JP2020504610A - 改善された迅速な抗菌薬感受性試験のための方法 - Google Patents

改善された迅速な抗菌薬感受性試験のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、改善された抗菌薬感受性試験、より詳細には、効果的で多用途の分析及び信頼できる結果のための臨床試料の改善された迅速な抗菌薬感受性試験を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４３８，７８０号及び２０１７年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８８，４５４号及び２０１７年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３５，１０６号の優先権を主張し、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本発明は概して抗菌薬感受性試験に関し、より詳細には臨床試料の迅速な抗菌薬感受性試験に関する。
抗菌薬耐性微生物感染は、感染した患者の罹患率、死亡率及び医療費の増加を含む臨床転帰不良に関連する。米国でのこのような施設におけるこれらの生物の有病率は、過去３０年間に着実に増加している。微生物の表現型抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）は、医師に適切な治療レジメンの情報を与えるために重要である。現在の方法を使用すると、ＡＳＴ測定は、典型的には少なくとも８時間を必要とし、多くの臨床微生物学研究室でのシフト作業のために一晩の工程となる。現在のＡＳＴ法からの決定を待つ間に、患者はしばしば広域スペクトルの抗菌薬を投与され、これは、しばしば患者の健康に重大な有害作用を及ぼし、及び／又は抗菌薬耐性流行病の増加に寄与する。さらに、正確な抗菌治療情報を得るまでのこの時間遅延は、患者の入院期間を延長させ、これにより患者への費用及び不便さを増大させる。
ＡＳＴ決定を得るのに長い時間がかかると、不完全な情報が医師に伝えられることになる。関与する時間の長さは、しばしば抗菌効果の速度又は殺傷動態の同定を妨げるエンドポイント決定を生じる。任意の短期又は断続的なデータ生成が利用可能である場合でも、その精度及び信頼度は、歴史的に利用可能であるか又は並行して実行されるかのいずれかである、適切な品質管理アッセイが存在しないので、疑わしい。
政府及び医療産業は、病院におけるより良い抗菌薬管理を促進するためのルールを提案しており、多くの産業専門家は、今後２年間に実施されるべき報奨金を期待している。したがって、微生物感染の抗菌薬感受性を迅速に決定する方法に対する必要性が存在する。本明細書に記載されている方法は、費用効率の高い手段でこの必要性に対処し、既存のアッセイハードウェア構成要素と互換性があり得るという点で有利である。
要旨
本発明は、本明細書に記載されている方法が、微生物感染の抗生物質感受性の改善された迅速な決定を提供するという発見に部分的に基づく。本発明はまた、迅速な抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）法の有効性及び信頼性が、微生物若しくは抗菌薬又はこれらの組合せの性質及び機能を含むいくつかの要因の変動性に適応することによって大幅に増大し、これによって本発明の多用途のモジュール式でロバストなプラットフォームアッセイシステムを生成するという驚くべき発見に部分的に基づく。
以下に記載されている態様及び実施形態のいずれも、任意の所望の方法で組み合わせることができ、文脈が別段の指示をしない限り、任意の実施形態又は実施形態の組合せを、以下に記載されている態様の各々に適用することができることが理解される。
一態様では、本発明は、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、インキュベーション期間を共有する複数の異なるアッセイを実施するステップであって、各々のアッセイは、１種以上の抗菌薬の存在下での微生物成長アッセイを含む、ステップ、及び相対的微生物成長に基づいて１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するステップを含む、方法を提供する。
アッセイの性能についての適切な閾値レベルを達成するために微生物の成長効果を増大させ、同時に、微生物の成長のためのインキュベーション時間の増加を防ぐことによって、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するためのアッセイの品質を改善する方法が本明細書に提供される。
また、微生物の抗菌薬感受性を決定するために微生物を含む試料を得ることから開始する必要な時間を増加させずに、さらなるアッセイを同時に準備し、実行することによって、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するためのアッセイの品質、精度及び信頼度を改善する方法も本明細書に提供される。
一部の実施形態では、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するステップは、１種以上の抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するステップを含む。
一部の態様では、本発明は、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、少なくとも１．５時間の初期インキュベーション期間を共有する複数の異なる成長アッセイを実施するステップであって、１種以上のプローブが、初期インキュベーション期間の完了後に加えられ、各々のアッセイが、１種以上の抗菌薬の存在下での微生物成長アッセイを含む、ステップ、並びに相対的微生物成長に基づいて１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するステップであって、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を得ることができる、ステップを含む、方法を提供する。
一部の態様では、本発明の方法は、以下のステップ：
・１種以上の微生物の懸濁液を、複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップであって、複数のチャンバは１種以上の抗菌剤を含む、ステップ、
・初期インキュベーション期間の間、微生物成長を促進する条件下でカートリッジをインキュベートするステップ、
・カートリッジチャンバのサブセットにおいて、微生物成長が閾値を達成したかどうかを決定するために１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップ、並びに
（ａ）閾値が達成された場合、１種以上の抗菌薬に対する微生物の感受性を決定するために複数のカートリッジチャンバにおいて複数の異なる成長アッセイを実施し、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／若しくは定性的感受性結果（ＱＳＲ）を得るステップ、又は
（ｂ）閾値が達成されていない場合、
（ｉ）閾値が達成され、その後、ステップ（ａ）を実施するまで、若しくは
（ｉｉ）閾値が達成されずに最大１８時間が経過し、さらなるアッセイが実施されなくなるまで、
微生物成長を促進する条件下で１回以上のさらなるインキュベーション期間を実施するステップ
を含む。
一態様では、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、代謝プローブが存在しない１種以上の抗菌薬の存在下で微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、１種以上の微生物のインキュベーション後、水混和性溶媒中に代謝プローブを導入するステップ、及び相対的微生物成長に基づいて１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するステップを含む成長アッセイを実施するステップを含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法が、微生物成長を促進するために、初期時間の期間の間、抗菌剤を含むカートリッジにおける複数のチャンバ内の微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、相対的微生物成長が閾値を達成したかどうかを決定するためにカートリッジチャンバのサブセットにおいて１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップであって、閾値の達成が、微生物についてのＭＩＣ又はＱＳＲデータを提供するためのアッセイシステムについての十分な成長を示す、ステップ、次いでＭＩＣ又はＱＳＲデータを得るためのアッセイを実施するステップを含む。
一部の実施形態では、１種以上の微生物が、微生物の抗菌薬感受性をアッセイするための微生物成長を促進する条件下で、１種以上の抗菌薬の存在下又は非存在下でインキュベートされる。
一部の態様では、本発明は、微生物成長を促進する方法であって、微生物成長を促進する条件下でカートリッジにおける１種以上の抗菌薬の存在下で１種以上の微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、並びに溶液混合を達成するのに不十分な振動数及び／又はオービタル振とう半径にてカートリッジを揺動するステップを含む、方法を提供する。
一部の態様では、本発明は、微生物成長を促進する方法であって、微生物の懸濁液を含むカートリッジを約３０℃〜約４５℃の温度に予熱するステップ、及び微生物の懸濁液を含む予熱したカートリッジを、微生物成長を促進する条件下で１種以上の抗菌薬の存在下でインキュベートするステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、１種以上の抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）が、複数のアッセイから決定される。
一部の実施形態では、１種以上の抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するために使用されるアッセイの数が、実施されるアッセイの数より少ない。
一部の実施形態では、抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するために使用されるアッセイの数が、実施されるアッセイの数と等しい。
一部の実施形態では、方法は、アッセイが、１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の感受性を決定するのに適切であるかどうかを決定するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、アッセイが、１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の感受性を決定するのに適切であるかどうかを決定するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、異なるアッセイが、異なる抗菌薬−微生物の組合せのために使用される。一部の実施形態では、１つ以上の異なるアッセイが、異なる微生物種のために使用される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのアッセイが、代謝プローブアッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、酵素生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、視覚アッセイ及びｐＨ分子プローブアッセイからなる群から選択される。
一部の実施形態では、複数の成長アッセイが、代謝アッセイ及び表面結合アッセイを含む。
一部の実施形態では、代謝成長アッセイが、
（ａ）複数のチャンバへの代謝プローブの添加、
（ｂ）微生物成長を促進する条件下でのアッセイインキュベーション期間、及び
（ｃ）吸光度、蛍光、ルミネセンス、電気化学的シグナル測定のうちの１つ以上を得ること
を含む。
一部の実施形態では、初期インキュベーション期間が、約２〜１８時間である。一部の実施形態では、初期インキュベーション期間が、約２〜６時間である。一部の実施形態では、初期インキュベーション期間が、約３時間である。
一部の実施形態では、さらなる時間の期間が、１〜１８時間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション期間が、約１〜４時間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション期間が、約１〜２時間である。
一部の実施形態では、アッセイインキュベーション期間が、約３０分〜２時間である。一部の実施形態では、インキュベーション期間が、約３時間である。
一部の実施形態では、カートリッジチャンバの５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満が、チェックポイントアッセイのために使用される。一部の実施形態では、１つ以上のチェックポイントアッセイチャンバが、抗菌薬を含まない。一部の実施形態では、１つ以上のチェックポイントアッセイチャンバが、１種以上の抗菌薬を含む。
一部の実施形態では、代謝プローブアッセイが、後の成長アッセイの前に実施される。一部の実施形態では、代謝プローブアッセイが、表面結合プローブアッセイの前に実施される。
一部の実施形態では、代謝プローブが、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）を含む。
代謝プローブは、式（Ｉ）に記載の構造
Figure 2020504610
 ［式中、
Ｒ１は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリール又はサブ構造Ａであり、
サブ構造Ａは、
Figure 2020504610
 （式中、
Ｌ１は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｌ２は独立して、共有結合、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ４は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールである）
であり、
各々のＸは独立して、不在又は一価アニオンである］
を有する。
一部の実施形態では、代謝プローブが、２−（４−ヨードフェニル（ｌｏｄｏｐｈｅｎｙｌ））−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）又は５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）を含む。
一部の実施形態では、代謝プローブが、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）を含む。
一部の実施形態では、表面結合プローブが、ランタニドとジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテート配位子との配位錯体を含む。
一部の実施形態では、表面結合プローブが
Figure 2020504610
 を含む。
一部の実施形態では、指標が、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウム又はこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、微生物細胞膜、細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜、細胞被膜に結合することができる化学基又は生化学基；細胞壁、細胞エンベロープ内の化学基又は生化学基、繊毛、線毛、鞭毛、細胞小器官、膜貫通タンパク質、細胞壁タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外関連多糖、細胞内関連多糖、脂質、細胞外脂質、細胞内脂質、膜脂質、細胞壁脂質、多糖及び／又は細胞エンベロープタンパク質若しくは細胞小器官に不可欠な脂質又は細胞エンベロープタンパク質若しくは細胞小器官に関連する脂質又は核酸に結合することができる化学基又は生化学基を含む。
一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、酵素、触媒及びナノ粒子並びにこれらの組合せからなる群から選択される増幅剤を使用することを含む。
一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、二本鎖ＤＮＡ濃度を定量するための指標を含む。一部の実施形態では、指標が、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ及びＳＹＴＯを含む、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール及びシアニン又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、核酸増幅を含む。一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、核酸シークエンシングを含む。一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、アデノシン三リン酸の使用を含む。
一部の実施形態では、微生物成長を決定するためのアッセイが、光散乱を含む。
一部の実施形態では、微生物成長のためのアッセイが、微生物の吸光度測定又は比濁測定に基づく。
一部の実施形態では、複数の異なるアッセイが、異なるカートリッジチャンバ内で実施される。
一部の実施形態では、複数の異なるアッセイが、同じカートリッジチャンバ内で実施される。
一部の実施形態では、複数の異なるアッセイが、逐次的に実施される。
一部の実施形態では、複数のチャンバが、培地中に懸濁された１種以上の抗菌薬を含む。
一部の実施形態では、複数のチャンバが、微生物の懸濁液の導入前に抗菌フィルムの形態の１種以上の抗菌薬を含む。
一部の実施形態では、複数のチャンバが、微生物の懸濁液の導入前に固形の１種以上の抗菌薬を含む。
一部の実施形態では、１種以上の抗菌薬が、凍結乾燥又は乾燥される。
一部の実施形態では、方法が、どの抗菌薬又は抗菌薬の組合せが、１種以上の微生物に対して最も効果的であるかを決定するステップをさらに含む。最も効果的な抗菌薬の決定は、どの抗菌薬又は組合せが、アッセイにおいて微生物成長の最大阻害を生じるかの決定である。
一部の実施形態では、方法が、１種以上の微生物によって引き起こされる感染を治療するための推奨事項を生成するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、アッセイが実施される場合、カートリッジが約３５℃の温度である。
一部の実施形態では、代謝プローブが、酸化還元活性プローブである。
一部の実施形態では、酸化還元活性プローブが、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）、３−（４，５−ジメチルチアゾール（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ）−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＴＮＢＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、５−シアノ−２，３−ジ（ｐ−トリル）テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、３，３’（３，３’−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾール（ｔｅｔｒａｚｏｌ）−３−イウム）（ＤＢＮＰＴ）、３−（ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ）−１−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＮＤＴ）、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴＢＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、フェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエチルスルフェート（ＰＥＳ）、グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン（ＧＦ−ＡＦＣ）、２，２’−ビス（４−ニトロフェニル）−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）テトラゾリウムクロリド（ＴＶ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）ジクロリド（ＢＴＣ）、５−シアノ−２，３−ビス（４−メチルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内塩（ＸＴＴ）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＢＡＴＤＡのアセトキシメチルエステル、フェロセン、ドデシルレザズリン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、５−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートアセチルエステル、ジヒドロカルセインＡＭ、ジヒドロエチジウム、ルミノール又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロテトラメチルジヒドロローザミンを含む。
一部の実施形態では、酸化還元活性プローブが、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）を含む。
一部の実施形態では、酸化還元活性プローブが、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）を含む。
一部の実施形態では、酸化還元活性プローブが、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）又は５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）を含む。
別の態様では、本発明は、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、微生物成長を促進するために初期時間の期間の間、１種以上の微生物及び１種以上の成長指標の懸濁液をインキュベートするステップ、並びに相対的微生物成長が閾値を達成しているかどうかを決定するために１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップ、並びに閾値が達成されている場合、１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）若しくは定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するための１つ以上のアッセイを実施するステップ、又は閾値が達成されていない場合、さらなる時間の期間の間、１種以上の微生物及び１種以上の成長指標の懸濁液をインキュベートするステップ、１種以上の微生物の濃度が閾値を達成していない場合、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）若しくは定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するための１つ以上のアッセイを実施するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、１つ以上のチェックポイントアッセイが、微生物を有さない１個以上のチャンバ内で実施される。
一部の実施形態では、１つ以上のチェックポイントアッセイが、１種以上の微生物に対して既知の有効性の１種以上の抗菌薬を有する１個以上のチャンバ内で実施される。
一部の実施形態では、閾値が、陽性対照対バックグラウンド対照の比によって決定される。
一部の実施形態では、陽性対照が、抗菌薬なしでインキュベートされた微生物及び１種以上の成長指標の懸濁液を含む。
一部の実施形態では、バックグラウンド対照が、微生物なしでインキュベートされた培地及び１種以上の成長指標を含む。
一部の実施形態では、陽性対照対バックグラウンド対照の比が、少なくとも１．１５である。
一部の実施形態では、初期時間の期間の間の微生物及び１種以上の成長指標の懸濁液のインキュベーションが、１つ以上のチェックポイントアッセイを実施する前に行われる。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、１つ以上のチェックポイントアッセイの間、光学的又は電気的に活性である。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標の光シグナルが、蛍光、時間分解蛍光、吸光度又はルミネセンスを含む。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標の電気シグナルが、ボルタンメトリー又は電位差測定である。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、チェックポイントアッセイの間、ｐＨに応答する。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、エオシンＹ、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ピラニン）、セミナフトローダフルオール（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒｓ）、カルボキシＳＮＡＲＦ、アリザリンイエロー、ブリリアントイエロー、ブロモクレゾール、ブロモフェノールブルー、ブロモチモールブルー、コンゴーレッド、ｏ−クレゾールフタレイン、ｍ−クレゾールパープル、クレゾールレッド、２，５−ジニトロフェノール、エチルオレンジ、メタニルイエロー、メチルオレンジ、メチルレッド、モーダントオレンジ、ニュートラルレッド、フェノールフタレイン、フェノールレッド、キナルジンレッド、ｐ−ロゾール酸、チモールブルー、チモールフタレイン、トロペオリン又はキシレノールブルーを含む。
一部の実施形態では、１つ以上のチェックポイントアッセイが、顕微鏡検査又は質量分析を含む。
一部の実施形態では、方法が、微生物の懸濁液を、１種以上の抗菌薬を含む複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも２４個のチャンバを含む。
一部の実施形態では、カートリッジが、９６個又は３８４個のチャンバを含む。
別の態様では、本発明は、微生物成長を促進する方法であって、微生物成長を促進する条件下でカートリッジにおいて１種以上の抗菌薬の存在下で１種以上の微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、及び溶液混合を達成するのに不十分な振動数又は半径にてカートリッジを揺動するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも９６個のチャンバを含む。
一部の実施形態では、カートリッジチャンバの各々が、１２ｍｍ未満の横寸法を有する。
一部の実施形態では、カートリッジが、機械的揺動、音響的揺動又は磁気的揺動によって揺動される。
一部の実施形態では、機械的揺動が、オービタル振とうである。
一部の実施形態では、オービタル振とうが、毎分５０回転より多い振動数で行われる。
一部の実施形態では、オービタル振とうが、毎分３５０回転より多い振動数で行われる。
一部の実施形態では、オービタル振とうが、毎分７５０回転より少ない振動数で行われる。
一部の実施形態では、オービタル振とうが、毎分約１５０回転の振動数で行われる。
一部の実施形態では、半径が２ｍｍより大きい。
一部の実施形態では、半径が２５ｍｍである。
一部の実施形態では、溶液混合を達成するのに不十分な振動数又は半径にてカートリッジを揺動することにより、カートリッジを揺動していない微生物成長に対するカートリッジを揺動している微生物成長の成長比が大きくなる。
一部の実施形態では、成長比が、１より大きく、１．５未満である。
別の態様では、本発明は、微生物成長を促進する方法であって、微生物の懸濁液を含むカートリッジを、約３０℃〜約４５℃の温度に予熱するステップ、及び微生物成長を促進する条件下で、１種以上の抗菌薬の存在下で微生物の懸濁液を含む予熱したカートリッジをインキュベートするステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも９６個のチャンバを含む。
一部の実施形態では、約３０℃〜約４５℃の温度にカートリッジを予熱することにより、少なくとも９６個のチャンバの実質的に均一な加熱が生じる。
一部の実施形態では、カートリッジが、１５分未満の間、予熱される。
一部の実施形態では、カートリッジが、１分、２分、５分、１０分又は１５分の間、予熱される。
一部の実施形態では、カートリッジが、放射加熱、伝導加熱又は対流加熱によって予熱される。
一部の実施形態では、放射加熱が、赤外放射加熱である。
一部の実施形態では、カートリッジが、伝導加熱及び対流加熱によって予熱される。
一部の実施形態では、１つ以上の加熱面が、伝導加熱及び対流加熱を実施する。
一部の実施形態では、カートリッジが、放射加熱と伝導加熱及び対流加熱の両方によって予熱される。
一部の実施形態では、カートリッジが、対流加熱のみによっては予熱されない。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも２５℃の温度にて１種以上の流体のカートリッジへの添加によって予熱される。
一部の実施形態では、１種以上の抗菌薬の存在下での微生物のインキュベーションが、カートリッジを予熱した後３０分以内に行われる。
一部の実施形態では、方法が、抗菌薬感受性試験を実施するための自動プラットフォームにカートリッジを充填する前にカートリッジを予熱するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、カートリッジにわたる温度のばらつきが、５％未満である。
一部の実施形態では、最高温度のチャンバと最低温度のチャンバとの℃での温度差が、５％未満である。
別の態様では、本発明は、微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、１種以上の微生物の懸濁液を、１種以上の抗菌薬を含む複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップ、初期時間の期間の間、微生物成長を促進する条件下でカートリッジをインキュベートするステップ、相対的微生物濃度が閾値を達成したかどうかを決定するために１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップ、及び１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の感受性を決定するために複数の異なる成長アッセイを実施するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、方法が、相対的微生物成長が閾値を達成していない場合、さらなる時間の期間の間、カートリッジをインキュベートするステップをさらに含む。
