであって、該濃度が微生物に対する低毒性と微生物増殖の代謝生成物による レゾルフィンヘの還元に対する実質的な感受性を特徴とする濃度範囲内に予め決 定されているレザズリンを分与する工程、ｂ．陽性増殖対照容器に予め設定され た濃度の微生物を分与する工程、 ｃ．試験容器に予め選択された濃度の抗菌生成物を分与する工程、 ｄ．試験容器に予め設定された濃度のレザズリンを分与する工程、 ｅ．試験容器に予め設定された濃度の増殖培地を分与する工程、 ｆ．試験容器に予め設定された濃度の微生物を分与する工程、 ｇ．全ての容器を、可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み取りプロトコ ルのうちの１種を含む予め選択された読み取りプロトコルに関係するインキュベ ーション時間で、一緒にインキュベートする工程、 ｈ．インキュベーション時間の後、予め選択された読み取りプロトコルに従って 容器を読み取り、レザズリンおよびレゾルフィンの相対濃度に基づいて試験容器 における微生物の増殖の有無を決定する工程であって、可視光読み取りプロトコ ルが、各容器において検出された可視光レフレクタンスの色の予め決定された関 数的な組み合わせの少なくとも１種に基づく決定アルゴリズムを含み、蛍光励起 読み取りプロトコルが、各容器において還元生成物であるレゾルフィンにより生 じる蛍光放射信号の値の予め決定された関数的な組み合わせの少なくとも１種に 基づく決定アルゴリズムを含む工程、を具備する方法。
2. ２．工程ｃないしｆを、 ｊ１）予め設定された量の抗菌生成物の乾燥固体容量、およびレザズリンおよび 増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分の予め選択されたサブセットの乾 燥固体容量を有する試験モジュールを試験容器内に形成し、ｊ２）工程ｇを行な う前に、予め設定された濃度の微生物、および試験モジュールに含まれていない 試験化学物質の全ての構成成分を含有する一定量の液体を試験ウェルに分与して 試験モジュールを再水化する、 ことにより行なう請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．試験化学物質セットが、再水化した試験化学物質溶液の最終ｐＨを制御する ための予め選択された緩衝剤、および工程ｇにおける増殖培地によるレザズリン の還元を実質的に抑制することを特徴とする予め選択されたレドックス安定化剤 を含む請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．工程ｊ１）を、 ｋ１）予め選択された濃度の抗菌生成物、予め設定された濃度のレザズリン、予 め選択された緩衝剤、および予め選択されたレドックス安定化剤を有する、予め 設定された容量の液体を担持媒体上に分与し、 ｋ２）担持媒体を乾燥させて、抗菌生成物、レザズリン、緩衝剤、およびレドッ クス安定化剤を乾燥固体成分として捕獲し、 ｋ３）工程ｋ１）およびｋ２）を行なう前もしくは後のいずれかに、試験容器内 に担持媒体を置く、ことにより行ない、かつ工程ｊ２）を、１１）予め設定され た濃度の増殖培地および予め設定された濃度の微生物を含む一定置の液体を試験 容器内に分与して、担持媒体中の乾燥固体成分を再水化する、ことにより行なう 請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．工程ｊ１）を、 ｋ１）予め選択された濃度の抗菌生成物、予め設定された濃度のレザズリン、予 め設定された濃度の増殖培地、予め選択された緩衝剤、および予め選択されたレ ドックス安定化剤を有する、予め設定された容量の液体を担持媒体上に分与し、 ｋ２）担持媒体を乾燥させて、抗菌生成物、レザズリン、増殖培地、緩衝剤、お よびレドックス安定化剤を乾燥固体成分として捕獲し、 ｋ３）工程ｋ１）およびｋ２）を行なう前もしくは後のいずれかに、試験容器内 に担持媒体を置く、ことにより行ない、かっ工程ｊ２）を、１１）予め設定され た濃度の微生物を含む一定量の液体を試験容器内に分与して、担持媒体中の乾燥 固体成分を再水化する、 ことにより行なう請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．工程ａを、 ｊ１）予め設定された濃度のレザズリン、予め設定された濃度の増殖培地、予め 選択された緩衝剤および予め選択されたレドックス安定化剤を含む予め設定され た濃度の液体であって、予め選択された緩衝剤がこの液体のｐＨを制御するため に予め設定された濃度を有し、予め選択されたレドックス安定化剤が工程ｇでの 増殖培地によるレザズリンの還元を実質的に抑制することを特徴するものである 液体を、１対の担持媒体の各々に分与し、 ｊ２）担持媒体の各々を乾燥させて、レザズリン、増殖培地、緩衝剤、およびレ ドックス安定化剤を乾燥固体成分として捕獲し、 ｊ３）工程ｊ１）およびｊ２）を行なう前もしくは後のいずれかに、担持媒体の １つを陰性増殖対照容器および陽性増殖対照容器の各々に置き、 ｊ４）陰性増殖対照容器内に一定量の無菌液体を分与して乾燥固体成分を再水化 する、 ことにより行ない、工程ｃ、ｄおよびｅを、ｋ１）予め選択された濃度の抗菌生 成物、予め設定された濃度のレザズリン、予め設定された濃度の増殖培地、予め 選択された緩衝剤および予め選択されたレドックス安定化剤を含有する予め設定 された量の液体を担持媒体上に分与し、ｋ２）担持媒体を乾燥させて、抗菌生成 物、レザズリン、増殖培地、緩衝剤およびレドックス安定化剤を乾燥固体成分と して捕獲し、 ｋ３）工程ｊ１）およびｊ２）を行なう前もしくは後のいずれかに、担持媒体を 試験容器内に置く、ことにより行ない、工程ｂおよびｆを、１１）予め設定され た濃度の微生物を含む一定量の液体を陽性増殖対照容器および試験容器内に分与 して、担持媒体中の乾燥固体成分を再水化する、 ことにより行なう請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．