一部の実施形態では、閾値が、微生物に応じて特定の値であってもよい。一部の実施形態では、閾値が、抗菌薬に応じて特定の値であってもよい。一部の実施形態では、閾値が、微生物及び抗菌薬に応じて特定の値であってもよい。
一部の実施形態では、培地が、液体、固体又は半固体である。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも２個、４個、６個、８個、１２個、２４個、４８個、９６個、１９２個、３８４個又は１５３６個のチャンバを含む。
一部の実施形態では、カートリッジが、抗菌薬を含まない、又は１種以上の微生物が感受性ではない抗菌薬を含む少なくとも１個の対照チャンバをさらに含む。
一部の実施形態では、カートリッジが、少なくとも２５℃で４５℃以下の温度にてインキュベートされる。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、微生物細胞膜、細胞壁、細胞エンベロープ、タンパク質、単糖、多糖、脂質、細胞小器官又は核酸に結合することができる化学基又は生化学基を含む。
一部の実施形態では、１種以上の成長指標が、酸化還元活性である。
一部の実施形態では、成長アッセイが、微生物成長又は生存に影響を及ぼす。
一部の実施形態では、複数の成長アッセイが、異なるチャンバにおいて並行して又は順次的に実施される。
一部の実施形態では、１種以上の微生物が、臨床試料に由来する。
一部の実施形態では、臨床試料が、血液、脳脊髄液、尿、便、膣試料、痰、気管支肺胞洗浄液、咽喉、鼻スワブ、創傷スワブ又はこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、１種以上の微生物が、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エールリヒア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ガードネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、イサタケンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、コクシジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ニューモシスチス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｓｐｐ．）、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、エキセロハイラム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リングワーム（ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、ムコールミセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、微生物成長を促進する条件が、周囲空気、嫌気条件又は最大で１０％までのＣＯ２を含む。
一部の実施形態では、カートリッジチャンバの底部が、平坦、円形又はＶ字形である。
一部の実施形態では、カートリッジが、光学的に透明、白色又は黒色のうちの１つ以上である。
一部の実施形態では、微生物懸濁培地が、少なくとも１種の栄養素を含む。
一部の実施形態では、１個以上のチャンバが、異なる液体成分を含む。
一部の実施形態では、閾値が、バックグラウンド補正を使用して決定される。
一部の実施形態では、バックグラウンド補正が、１個以上のチャンバからの測定に基づく。
一部の実施形態では、バックグラウンド補正チャンバが、微生物を含まない、又は生育不能な微生物を含む。
一部の実施形態では、微生物成長を決定する複数のアッセイが、指標の時間分解蛍光測定を含む。
一部の実施形態では、微生物成長を促進する条件が、３１℃〜４１℃でのインキュベーション期間を含む。
一部の実施形態では、チェックポイント成長時間が、最小発育阻止濃度又は定性的感受性結果の決定に影響を及ぼす。
一部の実施形態では、異なるアッセイが、異なる波長にて発光するプローブからの蛍光発光を測定する。
一部の態様では、本発明は、本発明に記載されているアッセイを実施するための全ての構成要素を含むキットを提供する。
本発明の他の特徴及び利点は、図面並びに以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
上記及びさらなる特性は、添付する図面と併せて解釈されて、続く詳細な記載からさらに明白に理解される。しかし図面は、例示の目的のみであり、限定のためではない。
微生物のインキュベーション後の成長ルミネセンス比（ｇｒｏｗｔｈ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｉｏｓ）を例示するグラフであり、ここで、レザズリンは、初期インキュベーション期間の前に１つの群の微生物に導入され、他の群は初期インキュベーション期間の後にレザズリンに導入された。図１は、レザズリンは、インキュベーションの際にウェルに含まれるとＡＳＴ結果までの時間を早めることができるが、細菌成長へのレザズリンの有害作用のために微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）成長に阻止効果を有する場合があることを示している。 アンピシリン、ゲンタマイシン及びレボフロキサシンの存在下での成長遅延臨床Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株についての微量希釈ＡＳＴ及びそのＭＩＣ決定の両方に対してｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）一晩参照法（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）を使用した写真である。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、目に見える細菌成長を有さない具体的な抗生物質の最も低い希釈度である。 表面結合アッセイが、種々の臨床Ｓ．アウレウス細菌株（成長遅延株を含む）で実施され、陽性成長ウェルの成長阻止対照ウェルに対する吸光度比が測定されたグラフである。図３は、種々の臨床試料での成長速度における差異を示し；臨床細菌株は、成長速度が大きく異なる場合がある。 レザズリン成長指標を使用するチェックポイントアッセイ（図４Ａ）及び面結合プローブアッセイ（図４Ｂ）のための、陽性成長ウェルからと非接種対照又は成長阻止対照ウェルからとのシグナルの蛍光比を示すグラフである。図４Ａ及び４Ｂは、成長指標が、エンドポイントアッセイによって測定される成長についてプロキシとして使用され得るチェックポイント検査ウェルから測定可能なシグナルを提供することを示している。図４Ａ及び４Ｂは、レザズリンが、細菌成長が生じたかどうかを決定するためのチェックポイントとして使用され得ることを示している。 アンピシリン、ゲンタマイシン及びレボフロキサシンの存在下で急速成長及び成長遅延臨床Ｓ．アウレウス株の両方についてのＡＳＴアッセイから得られたグラフである。図５は、得られるＡＳＴ決定への成長速度の影響を実証している。接種ウェルと非接種ウェルとのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（レザズリン）シグナルの比は、ＡＳＴアッセイが処理される準備ができているかどうかを決定するための成長チェックポイントとして使用され得る。 Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の３つの異なる株についてユウロピウムプローブを用いた時間分解蛍光（ＴＲＦ）によるＡＳＴアッセイからのＭＩＣデータを示すグラフである。各グラフのｘ軸は、抗微生物剤アミカシン（ＡＭＫ）の濃度をマイクログラム／ミリリットルで示し、ｙ軸は、細菌表面への結合由来の蛍光を示している。細菌培養物の光学密度（６００ｎｍでの吸光度）によって測定された成長チェックデータが、各株について記されている。図は、ＭＩＣ結果の信頼性が細菌の最適な成長に依存することを示している。 Ｐ．アエルギノーサの２つの株についての、成長チェック比対細菌コロニー形成アッセイデータのプロットを示す図である。データは、カートリッジ上の接種対非接種ウェル間の吸光度の比として表される、６００ｎｍでの光学密度を測定することによって得られた成長チェックポイントデータの相関を、細菌コロニー形成アッセイのものと共に示している。ｘ軸は、成長チェックポイントデータを記し、ｙ軸は、コロニー形成アッセイデータをコロニー形成単位（ＣＦＵ）で記している。 微生物（左にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び右にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を標識及び定量するためにユウロピウムクリプテート分子を使用する表面結合増幅アッセイからの結果並びに相対蛍光単位（ＲＦＵ）の測定値のグラフである。 インキュベーション期間に続いて、細菌試料で蛍光比が測定されたグラフである。一方の試料（図９Ａ）ではレザズリンは、インキュベーション期間開始時に添加された。他方の試料（図９Ｂ）ではレザズリンは、インキュベーション期間後に添加された。図９Ａ及び９Ｂは、レザズリン蛍光シグナルの細菌特異的誘導が細菌成長後のレザズリンの添加によって改善されることを実証している。 ９６ウェルマイクロプレートの温度が放射加熱又は対流のいずれかによって予熱される間に経時的に測定されたグラフである。図１０Ａは、９６ウェルプレートが放射加熱によって予熱され、２分間未満で成長促進温度に達したグラフである。図１０Ｂは、単一の９６ウェルマイクロプレート（リッド付き）が約２０分間の標準的対流加熱後に成長促進温度に達し、スタックされた９６ウェルマイクロプレートは、これらの温度に達するまでに約４０分間の加熱時間を必要としたことを実証している。 ９６ウェルマイクロプレートの４プレートスタックについてのウェル溶液温度データを示す図である。図１１は、４プレートスタックの中央プレートについて拡大されたウェル温度の顕著な放射状の分布があったことを実証している。 インキュベーションの終わりに光学密度測定することによって決定された細菌成長へのプレート予熱の影響を記すグラフである。３８４ウェルプレート上で、Ｅ．コリ培養物（図１２Ａ）及びＰ．アエルギノーサ培養物（図１２Ｂ）でのデータを示している。 ２つの細菌株について振とう対非振とう条件下で３８４ウェルマイクロプレートについて６００ｎｍでの光学密度測定によって決定された微生物成長についての成長比を示すグラフである。１つの場合は、３８４ウェルマイクロプレートは、１５０ｒｐｍ、半径２５ｍｍで振とうしながらインキュベートされ、２つ目の場合は同様に接種されたマイクロプレートはインキュベーションの際に静置された。 インキュベーションの際に静置された９６ウェルマイクロプレートについて６００ｎｍでの光学密度測定によって決定された微生物成長を、同様に接種され、１５０ｒｐｍ、半径２５ｍｍで振とうしながらインキュベートされた９６ウェルマイクロプレートと比較した成長比を示すグラフである。 インキュベーションの際のプレート揺動（振とう）の微生物成長への影響を示す図である。図１５Ａは、振とう及び静置（非振とう）条件下での細菌の成長についての光学密度データを示している。図１５Ｂは、図に示すとおり１５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ及び５００ｒｐｍの異なる振とう速度下でのＳ．アウレウス成長の細菌ＡＴＰ含有量測定を示している。 代謝プローブＩＮＴが、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を用いて単一のプレートで複数の抗微生物剤を用いて検査された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣ）が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）での種々の抗生物質（例えば、アンピシリン／スルバクタム（図１７）、メロペネム（図１８）、トブライミシン（Ｔｏｂｒａｙｍｉｃｉｎ）（図１９）及びアミカシン（図２０）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして利用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣ）が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）での種々の抗生物質（例えば、アンピシリン／スルバクタム（図１７）、メロペネム（図１８）、トブライミシン（図１９）及びアミカシン（図２０）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして利用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣ）が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）での種々の抗生物質（例えば、アンピシリン／スルバクタム（図１７）、メロペネム（図１８）、トブライミシン（図１９）及びアミカシン（図２０）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして利用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣ）が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）での種々の抗生物質（例えば、アンピシリン／スルバクタム（図１７）、メロペネム（図１８）、トブライミシン（図１９）及びアミカシン（図２０）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして利用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３及びＷＳＴ−８）がシュードモナス・アエルギノーサへの種々の抗生物質｛例えば、イミピネム（図２１）、ニトロフラントイン（図２２）、ゲンタマイシン（図２３）及びテトラサイクリン（図２４）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして使用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３及びＷＳＴ−８）がシュードモナス・アエルギノーサへの種々の抗生物質｛例えば、イミピネム（図２１）、ニトロフラントイン（図２２）、ゲンタマイシン（図２３）及びテトラサイクリン（図２４）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして使用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 テトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３及びＷＳＴ−８）がシュードモナス・アエルギノーサへの種々の抗生物質｛例えば、イミピネム（図２１）、ニトロフラントイン（図２２）、ゲンタマイシン（図２３）及びテトラサイクリン（図２４）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして使用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 トラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３及びＷＳＴ−８）がシュードモナス・アエルギノーサへの種々の抗生物質｛例えば、イミピネム（図２１）、ニトロフラントイン（図２２）、ゲンタマイシン（図２３）及びテトラサイクリン（図２４）の抗微生物剤感受性を決定するための代謝プローブとして使用された場合のＡＳＴ結果を示す図である。 種々の電子伝達体の存在下での細菌希釈曲線の吸光度結果を、標準的基準と比較して示すグラフである。 種々の電子伝達体の存在下での細菌希釈曲線の吸光度結果を、標準的基準と比較して示すグラフである。 種々の電子伝達体の存在下での細菌希釈曲線の吸光度結果を、標準的基準と比較して示すグラフである。 種々の電子伝達体の存在下での細菌希釈曲線の吸光度結果を、標準的基準と比較して示すグラフである。 各抗生物質についてＭＩＣを決定する二重アッセイを示す図であり、アルゴリズム的に呼び出されたＭＩＣに基づく値を用いて補正されたパーセントの比較を示している。Ａ：Ｋ．ニューモニエについての結果；Ｂ：Ｓ．アウレウスについての結果。結果は、抗生物質に応じて、代謝アッセイ又は表面結合アッセイのいずれかのさらなる正確性を示している。 例示的細菌株、クレブシエラ・ニューモニエでの抗微生物剤のパネルについて、２つのアッセイ、（左）代謝アッセイ及び（右）表面結合アッセイの間の比較を示す図である。 例示的細菌株、クレブシエラ・ニューモニエでの抗微生物剤のパネルについて、２つのアッセイ、（左）代謝アッセイ及び（右）表面結合アッセイの間の比較を示す図である。 例示的細菌株、クレブシエラ・ニューモニエでの抗微生物剤のパネルについて、２つのアッセイ、（左）代謝アッセイ及び（右）表面結合アッセイの間の比較を示す図である。
定義
本明細書に言及されている特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開された米国及び外国出願、参照は、各々が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されたものと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用されている場合、変数についての数値範囲の列挙は、本発明がこの範囲内の値のいずれかと等しい変数を用いて実施され得ることを伝えることが意図される。したがって、本質的に離散的である変数については、変数が範囲の終点を含む、数値範囲内の任意の整数値と等しくなり得る。同様に、本質的に連続的である変数については、変数が範囲の終点を含む、数値範囲内の任意の実数値と等しくなり得る。例として、限定されるものではないが、０〜２の値を有するものとして記載されている変数は、この変数が本質的に離散的である場合には０、１又は２の値を取ることができ、この変数が本質的に連続的である場合には０．０、０．１、０．０１、０．００１の値又は０以上かつ２以下の任意の他の実数値を取ることができる。
本明細書に使用されている場合、具体的に別段の指示をしない限り、「又は」という単語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味では使用されない。
本明細書に使用されている場合、「約」という用語は、これが修飾する値の±１０％以内を意味する。例えば、「約１」は「０．９〜１．１」を意味し、「約２％」は「１．８％〜２．２％」を意味し、「約２％〜３％」は「１．８％〜３．３％」を意味し、「約３％〜約４％」は「２．７％〜４．４％」を意味する。文脈から別段に明らかでない限り、本明細書に提供されている全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。
本明細書に使用されている場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
「１つ以上」、「少なくとも１つ」、「１つより多い」などの用語は、限定されないが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又はこれ以上及びこれらの間の任意の数を含むものと理解される。
本明細書に使用されている場合、「成長アッセイ」という用語は、微生物の成長又は生存を測定するために使用されるアッセイを指す。成長アッセイの例には、チェックポイントアッセイ及びエンドポイントアッセイが含まれる。
本明細書に使用されている場合、「チェックポイントアッセイ」という用語は、微生物成長を妨げることなくこれを確認するために使用されるアッセイを指す。典型的に、チェックポイントアッセイは微生物の成長又は生存を妨げない。チェックポイントアッセイは、エンドポイントアッセイの前に実施されてもよく、又はエンドポイントアッセイと同時に実施されてもよい。
本明細書に使用されている場合、「エンドポイントアッセイ」という用語は、抗微生物剤の存在下での微生物の成長又は生存を決定するために使用される、又は抗微生物剤に対する微生物の感受性を決定するために使用されるアッセイを指す。典型的に、エンドポイントアッセイは、微生物の成長又は生存を妨げる。エンドポイントアッセイは、チェックポイントアッセイと同時に実施されてもよく、又はチェックポイントアッセイの後に実施されてもよい。
本明細書に使用されている場合、「成長指標」という用語は、微生物成長を測定するために使用され得る物質を指す。典型的に、成長指標は、抗微生物剤の非存在下での微生物成長を測定するために使用される。
本明細書に使用されている場合、具体的に別段の指示をしない限り、「水混和性溶媒」という用語は、実質的に全ての割合で水と混和性の溶媒を指す。
本明細書に使用されている場合、「脂肪族」又は「脂肪族基」という用語は、完全に飽和している、又は１つ以上の不飽和単位を含有する任意選択的に置換された直鎖又は分枝Ｃ１〜１２炭化水素を意味する。例えば、適切な脂肪族基には、任意選択的に置換された直鎖又は分枝アルキル、アルケニル及びアルキニル基が含まれる。別段に指定しない限り、様々な実施形態では、脂肪族基は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３又は１〜２個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている「脂肪族」基が２価であり得ることは当業者に明らかである。単独で又はより大きな部分の一部として使用される「アルキル」という用語は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３又は１〜２個の炭素原子を有する飽和の、任意選択的に置換された直鎖又は分枝鎖炭化水素基を指す。
「アルコキシ」という用語は、構造−ＯＲ（式中、Ｒは本明細書に記載されているアルキル基である）を有する基を指す。
「アリール」という用語は、１〜３個の芳香環を含む任意選択的に置換されたＣ６〜１４芳香族炭化水素部分を指す。例えば、アリール基は、Ｃ６〜１０アリール基（すなわち、フェニル及びナフチル）である。アリール基には、限定されないが、任意選択的に置換されたフェニル、ナフチル又はアントラセニルが含まれる。本明細書に使用されている場合、「アリール」及び「アリ（ａｒ−）」という用語はまた、アリール環が、テトラヒドロナフチル、インデニル又はインダニル環のような任意選択的に置換された環状構造を形成するために１つ以上の脂環式環と縮合されている基も含む。「アリール」という用語は、「アリール基」、「アリール環」及び「芳香環」という用語と交換可能に使用され得る。
「脂環式」という用語は、３〜約１４個の環炭素原子を有する、任意選択的に置換された飽和又は部分的に不飽和の環状脂肪族環系を指す。脂環式基には、限定されないが、任意選択的に置換されたシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル又はシクロオクタジエニルが含まれる。
「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味する。
「ヘテロアリール」という用語は、５〜１４個の環原子、好ましくは５、６、９又は１０個の環原子を有する基；環状配置において共有される６、１０又は１４個のπ電子を有する基；並びに炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。ヘテロアリール基は、単環、二環、三環又は多環、例えば、単環、二環又は三環（例えば、単環又は二環）であってもよい。「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素又は硫黄を指し、窒素又は硫黄の任意の酸化形態及び塩基性窒素の任意の四級化形態を含む。例えば、ヘテロアリールの窒素原子は、塩基性窒素原子であってもよく、また、対応するＮ−オキシドに任意選択的に酸化されてもよい。ヘテロアリールがヒドロキシ基によって置換される場合、これはまた、この対応する互変異性体を含む。本明細書に使用されている場合、「ヘテロアリール」及び「ヘテロアリ（ｈｅｔｅｒｏａｒ−）」という用語はまた、複素芳香環が、１つ以上のアリール、脂環式又は複素脂環式環と縮合されている基も含む。ヘテロアリール基の非限定的な例には、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル及びピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが含まれる。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」又は「複素芳香族」という用語と交換可能に使用され得、これらの用語のいずれも、任意選択的に置換されている環を含む。
本明細書に使用されている場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式基」及び「複素環式環」という用語は、交換可能に使用され、飽和又は部分的に不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて、上記に定義されている、１〜４個のような１個以上のヘテロ原子を有する、安定な３〜８員の単環又は７〜１０員の二環式複素環式部分を指す。複素環の環原子を参照して使用される場合、「窒素」という用語は、置換された窒素を含む。例として、酸素、硫黄又は窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和又は部分的に不飽和の環において、窒素は、Ｎ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）、ＮＨ（ピロリジニルにおけるような）又はＮＲ＋（Ｎ置換ピロリジニルにおけるような）であってもよい。
接尾辞「エン（−ｅｎｅ）」の基への付加は、この基が二価部分であることを示し、例えば、アリーレンはアリールの二価部分であり、ヘテロアリーレンはヘテロアリールの二価部分である。
本明細書に使用されている場合、「１つ以上の置換基」という語句は、安定性及び化学的実現可能性の上記の条件が満たされる限り、利用可能な結合部位の数に基づいて可能な置換基の１つから最大数に等しい複数の置換基を指す。
アリール（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなどを含む）、ヘテロアリール（ヘテロアラルキル及びヘテロアリールアルコキシなどを含む）基は、１つ以上の置換基を含有してもよく、したがって「任意選択的に置換されて」いてもよい。上記及び本明細書に定義されている置換基に加えて、アリール基（例えば、フェニル又はナフチル）又はヘテロアリール基（例えば、ピリジル）の不飽和炭素原子上の適切な置換基はまた、−ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｒ＋、−Ｃ（Ｒ＋）＝Ｃ（Ｒ＋）２、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ＋、−ＯＲ＋、−ＳＲ○、−Ｓ（Ｏ）Ｒ○、−ＳＯ２Ｒ○、−ＳＯ３Ｒ＋、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）２、−ＮＲ＋Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−ＮＲ＋Ｃ（Ｓ）Ｒ＋、−ＮＲ＋Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−ＮＲ＋Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｒ○、−ＮＲ＋ＣＯ２Ｒ＋、−ＮＲ＋ＳＯ２Ｒ○、−ＮＲ＋ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｏ−ＣＯ２Ｒ＋、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｓ）Ｒ○、−ＣＯ２Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）−ＯＲ＋、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−ＯＲ＋、−Ｎ（Ｒ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）−ＯＲ＋、−Ｃ（Ｒ○）＝Ｎ−ＯＲ＋、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ＋）２、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−ＯＲ＋及び−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２を含み、概してこれらから選択され、式中、Ｒ＋は独立して、水素又は任意選択的に置換された脂肪族、アリール、ヘテロアリール、脂環式又はヘテロシクリル基である。各々のＲ°は、任意選択的に置換された脂肪族、アリール、ヘテロアリール、脂環式又はヘテロシクリル基である。
アルキル又はアルコキシ基は、１つ以上の置換基を含有してもよく、したがって「任意選択的に置換されて」いてもよい。上記及び本明細書において別段に定義されていない限り、アルキル又はアルコキシ基の飽和炭素上の適切な置換基は、アリール又はヘテロアリール基の不飽和炭素について上記に列挙したものから選択され、さらに以下を含む：＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｃ（Ｒ＊）２、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ＊）２、＝Ｎ−ＯＲ＊、＝Ｎ−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝Ｎ−ＮＨＣＯ２Ｒ°＝Ｎ−ＮＨＳＯ２Ｒ°又は＝Ｎ−Ｒ＊（式中、Ｒ°は上記に定義されており、各々のＲ＊は独立して、水素又は任意選択的に置換されたＣ１〜６脂肪族基から選択される）。
表面結合アッセイの目的のために、「表面結合プローブ」は、「シグナル伝達物質」と交換可能に使用され得る。
表面結合プローブの結合は、イオン結合、共有結合、配位結合、静電相互作用、水素結合及びファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌ）結合のうちの１つ以上を含み得る。
「成長アッセイ」という用語は、特に代謝プローブアッセイの場合、「生存アッセイ」と交換可能に使用され得る。
ランタニドキレートを含む表面結合プローブについて、「時間分解蛍光」という用語は、本明細書において、「時間ゲートルミネセンス（ｔｉｍｅ−ｇａｔｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」と交換可能であると定義される。したがって、これらの測定についての単位は、以下：相対蛍光単位、相対光単位、相対ルミネセンス単位、相対ルミネセンス強度（任意単位）、相対光強度（任意単位）のうちのいずれかであると定義され得る。