工程ｇが、容器を一緒に、蛍光励起読み取りプロトコルに関連するインキュ ベーション時間インキュベートする工程を含み、 工程ｈが、蛍光励起読み取りプロトコルに従って容器を読み取る工程を含み、 ｈ１）各容器におけるレゾルフィンの蛍光励起の値を読み取って、陰性増殖対照 ウェルの値をＮとし、陽性増殖対象ウェルの値をＰとし、および試験容器の値を Ｔとする工程、ｈ２）増殖対照パラメータＧｃおよび補正試験パラメータＴｃを 、それぞれＰとＮの値およびＴとＮの値の差として産出する工程、 ｈ３）増殖対照パラメータＧｃおよび補正試験パラメータＴｃの予め設定された 関数的な組み合わせを含む試験変数１の値を産出する工程、および ｈ４）予め選択された決定アルゴリズムにおいて、試験変数Ｉを用いて試験結果 を報告する工程、を具備する請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．工程ｈ３）が、試験変数１をＴｃおよびＧｃの比を含む予め設定された関数 として算出することを含み、かつ工程ｈ４）が、 Ｉが予め決定された陽性決定値ＸＰ以上である場合には陽性試験結果（微生物増 殖）、 Ｉが予め決定された陰性決定値ＸＬ以下である場合には陰性試験結果（微生物の 非増殖）、および１がＸＰおよびＸしの間にある場合には不確定の試験結果、 のうちの１つを報告することを含み、ここで決定値ＸしおよびＸＰは、既知の試 験結果を生じる微生物を使用する対照試験において得られるデータから経験的に 決定されるものである請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．工程ｇが高速蛍光励起読み取りプロトコルに従って行なわれ、かつ陽性増殖 対照容器において予め決定された割合の微生物の増殖を生じるに十分な時間容器 を一緒にインキュベートすることを含み、予め決定された割合は、この時間内の 少なくとも２つの異なる時点での、陰性増殖対照容器および陽性増殖対照容器に おけるレゾルフィンの蛍光励起の値を読み取ることにより決定されたものであり 、および工程ｈが、 ｈ１）試験容器および陽性増殖対照容器の各々におけるレゾルフィンの生成の予 め設定された動的特性の値を、それらの容器内および陰性増殖対照容器における レゾルフィンの蛍光励起の値を少なくとも２つの異なる時点で測定し、陰性増殖 対照容器からの測定値を補正のために用いることにより決定して、それぞれＴ′ およびＧ′とする工程、ｈ２）Ｉと名付けられ、予め設定されたＴ′およびＧ′ の関数的な組み合わせを含む試験変数の値を算出する工程、および ｈ３）予め選択された決定アルゴリズムにおいて試験変数Ｉの値を用いて試験結 果を報告する工程、を含む高速蛍光励起読み取りプロトコルに従って容器を読み 取ること含む請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．工程ｈ２）がＴ′微よびＧ′の比を含む予め設定された関数として試験変 数Ｉを算出することを含み、および工程ｈ３）が、 Ｉが予め決定された陽性決定値ＸＰ以上である場合には陽性試験結果（微生物増 殖）、 １が予め決定された陰性決定値ＸＬ以下である場合には陰性試験結果（微生物の 非増殖）、および１がＸＰおよびＸしの間にある場合には不確定の試験結果、 のうちの１つを報告することを含み、ここで決定値ＸしおよびＸＰは、既知の試 験結果を生じる微生物を使用する対照試験において得られるデータから経験的に 決定されるものである請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．工程ｇが、可視光読み取りプロトコルに関連する予め決定されたインキュ ベーション時間容器を一緒にインキユベートすることを含み、および 工程ｈが、 ｈ１）徴生物の増殖がないことを示す陰性増殖対照容器におけるレザズリンに由 来する初期青色の識別し得る変化がないこと、およびレザズリンの初期の青色か ら微生物の増殖により引き起こされる還元生成物であるレゾルフィンの生成に由 来する赤色への陽性増殖対照ウェルの実質的な色変化が存在することの検出に基 づき、読み取りのための容器を適格化する工程、 ｈ２）工程ｈ１）に従い、容器が読み取りに適していない場合には、試験の失敗 を報告する工程、およびｈ３）工程ｈ１）に従い、容器が読み取りに適している 場合には、レザズリンの初期の青色からレゾルフィンの赤色への試験容器の実質 的な色変化の有無を検出することにより試験結果を報告する工程であって、この 試験結果は色変化が存在する場合には陽性（徴生物増殖）であり、色変化が存在 しない場合には陰性（微生物増殖）である工程、を含む請求の範囲第１項記載の 方法。
12. １２．工程ｊ１）を、 ｋ１）予め選択された濃度の抗菌生成物、予め設定された濃度のレザズリン、予 め設定された濃度の増殖培地、予め選択された緩行剤および予め選択されたレド ックス安定化剤を含有する予め設定された量の液体を試験容器内に分与し、ｋ２ ）前記容量の液体を乾燥させて、抗菌生成物、レザズリン、増殖培地、緩衝剤お よびレドックス安定化剤を乾燥固体成分として捕獲する、 ことにより行ない、かつ工程ｊ２）を、１１）予め設定された濃度の微生物を含 有する一定量の液体を試験容器内に分与して乾燥固体成分を再水化する、ことに より行なう請求の範囲第３項記載の方法。
13. １３．担持媒体が、吸着紙ディスクおよびこのディスクに捕獲された乾燥固体成 分を含む請求の範囲第５項記載の方法。
14. １４．担持媒体が、少なくとも第１および第２の吸着紙ディスクであって、第１ のディスクがレザズリンを含み、第２のディスクが増殖培地を含み、および第１ および第２のディスクのうちの１つに分与されている緩衝剤およびレドックス安 定化剤を有する請求の範囲第５項記載の方法。
15. １５．工程ｇが、可視光読み取りプロトコルに関連した、予め決定されたインキ ュベーション時間容器を一緒にインキュベートすることを含み、および 工程ｈが、 ｈ１）微生物の増殖がないことを示す陰性増殖対照容器におけるレザズリンに由 来する初期青色の識別し得る変化がないこと、およびレザズリンの初期の青色か ら微生物の増殖により引き起こされる還元生成物であるレゾルフィンの生成に由 来する赤色への陽性増殖対照ウェルの実質的な色変化が存在することの検出に基 づき、読み取りのための容器を適格化する工程、 ｈ２）工程ｈ１）に従い、容器が読み取りに適していない場合には、試験の失敗 を報告する工程、およびｈ３）工程ｉ１）に従い、容器が読み取りに適している 場合には、レザズリンの初期の青色からレゾルフィンの赤色への試験容器の実質 的な色変化の有無を検出することにより試験結果を報告する工程であって、この 試験結果は色変化が存在する場合には陽性（微生物増殖）であり、色変化が存在 しない場合には陰性（微生物増殖）である工程、を含む請求の範囲第５項記載の 方法。
16. １６．第１および第２量の抗菌生成物を含む予め設定された定性的感受性試験プ ロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定性的感受性 を試験するための装置において、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および１対の試験ウェルを規定する 試験パネル、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および１対の試験ウェルの各々に担 持される試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリンおよ び一定量の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセット の乾燥固体容量を含み、１対の試験ウェル内の各試験モジュールは第１および第 ２量の抗菌生成物のうちの１つの乾燥固体容量をさらに含む試験モジュール、を 具備し、 陰性増殖対照ウェル内の試験モジュールは、サブセットに含まれない試験化学物 質セットの全ての構成成分を含有する一定量の無菌の液体による再水化に適応さ れ、陽性増殖対照ウェルおよび１対の試験ウェル内の試験モジュールは、予め設 定された濃度の微生物と一緒にサブセットに含まれない試験化学物質セットの全 ての構成成分を含有する一定量の接種液体による再水化に適応され、一定量の無 菌の液体および一定量の接種液体は同一の予め選択された容量を有し、レザズリ ンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物の増殖に よる代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性であること を特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予め選択さ れた量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル内で予め 選択された濃度の増殖培地を生成するよう予め選択されており、試験パネルおよ びその内部に担持される再水化された試験モジュールは、試験ウェル内の微生物 の増殖の有無を決定するために、可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み 取りプロトコルのうちの１つを含む予め選択された読み取りプロトコルに関連す るインキュベーション時間のインキュベートに適応され、その後、予め選択され た読み取りプロトコルに従って読み取られる。
17. １７．試験化学物質の第１のセットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤 、および試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザ ズリンの還元を抑制するための予め選択されたレドツクス安定化剤をさらに含む 請求の範囲第１６項記載の装置。
18. １８．試験モジュールが試験化学物質の全ての構成成分の乾燥固体容量を有する 請求の範囲第１６項記載の装置であって、陰性増殖対照ウェル内の試験モジュー ルが試験化学物質を含有しない一定量の無菌の液体によって再水化され、陽性増 殖対照ウェルおよび１対の試験ウェルの各々における試験モジュールが、予め設 定された濃度の微生物のみを含有する一定量の液体で再水化される装置。