揺動の目的のために、混合は、高いレイノルズ数（Ｒｅｎｏｌｄｓ ｎｕｍｂｅｒ）での流体不安定性によって生成されるランダム構造が、流体要素を伸ばし、折り畳む、乱流混合と定義される。
本明細書に使用されている場合、吸光度測定は、微生物培養物の光学密度の測定を示す。光学密度は、ある特定の周波数の入射光の吸光度によって測定され、この結果、吸光度は、ある特定の範囲にわたって培養物中に存在する微生物の数に比例する。本明細書に使用されている場合、比濁分析研究は、光の透過及び散乱に対するこの濁度の作用の測定に基づいて溶液中の曇り又は濁度の量を決定することを示す。
本明細書に使用されている場合、振とう及び揺動は、微生物培養カートリッジ又はアッセイカートリッジの文脈において交換可能に使用される。微生物培養物又はアッセイプレートの振とうは、回転シェーカー又はプラットフォーム、オービタルシェーカーにおいて実施され得る。
別段に定義されない限り、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本出願が属する当業者によって一般に理解されているもの及び本出願が属する分野において一般に使用されているものと同じ意味を有し、このような分野は、この全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本出願が優先する。
詳細な説明
本明細書に記載されている迅速なＡＳＴ法は、複数の抗微生物剤を用いて、及び複数の微生物について試験した場合に、臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＣＬＳＩ）参照法を使用して得られた結果と一致する正確な結果を提供することができるが、これらの方法は結果を提供するのにＣＬＳＩ法よりも顕著に短い時間のみを必要とし得る。本明細書に記載されている方法は、標準的な方法と比較して、大幅に低減された時間及び費用にて、適切な治療レジメン、すなわち、特有の抗微生物剤及び特定の投薬量を患者に提供することができる。したがって、本明細書に記載されている方法は、患者の転帰を改善することができ、病院費を下げることができ、抗微生物剤耐性微生物のさらなる進化を低減するのに役立つことができ、したがって、本明細書に記載されている方法は、ＡＳＴ分野における顕著なブレークスルーとなる。
本出願によって提供される方法は、一態様では、ＰＣＴ／ＵＳ１７／１４３４３に記載されているもののような迅速なＡＳＴ法、及びＰＣＴ／ＵＳ１７／２８９０６に記載されているもののような装置と併せて実施されることが意図され、これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、迅速なＡＳＴ法は、所定の抗微生物濃度にて抗微生物剤を含む複数のチャンバを含むカートリッジに微生物の懸濁液を導入することを提供することができる。カートリッジは、マルチウェルプレートであってもよい。カートリッジは、ウェルの１つ以上のリザーバを含む。一部の実施形態では、カートリッジはマイクロプレートである。カートリッジは、少なくとも２、４、６、８、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４又は１５３６個のチャンバを含んでもよい。さらに、カートリッジチャンバは、マイクロプレート上のウェル又はリザーバであってもよい。微生物の懸濁液は、少なくとも１種の栄養素を含む培地を含んでもよい。
さらに、迅速なＡＳＴ法は、微生物成長を促進する条件下である時間の期間の間、カートリッジをインキュベートするステップを含んでもよい。インキュベーション時間の期間は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間であってもよい。初期インキュベーションは、一部の実施形態では、約１〜２時間、約１〜３時間、約１〜４時間、約１〜５時間、約１〜６時間、約２〜３時間、約２〜４時間、約２〜５時間、約２〜６時間、約３〜４時間、約３〜５時間、約３〜６時間、約４〜５時間、約４〜６時間又は約５〜６時間の時間の期間であってもよい。一部の実施形態では、初期インキュベーション期間は約３時間である。
最後に、迅速なＡＳＴ法は、抗微生物剤に対する微生物の感受性を決定するために成長アッセイを実施することを提供することができる。成長アッセイは生存アッセイであってもよい。成長アッセイの非限定的な例には、代謝プローブアッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、視覚アッセイ又はｐＨ分子プローブアッセイが含まれ得る。
当業者に公知であるように、ＡＳＴプラットフォームは、試験した各抗微生物剤についての最小阻害発育濃度（ＭＩＣ）結果及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）をもたらすことができる。ＣＬＳＩ微生物基準によれば、微生物の所与の属種及び株に対する所与の抗生物質のＭＩＣは、微生物の成長を阻害し、医師に投薬情報を提供することができる、２倍希釈系列における抗生物質の最低濃度として定義され得る。ＱＳＲもまた、医師に同様の投薬情報を提供することができるが、数値的なＭＩＣを提供することはできない。
ＡＳＴアッセイは、主に、各々の得られた生物学的試料に対する複数の抗微生物剤を並行して試験するように構成され得る。ＭＩＣ又はＱＳＲの結果をもたらすために、希釈系列が各抗微生物剤について必要とされ得る。したがって、ＣＬＳＩによって「微量液体希釈法（ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）」と呼ばれる液体ベースのＡＳＴに関して、アッセイは、異なる濃度での異なる抗微生物剤の並行試験を可能にするカートリッジ及び／又はマイクロプレートにおいて一般に実施される。微生物種及び抗微生物剤と共に、これらのＭＩＣは、微生物種及び抗微生物剤の各組合せについての臨床ＡＳＴ結果を提供するための臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＣＬＳＩ）ブレークポイント解釈を決定するために使用される。このような結果は、ＣＬＳＩ公開Ｍ−１００Ｓに従って感受性（Ｓ）、中間（Ｉ）、耐性（Ｒ）、非感受性（ＮＳ）及び解釈なし（ＮＩ）の形態をとる。
開示されているように（例えば、実施例において）、本明細書に記載されている方法は、６種（エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びエンテロバクター属種）（「ＥＳＫＡＰＥ」）全ての病原体を含む、広範囲の微生物種について至適基準と同等の結果をもたらすことが示されている。本明細書に記載されている方法は、新たな微生物種株及び診断試験に容易及び安価に適合され得る。
一部の実施形態では、方法は、微生物の懸濁液を、抗微生物剤を含む複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップ、初期時間の期間の間、微生物成長を促進する条件下でカートリッジをインキュベートするステップ、相対的微生物濃度が閾値を達成したかどうかを決定するためにチェックポイントアッセイを実施するステップ、及び抗微生物剤に対する微生物の感受性を決定するために複数の異なる成長アッセイを実施するステップによって微生物の抗微生物剤感受性を決定することを提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、抗微生物剤感受性試験のための自動プラットフォームにおいて実施される。
複数の異なるアッセイ
ＡＳＴ法は、ある特定の細菌株におけるＭＩＣ又はＱＳＲを決定するために有用であり得るアッセイを実施することができる。１種類のアッセイが、抗微生物剤に対する微生物の感受性を決定する際に、他の種類のアッセイよりも特定の微生物株に対して有効である場合が生じる。本明細書に記載されている方法は、もしあれば、複数の異なるアッセイのうちのどれが、抗微生物剤に対する微生物の感受性を決定するのに適切であり得るかを決定するための手段を提供する。一部の実施形態では、方法は、異なる抗微生物剤−抗生物質の組合せについての異なるアッセイを使用する。
各々の成長アッセイは、代謝プローブアッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、微生物質量についての測定、視覚アッセイ又はｐＨ分子プローブアッセイのようなエンドポイントアッセイの群から選択され得る。
複数の異なるアッセイは並行して実施されてもよく、成長アッセイ（例えば、エンドポイントアッセイ）は、所与の微生物に対する抗微生物剤感受性の決定を提供する。ＡＳＴ法は、上記のようなカートリッジ上で実行され得る。一部の実施形態では、複数の異なるアッセイは、異なるカートリッジチャンバ内で実施される。一部の実施形態では、同じアッセイは、カートリッジ上のチャンバの特定の行又は列において実施される。
一部の実施形態では、並行での複数の異なるアッセイの実行とは、アッセイが微生物成長のためのインキュベーション期間を共有することを意味する。一部の実施形態では、並行でのアッセイの実行は逐次的に実施される。一部の実施形態では、並行でのアッセイの実行は、同じカートリッジチャンバ内で実施される。一部の実施形態では、並行でのアッセイの実行は重なる。
一部の実施形態では、本発明は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の一晩の参照法と比較して、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５又は８時間未満で抗微生物剤に対する微生物の感受性の正確な迅速な決定を可能にするために代謝プローブアッセイ及び表面結合プローブアッセイを実施することを提供する。一部の実施形態では、代謝プローブアッセイは、表面結合プローブアッセイの前に実施される。累積的に、これらの２つのアッセイからのデータは、抗微生物剤のＭＩＣの正確な決定を可能にすることができ、したがって、一部の実施形態では、本発明は、標準的な方法と比較して大幅に低減された時間で、適切な治療レジメン、例えば、特有の抗微生物剤及び特定の投薬量を患者に提供する。
代謝プローブアッセイは、水混和性溶媒中に存在する代謝プローブを利用することができる。したがって、一部の実施形態では、代謝プローブの導入はエマルションをもたらさない。エマルション中にプローブを導入することは、小さなチャンバにおいて不便であり得、一貫性のない結果をもたらし得る。一部の実施形態では、代謝プローブは親水性又は実質的に親水性である。一部の実施形態では、代謝プローブアッセイは、酸化還元活性プローブである代謝プローブを使用する。代謝プローブアッセイの間に導入され得る酸化還元活性プローブの非限定的な例には、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＴＮＢＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、５−シアノ−２，３−ジ（ｐ−トリル）テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、３，３’（３，３’−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム）（ＤＢＮＰＴ）、３−（ナフタレン−１−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＮＤＴ）、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴＢＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、フェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエチルスルフェート（ＰＥＳ）、グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン（ＧＦ−ＡＦＣ）、２，２’−ビス（４−ニトロフェニル）−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）テトラゾリウムクロリド（ＴＶ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）ジクロリド（ＢＴＣ）、５−シアノ−２，３−ビス（４−メチルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内塩（ＸＴＴ）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＢＡＴＤＡのアセトキシメチルエステル、フェロセン、ドデシルレザズリン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、５−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートアセチルエステル、ジヒドロカルセインＡＭ、ジヒドロエチジウム、ルミノール又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロテトラメチルジヒドロローザミンが挙げられ得る。
一部の実施形態では、適切な代謝プローブは、当業者に周知であり、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１１版、（２０１０年）（例えば、第１５章、「Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」を参照のこと）及びＲｉｓｓ ＴＬ、Ｍｏｒａｖｅｃ ＲＡ、Ｎｉｌｅｓ ＡＬら、Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、２０１３年、５月１日［２０１６年７月１日改訂］、Ｉｎ：Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ ＧＳ、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ＮＰ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｈら編集者、Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［インターネット］、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ及びｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００４年並びにＵＳ７，８９７，３３１に記載されており、これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、酸化還元活性プローブは、式（Ｉ）に記載の構造
Figure 2020504610
 ［式中、
Ｒ１は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリール又はサブ構造Ａであり、
サブ構造Ａは、
Figure 2020504610
 （式中、
Ｌ１は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｌ２は独立して、共有結合、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ４は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールである）
であり、
各々のＸは独立して、不在又は一価アニオンである］
を有する。
一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立してＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｘは、一価アニオン（例えば、Ｃｌ−又はＢｒ−）である。さらなる実施形態では、Ｒ１は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから選択される１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。
一部の実施形態では、Ｘは不在である。さらなる実施形態では、Ｒ１は独立して、イオン化されたスルホン酸基である置換基を含む置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである。
一部の実施形態では、Ｒ３はサブ構造Ａであり、化合物は式（ＩＩ）に記載の構造
Figure 2020504610
 を有する。
実施形態では、Ｌ１は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリーレンであり、Ｌ２は共有結合である。
実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリーレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、任意選択的に置換されたフェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は非置換フェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３又は４個の置換基を有する置換されたフェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）を含む置換されたフェニレンである。
一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立してＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４は同じ基である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５は同じ基である。一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、各々のＸは一価アニオンである（例えば、各々のＸは独立してＣｌ−又はＢｒ−である）。さらなる実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから選択される１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４は同じ基である。
式（Ｉ）の例示的な化合物を表１に列挙する。
Figure 2020504610
Figure 2020504610
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物はＩＮＴである。
一部の実施形態では、代謝プローブアッセイの間に導入される代謝プローブは水不溶性である。さらなる実施形態では、代謝プローブは、分子が微生物によって効率的に還元されるための中間電子伝達体の添加を必要としない。
一部の実施形態では、代謝プローブアッセイの間に導入される代謝プローブは、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、レザズリンを含む代謝プローブとして市販のａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）指示染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用する。レザズリンは、代謝的に活性な細胞において還元反応を受けることができ、ここで、レザズリンは、代謝的に活性な細胞の還元反応を介して、蛍光分子であるレゾルフィンに変換される。レゾルフィンによって生じる蛍光発光は、プレートリーダー、蛍光分光光度計及び／又はＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によって測定され得る。レザズリンが使用されるいくつかの場合において、励起フィルターが、約５６０ｎｍの波長の光により試料を励起するために使用され得、発光フィルターが、（例えば、レゾルフィンへの還元後）約５９０ｎｍにて試料から発せられる光を検出するために使用され得る。一部の実施形態では、異なるアッセイは、プローブの蛍光シグナルの検出におけるいかなる干渉も回避するために、異なる発光波長を有する蛍光プローブを利用する。例えば、代謝プローブアッセイ及び表面結合プローブアッセイは、異なる発光波長を有する蛍光プローブを使用することができ、この代謝プローブアッセイ及び表面結合プローブアッセイは、これらの蛍光プローブのシグナルの正確な検出を可能にする。蛍光プローブのこのような組合せの例は、レザズリン（レゾルフィンに変換する）及びユウロピウムクリプテートである。
一部の実施形態では、代謝プローブは微生物によって酵素的に加水分解されない。酵素的に加水分解されるプローブを導入することは、異なる微生物が異なる酵素を有し得るので、代謝アッセイにとって問題となり得る。微生物によって酵素的に加水分解されるプローブの例には、４−メチルウンベリフェリルホスフェートと、ヘキサノエート、オクタノエート若しくはノナノエート又は例えば、鎖長範囲Ｃ６〜Ｃ１６内の他の脂肪酸エステルのような４−メチルウンベリフェリル脂肪酸エステルとの混合物；４−メチルウンベリフェリルエステル、例えば、ホスフェートと、７（Ｎ）−アミノアシル−４−メチル−７−アミノクマリン、例えば、アラニン誘導体の代わりに対応するロイシン誘導体である、７（Ｎ）−アラニル−４−メチル−７−アミノ−クマリンとの混合物；４−メチルウンベリフェリルノナノエート（ＭＵＮ）；４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）；又は４−メチル−７−アミノ−クマリン−７−Ｎ−アラニルペプチド；又は他のクマリンの対応する蛍光誘導体が含まれる。
酵素生化学プローブアッセイの間に導入され得る酵素生化学プローブの非限定的な例には、４−メチルウンベリフェロン又は７−アミノ−４−メチルクマリンのクマリン誘導体を含有する合成酵素物質；ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル又は４−メチルウンベリフェロンのエステルを含有する合成酵素物質；ｐ−ニトロアニリン及び７−アミノ−４−メチルクマリンのアリールペプチド誘導体が含まれ得る。例えば、以下の酵素の誘導体が利用され得る：β−Ｄ−グルクロニダーゼ（限定されないが、フェノールフタレイン−モノ−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェノール−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含む物質）；β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（限定されないが、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む物質）；６−ホスホ−β−Ｄ−ガラクトシド６−ホスホガラクトヒドロラーゼ（限定されないが、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−６−ホスフェート、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む物質）；α−Ｄ−ガラクトシダーゼ（限定されないが、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトシドを含む物質）；β−Ｄ−グルコシダーゼ（限定されないが、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシドを含む物質）；α−アミラーゼ（限定されないが、ペンタ−、ヘキサ−及びヘプタ−マルトースのｐ−ニトロフェノール誘導体を含む物質）；ノイラミニダーゼ（限定されないが、ｏ−ニトロフェノール及びβ−Ｄ−ガラクトサミン、β−Ｄ−グルコサミン、２−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、β−Ｄ−Ｎ’，Ｎ’−ジアセチルキトビオースの４−メチルウンベリフェリル誘導体を含む物質）；エステラーゼ（限定されないが、４−メチルウンベリフェリル−ブチレートを含む物質）；ＤＮＡｓｅｓ（限定されないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−チミジン−３−ホスフェート、チミジン−５−モノホスフェート−ｐ−ニトロフェノールエステル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールのホスフェートエステルを含む物質）；ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｔｅｓ）（限定されないが、フェノールフタレイン、フェノール、α−又はβ−ナフトール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、ｐ−ニトロフェノール、４−メチルウンベリフェリルを含む物質）；ピログルタミルアミノペプチダーゼ（限定されないが、Ｌ−ピロリドニル−β−ナフチルアミド、Ｌ−ピログルタミル−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−ピログルタミル−７−アミド−４−メチルクマリンを含む物質）；Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ（限定されないが、ｐ−ニトロアニリド−Ｌ−アラニンを含む物質）；エンドペプチダーゼ（限定されないが、ニトロアニリド誘導体を含む物質）；又はコアグラーゼ（限定されないが、クロモザイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ）ＴＨ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−β−ナフチルアミドＨＣｌを含む物質）。
一部の実施形態では、ウレアーゼによって引き起こされるもののような、特定の酵素活性によって引き起こされるｐＨの変化が検出される。
生化学プローブアッセイの間に導入され得る生化学プローブの非限定的な例には、限定されないが、２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ｄｉａｚｏｌ）−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース；蛍光ポリミキシンＢ類似体（限定されないが、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）及びダンシル誘導体を含む）、蛍光ペニシリン類似体（限定されないが、ＢＯＣＩＬＬＩＮＴＭ ＦＬ及びＢＯＣＩＬＬＩＮＴＭ ６５０／６６５を含む）又は蛍光バンコマイシン類似体（限定されないが、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）を含む）のような蛍光抗生物質を含む蛍光グルコース類似体が含まれ得る。
核酸プローブアッセイの間に導入され得る核酸プローブの非限定的な例には、アクリジンオレンジ、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体、エチジウムモノアジド、ヨウ化ヘキシジウム、ミトラマイシン、ヨウ化プロピジウム、染料のＳＹＴＯＸ（登録商標）ファミリー、染料のＳＹＴＯ（登録商標）ファミリー、染料のＴＯＴＯ（登録商標）ファミリー（ＰＯＰＯＴＭ、ＢＯＢＯＴＭ、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＪＯＪＯＴＭ、ＰＯＰＯＴＭ、ＬＯＬＯＴＭを含む）、染料のＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）ファミリー（ＹＯ−ＰＲＯ（登録商標）を含む）又は７−アミノアクチノマイシンＤが含まれ得る。
一部の実施形態では、これらのプローブは、直接使用されてもよく、又は細胞溶解後に使用されてもよい。
細胞溶解の前に使用される場合、無傷の細胞膜に効果的に浸透することができない核酸プローブは、細胞成長を増加させるための減少するシグナルを与え得る。次いで逆のシグナルを与えるアッセイが、代謝（酸化還元）プローブ、生化学プローブなどのような、成長を増加させるための増加するシグナルを与えるアッセイと比較され得る。
ＲＮＡプローブアッセイの間に導入され得るＲＮＡプローブの非限定的な例には、染料のＳＹＴＯ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔＴＭファミリーが挙げられ得る。
タンパク質プローブアッセイの間に導入され得るタンパク質プローブの非限定的な例には、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸又はＦＵＮ（登録商標）１細胞染色が含まれ得る。
多くの異なる特徴を有する任意の光学装置（例えば、顕微鏡、マイクロプレートリーダー）は、本明細書に記載されている方法に従って放出されるシグナルを検出することができる。例えば、広域スペクトルランプ（例えば、キセノン）、狭域スペクトルランプ、レーザ、ＬＥＤ、多光子、共焦点又は全反射照明が、励起のために使用され得る。カメラ（単一又は複数）、フォトダイオードの単一又はアレイ（１Ｄ又は２Ｄ）、アバランシェフォトダイオード、ＣＭＯＳ又はＣＣＤセンサ、固体状態光電子増倍管（例えば、シリコン光電子増倍管）及び／又はフィルターベース若しくは格子ベースのいずれかのスペクトル分解能（スペクトル的に分解された発光波長）を有する光電子増倍管（単一又は複数）が、検出側では可能である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、光励起源（例えば、キセノンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ））、所望の特性（例えば、帯域通過、帯域阻止、中心波長、半値全幅（ＦＷＨＭ））を有する１組の光学フィルター（例えば、離散フィルター、モノクロメーター）及び光検出器（例えば、光電子増倍管）を含む光学システムを使用する。光学システムはまた、データを収集し、処理するために使用されるデータ収集及び処理電子機器を含んでもよい。一部の場合、光学システムは、システム全体にわたってカートリッジを移動させるために使用されるロボットアームに入れ子にされ、又はそうでなければこの中若しくは上に配置される光ファイバー及び集光光学系のような、１つ以上の構成要素を含んでもよい。このような構成は、より速い試料処理及び結果の読み出しを達成するのに役立つことができる。これらの光学システムは、カートリッジから検出器及びデータ処理電子機器にシグナルを運ぶことができる。
一部の実施形態では、代謝プローブアッセイは、抗微生物についてのＭＩＣ又はＱＳＲを決定するためにこれ自体で使用される。
ある特定の実施形態は、代謝プローブアッセイと表面結合プローブアッセイとの間の分離ステップを含む。可能な分離技術には、限定されないが、濾過（例えば、０．４５ミクロン以下又は０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルターによる）、遠心分離（例えば、５００×ｇ超のｇ力による）、電気泳動、誘電泳動及び磁気捕捉が含まれ得る。これらの技術は、微生物に関連する１つのアッセイからプローブを分離するために利用され得、この微生物はフィルター内に付着され、遠心分離機内でペレット化され、並びに／又は溶液中に遊離しているものから電気泳動的及び／若しくは磁気的に分離される。遊離プローブはフィルターを通過し（「濾液」）、遠心分離若しくは磁気分離後に溶液中に残り（「上清」）、及び／又は別々に電気泳動的に泳動する。遠心分離は、標準的な遠心分離、密度勾配遠心分離又は分画遠心分離であってもよい。磁気分離は、微生物と会合する又は結合するように特異的に標的化された磁性粒子の添加を必要とし得る。これらは、プローブ添加の前に添加されてもよく、又はプローブ添加と同時に添加されてもよい。
分離効率を最大化するために、すなわち、残っているアッセイからの遊離プローブの数を最小化するために、洗浄ステップが実施され得る。これらは、遠心分離若しくは磁気捕捉の場合のように不連続であってもよく、及び／又は濾過、磁気捕捉若しくは電気泳動の場合のように連続的であってもよい。
洗浄は、表面結合プローブアッセイからの表面結合プローブを微生物に添加する前に実施され得る。これらの洗浄は、例えば、インキュベーションの間に微生物が懸濁された液体中に存在する干渉する属種を除去することができる。一部の実施形態では、洗浄は実施されない。
本明細書に記載されている方法のある特定の実施形態は、エチレンジアミン四酢酸及び／又はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を含む洗剤溶液の添加を含む。一部の実施形態では、洗剤溶液は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＣＴＡＢ、Ｓｐａｎ、Ｂｒｉｊ、テトラアンモニウム化合物、カチオン性ポリマー、プルロニック、スルフェート、ＣＰＣ、スルホネート、ＢＡＣ、ホスフェート、ＢＺＴ、カルボキシレート、ＤＯＤＡＢ、ドクセート、脂肪／高炭素アルコール、ＣＨＡＰＳ、リン脂質及び／又はグルコシドのうちの１つ以上を含む。
表面結合プローブアッセイは、ランタニドとジエチレントリアミン四酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｔｒａａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ）又はクリプテート配位子との配位錯体を含む表面結合プローブを導入することができる。ある特定の実施形態では、表面結合プローブアッセイは、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウム又はこれらの組合せのような増幅剤を含む。一部の実施形態では、増幅剤は、
Figure 2020504610
 を含むユウロピウムシグナル伝達物質である。
本明細書に記載されている方法において、表面は、細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜の外面；細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜の内面；又は細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜内であってもよい。表面は、限定されないが、繊毛、線毛及び鞭毛を含む、細胞外に突出する細胞の構造を含んでもよい。表面は細胞小器官を含んでもよい。表面は、膜貫通タンパク質、細胞壁タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外関連多糖、細胞内関連多糖、細胞外脂質、細胞内脂質、膜脂質、細胞壁脂質、タンパク質、多糖及び／又は細胞エンベロープに不可欠な脂質若しくは細胞エンベロープに関連する脂質を含んでもよい。表面は核酸を含んでもよい。
表面は、シグナル伝達物質が結合する又は会合する生体分子を含んでもよい。生体分子の非限定的な例には、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポリン、ベータ−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、リピドＡ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質及びこれらの組合せが含まれ得る。
表面結合プローブアッセイのシグナル発生は、発生溶液の添加を必要とし得る。触媒を含むシグナル伝達物質に関して、発生溶液は、光学的及び／又は電気的に活性なシグナル伝達分子に変換され得るシグナル前駆体を含んでもよい。発生溶液の添加後の特定の時間に、比色及び／又は電気化学的シグナルが測定され得る。このようなシグナルには、限定されないが、吸光度、蛍光、時間分解蛍光、化学ルミネセンス、電気化学ルミネセンス、電流測定、ボルタンメトリー、インピーダンス及び／又はインピーダンス分光法が含まれ得る。次いでデータが、従来のＡＳＴプロトコールと同様に、ＡＳＴ及びＭＩＣを決定するために比較され得る。
一部の実施形態では、ランタニド系増幅剤が使用される場合、時間分解蛍光（ＴＲＦ）又は時間ゲートルミネセンス（ＴＧＬ）が使用される。ある特定の実施形態では、ユウロピウム（例えば、ユウロピウムクリプテート）が使用される場合、励起フィルターが、約３３０ｎｍの波長の光により（例えば、８０ｎｍの帯域により）試料を励起するために使用され、発光フィルターが、約６１５ｎｍ（例えば、１０ｎｍの帯域幅）にて試料から発せられる光を検出するために使用される。ＴＧＬが、ランタニドレポーター分子の長い寿命に起因して、測定のための短いパルス及び遅延時間窓を使用するので、励起及び検出器が典型的に同期される。例えば、ユウロピウムに関して、１００〜２００マイクロ秒（μｓ）の遅延が、励起光源の消光と試料によって発せられる光の測定開始との間で使用され得る。例えば、試料によって発せられる光を測定する２００〜６００μｓの期間（すなわち、積分窓）が使用され得る。
一部の実施形態では、シグナルレベルを決定することは、無傷の微生物に関連するシグナルレベルを測定することを含む。或いは又はさらに、シグナルレベルを決定することは、無傷の微生物に関連しないシグナルレベルを測定することを含む。
これらのプロセスは、培養物、継代培養物、陽性血液培養物、試料から直接実施され得る。微生物を濃縮し、及び／又は潜在的な干渉する属種を除去するための処理は、ＡＳＴの前に実施されてもよく、又はシグナル伝達物質の添加の前に実施されてもよい。
ＭＩＣ及び／又はＱＳＲ出力データは、本明細書に記載されているアッセイによって生成されるデータから直接、ユーザによって解釈され得る。或いは、これらのデータは、ＭＩＣ及び／又はＱＳＲを得るようにアルゴリズムによって処理され得る。報告されたＭＩＣ及び／又はＱＳＲの値は、本明細書に記載されているアッセイから導き出され得る。
一部の実施形態では、抗微生物剤についてのＭＩＣ又はＱＳＲを決定する異なるアッセイの数は、実施されるアッセイの数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、抗微生物剤についてのＭＩＣ又はＱＳＲを決定する異なるアッセイの数は、実施されるアッセイの数と等しくてもよい。
チェックポイントアッセイ
チェックポイントアッセイは、微生物成長を確認するために実施され得る。例えば、正確なＡＳＴ決定を得るために、アッセイはゆっくり成長する細菌株を考慮することができ、したがって本明細書の方法は、十分な微生物成長が起こったかどうかを確認するために初期インキュベーション期間後に行われるチェックポイントアッセイを提供することができる。微生物の成長のような成長は、微生物の数の増殖、長さの増加、体積の増加並びに／又は核酸及び／若しくはタンパク質含有量の増加を含み得る。
ＡＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び表面結合測定のような様々なエンドポイント測定は、ＡＳＴ決定に適用可能であることが以前に示されているが、これらのアッセイは、メチシリン耐性株及びメチシリン感受性株を含む、他のＳ．アウレウス株よりも顕著に遅い成長動態を有し得るバンコマイシン中間体スタフィロコッカス・アウレウスのような、ゆっくり成長する微生物株を考慮に入れることができないため、現在まで商業的に失敗している。
従来のＡＳＴ法は、マイクロプレートにおける微量液体希釈法手順を利用する自動化された機器上で実施され得、ここで、成長指標は、時間に関する指標シグナルを測定することによって、ＡＳＴの結果を決定するために接種及びインキュベーションの間に培養液中に含まれる。しかしながら、レザズリンのようなこれらの成長指標は、実際には、これらがインキュベーション期間の間に添加される場合、微生物に対して有害であり得ることが見出された。
一部の成長指標は微生物成長を抑制し得るが、これらは、微生物インキュベーションの間の成長閾値チェックポイントウェルへのこれらの組み込みによって、阻害されない成長のための代用物として役立ち得る。ゆっくり成長する細菌の限界に対処するために、成長指標を使用するチェックポイントアッセイは、十分な微生物成長が閾値に達したことを測定するために最初に実施され得、次いで相対的微生物濃度の最終測定が、ＡＳＴの結果（例えば、ＭＩＣ又はＱＳＲ）を決定するために別々のウェルにおいて実施され得る。チェックポイントアッセイが、微生物成長が閾値に達しなかったことを示す場合、マイクロプレートは、さらなる時間の期間の間、インキュベートされ得、成長閾値に達するまで、相対的微生物濃度の最終的な測定を開始しない。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションの時間の期間は、１〜２０時間、２〜２０時間、３〜２０時間、４〜２０時間、５〜２０時間、６〜２０時間、８〜２０時間、９〜２０時間、１０〜２０時間、１１〜２０時間、１２〜２０時間、１３〜２０時間、１４〜２０時間、１５〜２０時間、１６〜２０時間、１７〜２０時間、１８〜２０時間又は１９〜２０時間、実施される。一部の実施形態では、インキュベーション期間は、２〜１９時間又は３〜１８時間、４〜１６時間、３〜１４時間、３〜１２時間又はこれらの間の全ての可能な時間間隔である。
一部の実施形態では、閾値は、陽性対照とバックグラウンド対照との間の比である。一部の実施形態では、陽性対照は、微生物の懸濁液及び微生物なしでインキュベートされた成長指標を含む。一部の実施形態では、バックグラウンド対照は、培地及び抗微生物剤なしでインキュベートされた成長指標を含む。一部の実施形態では、シグナル対ノイズ比は、未接種ウェルに対する接種ウェルにおけるａｌａｍａｒ ｂｌｕｅシグナルのような成長指標の比を決定することによって測定される。ある特定の実施形態では、陽性対照対バックグラウンド対照の比は、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５又はこれ以上である。一部の実施形態では、シグナル対ノイズ比は、未接種ウェルに対する接種ウェルにおける表面結合剤からのシグナルを決定することによって測定される。
一部の実施形態では、これらのチェックポイントアッセイのために使用されるマイクロプレートのウェルは抗微生物剤を含まず、これらは、抗微生物剤の効力を決定するための最終測定にも利用されない。ある特定の実施形態では、チェックポイントアッセイは、抗微生物剤を有さないチャンバ内で実施される。一部の実施形態では、チェックポイントアッセイは、１種以上の微生物を有さないチャンバ内で実施される。一部の実施形態では、チェックポイントアッセイは、微生物に対する既知の効力の１種以上の抗微生物剤を有するチャンバ内で実施される。
閾値チェックポイントアッセイが、ＡＳＴ成長アッセイを開始するのに十分な成長を示す場合、複数の異なるアッセイが実施され得る。以前に説明されているように、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）のような、ＡＴＰについてのアッセイ；ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯを含む、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール及びシアニンのようなＤＮＡ染色；並びに酵素結合免疫吸着測定法、抗体アッセイ、レクチンベースのアッセイ、ポリミキシンＢベースのアッセイ及び化学プローブベースのアッセイのような結合アッセイのようなＡＳＴ成長アッセイが利用され得る。
一部の実施形態では、チェックポイントアッセイは、核酸増幅又は核酸シークエンシングを含む。一部の実施形態では、チェックポイントアッセイは、顕微鏡検査又は質量分析を含む。一部の実施形態では、チェックポイントアッセイは、微生物質量を測定することを含む。
成長指標
上記のように、成長指標は、ＡＳＴ成長アッセイを実施する前に十分な微生物成長を確認するためにチェックポイントアッセイにおいて使用され得る。以下に示されるように、様々な成長指標が利用され得る。
一部の実施形態では、成長指標は、チェックポイントアッセイの間、光学的又は電気的に活性である。さらに、一部の実施形態では、成長指標の光シグナルは、蛍光、時間分解蛍光、吸光度又はルミネセンスを含む。成長指標の電気シグナルは、ボルタンメトリー（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｉｃ）又は電位差測定であり得る。
ある特定の実施形態では、成長指標は、チェックポイントアッセイの間に化学又は生化学反応を起こす。一部の実施形態では、成長指標は、微生物細胞膜、細胞壁、細胞エンベロープ、タンパク質、単糖、多糖、脂質、細胞小器官又は核酸に結合することができる化学又は生化学基である。なおさらに、成長指標は、チェックポイントアッセイの間、ｐＨに応答し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている成長指標は、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＴＮＢＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、５−シアノ−２，３−ジ（ｐ−トリル）テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、３，３’（３，３’−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム）（ＤＢＮＰＴ）、３−（ナフタレン−１−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＮＤＴ）、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴＢＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、フェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエチルスルフェート（ＰＥＳ）、グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン（ＧＦ−ＡＦＣ）、２，２’−ビス（４−ニトロフェニル）−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）テトラゾリウムクロリド（ＴＶ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）ジクロリド（ＢＴＣ）、５−シアノ−２，３−ビス（４−メチルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内塩（ＸＴＴ）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＢＡＴＤＡのアセトキシメチルエステル、フェロセン、ドデシルレザズリン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、５−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート及びこのアセトキシメチルエステル、クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートアセチルエステル、ジヒドロカルセインＡＭ、ジヒドロエチジウム、ルミノール又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロテトラメチルジヒドロローザミンを含む。
一部の実施形態では、成長指標は、式（Ｉ）に記載の構造
Figure 2020504610
 ［式中、
Ｒ１は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリール又はサブ構造Ａであり、
サブ構造Ａは、
Figure 2020504610
 （式中、
Ｌ１は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｌ２は独立して、共有結合、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ４は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールである）
であり、
各々のＸは独立して、不在又は一価アニオンである］
を有する。
一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立してＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ３は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｘは、一価アニオン（例えば、Ｃｌ−又はＢｒ−）である。さらなる実施形態では、Ｒ１は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから選択される１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。
一部の実施形態では、Ｘは不在である。さらなる実施形態では、Ｒ１は独立して、イオン化されたスルホン酸基である置換基を含む置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである。
一部の実施形態では、Ｒ３はサブ構造Ａであり、化合物は式（ＩＩ）に記載の構造
Figure 2020504610
 を有する。
実施形態では、Ｌ１は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリーレンであり、Ｌ２は共有結合である。
実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリーレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、任意選択的に置換されたフェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は非置換フェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３又は４個の置換基を有する置換されたフェニレンである。実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々は独立して、Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）を含む置換されたフェニレンである。
一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立してＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ４は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４は同じ基である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、０、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、非置換フェニル又は非置換ナフチルである。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ５は独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５は同じ基である。一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；ニトロ；及びスルホン酸又はこのイオン化形態（例えば、−ＳＯ３Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａ）から独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ２及びＲ５の各々は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）である。
一部の実施形態では、各々のＸは一価アニオンである（例えば、各々のＸは独立してＣｌ−又はＢｒ−である）。さらなる実施形態では、Ｒ１及びＲ４の各々は独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール（例えば、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル）；Ｃ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ）；ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）；−ＣＮ；及びニトロから選択される１、２、３、４又は５個の置換基によって置換されたフェニル）である。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ４は同じ基である。
式（Ｉ）の例示的な化合物を表２に列挙する。
Figure 2020504610
Figure 2020504610
Figure 2020504610
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物はＩＮＴである。
一部の実施形態では、適切な成長指標は、当業者に周知であり、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１１版、（２０１０年）（例えば、第１５章、「Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」）及びＲｉｓｓ ＴＬ、Ｍｏｒａｖｅｃ ＲＡ、Ｎｉｌｅｓ ＡＬら、Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、２０１３年５月１日［２０１６年７月１日改訂］、Ｉｎ：Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ ＧＳ、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ＮＰ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｈら編集者、Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［インターネット］、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００４年並びにＵＳ７，８９７，３３１（これらの全体は参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている代謝プローブである。
一部の実施形態では、成長指標は、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、レザズリンを含む成長指標として市販のａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を使用する。一部の実施形態では、レザズリンは代謝的に活性な細胞において還元反応を起こし、ここで、レザズリンは蛍光分子であるレゾルフィンに変換される。一部の実施形態では、レゾルフィンによって生じる蛍光発光は、プレートリーダー、蛍光分光光度計及び／又はＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によって測定される。一部の実施形態では、成長指標は、微生物の懸濁液をカートリッジチャンバに導入する間又はインキュベーション期間の開始時に所定のチェックポイントアッセイチャンバに導入される。
時間ゲートルミネセンス（例えば、時間分解蛍光）は、成長指標からの光シグナルを測定するために利用され得る。一部の場合、方法は、増幅剤分子の励起及び放出光の検出を可能にし、この放出光は、時間的（例えば、検出は遅延させることができ、全ての自己蛍光が消滅した励起後に行われる）及びスペクトル的（例えば、励起波長は発光から１００ｎｍ超離れてもよく、これによってより安価なバンドパスフィルターの使用が可能となる）の両方で分離され得る。一部の実施形態では、増幅は、結合分子によって触媒的に修飾された基質の添加によって達成され、光出力が測定され得る。この光シグナルは、吸光度シグナル、蛍光シグナル及び／又は化学ルミネセンスシグナルを含んでもよい。一部の実施形態では、シグナルは電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）を含む。
カートリッジ
カートリッジは、微生物の液体懸濁液を保持し、成長を可能にすることができる容器であってもよい。カートリッジの非限定的な例には、培養フラスコ、培養皿、ペトリ皿、バイオアッセイ皿、培養管、試験管、マイクロチューブ、ボトル、マイクロチャンバプレート、マルチチャンバプレート、マイクロタイタープレート、マイクロプレートが含まれ得る。カートリッジは１つのチャンバを含んでもよい。カートリッジは複数のチャンバを含んでもよく、各チャンバは別の空間から物理的に隔離された液体懸濁液を保持することができる空間であり、チャンバの一例はマルチウェル（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ）プレートにおけるチャンバである。カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６個又はこれ以上のチャンバ及びこれらの間の任意の数のチャンバを含んでもよい。カートリッジチャンバの底部は、平坦、円形又はＶ字形であってもよい。
カートリッジ上の複数のチャンバ内に存在する抗微生物剤は培地中に懸濁され得る。一部の実施形態では、抗微生物剤は抗微生物フィルムの形態で存在する。ある特定の実施形態では、抗微生物剤は固形である。一部の実施形態では、固形抗微生物剤は凍結乾燥及び／又は乾燥される。ある特定の実施形態は、微生物の懸濁液の導入前に、固形の、凍結乾燥された、又は乾燥された抗微生物フィルムとして、１個以上のカートリッジチャンバ内に存在する１種以上の抗微生物剤を提供する。
抗微生物剤希釈系列は、微生物をプレート接種する前に、凍結され、凍結乾燥され、又は新たに調製され得る。一部の場合、カートリッジの接種は、手動により実施されてもよく、又は自動システムを使用して実施されてもよい。一部の例では、新たな抗微生物剤プレートのような場合、自動液体操作システムが、抗微生物剤希釈系列を用いてカートリッジを準備するために使用され得る。接種プロセスは、当該技術分野において公知であり得る様々なプロセスのいずれかを含んでもよい。
本明細書に記載されているように、カートリッジは、チェックポイントアッセイ及び複数の異なる成長アッセイのような複数の試験シーケンスを実施するために、流体の様々な組合せを含有するために使用され得る。一部の実施形態では、カートリッジは、１つ以上のチェックポイントアッセイを促進するために使用されるチャンバのセット及び１つ以上の成長アッセイを促進するために使用されるチャンバのセットを有する。例として、カートリッジは、行及び列に配置されたチャンバのアレイを含んでもよい。カートリッジは、対照チャンバのセット及び抗微生物剤試験チャンバのセットを含んでもよい。対照チャンバのセットは２個のチャンバを含んでもよく、試験チャンバのセットは、プレートに沿ってチャンバの残りを含んでもよい。一部の実施形態では、対照チャンバのセットは少なくとも２個のチャンバを含み、１個のチャンバは成長チャンバであり、別のチャンバは非成長チャンバである。一部の実施形態では、成長チャンバは、培養期間の間に培養液内で成長することができる培養液及び微生物の組合せを含み、又は含むように接種される。ある特定の実施形態では、抗微生物剤はチェックポイントアッセイチャンバに添加されない。一方、一部の実施形態では、非成長チャンバは、微生物を有さない培養液を含んでもよく、又は含むように接種されてもよい。一部の実施形態では、抗微生物剤はまた、非成長チャンバに添加されない。したがって、インキュベーション期間の間、非成長チャンバは、微生物が成長することができる成長チャンバと比較するベースラインとして機能し得る。
一部の実施形態では、各カートリッジは、抗微生物剤及び各抗微生物剤の規定された２倍希釈系列の組合せを含む。さらに、各カートリッジは、成長対照チャンバ、非成長（夾雑物）対照チャンバ及び生理食塩水対照チャンバのような対照チャンバを含有してもよい。生理食塩水対照チャンバは、接種材料中の微生物の初期濃度とほぼ等しいＦＩＴ対照を表し得る。カートリッジは、カバー（例えば、取り外し可能な蓋）及び抗生物質の構成を固有に規定する識別子（例えば、バーコード）及びプレートを規定し、ＨＩＰＡＡに準拠する固有の患者試料と関連付けることができる固有のコードを有する複数のチャンバ（例えば、９６個のチャンバのカートリッジ又は３８４個のチャンバのカートリッジ）を含んでもよい。
試験チャンバは、生物学的試料に由来する微生物と、感受性が分析され得る様々な種類及び濃度の抗微生物剤との様々な組合せのいずれかを含んでもよい。チャンバの行は特定の抗微生物剤専用であってもよく、この抗微生物剤の濃度は同じ行の列の間で変化させてもよい。例えば、カートリッジはペニシリンを含有するチャンバの行を有してもよく、各々のチャンバは左から右へ増加していく濃度のペニシリンを含有する。
もちろん、他の例も可能である。例えば、異なるチャンバ及びチャンバのセットが、カートリッジに沿った様々な位置のいずれかに配置されてもよい。さらに、異なるチャンバのセット（例えば、対照チャンバ及び試験チャンバ）は、カートリッジに沿って、より多くの個々のチャンバを含んでもよく、又はより少ない個々のチャンバを含んでもよい。さらに、一部の場合、試験の間に全てのチャンバが使用されるとは限らず／占有されるとは限らない。
予熱カートリッジ
インキュベーション期間の前にカートリッジを３０〜４５℃に予熱することは、微生物成長を促進するために有利であり得、これにより次に、より速い及び／又はより正確な抗微生物剤感受性試験（ＡＳＴ）決定がもたらされ得る。標準的な空気対流インキュベーターは典型的に、試験パネルを所望の作業温度にするのに３０〜６０分かかるので、予熱は一部の場合に有用であり得る。典型的な所望のインキュベーション時間は８時間未満であり、ほとんどの場合、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満又は３時間未満であるので、予熱は、迅速なＡＳＴを実施するための本明細書に記載されている方法と共に使用するのに特に有用であり得る。
微生物が３０℃〜４５℃、３１〜３９℃又は３３〜３７℃の温度にてインキュベートされる時間を最大化することによって、動的成長範囲を達成するための十分な成長、したがってより正確なＡＳＴ決定が実現され得る。微量液体希釈法が使用される自動ＡＳＴ試験において、各カートリッジウェルにおける溶液が微生物成長を促進する温度に達する速度を増加させることにより、ＡＳＴアッセイの期間を短縮することができる。
一部の実施形態では、単一の９６ウェルマイクロプレート（蓋付き）は、標準的な対流加熱の約２０分後に成長促進温度に達し、アッセイスループットを増加させるのに役立ち得る、積み重ねた９６ウェルマイクロプレートは、これらの温度に達するのに約４０分の加熱時間を必要とした。
ウェル間の加熱の均一性もまた、特に積み重ねたマイクロプレートと共に標準的なインキュベートを使用する際に問題となり得る。４プレート積み重ねの中央プレートについて拡大され得るウェル温度のかなりの半径方向分布が存在し得る。