19. １９．各試験モジュールが関連付けられたウェルに保持される担持媒体を有し、 各試験モジュールが試験化学物質セットの構成成分のサブセットを担持する請求 の範囲第１６項記載の装置。
20. ２０．担持媒体が吸着紙ディスクを有し、試験ウェル内の各吸着紙ディスクに、 そこに貯蔵されている抗菌生成物の名称および濃度が視覚的に判読できるように 記されている請求の範囲第１９項記載の装置。
21. ２１．担持媒体が少なくとも第１および第２の吸着紙ディスクを有し、第１のデ ィスクがレザズリンを担持し、かつ第２のディスクが増殖培地を担持しており、 各試験ウェルの第１および第２の紙ディスクの１つが関連する量の抗菌生成物を 担持し、かつそこに貯蔵されている抗菌生成物の名称および濃度が視覚的に判読 できるように記されている請求の範囲第１９項記載の装置。
22. ２２．第１および第２量の抗菌生成物を含む予め設定された定性的感受性試験プ ロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定性的感受性 を試験するためのキットにおいて、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および１対の試験ウェルを規定する 試験パネル、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および１対の試験ウェルの各々に担 持される試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリンおよ び一定量の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセット の乾燥固体容量を含み、１対の試験ウェル内の各試験モジュールは第１および第 ２量の抗菌生成物のうちの１つの乾燥固体容量をさらに含む試験モジュール、サ ブセットに含まれない試験化学物質セットの全ての構成成分を含有する再水化液 の容器、 予め設定された濃度の微生物を含有する接種液を形成するために添加された微生 物を含む一定量の再水化液を貯蔵するための接種物貯蔵手段、 試験モジュール中の試験化学物質を再水化するために、陰性増殖対照ウェルに予 め設定された量の再水化液を分与するための手段、陽性増殖対照ウェルおよび１ 対の試験ウェルに予め設定された接種液を分与するための手段を含む接種手段、 を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されており、試 験パネルおよびその内部に担持される再水化された試験モジュール中は、試験ウ ェル内の微生物の増殖の有無を決定するために、可視光読み取りプロトコルおよ び蛍光励起読み取りプロトコルのうちの１つを含む予め選択された読み取りプロ トコルに関連するインキュベーション時間のインキュベートに適応され、その後 、予め選択された読み取りプロトコルに従って読み取られる。
23. ２３．試験化学物質の第１のセットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤 、および試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザ ズリンの還元を抑制するための予め選択されたレドックス安定化剤をさらに含む 請求の範囲第２２項記載の装置。
24. ２４．試験モジュールが試験化学物質の全ての構成成分の乾燥固体容量を有する 請求の範囲第２２項記載の装置であって、陰性増殖対照ウェル内の試験モジュー ルが試験化学物質を含有しない一定量の無菌の液体によって再水化され、陽性増 殖対照ウェルおよび１対の試験ウェルの各々における試験モジュールが、予め設 定された濃度の微生物のみを含有する一定量の液体で再水化される装置。
25. ２５．各試験モジュールが吸着紙ディスクを有し、試験ウェル内の各吸着紙ディ スクに、そこに貯蔵されている抗菌生成物の名称および濃度が視覚的に判読でき るように記されている請求の範囲第２２項記載の装置。
26. ２６．試験モジュールが少なくとも第１および第２の吸着紙ディスクを有し、第 １のディスクがレザズリンを担持し、かつ第２のディスクが増殖培地を担持して おり、各試験ウェルの第１および第２の紙ディスクの１つが関連する量の抗菌生 成物を担持し、かつそこに貯蔵されている抗菌生成物の名称および濃度が視覚的 に判読できるように記されている請求の範囲第２２項記載の装置。
27. ２７．第１および第２量の抗菌生成物を含む予め設定された定性的感受性試験プ ロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定性的感受性 を試験するためのキットにおいて、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および１対の試験ウェルを規定する 試験パネル、 第１量の抗菌生成物、および一定置のレザズリンおよび一定量の微生物用増殖培 地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセットを有する試験化学物質群を 乾燥固体の形態で担持するための担持媒体を含む第１の試験モジュール、第２量 の抗菌生成物および試験化学物質群を乾燥固体の形態で担持するための担持媒体 を有する第２の試験モジュール、第１および第２の試験モジュールを１対の試験 ウェル内に分与するための分与手段、 サブセットに含まれない試験化学物質の全ての構成成分を含有する一定量の予め 選択された再水化液、および接種液を形成するための予め設定された量の微生物 を含む接種物貯蔵手段、 １対の試験ウェルに予め設定した量の接種液を分与して、試験モジュールに貯蔵 される試験化学物質を再水化するための接種手段、 を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されており