本明細書に記載されている方法は、微生物の懸濁液を含むカートリッジを、予熱されたカートリッジをインキュベートする前に約３０℃〜約４５℃の温度に予熱することによって、微生物成長を促進することができる。一部の実施形態では、微生物のインキュベーションは、カートリッジを予熱してから１０、１５、２０、２５、３０又は６０分以内に行われる。より大きな動的成長範囲を、本明細書に記載されているこれらの増強された成長技術によって生じることができ、これにより、良好なＡＳＴアッセイ結果をもたらすことができる。
一部の実施形態では、カートリッジは、約２７℃〜約４８℃、約３０℃〜約４５℃、約３１℃〜約３９℃又は約３３℃〜約３７℃の温度に予熱される。
予熱されるカートリッジは、少なくとも９６個のチャンバを含んでもよい。カートリッジの予熱は、少なくとも９６個のチャンバの実質的に均一な加熱を生じ得る。
一部の実施形態では、カートリッジは、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、約２分未満又は約１分未満の間、予熱される。ある特定の実施形態では、カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５又は３０分の間、予熱される。
カートリッジの予熱は、放射加熱、伝導加熱又は対流加熱によって行うことができる。一部の実施形態では、放射加熱は赤外放射加熱である。或いは、カートリッジは伝導加熱及び対流加熱によって予熱され得、少なくとも１つの加熱面が伝導加熱及び対流加熱を実施することができる。一部の実施形態では、カートリッジは、放射加熱と、伝導加熱及び対流加熱との両方によって予熱される。ある特定の実施形態では、カートリッジは対流加熱のみによっては予熱されない。カートリッジはまた、少なくとも２５℃の温度、少なくとも３０℃の温度又は少なくとも３５℃の温度にて、少なくとも１種の流体のカートリッジへの添加によって予熱されてもよい。
一部の実施形態では、カートリッジは、抗微生物剤感受性試験を実施するための自動プラットフォームにカートリッジを充填する前に予熱される。
カートリッジの予熱は、５％未満のカートリッジにわたる温度のばらつきを生じ得る。ある特定の実施形態は、最高温度のチャンバと最低温度のチャンバとの間の温度のパーセント差が５％未満である、チャンバの実質的に均一な加熱を提供する。
カートリッジ揺動
溶液混合は、溶液通気を高めることによって、大きな成長溶液体積（例えば、１０ｍＬ超）における微生物成長速度を促進することが、当業者によって十分に理解される。微量液体希釈法ＡＳＴアッセイは一般に、１２ｍｍ未満の横寸法を有するウェルを含むカートリッジにおいて実施される。１２ｍｍ未満の横寸法を有するウェル内で適切な溶液混合を達成するために、オービタル振とう振動数は少なくとも毎分５００回転（ｒｐｍ）でなければならない。しかしながら、これらの振動数は、微生物に対する高ひずみ及び高せん断に起因して、１２ｍｍ未満の横寸法を有するウェル内の微生物成長を阻害する。
ある特定の実施形態では、方法は、溶液混合を達成するのに不十分な振動数又は半径にてカートリッジを揺動することによって微生物成長を促進することを提供する。カートリッジ及びこの中の微生物のオービタル又は軸方向振とうのような揺動は、インキュベーションの間、微生物の良好な酸素化及び成長培地中の栄養素への均一な曝露を促進するために使用され得る。驚くべきことに、副混合（ｓｕｂ−ｍｉｘｉｎｇ）により誘導される振とう振動数及び半径は、微生物成長速度を速めることができることが見出された。
本発明の方法の一部の実施形態では、カートリッジは少なくとも９６個のチャンバを含み、チャンバの各々は１２ｍｍ未満の横寸法を有する。カートリッジは、機械的揺動、音響的揺動又は磁気的揺動によって揺動され得る。機械的揺動の非限定的な例には、振とう若しくは振動並びに／又は撹拌子、撹拌パドル、撹拌ブレード及び／若しくは撹拌プロペラ若しくはインペラの使用が含まれ得る。機械的揺動は、軸線、オービタル又は半オービタル振とうであってもよい。
オービタル振とう（例えば、円形、楕円形など）は、毎分５０回転超、毎分６０回転超、毎分７０回転超、毎分８０回転超、毎分９０回転超、毎分１００回転超、毎分１２５回転超、毎分１５０回転超、毎分１７５回転超、毎分２００回転超、毎分２２５回転超、毎分２５０回転超、毎分２７５回転超、毎分３００回転超、毎分３２５回転超、毎分３５０回転超、毎分３７５回転超、毎分４００回転超、毎分５００回転超、毎分６００回転超、毎分７００回転超、毎分７２５回転超、毎分７５０回転超、毎分７７５回転超の振動数で行われ得る。
オービタル振とう半径は、１ｍｍ超、２ｍｍ超、３ｍｍ超、４ｍｍ超、５ｍｍ超、６ｍｍ超、７ｍｍ超、８ｍｍ超、９ｍｍ超、１０ｍｍ超、１１ｍｍ超、１２ｍｍ超、１３ｍｍ超、１４ｍｍ超、１５ｍｍ超、１６ｍｍ超、１７ｍｍ超、１８ｍｍ超、１９ｍｍ超、２０ｍｍ超、２１ｍｍ超、２２ｍｍ超、２３ｍｍ超又は２４ｍｍ超であってもよい。半径は２５ｍｍであってもよい。
一部の実施形態では、軸線振とうは、１、２、３、４、５又は６軸線運動を含む。
揺動の速度及び変位は、さらなる最適な性能のために調節され得る。例えば、３８４個のチャンバのカートリッジのような、より小さなウェルサイズ（例えば、直径）を有するカートリッジは、９６個のチャンバのカートリッジのような大きなウェルと比較して、多い振動数及び小さい直径オービタル（オービタル揺動の場合）により実施される揺動から利益を得ることができる。この揺動の変化は、プレートの幾何学的形状が変化しても、カートリッジウェル内の液体をウェル内で円滑に旋回させ続けるのに有用であり得る。一部の実施形態では、微生物成長を促進する条件は、周囲空気、嫌気条件又は最大で１０％までのＣＯ２に微生物を曝露することを含む。
一部の実施形態では、溶液混合を達成するのに不十分な振動数又は半径にてカートリッジを揺動することにより、カートリッジを揺動していない微生物成長に対するカートリッジを揺動している微生物成長の成長比が大きくなる。
微生物
感染症は、微生物由来、例えば細菌、真菌細胞、古細菌及び原虫の任意の感染性病原体を含み得る。一部の例では感染性病原体は、細菌、例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び非定型細菌である。抗微生物剤耐性微生物は、抗微生物剤、すなわち、抗細菌性薬、抗真菌性薬、抗古細菌薬物療法及び抗原虫薬に耐性である微生物であり得る。
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、微生物の１つの株を含んでよい。微生物は、微生物の１つの種を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い株を含んでよい。微生物は、微生物の１つの目を含んでよい。微生物は、微生物の１つの網を含んでよい。微生物は、微生物の１つの科を含んでよい。微生物は、微生物の１つの界を含んでよい。
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、微生物の１つより多い株を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い種を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い属を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い目を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い網を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い科を含んでよい。微生物は、微生物の１つより多い界を含んでよい。
微生物は、細菌であってよい。細菌の例として、これだけに限らないが、アセトバクター・アウランチウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・ビツメン（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂｉｔｕｍｅｎ）、アシネトバクター属種、アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス属種、アエロコッカス属種、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシラス属種、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）としても周知）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ属種、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ属種、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属種、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリマトバクテリウム・グラヌロマチス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジア属種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以前はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と称された）、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）（以前はクラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）と称された）、クラミドフィラ属種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（以前はクロストリジウム・ウェルシュ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｅｌｃｈｉｉ）と称された）、クロストリジウム属種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コリネバクテリウム属種、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エールリヒア属種、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター属種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ドゥラン（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガルリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラツス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス属種、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フランシセラ属種、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガードネレラ属種、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ペルツシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属種、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシレア属種、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス属種、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ属種、レプトスピラ属種、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属種、メタノバクテリウム・エクストロクエンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、マイクロバクテリウム・マルチフォルメ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコプラズマ・レプラムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム属種、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ属種、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ナイセリア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属種、ノカルジア属種、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ属種、パスツレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（以前、バクテロイデス・メラニノゲニカスと称された）、プロテウス属種、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス属種、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッチア・プロワゼキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・プシタチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッチア・クインタナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチア属種、リケッチア・トラコーマエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロチア・デントカリオーサ（Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ属種、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ディセンテリア（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ属種
、スピリルム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス属種、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロホモナス属種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス属種、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・パリデュム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ属種、ウレアプラズマ属種、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ属種、ビブリオ・ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビリダンス・ストレプトコッキ（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びエルシニア属種が挙げられる。
微生物は、真菌であってよい。真菌の例として、これだけに限らないが、アスペルギルス属種、ブラストミセス属種、カンジダ属種、クラドスポリウム属、コクシジオイデス属種、クリプトコッカス属種、エキセロハイラム属、フサリウム属（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラズマ属種、イサタケンキア属種、ムコールミセテス、ニューモシスチス属種、リングワーム、スケドスポリウム（ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロスリックス及びスタキボトリス属種が挙げられる。微生物は、原虫であってよい。原虫の例として、これだけに限らないが、エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモジウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ギアルディア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）が挙げられる。
抗微生物剤
微生物が細菌である場合、例示的抗微生物剤として、これだけに限らないが、アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシシリン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラネート、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、抗毒素、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、β−ラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、サイクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロン類、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポシゾリド（Ｐｏｓｉｚｏｌｉｄ）、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ラデゾリド（Ｒａｄｅｚｏｌｉｄ）、ラキシバクマブ、リファブチン、リファンピシン、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、スルファジアジン銀、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプトグラミン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テキソバクチン（Ｔｅｉｘｏｂａｃｔｉｎ）、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チカルシリン／クラブラネート、チカルシリン／クラブラン酸、チゲサイクリン、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、バンコマイシン、及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアントが挙げられる。
微生物とのその相互作用が微生物表面上の負電荷に影響を与える又はそれにより影響される抗微生物剤として：細胞表面への結合でＭｇ２＋イオンを置き換え、脂質膜構成成分を架橋し、それにより外膜を破壊して薬物取り込みを増強するポリカチオン性アミノグリコシド；微生物細胞へのその結合が膜の負電荷にも依存し、それに対する変異性及びプラスミド媒介性耐性の両方が膜負電荷を低減することによって生じるカチオン性ポリミキシン（コリスチン及びポリミキシンＢ）；並びに、宿主の自然免疫応答カチオン性抗微生物剤ペプチドに似ており、作用の膜破壊機構のためにＣａ２＋及びホスファチジルグリセロールを必要とし、それに対する耐性が細胞表面電荷の変化も含む場合があるリポペプチド、ダプトマイシンが挙げられる。
微生物が真菌である場合、例示的抗微生物剤として、５−フルオロシトシン、アバフンギン（Ａｂａｆｕｎｇｉｎ）、アルバコナゾール、アリルアミン、アンホテリシンＢ、アンコボン（Ａｎｃｏｂｏｎ）、アニデュラファンギン、アゾール、ペルーバルサム（Ｂａｌｓａｍ ｏｆ Ｐｅｒｕ）、安息香酸、ビホナゾール、ブトコナゾール、カンジシジン、カスポファンギン、シクロピロクス、クロトリマゾール、クレセンバ（Ｃｒｅｓｅｍｂａ）、クリスタルバイオレット、ジフルカン、エキノキャンディン、エコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フェンチコナゾール、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、グリフルビンＶ、グリセオフルビン、Ｇｒｉｓ−Ｐｅｇ、ハロプロジン、ハマイシン（Ｈａｍｙｃｉｎ）、イミダゾール、イサブコナゾール、イサブコナゾニウム（ｉｓａｖｕｃｏｎａｚｏｎｉｕｍ）、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラミシール、ルリコナゾール、ミカフンギン、ミコナゾール、ナタマイシン、ノキサフィル（Ｎｏｘａｆｉｌ）、ニスタチン、オモコナゾール、オンメル（Ｏｎｍｅｌ）、オラビ（Ｏｒａｖｉｇ）、オキシコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、リモシジン（Ｒｉｍｏｃｉｄｉｎ）、セルタコナゾール、スポラノックス、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チアゾール、チオカルバメート抗真菌剤、チオコナゾール、トルナフタート、トリアゾール、ウンデシレン酸、ブイフェンド、ボリコナゾール、及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアントが挙げられる。
微生物が原虫である場合、例示的抗微生物剤として、８−アミノキノリン、アセタルソール、アメーバ動物に対する薬剤、アイラントン（Ａｉｌａｎｔｈｏｎｅ）、アモジアキン、アンホテリシンＢ、アンプロリウム、抗トリコモナス剤、アプラスモマイシン、アルスチノール、アルテリン酸、アーテメータ、アーテメータ／ルメファントリン、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アーテスネート、アーテスネート／アモジアキン、アトバコン、アトバコン／プログアニル、アザニダゾール、アジスロマイシン、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、ブパルバコン（Ｂｕｐａｒｖａｑｕｏｎｅ）、カルバルゾン（Ｃａｒｂａｒｓｏｎｅ）、カルニダゾール、キニオホン、クロロキン、クロルプログアニル、クロルプログアニル／ダプソン、クロルプログアニル／ダプソン／アーテスネート、クロルキナルドール、クロムアルベオレート（Ｃｈｒｏｍａｌｖｅｏｌａｔｅ）抗寄生虫薬、キンコナ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、シパルガミン（Ｃｉｐａｒｇａｍｉｎ）、クラズリル（Ｃｌａｚｕｒｉｌ）、クレファミド、クリオキノール、抗コクシジウム薬、コジナエオプシン（Ｃｏｄｉｎａｅｏｐｓｉｎ）、コトリファジド（Ｃｏｔｒｉｆａｚｉｄ）、クリプトレピン（Ｃｒｙｐｔｏｌｅｐｉｎｅ）、シクログアニル、デヒドロエメチン、ジフェタルソン、ジヒドロアルテミシニン、ジロキサニド、ジミナゼン、ジスルフィラム、ドキシサイクリン、エフロルニチン、ＥＬＱ−３００、エメチン、エトファミド、エクスカバタ抗寄生虫薬、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルソル、ＧＮＦ６７０２、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、イミドカルブ、イプロニダゾール、ジェスイットの樹皮（Ｊｅｓｕｉｔ’ｓ ｂａｒｋ）、ＫＡＦ１５６、ルメファントリン、マドュラミシン、メフロキン、メガゾール（Ｍｅｇａｚｏｌ）、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテホシン、ニューロレニン（Ｎｅｕｒｏｌｅｎｉｎ）Ｂ、ナイカルバジン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタルソン（Ｎｉｔａｒｓｏｎｅ）、ニチジン（Ｎｉｔｉｄｉｎｅ）、ニトロフラール、オリバシン（Ｏｌｉｖａｃｉｎｅ）、オルニダゾール、オロイジン（Ｏｒｏｉｄｉｎ）、パマキン、パロモマイシン、ペンタミジン、五価アンチモニアル、ファンキノン、フェナミジン（Ｐｈｅｎａｍｉｄｉｎｅ）、ピペラキン、プリマキン、プログアニル、プロジェクト５２３、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン（Ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、キンファミド（Ｑｕｉｎｆａｍｉｄｅ）、キニーネ、ロニダゾール、スケジュラロマナ（Ｓｃｈｅｄｕｌａ Ｒｏｍａｎａ）、ＳＣＹＸ−７１５８、セクニダゾール、セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ）、スチボグルコネートナトリウム、スピロインドロン（Ｓｐｉｒｏｉｎｄｏｌｏｎｅ）、スルファドキシン、スルファドキシン−ピリメタミン、スルファレン、スラミン、タフェノキン（Ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）、テクロザン、テノニトロゾール、チルプロキノール、チニダゾール、トリメトレキサート、殺トリパノソーマ剤、ワールブルグチンキ及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアントが挙げられる。
抗微生物剤は、本明細書に列挙する薬物と類似の機構によって作用する薬物であってよい。当技術分野において周知の他の抗微生物薬は、本明細書に記載される方法において使用されてよい。
液体懸濁液
液体は、カチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＭＨＢ）のような成長培地を含み得る。この培地は、微生物成長及び安定性を促進するために当業者に周知の添加物を含んでよい。さまざまな抗微生物剤に加えて、異なる検査ウェルは、特定の抗微生物剤に対するＡＳＴ正確性を改善することが周知である添加物を含む場合がある。例えば、追加的な塩化ナトリウムはオキサリシンを含む検査に加えられてよく、追加的なカルシウムはダプトマイシンを含む検査に加えられてよい。
生物学的試料
本明細書に記載される微生物は、生物学的試料由来であってよい。一部の実施形態では生物学的試料は、微生物、例えば細菌及び真菌細胞を含む任意の試料である。生物学的試料は、臨床試料由来であってよい。
例示的生物学的試料として、これだけに限らないが、全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、バフィーコート、涙液、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、脊髄又は脳脊髄液、腹水、胸水、滲出液、穿刺液、上皮スメア、生検、骨髄試料、嚢胞又は膿瘍由来液、滑液、硝子体又は眼房水、洗眼液又は吸引物、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液又は肺洗浄液、肺吸引物、並びに、これだけに限らないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓などが挙げられる器官及び組織、スワブ（非限定的に、創傷スワブ、頬側スワブ、咽頭スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、直腸内スワブ、病変スワブ（ｌｅｓｉｏｎ ｓｗａｂ）、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどが挙げられる）並びにこれらの任意の組合せが挙げられる。同様に、細菌培養物又は細菌単離物、真菌培養物又は真菌単離物が挙げられる。当業者は、上の例示的生物学的試料のいずれかから得られた単離物、抽出物又は材料も本発明の範囲内であることを理解し得る。
生物学的試料から得られた微生物は、培養されてよい、又は当技術分野において日常的に実施されるとおり他に処理されてよい。
ＡＳＴ法において使用される対照
対照は、微生物が感受性でない抗微生物剤を含んでよい。例として、アッセイがグラム陽性細菌の感受性を決定するために使用される場合、対照（及び検査インキュベーション）は、グラム陰性細菌を標的化する１種以上の抗微生物剤を含んでよく、アッセイが真核微生物の感受性を決定するために使用される場合、対照（及び検査インキュベーション）は、１種以上の抗細菌性抗微生物剤を含んでよい。
一部の実施形態では対照は、抗微生物剤を含まない又は微生物が感受性でない１種以上の抗微生物剤を含むが、他は同一の条件下で微生物から測定される陽性対照である。一部の実施形態では対照は、栄養素を含まないが、他は同一の条件下で微生物から測定される。一部の実施形態では対照は、微生物の成長を阻止することが周知である１種以上の毒素を含むが、他は同一の条件下で微生物から測定される。
一部の実施形態では、対照は陰性対照である。陰性対照は、他のアッセイと同一の設定であるが、少なくとも１つの構成成分を欠いている対照であってよい。多くの場合、陰性対照は、他のアッセイ設定と他のすべては同一で、微生物を含まない。一部のアッセイではバックグラウンド対照が存在する。
対照は、歴史的対照であってよい。一部の実施形態では、検査インキュベーションは、対照インキュベーションが実施された後に実施される。一部の実施形態では、対照は、検査インキュベーションを含むカートリッジと異なるカートリッジにおいて実施される。
自動化ＡＳＴ法
本明細書に記載される方法は、商業的に入手できる装置、特注の装置又はこれらの組合せを使用して自動化された様式で実施され得る。自動化法は、より多くの数のアッセイの実施及びアッセイでの一貫性の増大を可能にする。自動化は、これらの方法の速度及び分解能も増大させることができる。
表面結合プローブアッセイ
表面結合アッセイ（表面結合プローブアッセイとも称される）は、シグナル伝達剤を利用する場合がある。シグナル伝達剤は、微生物に結合できる成分（例えば、微生物表面に結合する抗体及び／又はレクチン、微生物表面に非特異的に結合する荷電成分及び／又は機能性成分）並びにシグナルを供給する又はシグナルの産生に寄与する化学成分（例えば、酵素ケミルミノフォア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）及びランタニドキレート）を典型的には含む。例示的酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ及びこれらの組合せが挙げられる。
シグナル発生剤（ｓｉｇｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）は、１種以上の微生物受容体にコンジュゲートした１種以上の化学成分を含んでよい。シグナル発生剤として、これだけに限らないが、１種以上の触媒（酵素、金属酸化物ナノ粒子、有機金属触媒、（本出願が優先権を主張し、これらの全体を参照により組み込む米国仮特許出願に記載されているもののような）シグナル増幅のために設計されたナノ粒子を含む、シグナル発生エレメントを含むバクテリオファージ、フルオロフォア（有機フルオロフォア、ユウロピウム又はルテニウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、パラジウム（ＩＩ）、白金（ＩＩ）コート有機金属を含む）及び／又は比色定量色素（有機染料を含む）が挙げられる。酵素、フルオロフォア及び／又は有機金属分子を有するナノ粒子、デンドリマー及び／又は他のナノスケール構造のような上記の組合せは使用され得る。
化学成分は、シグナル伝達剤を微生物に接触させる前にシグナル伝達剤にコンジュゲートされてよい、一方でシグナル伝達剤は、微生物に初期に又はシグナル伝達剤が微生物に接触された後に接触される。
シグナル伝達剤が微生物を含有するＡＳＴ希釈物に加えられる場合、シグナル伝達剤受容体（例えば、微生物に特異的又は非特異的に結合できる成分）は、微生物表面に会合できる。それにより、例えば溶液中にある、インタクトな微生物が多いほど、より多くの数のシグナル伝達剤がこれらの細菌に会合する。結果として、インタクトな細菌の数と、インタクトな細菌に結合しないものとして定義される溶液中で遊離であるシグナル伝達剤の数との間に逆相関がある。例えば、抗微生物剤処置への反応で微生物が溶解する場合に、遊離シグナル伝達剤が可溶性微生物構成成分に結合する場合があることに注目されたい。
微生物表面と会合する及び／又はそれにインターカレートするシグナル伝達剤の数は、微生物表面積に比例する。微生物表面積は、真に耐性の微生物と強く関連する。具体的には、ＭＩＣ及びＭＩＣ以下の濃度の抗微生物剤への応答で膨張する又は伸長する微生物（例えば、フィラメント形成細菌）の場合、代謝及び／又は体積同定は、６時間未満のものと定義される迅速なＡＳＴ時点に関して誤った感受性プロファイルをもたらすことが周知である。この制限を克服するために、本発明は、微生物表面積（体積ではなく）を光学的シグナルのような測定可能なシグナルに変換する。本明細書に記載される方法は、６時間未満で微生物耐性プロファイルを正確に決定することができる。
微生物と会合した及び／又はそれにインターカレートしたシグナル伝達剤を遊離シグナル伝達剤から分離するために、１種以上の分離及び／又は競合的結合ステップを実施する必要がある場合がある。そのようなステップとして、これだけに限らないが、遠心分離（例えば、ｇ力＞５００ｘｇ）、濾過（例えば、０．４５ミクロン以下又は０．２ミクロン以下のポアを有するフィルターを介する）、電気泳動、及び／又は磁気捕捉が挙げられる；そのようなステップは、当業者に周知である。
シグナル伝達剤結合を促進する、及び／又はバックグラウンドを低減するために、シグナル伝達剤を加える前に微生物を、それらがインキュベーションの際に懸濁された液体から分離することがさらに有利である場合がある。そのような分離として、これだけに限らないが、遠心分離、濾過、電気泳動及び／又は磁気捕捉が挙げられる。
シグナル伝達剤は、それらがＡＳＴインキュベーション期間全体に存在するように微生物及び／又は抗微生物剤と併せて加えられてよい。この全期間は、２４時間まで又は８時間以内又は５時間以内であってよい。代替的にシグナル伝達剤は所定のインキュベーション期間後に微生物及び抗微生物剤に加えられてよい。この期間は、２４時間まで又は８時間以内又は４時間以内であってよい。
シグナル伝達剤は壁及び／又は膜を含む微生物表面と会合する及び／又はそれにインターカレートするように設計される。会合のために設計されたシグナル伝達剤は、これだけに限らないが、１種以上の抗体、レクチン、他のタンパク質、１種以上の荷電化学基を有する小分子、１種以上の官能化学基を含む小分子、ファージ、糖タンパク質、ペプチド、アプタマー、荷電小分子、固定電荷を有する小分子、荷電ポリマー、固定電荷を有する荷電ポリマー、疎水性小分子、荷電ペプチド、固定電荷を有する荷電ペプチド、親水性と疎水性領域とを交互に有するペプチド、及び／又は有機金属複合体であっても無くてもよい小分子リガンドが挙げられる結合成分を含む。微生物会合のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナル伝達剤は、微生物に結合したままでよく、及び／又は内部移行してよく、したがってすべての会合が含まれる。インターカレーションのために設計されたシグナル伝達剤として、これだけに限らないが、小さな疎水性分子、疎水性ペプチド及び／又は親水性と疎水性領域とを交互に有するペプチドが挙げられる。微生物インターカレーションのために設計された分子は、当業者に十分周知である。さらにシグナル伝達剤は、１つ以上の種類の微生物に特異的であってよい。シグナル伝達剤は、複数の受容体を有してよい。これらは、結合を増強できる、及び／又は２つ以上の微生物への同時結合を可能にし、細菌を凝集させることにさらに役立つ可能性がある。シグナル伝達剤の添加の前又はそれと同時に溶液ｐＨを調整することは有利である場合がある。これは、微生物とシグナル伝達剤との間の電荷電荷相互作用を増強するために有益であり得る。微生物のアニオン電荷は、中性を超える（さらに塩基性の）溶液ｐＨに用量設定することによって増大され得る。それにより、１種以上の固定された、カチオン電荷を含む成分を利用することは有益であり得る。
シグナル伝達剤が、微生物に特異的に結合できる（例えば、微生物種又は微生物の株に特異的に結合する抗体）又は微生物に非特異的に結合する場合がある（例えば、一般的な共有結合又は非共有結合形成及び当技術分野において周知の別の非特異的化学的会合によって）ことに注目すべきである。
代替的に、シグナル伝達剤と会合することができる化学物質及び／又は生化学物質は、インキュベーションの際に化学的物質及び／又は生化学物質が微生物に組み込まれるように、微生物が成長の際に懸濁される液体に加えられてよい。これは、シグナル伝達剤の微生物との会合を増強するために役立つ可能性がある。代替的実施形態では、微生物がインキュベーションの際に懸濁される液体中にシグナル伝達剤それ自体が存在してよく、成長の際に微生物に組み込まれる場合がある。
シグナル伝達剤は、インタクトな各微生物からのシグナルが、各微生物に会合しているシグナル伝達剤の数を超えて増幅され得るように、増幅シグナル発生剤（増幅基（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ ｇｒｏｕｐ））を含んでよい。例えば酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、＞ｌｘｌ０４倍にシグナルを増幅できることが周知である。したがって、１００個のＨＲＰ分子が各微生物表面に結合すると、１０６倍の増幅が達成され得る。これは、他では識別できない微生物濃度の判別を可能にすることによってＡＳＴ決定がなされ得て、速度を増加させることができる。ユウロピウム製剤の使用は、同様にシグナル増幅を提供する。
代替的に、シグナル伝達剤は、細胞膜のような疎水性領域へのインターカレーションで、蛍光発光を大きく増大させるように設計されている、膜色素として当業者に周知の光学色素前駆体を含んでよい。これらのシグナル伝達剤を用いて設計されたアッセイは、容易に光学的に測定されるように十分なシグナルを産生するために、微生物が少量で、平面に近く、濃縮されることを必要とする場合がある。妨害種は、近ＩＲフルオロフォアの使用を必要とする場合がある。
例示的増幅基として、例えば、それぞれその全体を参照により組み込む国際公開第ＷＯ ２０１６／０１５０２７号において、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号において記載されているものが挙げられる。増幅基は、触媒、フルオロフォア、比色定量色素、酵素、触媒又はナノ粒子を含み得る。例示的フルオロフォアとして、その全体を参照により組み込む国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ １６／４２５８９号の表１に記載されているものが挙げられる。増幅基は、ランタニドを含み得る。ランタニドとして、これだけに限らないが、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム又はジスプロシウムが挙げられる。
増幅基は、有機フルオロフォア、例えば配位複合体を含んでよい。配位複合体は、ユウロピウム配位複合体、ルテニウム配位複合体、レニウム配位複合体、パラジウム配位複合体、白金配位複合体であってよい。増幅基は、ケミルミノフォア、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユウロピウム配位複合体、ルテニウム配位複合体、レニウム配位複合体、パラジウム配位複合体、白金配位複合体、サマリウム配位複合体、テルビウム配位複合体又はジスプロシウム配位複合体を含んでよい。
一部の実施形態では増幅基は：
Figure 2020504610
 である成分を含む。
一部の実施形態では増幅基は：
Figure 2020504610
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である成分を含む。
増幅基は、フルオロフォア又は比色定量色素を含んでよい。好適なフルオロフォア及び比色定量色素は、当業者に十分周知であり、その全体を参照により本明細書に組み込むＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１ｔｈ Ｅｄ．（２０１０）及びＧｏｍｅｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ａｎｄ Ｌｉｍａ／．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（２００５）４５〜８０頁及びＭａｎａｆｉ，Ｋｎｅｉｆｅｌ，ａｎｄ Ｂａｓｃｏｍｂ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５（１９９１）３３５〜３４８頁、に記載されている。例示的フルオロフォアとして、例えば、それぞれその全体を参照により組み込む国際公開第ＷＯ２０１６／０１５０２７号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ １６／４２５８９号に記載されているものも挙げられる。
好適なフルオロフォア又は比色定量色素の例として、これだけに限らないが、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、シアニン、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯ、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジン、アレクサフローラ、アリザリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ボディパイ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カテコールアミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミン、モノブロモビマン、オレゴングリーン、フィコエリトリン、ＳＹＴＯ、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チオフラビン、Ｘ−ローダミン、Ｃ又はテトラメチルローダミネルソチオシアネートが挙げられる。
増幅基は、有機金属化合物、遷移金属複合体又は配位複合体を含み得る。このような増幅基の例として、これだけに限らないが、その全体を参照により組み込むＥＰ０１８０４９２、ＥＰ０３２１３５３、ＥＰ０５３９４３５、ＥＰ０５３９４７７、ＥＰ０５６９４９６、ＥＰ１３９６７５、ＥＰ６４４８４、ＵＳ４，２８３，３８２、ＵＳ４，５６５，７９０、ＵＳ４，７１９，１８２、ＵＳ４，７３５，９０７、ＵＳ４，８０８，５４１、ＵＳ４，９２７，９２３、ＵＳ５，１６２，５０８、ＵＳ５，２２０，０１２、ＵＳ５，３２４，８２５、ＵＳ５，３４６，９９６、ＵＳ５，３７３，０９３、ＵＳ５，４３２，１０１、ＵＳ５，４５７，１８５、ＵＳ５，５１２，４９３、ＵＳ５，５２７，６８４、ＵＳ５，５３４，６２２、ＵＳ５，６２７，０７４、ＵＳ５，６９６，２４０、ＵＳ６，１００，３９４、ＵＳ６，３４０，７４４、ＵＳ６，５２４，７２７、ＵＳ６，７１７，３５４、ＵＳ７，０６７，３２０、ＵＳ７，３６４，５９７、ＵＳ７，３９３，５９９、ＵＳ７，４５６，０２３、ＵＳ７，４６５，７４７、ＵＳ７，６２５，９３０、ＵＳ７，８５４，９１９、ＵＳ７，９１０，０８８、ＵＳ７，９５５，８５９、ＵＳ７，９６８，９０４、ＵＳ８，００７，９２６、ＵＳ８，０１２，６０９、ＵＳ８，０１７，２５４、ＵＳ８，０１８，１４５、ＵＳ８，０４８，６５９、ＵＳ８，０６７，１００、ＵＳ８，１２９，８９７、ＵＳ８，１７４，００１、ＵＳ８，１８３，５８６、ＵＳ８，１９３，１７４、ＵＳ８，２２１，７１９、ＵＳ８，２８８，７６３、ＵＳ８，３６２，６９１、ＵＳ８，３８３，２４９、ＵＳ８，４９２，７８３、ＵＳ８，６３２，７５３、ＵＳ８，６６３，６０３、ＵＳ８，７２２，８８１、ＵＳ８，７５４，２０６、ＵＳ８，８９０，４０２、ＵＳ８，９６９，８６２、ＵＳ９，０１２，０３４、ＵＳ９，０５６，１３８、ＵＳ９，１１８，０２８、ＵＳ９，１３３，２０５、ＵＳ９，１８７，６９０、ＵＳ９，１９３，７４６、ＵＳ９，３１２，４９６、ＵＳ９，３３７，４３２、ＵＳ９，３４３，６８５、ＵＳ９，３９１，２８８、及びＵＳ９，５３７，１０７に記載されるものが挙げられる。例示的な有機金属化合物、遷移金属複合体又は配位複合体として、例えば、それぞれその全体を参照により組み込む国際公開第ＷＯ ２０１６／０１５０２７号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号に記載されているものも挙げられる。
一部の実施形態では増幅基は、ランタニド（例えば、Ｅｕ若しくはＴｂ）と四座リガンドとの間の複合体又はランタニド（例えば、Ｅｕ若しくはＴｂ）とクリプテートリガンドとの間の複合体のようなランタニド配位複合体である。一部の実施形態では増幅基は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）又は白金（Ｐｔ）の配位複合体である。一部の実施形態では増幅基は、原子番号５７を有するランタンから原子番号７１を有するルテチウムまでの１５元素の群（ランタニド）、並びに原子番号２１を有するスカンジウム及び原子番号３９を有するイットリウムからなる２つの追加的な元素からなる１７元素を集合的に指す希土類金属の配位複合体である。希土類金属の具体的な例として、ユウロピウム、テルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジウム、プロメチウム、サマリウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムが挙げられる。一部の実施形態では増幅基は、ランタニド（例えば、ユウロピウム又はテルビウム）とジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテートリガンドとの配位複合体である。
シグナル伝達剤の具体的な例として、これだけに限らないが：
Figure 2020504610
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を含む成分が挙げられる。
シグナル伝達剤は、高いルミネセンス量子効率及び長いルミネセンス減衰時間（＞１００ｎｓ）を特徴とする発光団（ドナー）を含む場合がある。例示的な発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（具体的には、ユウロピウム及びランタン）のカチオン性有機金属複合体である。これらの有機金属複合体の有機部分は、例えば、ポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリン又は他のヘテロ環式化合物の群由来のリガンドからなってよい。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、抗体（例えば、モノクローナル若しくはポリクローナル）、改変抗体（例えば、ビオチン化モノクローナル体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユウロピウムキレート−抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体）、抗体バリアント（例えば、Ｆａｂ：断片、抗原結合（腕１本）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、ヒンジ領域（両腕）を含む抗原結合、；Ｆａｂ’：断片、ヒンジ領域（腕１本）を含む抗原結合；ｓｃＦｖ：１本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体１本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二特異性モノクローナル抗体；三機能性抗体；及びＢｉＴＥ：二特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ））、ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、レクチン、天然ペプチド、合成プチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ、並びに／又はアプタマーを含む。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマーを含む構造を含むか、又はそれから形成される。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、ランタニド配位複合体、並びに／又は酵素及びストレプトアビジン並びに／又は抗体並びに／又はアプタマーを含む増幅基を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む結合成分を含む。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、改変抗体を含む結合成分を含む。例示的な改変抗体として、ビオチン化モノクローナル抗体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユウロピウムキレート抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体が挙げられる。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、抗体バリアントを含む結合成分を含む。例示的な抗体バリアントとして、Ｆａｂ：断片、抗原結合（腕１本）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、ヒンジ領域（両腕）を含む抗原結合；Ｆａｂ’：断片、ヒンジ領域（腕１本）を含む抗原結合；ｓｃＦｖ：１本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体１本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二特異性モノクローナル抗体；三機能性抗体；及びＢｉＴＥ：二特異性Ｔ細胞エンゲイジャー）が挙げられる。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、合成及び／又は天然リガンド及び／又はペプチドを含む結合成分を含む。一部の実施形態ではリガンド及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リシン及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、合成及び／又は天然ポリマー及び／又はグリコポリマーを含む結合成分を含む。実施形態では、天然及び／又は合成ポリマーは、直鎖又は分岐であり、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタアクリレート］及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、天然及び／又は合成ポリマー及び／又はグリコポリマーは、これだけに限らないが、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、四級アミン、ピリジニウムトリブロミド、ヒスチジン、リシン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム又は、これだけに限らないが、コブロック、グラフト及び交互ポリマー（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ）が挙げられるこれらの組合せ、が挙げられる成分を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、マンノース結合レクチン、他のレクチン、アネキシン及びこれらの組合せから選択される糖タンパク質を含む結合成分を含む。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は：抗体；及びユウロピウム配位複合体を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（２Ｋ）、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（４Ｋ）、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含むリンカー基Ｌを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は：
Figure 2020504610
 を含むユウロピウム複合体を含む。
一部の実施形態では、微生物表面に結合できるシグナル伝達剤は：
Figure 2020504610
 を含むユウロピウム複合体を含む。
ＡＳＴ法の例示的有利点
本明細書に記載される方法の態様は、所与の微生物に対してどの抗微生物剤が最も有効であるかを判定するための複数の成長アッセイを実施することによって、正確で、低費用な表現型ＡＳＴ結果を述べることができる。本明細書の方法は、処方目的のために所与の有効な抗微生物剤の適切な濃度を提供できる。一部の実施形態では、方法は、所与の微生物によって生じる患者の感染の処置のための推奨の作成を提供する。患者は、本明細書に考察される生物学的試料又は標本の供給源として役立ち得る宿主であってよい。ある特定の態様ではドナーは、脊椎動物であり、任意の動物種（例えば、ヒトのような哺乳動物）を意味することが意図される。ある特定の実施形態では、患者は、これだけに限らないが、ヒト及び非ヒト霊長類、鳥類、は虫類、両生類、ウシ、イヌ、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、キャビティー（ｃａｖｉｔｉｅｓ）、カラス、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ウマ、ネコ、ヤギ（ｈｉｒｃｉｎｅ）、ウサギ（ｌａｐｉｎｅ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）、オオカミ、ヒツジ、ブタ、ラシーン（ｒａｃｉｎｅｓ）、キツネなどが挙げられる任意の動物宿主であり、非限定的に、飼い慣らされた家畜、群れ又は移住動物又は鳥類、外来又は動物学的検体並びにコンパニオン動物、ペット及び獣医師の保護下にある任意の動物が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、標準的微生物コロニー単離物から又は陽性血液試料から直接、８時間未満、６時間未満、５時間未満又は４時間未満で低費用の表現型ＡＳＴを提供する。これは、標準的な臨床微生物学研究室で同じシフト、表現型のＡＳＴ結果を可能にする。これは、現在の待ち時間を２０時間を超えて短くでき、現在ＦＤＡ治験間近である陽性血液培養ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定から直接、及びＦＤＡ認可を既に得ている陽性血液培養多重ＰＣＲ同定プラットフォームから直接と一致し得る。一部の実施形態では、本設計は、伝統的な速度対費用のトレードオフを壊すような本明細書に記載される方法（「ｆａｓｔ−ＡＳＴ」プラットフォーム）を可能にする。方法は、標準的マイクロプレートフォーマット（例えば、６、１２、２４、４８、９６、３８４又は１５３６ウェルを有する）並びに従来の光検出器の両方に適合できる。
迅速で正確な侵入病原体の同定及び抗微生物剤感受性検査（ＡＳＴ）は、最も有効な治療剤の時宜を得た投与を可能にできる。このような処置は、感染を回復させ、入院患者の滞在期間を減少させ、後に抗微生物剤耐性の地球的な蔓延の要因となる広域スペクトルの抗微生物剤に患者が供される時間を減少させる。対照的に、微生物同定及び感受性結果のために現在許容されている３０時間を超える待機は、広域スペクトル抗微生物剤の過剰使用を必要とし、必要な患者滞在より長い。この理由から、抗生物質耐性細菌駆除についての大統領諮問機関は、近年、抗生物質耐性細菌の検出のための迅速な診断の開発及び使用をその主な目標の１つにした。
感染を有する患者の処置
本明細書に記載される方法は、微生物によって生じた感染を有する患者の処置を提供する。ＡＳＴ決定は、医療専門家又は診断科学者が望ましい行動指針又は処置レジメンに関する患者への推奨を作成できるようにする。一部の実施形態では推奨は、本発明によって提供されて迅速に及びより正確にもたらされる。感染の処置についての推奨は、具体的な抗微生物剤若しくは抗微生物剤の組合せの選択又はそのような抗微生物剤の用量を含む場合がある。一部の実施形態ではそのような推奨は、ＭＩＣ及び／又はＱＳＲ結果に基づいて医師によって提供又は作成される。
上記態様及び実施形態のいずれも、図面、概要及び／又は下記の実施例を含む詳細な記載に開示されている任意の他の態様又は実施形態と組み合わされてよい。
本発明は、限定として解釈されるべきでない続く実施例によってさらに例示される。当業者は、本明細書に記載される具体的な物質及び手順への多数の均等物を、単なる日常的実験を使用して認識する又は確認できる。このような均等物は、下記実施例に続く特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
［実施例１］
並行抗微生物剤感受性アッセイ
本実施例は、並行して（例えば、同じインキュベーション期間を共有して）実施される複数の抗微生物剤感受性アッセイを記載する。
各ウェルが１００μＬミューラーヒントンブロス（ＭＨ）を含むマイクロプレートを、調整済み抗微生物剤希釈物を用いて接種し、３５℃、３時間４５分間インキュベートした。３時間４５分間後にマイクロプレートを振とうインキュベーターから外し、１０μＬのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を各ウェルに加えた。次にマイクロプレートをインキュベーターに１時間戻した。マイクロプレートを振とうインキュベーターから外したときに、ウェルをＢｉｏＴｅｋ ＨＩプレートリーダーで蛍光（励起５６０／発光５９０ｎｍ）を読み取った。次に、エチレンジアミン四酢酸及びセチルトリメチルアンモニウムブロミドを含む１００μＬの界面活性剤溶液を両方のマイクロプレートの各ウェルに加えた。次に２枚のマイクロプレートを３００ｒｐｍ、１０分間振とうし、沈殿させるために２．５分間、２５００ｘｇでの遠心分離が続いた。次にＭＨブロスを吸引し、１００μＬの２５ｍＭ ＰＢＳを両方のマイクロプレートの各ウェルに加えた。１０μＬの化学成分（ここでは、０．００５％グルタルアルデヒド）を次に各ウェルに、続いて１０μＬのユウロピウムクリプテート製剤（シグナル伝達剤として）を各ウェルに加えた（２０ｎｇ／ウェル）。次に２枚のマイクロプレートを３００ｒｐｍ、３０分間振とうした。その後、沈殿させるために両方のプレートを２．５分間、３０ ２５００ｘｇで遠心分離した。溶液を吸引し、２００μＬ ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎの洗浄液を各ウェルに加え、沈殿させるために遠心分離が続いた。溶液の吸引、２００μＬ ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎの２回目の同じ洗浄を行った後、沈殿させるための最終遠心分離が続いた。２００μＬ ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎを各ウェルに加えた。次にプレートをＢｉｏＴｅｋ ＨＩプレートリーダー上で時間分解蛍光を使用し、読み取った。
表３は代謝プローブアッセイ及び表面結合アッセイの両方を、種々のＥ．コリ株に対する２０種の異なる抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定することに関して、ＣＬＳＩ一晩法と比較して実施した場合の結果を示している。非特定化された単離された臨床Ｅ．コリ株を、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）及びＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）によって契約下で管理されている、などの供給源から得た。ＣＬＳＩ参照法−決定ＭＩＣを太字で示し、２つの迅速アッセイそれぞれの結果を「ｏｋ」（正確に合致）、「耐性」（＞１希釈によって基準より高いＭＩＣ）又は「感受性」（＜１希釈によって基準未満のＭＩＣ）のいずれかとして示す。データは、２つの異なるアッセイを使用することが確実で迅速なＡＳＴ結果を確実にするために有益であることを示している。
Figure 2020504610
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Figure 2020504610
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Figure 2020504610
［実施例２］
チェックポイントアッセイは、十分な微生物成長を確認するために使用され得る。
本実施例は、チェックポイントアッセイが微生物成長を確認できることを示している。
成長指標は、インキュベーションの際に微生物成長を阻止する場合がある。
細菌を、レザズリン（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））の存在又は非存在下でカチオン調整ミューラーヒントンブロスを含む９６ウェルマイクロプレートに接種し、３５℃、４時間インキュベートした。レザズリンを用いてインキュベートしなかったウェルについて、成長指標を４時間インキュベーション直後に加えた。ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）をすべてのウェルに加え、ルミネセンスを測定した。細菌がレザズリンの存在下でインキュベートされた場合は、細菌がレザズリンの存在下でインキュベートされなかったウェルよりも少ないルミネセンスシグナルがＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）の添加で観察され、より少ない生細菌が存在していることを示している。図１は、レザズリンは、インキュベーションの際にウェルに含まれるとＡＳＴ結果までの時間を速めることができるが、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）成長に阻止効果を有する可能性があることを示している。したがって、インキュベーションの際は検査ウェルから成長指標を除くことが有利である可能性がある。
ＡＳＴ結果についてのエンドポイント測定は、成長遅延細菌株が原因で限定的である。
図２は、アンピシリン、ゲンタマイシン及びレボフロキサシンの存在下での成長遅延臨床Ｓ．アウレウス株についての微量液体希釈法ＡＳＴ結果についてのＣＬＳＩ一晩参照法からの写真を示している、ここでＭＩＣは目に見える細菌成長を有さない具体的な抗生物質の最低希釈と呼ばれる。これは、アッセイが一晩実行され得た場合に、ＭＩＣがどの程度であると見なされるかである。