28. ２８．各々が、試験化学物質を乾燥固体の形態で担持するための担持媒体を有す る１対の増殖試験モジュール、再水化成の容器、 をさらに具備する請求の範囲第２７項記載のキットであって、分与手段が、陰性 増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェルの各々に１対の増殖試験そジュールの １つを分与するための手段を有し、 接種手段が、陰性増殖対照ウェルに予め設定された量の再水化液を分与し、陽性 増殖対照ウェルに予め設定された量の接種物質を分与するための手段を有するキ ット。
29. ２９．複数の微生物を試験するための複数の試験パネル、および各々複数の第１ の試験モジュールおよび第２の試験モジュールを具備する請求の範囲第２７項記 載のキットであって、 分与手段が、複数の第１および第２試験モジュールをそれぞれ貯蔵するための第 １および第２貯蔵手段、および複数の試験パネルのうちの１つの試験パネルにお いて第１貯蔵手段からの第１試験モジュールの１つを試験ウェルの１つに、第２ 貯蔵手段からの第２試験モジュールの１つを試験ウェルの他方に同時に分与する ために貯蔵手段と作働上関連する分配器を有するキット。
30. ３０．複数の微生物を試験するための複数の試験パネル、および各々複数の第１ の試験モジュールおよび第２の試験モジュールを具備する請求の範囲第２７項記 載のキットであって、 分与手段が、複数の第１および第２試験モジュールをそれぞれ貯蔵するための第 １および第２貯蔵手段を間に挿入する方式で有し、かつ第１試験モジュールを特 定の試験パネルの試験ウェルに、および第２試験モジュールを該試験パネルの他 方の試験ウェルに代わりに分与するために貯蔵手段と作働上関連する分配器を有 するキット。
31. ３１．第１の試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤、 および試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズ リンの還元を抑制するための予め選択されたレドックス安定化剤をさらに含む請 求の範囲第２７項記載のキット。
32. ３２．各試験モジュールが、試験化学物質のサブセットをその内部に担持し、内 部に担持する抗菌生成物の名称および濃度の両方を視覚的に判読できるように記 した吸取紙ディスクを有する請求の範囲第２７項記載のキット。
33. ３３．試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤、および 試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズリンの 還元を抑制するための予め選択されたレドックス安定化剤をさらに有し、かつ試 験化学物質セットの全ての構成成分が吸取紙ディスクに担持され、接種液が微生 物のみを含有する請求の範囲第３２項記載のキット。
34. ３４．Ｍ種の異なる抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定性的感受性 を試験するために適応される請求の範囲第２７項記載のキットであって、 試験パネルがＭ対の試験ウェルを規定し、各々の対がＭ種の抗菌生成物の１種に 関係付けられており、第１試験モジュールのＭ個および第２試験モジュールのＭ 個が提供され、各々が抗菌生成物の１種に関係付けられており、 分与手段が、Ｍ個の第１試験モジュールおよびＭ個の第２試験モジュールの各々 をＭ対の試験ウェルの関係付けられた１つに分与するための手段を有し、 接種手段が、Ｍ対の試験ウェルの各ウェルに予め設定された量の接種液を分与す るキット。
35. ３５．Ｍ種の第１および第２試験モジュールの各々が、その内部に担持される抗 菌生成物の名称および濃度の両方が視覚的に判読し得るように記されている吸取 紙ディスクを有する請求の範囲第３４項記載のキット。
36. ３６．試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための緩行剤、および試験パネルのイ ンキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズリンの還元を抑制する ためのレドックス安定化剤をさらに含み、試験化学物質セットの全ての構成成分 が各吸取紙ディスクに担持されており、接種液が微生物のみを含有する請求の範 囲第３５項記載のキット。