図３は、成長遅延Ｓ．アウレウス株を含む、種々の臨床Ｓ．アウレウス細菌株における成長速度の差異を示している。カチオン調整ミューラーヒントンブロスを含有する９６ウェルマイクロプレートを使用して、細菌を、分光光度計を使用して確認されたマクファーランド値（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｖａｌｕｅ）０．５に達するようにコロニーを生理食塩水に希釈することによって調製した。これを１：２０で生理食塩水中に希釈し、１０μｌの接種菌液を各ウェルに加えた。接種したプレートを３５℃、１５０ｒｐｍで振とうしながら３時間４５分間インキュベートした。このインキュベーション後、カチオン性磁気ビーズ及び抗Ｓ．アウレウス抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされている）を各ウェルに加え、２０分間、インキュベートした。自動プレート洗浄機を使用して、磁気ビーズを捕捉し、各ウェルの内容物をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）を用いて３回洗浄した。ＴＭＢを加え、１５分間、インキュベートし、その後反応を１Ｍ硫酸の添加によって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を各ウェルについて測定した。図３中のデータは、陽性成長ウェルからの吸光度シグナルと成長阻止（栄養素不含有）ウェルにおいて測定された吸光度との比を測定したことを示している。任意のシグナル比＞１は、細菌成長が生じたことを示し、大きな数はより多い細菌成長が生じたことを示している。
そのような成長の遅さは、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）が成長するために十分な時間がないことから、誤った又は不完全な結果をもたらす場合があり、それにより、それらの抗微生物剤への応答は有効に評価されない場合がある。この問題は、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）破壊性であるアッセイについては、さらなる検査を実施できないことから特に深刻である可能性がある。
チェックポイント成長アッセイは、十分な微生物成長を確認できる。
図４Ａ及び４Ｂは、成長指標が、エンドポイントアッセイによって測定される成長についての代用として使用され得るチェックポイント検査ウェルから測定可能なシグナルをもたらすことを示している。カチオン調整ミューラーヒントンブロスを含む９６ウェルプレートを使用して、細菌を、分光光度計を使用して確認したマクファーランド値０．５に達するようにコロニーを生理食塩水に希釈することによって調製した。これを１：２０で生理食塩水中に希釈し、１０μｌの接種菌液を各ウェルに加えた。成長指標レザズリンを予め決定したチェックポイントアッセイウェルに加えた。接種したプレートを３５℃、１５０ｒｐｍで振とうしながら３時間４５分間インキュベートした。このインキュベーション後、蛍光（励起５６０／発光５９０ｎｍ）をレザズリンを含むウェルから測定した。図４Ａ（レザズリン）中のデータは、陽性成長対照ウェルにおいて測定された蛍光と非接種ウェルにおいて測定された蛍光との比として示されている。任意のシグナル比＞１は、細菌成長が生じたことを示している。陽性成長閾値対照ウェルは、成長ブロス及び微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）及び成長指標を含んだが抗微生物剤を含まなかった。図４Ｂ（表面結合）は、表面結合による細菌定量を示し、ここでカチオン性磁気ビーズ及び抗Ｓ．アウレウス抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされている）を各ウェルに加え、２０分間、インキュベートした。自動プレート洗浄機を使用して、磁気ビーズを捕捉し、各ウェルの内容物をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）を用いて３回洗浄した。ＴＭＢを加え、１５分間、インキュベートし、その後反応を１Ｍ硫酸の添加によって停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を各ウェルについて測定した。図４Ｂ中のデータは、陽性成長チェックポイントウェルにおいて測定された吸光度と成長阻止（栄養素不含有）ウェルにおいて測定された吸光度との比として表されている。任意のシグナル比＞１は、細菌成長が生じたことを示している。
図５は、急速成長及び成長遅延臨床Ｓ．アウレウス株の両方についてのチェックポイントアッセイ結果並びにもたらされたＡＳＴ決定への影響を実証している。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（レザズリン）シグナルの接種されたウェルにおいてと非接種ウェルとの比を、ＡＳＴアッセイが処理される用意ができたかどうかを決定するための成長チェックポイントとして使用した。
図５に示すとおり、成長遅延Ｓ．アウレウス株は、３時間４５分間のインキュベーション期間に続いて実施されたＡＳＴアッセイから識別可能なＭＩＣ決定をもたらさなかった。迅速ＡＳＴを２つのＳ．アウレウス株を用いて接種後３時間４５分間で実施した。この際、各株について１つのウェルを「チェックポイントウェル」として接種し、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（細胞成長の測定値として作用する成長指標）を含ませた。急速成長株は、接種試料と非接種試料とのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）シグナル比２．５８を示した。成長遅延株は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）シグナル比１．１５を示した。処理前により高い成長チェックポイント比（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）比（細菌：対照）＝２．５８）を有した急速成長Ｓ．アウレウス株が、処理ＡＳＴアッセイにおいて、より決定的なＭＩＣデータをもたらした一方で、成長遅延株は、低い成長チェックポイント比（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）比（細菌：対照）＝１．１５）を有し、あまり決定的でないＭＩＣデータをもたらした。成長遅延Ｓ．アウレウス株の識別できないＭＩＣデータは、この試料がチェックポイントフェーズでＡＳＴ処理を継続することが承認されず、代わりにさらなるインキュベーション期間についてインキュベーターに戻されることを示している。
図６は、例示的細菌としてＰ．アエルギノーサの３つの株を使用した同様の結果を実証しており、ＡＳＴ検査は、細菌がある特定の成長チェック比値を達成した時点で検査が実施された場合に、改善された決定的なＭＩＣデータを示した。ＡＳＴは、プローブの表面結合に続く時間分解蛍光によって実施した。Ｐ．アエルギノーサ株を、成長を達成するための３５℃、振とう条件で４時間インキュベートし、成長チェックを４時間の成長後に培養物の吸光度を６００ｎｍで測定することによって実施した。株２は成長チェックポイント値１．１３で、８であることが期待されるアミカシン（ＡＭＫ）を用いた信頼できるＭＩＣデータを示さなかった。一方、より高い成長チェック値２．１８で株１は、８の信頼できるＭＩＣを示した。同様に株３は、成長チェック値１．２５で信頼性を実証した。
図７は、Ｐ．アエルギノーサの２株を用いて、光学密度測定を使用して得られた成長チェック比値がＣＦＵ値と一致しており、ここで、高い成長チェック比値を有する株は高いＣＦＵ値を有することを実証している。Ｐ．アエルギノーサの２株を１００μｌのＭＨＢ中に接種し、３５℃、振とう条件で４時間成長させた。波長６００ｎｍでの接種ウェルと非接種ウェルでの細菌培養の光学密度（ＯＤ）の比を決定した。培養物の系列希釈を実施し、それぞれの好適な希釈物の１０μｌをアガープレートに蒔き、一晩インキュベートした。コロニー形成を翌日計数し、ウェルあたりの細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を蒔かれた希釈物に基づいて算出した。図に示すとおり、２つの方法の一致が観察された。
成長指標は微生物の成長を抑制する場合があるが、それらは、微生物のインキュベーションの際に成長閾値チェックポイントウェルでのそれらの組み込みを通じて、非成長阻止についての代用として役立ち得る。
十分な成長の決定において、ＡＳＴ結果は決定され得る。
表面結合増幅アッセイ
微生物を標識し、定量するためにユウロピウムクリプテート分子を使用する表面結合増幅アッセイは、図８に実証のとおりＡＳＴ結果を決定するために利用され得る。Ｅ．コリ及びｄＳ．アウレウス（左パネル）又はクレブシエラ・ニューモニエ（右パネル）をＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６中、ｌｅ５〜ｌｅ９の範囲の濃度で９６ウェルマイクロプレートに接種した。細菌を含む各ウェルに、及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（Ｃｉｓｂｉｏ）を６６ｎｇ／ウェルで加え、次に５％溶液のグルタルアルデヒドをユウロピウムクリプテートを含むウェルに加えた。反応溶液を、ウェル内の細菌の外面を選択したレポーターを用いて標識化することを促進するために３０分間、インキュベートした。次に検査プレートを、細菌をプレートの底に沈殿させる一方で、すべての未会合レポーターを上清に残すようにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３を、２５００ｒｐｍの速度で２．５分間使用して遠心分離した。次にプレートを、洗浄緩衝液の添加の前に上清及び未反応レポーターを除去するためにＢｉｏＴｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏ Ｘプレート洗浄機を使用して吸引した。この洗浄手順を、すべての未反応レポーターを完全に除去するためにもう１度繰り返した。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中に再構成し、ＢｉｏＴｅｋ ＨＩプレートリーダー上で時間分解蛍光を使用して読み取った。
代謝プローブアッセイ
図９Ａ及び９Ｂは、十分な微生物成長を決定する成長閾値が達成された後だけに、代謝プローブをマイクロプレート上の追加的なウェルに加える場合に、代謝プローブがＡＳＴ結果を決定するために利用され得ることを示している。これは、それらの欠点を伴わずに成長指標の有利点を可能にする：シグナルは、生きた微生物から主に生じるが、成長阻止及び毒性作用は、初期インキュベーション期間から除かれる。カチオン調整ミューラーヒントンブロスを含む９６ウェルプレートを使用して、細菌を、分光光度計を使用して確認されたマクファーランド値０．５に達するようにコロニーを生理食塩水に希釈することによって調製した。これを１：２０で生理食塩水中に希釈し、１０μｌの接種菌液を各ウェルに加えた。指標レザズリンを接種の時点又は３時間４５分間後のいずれかで特定のウェルに加えた。接種したプレートを３５℃、１５０ｒｐｍで振とうしながら４時間４５分間インキュベートした。このインキュベーション後、蛍光（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）をレザズリンを含むウェルから測定した。図９Ａ及び図９Ｂにおけるデータは、陽性成長対照ウェルにおいて測定された蛍光と非接種ウェルにおいて測定された蛍光との比として示されている。接種ウェルにおいてと非接種ウェルとの蛍光シグナルの比は、レザズリンが初期細菌インキュベーション後に加えられた場合にさらに大きかった。
［実施例３］
インキュベーションに先行するカートリッジの予熱
本実施例は、赤外線放射加熱を利用するカートリッジ予熱を記載する。赤外線予熱器についての実験設定は、ＶＪ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｘ（ＶＪ ＩＲ−１Ｃ）からの既製の加熱装置及び９６ウェルマイクロプレートを保持するための特注の固定器具（ｆｉｘｔｕｒｉｎｇ）からなった。熱データ回収をＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＣｏｍｐａｃｔＤＡＱ Ｃｈａｓｓｉｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｄｅｖｉｃｅ（ＲＴＤ）ａｎａｌｏｇ ｍｏｄｕｌｅ（ＮＩ ９２１６）及び８個までの密封ＲＴＤ（Ｏｍｅｇａ、ＨＳＲＴＤ−３−１００−Ａ−４０−Ｅ）によって実施した。
ＲＴＤをマイクロプレートリッドを通して穴を開けた１／８”ホールを通じた測定のための望ましいウェルに挿入し、ＲＴＤチップが各ウェル中に存在する１００μＬの液体中に浸かったままになるようにテープを貼った。プレート、リッド及び体積は、それを通してＲＴＤが挿入されるリッドに開けられたホールを通じていることを除いて、標準的微量液体希釈法検査のために使用されるものと同様であった。この実験適応は、リアルタイムで温度を記録するために必要であった。
望ましい予熱温度をＩＲ−１Ｃ予熱器に設定し、４個の加熱器をオンにした。ＩＲ−１Ｃがそれ自体の温度を正確にモニターし、それによりそれは設定温度を正確に維持するために、Ｋ−型熱電対を挿入し、加熱プレートのすぐ上に固定した。
加熱器が温度になったら、検査マイクロプレートをスプリングロードホルダーに置いた。この固定器具は、プレートを加熱マントルの約２ｃｍ上のレベルに保持した。固定器具は、マイクロプレートをしっかりと保持するように設計され、そのため予熱ステップの間に動かなかった。
図１０Ａにおけるデータは、加熱の速度及び均一性を示している。＜２分間の加熱後、測定ウェル内に存在する液は、３５±１℃の温度に達した。９６ウェルプレートフォーマットは、「Ａ」〜「Ｈ」と標識された８行及び「１」〜「１２」と標識された１２列を有する。図１０Ａ中の３点での熱データは、２つの反対側の端のウェル及び中央ウェルを表している。
対照的に標準的対流インキュベーターは、９６ウェルプレートのすべてのウェルを２５℃〜３５℃に加熱するために２０〜３０分間必要である場合がある。図１０Ｂ中のデータは、同じ温度取得ハードウエアを用い、マイクロプレートアダプターを備えたＳｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩｎｃｕＳｈａｋｅｒ Ｍｉｎｉを利用して得た。このようなインキュベーター中のスタッキングプレートは、図１１のデータによって示されるように不均一な加熱をさらにもたらす可能性がある。微生物成長速度は、この範囲の温度で上昇と共に増加する、２分間で１℃上昇は、３０分間で１℃上昇よりも長い成長期間をもたらした。これは、微生物成長に基づくＡＳＴのようなアッセイの時間を短縮することから有利である。追加的に加熱の均一性は、正確さのために重要である可能性がある。したがって予熱は、本明細書に記載される方法によるＡＳＴアッセイを実施するためのインキュベーション時間内の好適な細菌成長を促進する。予熱は、対流インキュベーターでの続くスタッキングをさらに可能にできる。
図１２Ａ及び１２Ｂは、２つの例示的な細菌種Ｅ．コリ及びＰ．アエルギノーサそれぞれについてのプレートを予熱することでの細菌成長の改善を示している。プレートを３０分間予熱した、又は室温のままにした。図１２Ａについて、Ｅ．コリは、３８４ウェルプレート上で周知の細菌培養方法によって成長させ、吸光度（光学密度、ＯＤ）値を６００ｎｍで決定し、非接種対照ウェルについての同じ値を細菌成長を示す結果のＯＤ値を得るために減算した。図１２Ｂの場合では、Ｐ．アエルギノーサの２つの株を予熱した３８４ウェルプレート又は室温のままにした同一のプレートのいずれか中の４０μｌのカチオン調整ＭＨＢに接種した。予熱した又はしていないプレートでの細菌成長をグラフに示す、細菌接種をしていないウェルのバックグラウンド値を減算した後の６００ｎｍでの吸光度によって決定されたＯＤ値を示している。結果は、プレートの３０分間の予熱が、本方法の目的の１つに好都合である２〜４時間の短期間インキュベートされた場合に細菌の成長に好ましい又は最適な上昇、抗微生物剤感受性アッセイの実施の全体時間の低減をもたらしたことを示している。
［実施例４］
インキュベーションの際のカートリッジの揺動
２つの代表的な微生物、Ｐ．アエルギノーサ及びＳ．アウレウスの希釈物を、２つの標準的３８４ウェルマイクロプレートに導入し、一方のマイクロプレートを、回数１５０ｒｐｍ及び半径２５ｍｍでオービタル振とうする（すなわち、揺動する）ようにしたインキュベーターに置いた。他方のマイクロプレートをインキュベーターに置き、静置した。３時間後、微生物成長を６００ｎｍでの光学密度測定によって決定した。図１３は、３つの条件下でインキュベートした代表的な微生物の増強された成長比を示している。成長比は、インキュベーションの際に静置された３８４ウェルマイクロプレートについて６００ｎｍでの光学密度測定を、同様に接種され、１５０ｒｐｍ、半径２５ｍｍで振とうしながらインキュベートした３８４ウェルマイクロプレートと比較することによって決定された微生物成長である。図１４は、同様の成長増強が９６ウェルマイクロプレートにおいて達成されたことを示している。
横寸法＜１２ｍｍを有するウェルを有するＡＳＴマイクロプレートを、溶液が混合されるためには不十分な回数及び半径での振とうで揺動しながらインキュベートすることによって、微生物の成長速度の増強が達成された。
図１５Ａは、オービタル振とうした又はしなかったＳ．アウレウス培養物のＯＤ値を測定することによる細菌成長の直接対照比較を提供する。細菌を、３８４ウェルプレート中で揺動を除いて同一の条件下でインキュベートし、培養物の吸光度を成長４時間後に６００ｎｍでのＯＤを測定することによって決定した。図１５Ｂは、培養物中の相対ＡＴＰレベルを測定することによって示されるＳ．アウレウス成長を示しており、一方同一の培養物をそれぞれ１５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ及び５００ｒｐｍの振とう速度に供した。この研究では細菌を、３８４ウェルプレート中の４０μｌのカチオン調整ＭＨＢに接種した。細菌を３５℃、２時間、表示の速度で振とうしてインキュベートした。ＡＴＰの存在下でルミネセンスシグナルを産生できる薬剤であるＢａｃｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを２時間のインキュベーション後にウェルに加えた。シグナルの強度は、培養液中の生細菌の量に比例する、それにより成長の指標である。このデータは、良好なＡＳＴ結果を可能にする所与の条件下で、弱いから中程度の振とう速度がこれらの細菌の成長のために最適であることを示した。
［実施例５］
微生物生存率決定のためのテトラゾリウム類似物の使用
本実施例は、テトラゾリウムベースの分子が微生物生存率の決定において代謝プローブ及び成長指標として使用され得ることを示している。これらの分子は、（１）同じインキュベーション期間を共有して表面結合アッセイと共に実行される代謝プローブアッセイにおいて、及び／又は（２）十分な微生物成長を決定する成長閾値が達成された後だけに、代謝プローブをマイクロプレート上の追加的なウェルに加える場合に、ＡＳＴ結果を決定するために利用され得る。
図１６は、代謝プローブＩＮＴを単一のコンボプレート上でシュードモナス・アエルギノーサを用いて検査した場合の、ＡＳＴ結果を示している。図１７〜２０は、アシネトバクター・バウマンニ及び種々の抗生物質（例えば、アンピシリン／スルバクタム（図１７）、メロペネム（図１８）、トブライミシン（図１９）及びアミカシン（図２０）と組み合わせて、追加的なテトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣ）が代謝プローブとして利用された場合のＡＳＴ結果を示している。ＡＳＴプレートを０．５ＭａｃＦａｒｌａｎｄ細菌標準物の１：２０希釈物を用いて接種し、３．５時間インキュベートした。次に各プレートに、１０μｌの指標（代謝プローブ）溶液−テトラゾリウム類似物ＮＤＴ、ＤＢＮＰＴ、ＴＢＴＢ、ＣＴＣ及びＴＴＣの２ｍｇ／ｍＬ溶液、ＩＮＴ又はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の０．８ｍｇ／ｍＬ溶液を加えた。プレートを、生細菌についての測定可能な結果を得るためにさらに１時間インキュベートし、プレートリーダーで読み取った。テトラゾリウムを４９０ｎｍでの吸光度について読み取り、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）をＥｘ５６０／Ｅｍ５９０での蛍光について読み取った。次にＩＮＴを含有するプレートを、不溶性ホルマザン産生物による干渉が見られないことを確実にするためにユウロピウムアッセイに供した。
図２１〜２４は、追加的なテトラゾリウム類似物（ＩＮＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３及びＷＳＴ−８）がシュードモナス・アエルギノーサを種々の抗生物質｛例えば、イミピネム（図２１）、ニトロフラントイン（図２２）、ゲンタマイシン（図２３）及びテトラサイクリン（図２４）と組み合わせた場合に代謝プローブとして使用された場合のＡＳＴ結果を示している。ＡＳＴプレートを０．５ＭａｃＦａｒｌ及び細菌標準物の１：２０希釈物を用いて接種し、３．５時間インキュベートした。次に各プレートに、１０μｌの指標（代謝プローブ）溶液−ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３又はＷＳＴ−８、ＷＳＴ−１細胞増殖溶液の０．５ｍＭ溶液、０．８ｍｇ／ｍＬのＩＮＴ又はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）溶液を加えた。プレートを、生細菌についての測定可能な結果を得るためにさらに１時間インキュベートし、プレートリーダーで読み取った。テトラゾリウムを４９０ｎｍでの吸光度について読み取り、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）をＥｘ５６０／Ｅｍ５９０での蛍光について読み取った。
追加的に、ある特定のテトラゾリウム類似物について、前述のＡＳＴ結果が達成されるために、中間体電子伝達体は必要とされないことが見出された。電子伝達体分子がＩＮＴ低減に好影響を有するかどうかを決定するために、いくつかの細菌及び電子伝達体を検査した。Ｅ．コリ、Ｐ．アエルギノーサ、Ｓ．アウレウス及びクレブシレア属の細菌液（１００μｌ）を、１００μｌのＭＨＢ ＩＩを各ウェルに含有する４枚の別々の９６ウェルマイクロプレート（細菌株あたり１枚のマイクロプレート）の一番上の列に接種し、プレートの下方へ系列希釈し、最後の列は純粋なＭＨＢのままにした。次にプレートを細菌が複製するように１時間インキュベートした。１０μＬの０．８ｍｇ／ｍＬ ＩＮＴ溶液又はＷＳＴ−１細胞増殖溶液を、各ウェルに加え、メナジオン、ｌ−メトキシ−５−メチル−フェナジニウムメチルスルフェート、フェナジンエトスルフェート、メルドラブルー又はメチレンブルーの０．５ｍＭ溶液の添加が続いた。次にプレートを、ＩＮＴについて４９０ｎｍ及びＷＳＴ−１について４５０ｎｍでテトラゾリウムの吸光度を測定する前に１時間インキュベートした。図２５〜２８は、種々の電子伝達体の存在下で細菌希釈曲線の吸光度結果を標準的基準と比較して示している。図２５は、エシェリキア・コリ；図２６は、シュードモナス・アエルギノーサ；図２７は、スタフィロコッカス・アウレウス；図２８は、クレブシエラ・ニューモニエについての希釈曲線を示している。
［実施例６］
ＭＩＣ検証のための二重アッセイの実施
本実施例は、各試料について２つの異なるアッセイ方法を使用するＡＳＴベースＭＩＣアッセイが任意の単一のアッセイを使用するよりもより良い確証をもたらし得ることを示す。パーセント補正スコア（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｒｒｅｃｔ ｓｃｏｒｅ）を代謝アッセイ又は表面結合アッセイについて、各種の３０を超える株のアルゴリズム的に呼び出されたデータ（ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃａｌｌｙ ｃａｌｌｅｄ ｄａｔａ）に基づいて作成した。このスコア化システムでは、基本的な一致は、２つのアッセイについてのＭＩＣが１回の２倍希釈までで互いに異なっている場合に達成したと見なした。図２９は、２つの種、Ａ、Ｋ．ニューモニエ及びＢ、Ｓ．アウレウスについての代謝アッセイ又は表面結合アッセイに対するパーセント補正スコアを示している。図に示すとおり、２つのアッセイ間はかなり一致しているが、パーセント補正スコアは使用された抗生物質に基づいてアッセイ内で異なっていた。例えば図２９Ａでは、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）についての表面結合アッセイは、Ｋ．ニューモニエについての代謝アッセイよりも、アルゴリズム的に呼び出されたデータとより良い一致を示した。９５％対８３％。このような場合では表面結合アッセイは、微生物、Ｋ．ニューモニエへの抗微生物剤ゲンタマイシンのＭＩＣについてさらに決定的、明白かつ説得力がある結果をもたらした。一方、抗微生物剤セフトリアキソン（ＣＲＯ）は、代謝アッセイがアルゴリズム的に呼び出されたＭＩＣデータとの１００％一致を達成して、代謝アッセイ及び表面結合アッセイの両方に高い程度の正確性を示した。
図３０Ａ〜Ｆに示すとおり、二重アッセイのさらに詳細な調査をＫ．ニューモニエ及びＳ．アウレウスでの抗生物質のより多い選択肢を用いて実施した。このアッセイでは、ＡＳＴプレートをＣＬＳＩ指針に基づいた細菌用いて接種した。細菌（図３０Ａ〜Ｃ、クレブシレア属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）及び図３０Ｄ〜Ｆ、スタフィロコッカス・アウレウス）を、３５℃、３時間振とう条件でインキュベートし、成長させた。インキュベーションに続いて、レザズリン試薬を１：１０ウェル体積で加え、さらに１時間インキュベートした。分光学的測定を代謝アッセイ結果を与える５６０／５９０ｎｍの励起／発光波長で得た。ＰＢＳ中に１％ Ｔｗｅｅｎを含有する１００マイクロリットルの界面活性剤溶液を各ウェルに加え、１０分間、振とう条件に保った。培養物を細菌沈殿を得るために２，５００ｘｇ、２．５分間遠心分離した。上清を吸引し、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ中、１ウェルあたり１００マイクロリットルに沈殿を再懸濁した。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート、濃度５ｎｇ／ウェル（Ｋ．ニューモニエ）又は２０ｎｇ／ウェル（Ｓ．アウレウス）を１０μｌ／ウェル、０．０００５％グルタルアルデヒドと共に加え、１０分間振とうした。プレートを２．５分間、２，５００ｘｇ遠心分離した。上清を吸引し、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）を用いて２〜３回洗浄した。沈殿を０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）を用いて再懸濁し、蛍光測定を結合アッセイ結果を得るために時間分解蛍光によって行った。データは、相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）に対応するバーとして示されている。
図３０Ａ〜Ｆでは、各抗微生物剤についての左パネルは代謝アッセイ結果に対応し、右パネルは表面結合アッセイに対応する。各抗微生物剤についての２つのアッセイ間の例示的不一致は、各図において矢印によって指摘されている。この図に示されるとおり、各抗微生物剤についての代謝データ及び表面結合データは、問題の抗微生物剤、問題の微生物に応じて異なっている可能性がある。例えば、図３０Ａに示すとおり、表面結合アッセイは、代謝アッセイと比較してＫ．ニューモニエへのゲンタマイシンについてより決定的なＭＩＣを示し、用量を増加させて用いた細菌の阻止はあまり明らかでなかった。結果としてこれは、所与の微生物への具体的な抗微生物剤についてＭＩＣの最良の判断を作成するために少なくとも２つのアッセイが実施されることが推奨されることを示している。

Claims (129)

  1. 微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、
    １種以上の微生物の懸濁液を、複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップであって、複数のチャンバは１種以上の抗菌剤を含む、ステップ、
    初期インキュベーション期間の間、微生物成長を促進する条件下でカートリッジをインキュベートするステップ、
    カートリッジチャンバのサブセットにおいて、微生物成長が閾値を達成したかどうかを決定するために１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップ、並びに
    （ａ）閾値が達成された場合、１種以上の抗菌薬に対する微生物の感受性を決定するために複数のカートリッジチャンバにおいて複数の異なる成長アッセイを実施し、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／若しくは定性的感受性結果（ＱＳＲ）を得るステップ、又は
    （ｂ）閾値が達成されていない場合、
    （ｉ）閾値が達成され、その後、ステップ（ａ）を実施するまで、若しくは
    （ｉｉ）閾値が達成されずに最大１８時間が経過し、さらなるアッセイが実施されなくなるまで、
    微生物成長を促進する条件下で１回以上のさらなるインキュベーション期間を実施するステップ
    を含む、方法。
  2. １種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、
    少なくとも１．５時間の初期インキュベーション期間を共有する複数の異なる成長アッセイを実施するステップであって、初期インキュベーション期間の完了後、１種以上のプローブが加えられ、各々のアッセイは、１種以上の抗菌薬の存在下での微生物成長アッセイを含む、ステップ、並びに
    相対的微生物成長に基づいて１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定し、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を得ることができるステップ
    を含む、方法。
  3. 微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、
    （ａ）１種以上の微生物の懸濁液を、１種以上の抗菌薬を含む複数のチャンバを含むカートリッジに導入するステップ、
    （ｂ）初期時間の期間の間、微生物成長を促進する条件下でカートリッジをインキュベートするステップ、
    （ｃ）チャンバの少なくともサブセットにおいて微生物成長が閾値を達成したかどうかを決定するためのチェックポイントアッセイを実施するステップ、並びに
    （ｄ）微生物成長が閾値を達成すると、複数のカートリッジチャンバ内の複数の抗菌薬に対する微生物の感受性を決定するための複数の成長アッセイを実施し、これによって抗菌薬の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を微生物について得ることができるステップ
    を含む、方法。
  4. ステップ（ｄ）が、
    微生物成長が閾値より低いと、最大１８時間のさらなる期間の間インキュベートし、微生物成長が閾値を達成しているかどうかを決定するためにステップ（ｃ）を反復するステップ、並びに