37. ３７．Ｎ＞２であるＮ種の異なる量の抗菌生成物を含む予め設定された定置的感 受性試験プロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定 量的感受性を試験するための装置において、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、およびＮ個の試験ウェルを規定する 試験パネル、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、およびＮ個の試験ウェルの各々に担 持される試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリンおよ び一定量の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセット の乾燥固体容量を含み、Ｎ個の試験ウェル内の各試験モジュールが定量的感受性 試験プロトコルに従って予め選択された異なる量の抗菌生成物の乾燥固体容量を さらに含む試験モジュール、 を具備し、 陰性増殖対照ウェル内の試験モジュールは、サブセットに含まれない試験化学物 質セットの全ての構成成分を含有する一定量の無菌の液体による再水化に適応さ れ、陽性増殖対照ウェルおよびＮ個の試験ウェル内の試験モジュールは、予め設 定された濃度の微生物と一緒にサブセットに含まれない試験化学物質セットの全 ての構成成分を含有する一定量の接種液体による再水化に適応され、一定量の無 菌の液体および一定量の接種液体は同一の予め選択された容量を有し、レザズリ ンの量は、各ウェル内で、徴生物の増殖に対して低毒性であり、微生物の増殖に よる代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性であること を特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予め選択さ れた量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル内で予め 選択された濃度の増殖培地を生成するよう予め選択されており、試験パネルおよ びその内部に担持される再水化された試験モジュールは、試験ウェル内の微生物 の増殖の有無を決定するために、可視光読み取りプロトコルおよび蛍光励起読み 取りプロトコルのうちの１つを含む予め選択された読み取りプロトコルに関連す るインキュベーション時間のインキュベートに適応され、その後、予め選択され た読み取りプロトコルに従って読み取られる。
38. ３８．第１の試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤、 および試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズ リンの還元を抑制するための予め選択されたレドックス安定化剤をさらに含む請 求の範囲第３７項記載の装置。
39. ３９．全ての試験モジュールが第１試験化学物質セットの全ての構成成分の乾燥 固体容量を含み、陰性増殖対照ウェル内の試験モジュールが、試験化学物質を含 まない一定置の無菌の液体によって再水化され、陽性増殖対照ウェルおよびＮ個 の試験ウェルの各々における試験モジュールが、予め設定された濃度の微生物の みを含有する一定量の液体によって再水化される請求の範囲第３７項記載の装置 。
40. ４０．各試験モジュールが関係付けられたウェル内に保持される担持媒体を有し 、かつ各試験モジュールが試験化学物質セットの構成成分のサブセットを担持す る請求の範囲第３７項記載の装置。
41. ４１．担持媒体が吸取紙ディスクを有しており、試験ウェル内の各吸取紙ディス クにはその内部に貯蔵される抗菌生成物の名称および濃度の両方が視覚的に判読 し得るように記されている請求の範囲第４０項記載の装置。
42. ４２．担持媒体が少なくとも第１および第２の吸取紙ディスクを有しており、第 １ディスクがレザズリンを担持し、第２ディスクが増殖培地を担持し、各試験ウ ェル内の第１および第２紙ディスクのうちの１つが関連付けられた量の抗菌生成 物を担持し、さらにその内部に貯蔵される抗菌生成物の名称および濃度の両方が 視覚的に判読し得るように記されている請求の範囲第４０項記載の装置。
43. ４３．．Ｎ＞２であるＮ種の異なる量の抗菌生成物を含む予め設定された定量的 感受性試験プロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の 定量的感受性を試験するためのキットにおいて、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、およびＮ個の試験ウェルを規定する 試験パネル、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、およびＮ個の試験ウェルの各々に担 持される試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリンおよ び一定量の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセット の乾燥固体容量を含み、Ｎ個の試験ウェル内の各試験モジュールがＮ種の異なる 量の抗菌生成物の乾燥固体容量をさらに含む試験モジュール、 サブセットに含まれない試験化学物質セットの全ての構成成分を含有する再水化 液の容器、 予め設定された濃度の微生物を含有する接種液を形成するために添加された微生 物を含む一定量の再水化液を貯蔵するための接種物貯蔵手段、 試験モジュール中の試験化学物質を再水化するために、陰性増殖対照ウェルに予 め設定された量の再水化液を分与するための手段、陽性増殖対照ウェルおよびＮ 個の試験ウェルの各々に予め設定された接種液を分与するための手段を含む接種 手段、 を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されており、試 験パネルおよびその内部に担持される再水化された試験モジュールは、試験ウェ ル内の微生物の増殖の有無を決定するために、可視光読み取りプロトコルおよび 蛍光励起読み取りプロトコルのうちの１つを含む予め選択された読み取りプロト コルに関連するインキュベーション時間のインキュベートに適応され、その後、 予め選択された読み取りプロトコルに従って読み取られる。
44. ４４．第１の試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤、 および試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズ リンの還元を抑制するための予め選択されたレドックス安定化剤をさらに含む請 求の範囲第４３項記載の装置。
45. ４５．試験モジュールが、試験化学物質セットの全ての構成成分の乾燥固体容量 を含み、 陰性増殖対照ウェル内の試験モジュールが試験化学物質を含まない一定量の無菌 の液体で再水化され、陽性増殖対照ウェルおよびＮ個の試験ウェルの各々におけ る試験モジュールが、予め設定された濃度の微生物のみを含有する一定量の液体 によって再水化される請求の範囲第４３項記載の装置。
46. ４６．各試験モジュールが吸取紙ディスクを有しており、Ｎ個の試験ウェル内の 各吸取紙ディスクにはその内部に貯蔵される抗菌生成物の名称および濃度の両方 が視覚的に判読し得るように記されている請求の範囲第４３項記載の装置。
47. ４７．各試験モジュールが少なくとも第１および第２の吸取紙ディスクを有して おり、第１ディスクがレザズリンを担持し、第２ディスクが増殖培地を担持し、 各試験ウェル内の第１および第２紙ディスクのうちの１つが関連付けられた量の 抗菌生成物を担持し、さらにその内部に貯蔵される抗菌生成物の名称および濃度 の両方が視覚的に判読し得るように記されている請求の範囲第４３項記載の装置 。
48. ４８．Ｎ＞２であるＮ種の異なる量の抗菌生成物を含む予め設定された定量的感 受性試験プロトコルを用いて、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定 量的感受性を試験するためのキットにおいて、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、およびＮ個の試験ウェルを規定する 試験パネル、 Ｎ種の異なる量の抗菌生成物の１種および一定量のレザズリンおよび微生物用増 殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセットを有する試験化学物質 群を乾燥固体形態で担持するための担持媒体を各々包含する少なくともＮ個の試 験モジュール、 Ｎ種の試験モジュールを、その内部の抗菌生成物の量に従って順にＮ個の試験ウ ェルに分与するための分与手段、接種液を形成するための、サブセットに含まれ ない試験化学物質セットの全ての構成成分を含有する予め選択された一定量の再 水化液および予め設定された量の微生物を収容するための接種物貯蔵手段、 試験モジュール中に貯蔵される試験化学物質を再水化するために、Ｎ個の試験ウ ェルの各々に予め設定された量の接種液を分与するための接種手段、 を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されている。
49. ４９．試験化学物質群を乾燥固体形態で担持するための担持媒体を各々有する１ 対の増殖試験モジュール、再水化液の容器、 １対の増殖試験モジュールの１つを陰性増殖対照ウェルおよび陽性増殖対照ウェ ルの各々に分与するための第２分与手段、 をさらに具備し、 接種手段が、予め設定された量の再水化液を陰性増殖対照ウェルに分与し、予め 設定された量の接種物を陽性増殖対照ウェルに分与するための手段を有している 請求の範囲第４８項記載のキット。
50. ５０．複数の微生物を試験するための複数の試験パネルおよびＮ種の試験モジュ ールの複数のセットを有する請求の範囲第４８項記載のキットであって、 分与手段が、Ｎ個の試験モジュールの複数のセットを貯蔵するための貯蔵手段と 、試験モジュールを貯蔵手段から一度に分与するための手段とを有し、複数のセ ットの各々におけるＮ個の試験モジュールが、貯蔵手段内部において、その内部 の抗菌生成物の量に従って予め設定された順番で組織化されており、Ｎ個の試験 モジュールを各試験パネルのＮ個の試験ウェルに前記順番で分与するよう分与手 段を作働させることができる。
51. ５１．各試験モジュールが、内部に担持する関連抗菌生成物の名称および濃度を 視覚的に判読し得るように記された吸取紙ディスクを有する請求の範囲第５０項 記載のキット。
52. ５２．試験化学物質セットが、ｐＨ制御のための予め選択された緩衝剤、および 試験パネルのインキュベーション中の増殖培地および緩衝剤によるレザズリンの 還元を抑制するためのレドックス安定化剤をさらに含み、試験化学物質セットの 全ての構成成分が吸取紙ディスクに担持され、かつ接種液が微生物のみを含有す る請求の範囲第５１記載のキット。