    複数のカートリッジチャンバ内の複数の抗菌薬に対する微生物の感受性を決定するための複数のアッセイを実施し、これによって抗菌薬の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を微生物について得ることができる、ステップ
    をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 成長アッセイを実施することによって１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、成長アッセイが
    代謝プローブが存在しない１種以上の抗菌薬の存在下で微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、
    １種以上の微生物のインキュベーション後、水混和性溶媒中に代謝プローブを導入するステップ、及び
    相対的微生物成長に基づいて１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定するステップ
    を含む、方法。
  6. １種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する方法であって、
    （ａ）微生物成長を促進するために初期時間の期間の間、抗菌剤を含むカートリッジにおける複数のチャンバ内の微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、
    （ｂ）相対的微生物成長が閾値を達成したかどうかを決定するためにカートリッジチャンバのサブセットにおいて１つ以上のチェックポイントアッセイを実施するステップであって、閾値の達成は、微生物についてのＭＩＣ又はＱＳＲデータを提供するためにアッセイシステムについての十分な成長を示す、ステップ、
    （ｃ）閾値が、
    （ｉ）達成された場合、１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）若しくは定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するための１つ以上の成長アッセイを実施するステップ、又は
    （ｉｉ）達成されていない場合、さらなる時間の期間の間、微生物の懸濁液をインキュベートし、
    条件（ｂ）（ｉ）を満たすまで、若しくは
    微生物についてのＭＩＣ若しくはＱＳＲデータを提供するためのアッセイシステムについての成長が不十分な状態で合計時間が経過するまで
    ステップ（ａ）及び（ｂ）を反復するステップ
    を含む、方法。
  7. 微生物成長を促進する方法であって、
    微生物成長を促進する条件下でカートリッジにおいて１種以上の抗菌薬の存在下で１種以上の微生物の懸濁液をインキュベートするステップ、並びに
    溶液混合を達成するのに不十分な振動数及び／又はオービタル振とう半径にてカートリッジを揺動するステップ
    を含む、方法。
  8. 微生物成長を促進する方法であって、
    微生物の懸濁液を含むカートリッジを約３０℃〜約４５℃の温度に予熱するステップ、及び
    微生物の懸濁液を含む予熱したカートリッジを、微生物成長を促進する条件下で１種以上の抗菌薬の存在下でインキュベートするステップ
    を含む、方法。
  9. １種以上の抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するために使用されるアッセイの数が、実施されるアッセイの数より少ない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 抗菌薬についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）を決定するために使用されるアッセイの数が、実施されるアッセイの数と等しい、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. アッセイが、１種以上の抗菌薬に対する１種以上の微生物の感受性を決定するのに適切であるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 異なるアッセイが、異なる抗菌薬−微生物の組合せのために使用される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. １つ以上の異なるアッセイが、異なる微生物種のために使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 少なくとも１つのアッセイが、代謝プローブアッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、酵素生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、視覚アッセイ及びｐＨ分子プローブアッセイからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. アッセイの各々が、代謝プローブアッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、酵素生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、視覚アッセイ及びｐＨ分子プローブアッセイからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 複数の成長アッセイが、表面結合アッセイを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 複数の成長アッセイが、代謝アッセイを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 複数の成長アッセイが、代謝アッセイ及び表面結合アッセイを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 代謝成長アッセイが、
    （ａ）複数のチャンバへの代謝プローブの添加、
    （ｂ）微生物成長を促進する条件下でのアッセイインキュベーション期間、及び
    （ｃ）吸光度、蛍光、ルミネセンス、電気化学的シグナル測定のうちの１つ以上を得ること
    を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. アッセイインキュベーション期間が、約３０分〜２時間である、請求項１９に記載の方法。
  21. アッセイ成長インキュベーション期間が約１時間である、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 代謝プローブアッセイが、後の成長アッセイの前に実施される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 代謝プローブアッセイが、表面結合プローブアッセイの前に実施される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 代謝プローブが、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 代謝プローブが、式（Ｉ）に記載の構造
    Figure 2020504610
     ［式中、
    Ｒ１は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
    Ｒ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
    Ｒ３は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリール又はサブ構造Ａであり、
    サブ構造Ａは、
    Figure 2020504610
     （式中、
    Ｌ１は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
    Ｌ２は独立して、共有結合、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
    Ｒ４は独立して、ＣＮ、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールであり、
    Ｒ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール又は任意選択的に置換された５〜１０員ヘテロアリールである）
    であり、
    各々のＸは独立して、不在又は一価アニオンである］
    を有する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. Ｒ１が独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、請求項２５に記載の方法。
  27. Ｒ２が独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. Ｒ３が独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
  29. Ｘが、一価アニオンである、請求項２８に記載の方法。
  30. Ｒ３がサブ構造Ａであり、化合物が、式（ＩＩ）に記載の構造：
    Figure 2020504610
     を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. Ｌ１及びＬ２の各々が独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリーレンである、請求項３０に記載の方法。
  32. Ｒ４が独立して、ＣＮ又は任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. Ｒ５が独立して、任意選択的に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 各々のＸが独立して、一価アニオンである、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 代謝プローブが、
    Figure 2020504610
    Figure 2020504610
    Figure 2020504610
    からなる群から選択される構造を有する、請求項２５に記載の方法。
  36. 代謝プローブが、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）又は５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 代謝プローブが、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、５−シアノ−２，３−ジ（ｐ−トリル）テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、３，３’（３，３’−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム）（ＤＢＮＰＴ）、３−（ナフタレン−１−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＮＤＴ）、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴＢＴＢ）、フェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエチルスルフェート（ＰＥＳ）、グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン（ＧＦ−ＡＦＣ）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＢＡＴＤＡのアセトキシメチルエステル又はフェロセンを含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 表面結合プローブが、ランタニドとジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテート配位子との配位錯体を含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
  39. 表面結合プローブが、
    Figure 2020504610
     を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. １種以上の成長指標が、微生物細胞膜、細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜、細胞被膜に結合することができる化学基又は生化学基；細胞壁、細胞エンベロープ内の化学基又は生化学基、繊毛、線毛、鞭毛、細胞小器官、膜貫通タンパク質、細胞壁タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外関連多糖、細胞内関連多糖、脂質、細胞外脂質、細胞内脂質、膜脂質、細胞壁脂質、多糖及び／又は細胞エンベロープタンパク質若しくは細胞小器官に不可欠な脂質又は細胞エンベロープタンパク質若しくは細胞小器官に関連する脂質又は核酸に結合することができる化学基又は生化学基を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 微生物成長を決定する複数のアッセイが、指標の時間分解蛍光測定を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 指標が、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウム又はこれらの組合せを含む、請求項１〜４１に記載の方法。
  43. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、増幅剤を使用することを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 増幅剤が、酵素、触媒及びナノ粒子並びにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、二本鎖ＤＮＡ濃度を定量するための指標を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 指標が、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ及びＳＹＴＯを含む、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール及びシアニン又はこれらの組合せである、請求項４５に記載の方法。
  47. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、核酸増幅を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、核酸シークエンシングを含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、アデノシン三リン酸の使用を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、光散乱を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、光学顕微鏡検査を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 微生物成長を決定するための複数のアッセイが、微生物質量を測定することを含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 微生物成長のためのアッセイが、微生物の吸光度測定又は比濁測定に基づく、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 異なる成長アッセイが、異なるカートリッジチャンバ内で実施される、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 異なる成長アッセイが、同じカートリッジチャンバ内で実施される、請求項１〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 異なる成長アッセイが、逐次的に実施される、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法。
  57. 異なる成長アッセイが、同時に実施される、請求項１〜５６のいずれかに記載の方法。
  58. 複数のチャンバが、培地中に溶解された１種以上の抗菌薬を含む、請求項１〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. 初期インキュベーション期間が、約２〜１８時間である、請求項１〜５８のいずれかに記載の方法。
  60. 初期インキュベーション期間が、約２〜６時間である、請求項１〜５９のいずれかに記載の方法。
  61. 初期インキュベーション期間が、約３時間である、請求項１〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. さらなるインキュベーション期間が、約１〜４時間である、請求項１〜６１のいずれかに記載の方法。
  63. さらなるインキュベーション期間が、約１〜２時間である、請求項１〜６２のいずれかに記載の方法。
  64. カートリッジチャンバの５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満が、チェックポイントアッセイのために使用される、請求項に記載の方法。
  65. チェックポイントアッセイチャンバが、
    （ａ）初期インキュベーション期間及び／若しくはさらなるインキュベーション期間の間に成長指標を含み、並びに／又は
    （ｂ）成長指標を含まず、チェックポイントアッセイが、吸光度、比濁法、質量共鳴によって実施され、又は音響的に実施される、請求項１〜６４のいずれかに記載の方法。
  66. １つ以上のチェックポイントアッセイチャンバが、抗菌薬を含まない、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法。
  67. １つ以上のチェックポイントアッセイチャンバが、１種以上の抗菌薬を含む、請求項１〜６６のいずれかに記載の方法。
  68. 閾値決定が、陽性対照を含む、請求項１〜６７のいずれかに記載の方法。
  69. 閾値が、陽性対照及びバックグラウンド対照を含む、請求項１〜６８のいずれかに記載の方法。
  70. 閾値決定が、陽性対照対バックグラウンド対照の比を含む、請求項１〜６９のいずれかに記載の方法。
  71. 陽性対照が、微生物の懸濁液及び抗菌薬なしでインキュベートされたときに微生物成長を促進する培地を含む、請求項１〜７０のいずれかに記載の方法。
  72. バックグラウンド対照が、微生物の懸濁液及び微生物成長を促進しない培地を含む、請求項１〜７１のいずれかに記載の方法。
  73. 陽性対照が、微生物の懸濁液及び抗菌薬なしでインキュベートされたときに微生物成長及び１種以上の成長指標を促進する培地を含む、請求項１〜７２のいずれかに記載の方法。
  74. バックグラウンド対照が、微生物の懸濁液及び微生物成長及び１種以上の成長指標を促進しない培地を含む、請求項１〜７３のいずれかに記載の方法。
  75. バックグラウンド対照が、微生物を有さないチャンバを含む、請求項１〜７４のいずれかに記載の方法。
  76. 陽性対照対バックグラウンド対照の比が、約１．１〜約２．５である、請求項１〜７５のいずれかに記載の方法。
  77. １種以上の成長指標が、１つ以上のチェックポイントアッセイの間、光学的又は電気的に活性である、請求項１〜７６のいずれかに記載の方法。
  78. １種以上の成長指標の光シグナルが、蛍光、時間分解蛍光、吸光度又はルミネセンスを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. １種以上の成長指標の電気シグナルが、ボルタンメトリー又は電位差測定である、請求項７７に記載の方法。
  80. １種以上の成長指標が、化学又は生化学反応を起こす、請求項１〜７９のいずれかに記載の方法。
  81. １種以上の成長指標が、７−ヒドロキシ−１０−オキシドフェノキサジン−１０−イウム−３−オン（レザズリン）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（２，４−ジニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート（ＷＳＴ−３）又は５−（２，４−ジスルホフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内塩，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、５−シアノ−２，３−ジ（ｐ−トリル）テトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）、３，３’（３，３’−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム）（ＤＢＮＰＴ）、３−（ナフタレン−１−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＮＤＴ）、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴＢＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、フェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエチルスルフェート（ＰＥＳ）、グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン（ＧＦ−ＡＦＣ）、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）、ＢＡＴＤＡのアセトキシメチルエステル又はフェロセンを含む、請求項１〜８０のいずれかに記載の方法。
  82. 成長指標がレザズリンを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 成長指標がＩＮＴを含む、請求項８１に記載の方法。
  84. 成長指標が、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３又はＷＳＴ−８を含む、請求項８１に記載の方法。
  85. １種以上の成長指標が、ｐＨに応答する、請求項１〜８４のいずれかに記載の方法。
  86. １種以上の成長指標が、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、エオシンＹ、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ピラニン）、セミナフトローダフルオール、カルボキシＳＮＡＲＦ、アリザリンイエロー、ブリリアントイエロー、ブロモクレゾール、ブロモフェノールブルー、ブロモチモールブルー、コンゴーレッド、ｏ−クレゾールフタレイン、ｍ−クレゾールパープル、クレゾールレッド、２，５−ジニトロフェノール、エチルオレンジ、メタニルイエロー、メチルオレンジ、メチルレッド、モーダントオレンジ、ニュートラルレッド、フェノールフタレイン、フェノールレッド、キナルジンレッド、ｐ−ロゾール酸、チモールブルー、チモールフタレイン、トロペオリン又はキシレノールブルーを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. １つ以上のチェックポイントアッセイが、顕微鏡検査又は質量分析を含む、請求項１〜８６のいずれかに記載の方法。
  88. カートリッジが、少なくとも２４個のチャンバを含む、請求項１〜８７のいずれかに記載の方法。
  89. カートリッジが、９６個、３８４個又は１５３６個のチャンバを含む、請求項１〜８８のいずれかに記載の方法。
  90. カートリッジチャンバの各々が、１２ｍｍ未満の横寸法を有する、請求項１〜８９のいずれかに記載の方法。
  91. カートリッジが、機械的揺動、音響的揺動又は磁気的揺動によって揺動される、請求項１〜９０のいずれかに記載の方法。
  92. 機械的揺動が、オービタル振とうである、請求項９１に記載の方法。
  93. オービタル振とうが、毎分５０回転より多い振動数で行われる、請求項９２に記載の方法。
  94. オービタル振とうが、毎分３５０回転より多い振動数で行われる、請求項９１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. オービタル振とうが、毎分７５０回転より少ない振動数で行われる、請求項９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. オービタル振とうが、９６個のチャンバのカートリッジについて毎分約１５０回転の振動数で行われる、請求項１〜９５のいずれかに記載の方法。
  97. オービタル振とうが、３８４個のチャンバのカートリッジについて毎分約４５０回転の振動数で行われる、請求項１〜９６のいずれかに記載の方法。
  98. オービタル振とう半径が２ｍｍより大きい、請求項１〜９７のいずれかに記載の方法。
  99. オービタル振とう半径が２５ｍｍである、請求項１〜９８のいずれかに記載の方法。
  100. 溶液混合を達成するのに不十分な振動数又は半径にてカートリッジを揺動することにより、カートリッジを揺動していない微生物成長に対するカートリッジを揺動している微生物成長の成長比が大きくなる、請求項１〜９９のいずれかに記載の方法。
  101. 成長比が、１より大きく、１．５未満である、請求項１００に記載の方法。
  102. 約３０℃〜約４５℃の温度にカートリッジを予熱することにより、少なくとも２４個のチャンバの実質的に均一な加熱が生じる、請求項１〜１０１のいずれかに記載の方法。
  103. カートリッジが、１５分未満の間、予熱される、請求項１〜１０２のいずれかに記載の方法。
  104. カートリッジが、１分、２分、５分、１０分又は１５分の間、予熱される、請求項１〜１０３のいずれかに記載の方法。
  105. カートリッジが、放射加熱、伝導加熱又は対流加熱によって予熱される、請求項１〜１０４のいずれかに記載の方法。
  106. 放射加熱が、赤外放射加熱である、請求項１〜１０５のいずれかに記載の方法。
  107. カートリッジが、伝導加熱及び対流加熱によって予熱される、請求項１〜１０６のいずれかに記載の方法。
  108. １つ以上の加熱面が、伝導加熱及び対流加熱を実施する、請求項１０５に記載の方法。
  109. カートリッジが、放射加熱と伝導加熱及び対流加熱との両方によって予熱される、請求項１０５に記載の方法。
  110. カートリッジが、対流加熱のみによっては予熱されない、請求項１０５に記載の方法。
  111. カートリッジが、少なくとも２５℃の温度にて１種以上の流体のカートリッジへの添加によって予熱される、請求項１〜１１０のいずれかに記載の方法。
  112. １種以上の抗菌薬の存在下での微生物のインキュベーションが、カートリッジを予熱した後約３０分以内に行われる、請求項１〜１１１のいずれかに記載の方法。
  113. 抗菌薬感受性試験を実施するための自動プラットフォームにカートリッジを充填する前にカートリッジを予熱するステップをさらに含む、請求項１〜１１２のいずれかに記載の方法。
  114. カートリッジにわたる温度のばらつきが、予熱するステップの間、５％未満である、請求項１〜１１３のいずれかに記載の方法。
  115. 最高温度のチャンバと最低温度のチャンバとの℃での温度差が、５％未満である、請求項１１４に記載の方法。
  116. 微生物成長を促進する条件が、約３３℃〜約３７℃の温度範囲を含む、請求項１〜１１５のいずれかに記載の方法。
  117. 微生物成長を促進する条件が、約３５℃の温度を含む、請求項１〜１１６のいずれかに記載の方法。
  118. １種以上の微生物が、臨床試料に由来する、請求項１〜１１７のいずれかに記載の方法。
  119. 臨床試料が、血液、脳脊髄液、尿、便、膣試料、痰、気管支肺胞洗浄液、咽喉、鼻スワブ、創傷スワブ又はこれらの組合せを含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. １種以上の微生物が、エシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エールリヒア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ガードネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、イサタケンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、コクシジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ニューモシスチス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｓｐｐ．）、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、エキセロハイラム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リングワーム（ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、ムコールミセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 微生物成長を促進する条件が、周囲空気、嫌気条件又は最大で１０％までのＣＯ２を含む、請求項１〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. カートリッジチャンバの底部が、平坦、円形又はＶ字形である、請求項１〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. カートリッジが、光学的に透明、白色又は黒色のうちの１つ以上である、請求項１〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 微生物懸濁培地が、少なくとも１種の栄養素を含む、請求項１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. １個以上のチャンバが、異なる液体成分を含む、請求項１〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. どの抗菌薬又は抗菌薬の組合せが、１種以上の微生物に対して最も効果的であるかを決定するステップをさらに含む、請求項１〜１２５のいずれかに記載の方法。
  127. １種以上の微生物によって引き起こされる感染を治療するための推奨事項を生成するステップをさらに含む、請求項１〜１２６のいずれかに記載の方法。
  128. ステップが、抗菌薬感受性試験のための自動プラットフォームにおいて実施される、請求項１〜１２７のいずれかに記載の方法。
  129. 請求項１〜１２８のいずれかに記載の方法を実施するための構成要素を含むキット。
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