53. ５３．Ｍ種の異なる抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定量的感受性 の試験に適応される請求の範囲第５０記載のキットであって、 試験パネルがＮ個の試験ウェルのＭセットを規定し、各セットは抗菌生成物と関 係付けられており、分与手段が、各々Ｍ種の抗菌生成物の１種に関係付けられて いるＭ個の独立した貯蔵手段の１つを有しており、かつ内蔵されるＮ種の試験モ ジュールをＭセットのＮ個の試験ウェルの関係付けられた１つに分与するための 関連する手段を有し、 接種手段が、予め設定された量の接種液をＭセットの試験ウェルの各々における Ｎ個の試験ウェルの各々に、一度に１セットを系統的に分与する。
54. ５４．Ｍ１種の予め選択された抗菌生成物のセットとＭ２種の使用者が選択する 抗菌生成物のセットによる増殖の阻害に対する微生物の定量的感受性を試験する ためのキットにおいて、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、各々予め選択されたＭ１種の抗菌生 成物の１種と関係付けられたＭ１対の試験ウェルからなる試験ウェルの第１セッ ト、および各々使用者が選択するＭ２種の抗菌生成物の１種と関係付けられたＭ ２対の試験ウェルからなる試験ウェルの第２セットを規定する試験パネル、 陰性増殖対照ウェル、陽性増殖対照ウェル、および試験ウェルの第１セットの各 々に担持される試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリ ンおよび一定量の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブ セットの乾燥固体容量を含み、試験ウェルの第１セットに担持される各試験モジ ュールがそれに関連する第１および第２の量の抗菌生成物の乾燥固体容量をさら に含む試験モジュール、 各々使用者が選択するＭ２種の抗菌生成物に関係付けられ、乾燥固体形態の化学 物質の試験群および使用者が選択するＭ２種の抗菌生成物の関連する１種の第１ および第２の乾燥固体料を担持するための担持媒体を含む、Ｍ２セットの試験モ ジュール、 Ｍ２セットの試験モジュールをＭ２対の試験ウェルに分与するための分与手段、 接種液を形成するための、サブセットに含まれない試験化学物質の全ての構成成 分および予め設定された量の微生物を含有する予め選択された容量の予め選択さ れた再水化液を収容するための接種物貯蔵手段、 予め設定された容量の接種液をＭ１対の試験ウェルおよびＭ２対の試験ウェルの 各々に分与するための接種手段、を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されている。
55. ５５．Ｎ＞２であるＮ種の異なる量の抗菌生成物を含む予め選択された定量的感 受性試験プロトコルを用いて、Ｍ１種の予め選択された抗菌生成物のセットとＭ ２種の使用者が選択する抗菌生成物のセットによる増殖の阻害に対する微生物の 定量的感受性を試験するためのキットにおいて、陰性増殖対照ウェル、陽性増殖 対照ウェル、試験ウェルのＮ行Ｍ１列の第１配列であってＭ１列の各々がＭ１種 の予め選択された抗菌生成物の１種に関係付けられている配列、および試験ウェ ルのＮ行Ｍ２列の第２配列であってＭ２列の各々がＭ２種の使用者が選択する抗 菌生成物の１種に関係付けられている配列を規定する試験パネル、陰性増殖対照 ウェル、陽性増殖対照ウェル、および試験ウェルの第１配列の各々に担持される 試験モジュールであって、各試験モジュールが一定量のレザズリンおよび一定量 の微生物用増殖培地を含む試験化学物質セットの構成成分のサブセットからなる 化学物質の試験群の乾燥固体容量を含み、試験ウェルの第１配列に担持される各 試験モジュールが、その試験モジュールが担持される試験ウェルに関連するＮ種 の異なる量の抗菌生成物の１種の乾燥固体容量をさらに含む試験モジュール、 各々使用者が選択するＭ２種の抗菌生成物に関係付けられ、乾燥固体形態の化学 物質の試験群および使用者が選択するＭ２種の抗菌生成物の関連する１種の乾燥 固体料を担持するための担持媒体を含む、Ｍ２セットのＮ種の試験モジュール、 Ｍ２セットの試験モジュールを試験ウェルの第２配列に分与するための分与手段 、 接種液を形成するための、サブセットに含まれない試験化学物質の全ての構成成 分および予め設定された量の微生物を含有する予め選択された容量の予め選択さ れた再水化液を収容するための接種物貯蔵手段、 予め設定された容量の接種液をＭ１対の試験ウェルおよびＭ２対の試験ウェルの 各々に分与するための接種手段、を具備し、 レザズリンの量は、各ウェル内で、微生物の増殖に対して低毒性であり、微生物 の増殖による代謝生成物によるレゾルフィンヘの還元に対して実質的に感受性で あることを特徴とする範囲の予め選択された濃度のレザズリンを生成するよう予 め選択された量に関して予め選択されており、および増殖培地の量は、各ウェル 内で予め選択された濃度の標準増殖培地を生成するよう予め選択されている。
56. ５６．Ｎ種の異なる量の抗菌生成物を用いる定量的感受性試験プロトコルに従う 、抗菌生成物による増殖の阻害に対する微生物の定量的感受性の試験に用いられ る試験モジュール分与システムであって、 各々予め設定された試験化合物のセットを担持する試験モジュールの複数のセッ トであって、各セットの各試験モジュールがＮ種の異なる量の抗菌生成物の異な る１種をさらに担持するセット、 試験モジュールの複数のセットを、セットの規則的な系列配置および異なる量の 抗菌生成物の列に従って各セット内で配列された配置を特徴とする配置で貯蔵す るための貯蔵手段、および、 貯蔵手段と作働上関連し、そこから試験モジュールを一度に分与するための分与 手段を具備するシステム。