CN114292896B

CN114292896B - 一种幽门螺杆菌药敏检测方法

Info

Publication number: CN114292896B
Application number: CN202111596521.4A
Authority: CN
Inventors: 李红; 唐红; 申亚琳; 宋小娜; 唐小琼
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114292896A

Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌药敏检测方法，本发明采用微量肉汤稀释法，只需要两个48孔板便可以一次性检测一例临床分离菌株对多种抗菌药物的MIC值，极大提高了药敏检测效率，药敏结果与金标准即琼脂稀释法一致性较高，操作简便，而且药敏结果检测已实现半自动化；本发明的方法操作简单耗费少，与琼脂稀释法相比不需要配置大量的板子，梯度稀释的抗生素液体和培养基的加入可以由工作站完成，而且比E‑test试纸条成本低，药敏结果可以用酶标仪检测，通过染色液染色，结果直观可见。

Description

一种幽门螺杆菌药敏检测方法

技术领域

本发明属于药敏检测技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌药敏检测方法。

背景技术

幽门螺杆菌是革兰氏阴性菌，幽门螺杆菌感染可引起胃炎，十二指肠球炎和消化性溃疡，并与胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤的发生密切相关，感染世界一半以上的人口。然而，由于抗菌药物的不规范化使用，幽门螺杆菌对常用抗菌药物的耐药率逐年增高，导致幽门螺杆菌耐药率明显升高，根除率明显下降。而药敏试验可以确定细菌对抗生素的敏感性，是目前公认的针对细菌耐药性和敏感性的方法。通过药敏结果来指导幽门螺杆菌抗菌药物的选择，从而避免因抗菌药物选择不当而导致的治疗失败和耐药菌株的产生。

目前检测幽门螺杆菌药敏试验的主要技术有琼脂稀释法、E-test试纸条、纸片扩散法、微量肉汤稀释法和幽门螺杆菌分子检测法。琼脂稀释法需要制备大量不同稀释浓度的抗菌药物平板，操作复杂、费时费力，尤其不适合针对少量临床分离菌株的药敏检测。E-test试纸条法中需要用到试纸条，价格昂贵成本高。纸片扩散法对药敏结果判定尚未统一标准，且对部分抗菌药物无明确的抑菌环折点，不适合临床广泛应用。耐药分子检测目前只能检测两种抗菌药物即克拉霉素和左氧氟，不能包括其他用来治疗幽门螺杆菌的抗生素。

CN103757088A公开了幽门螺杆菌活菌的定量测定、药敏测定试剂盒及测定方法，该发明中采用疑似含活幽门螺杆菌的粪便或者血液或者分泌物，培养出来的菌不能认定为幽门螺杆菌，尿素酶反应不是幽门螺杆菌独特的反应，可能是其他细菌，假阳性率较高，在此基础上进行的定量和药敏可信度低，且药敏检测时间长。另外，传统的幽门螺杆菌药敏检测需要配制大量的培养平板，并且操作人员需要受过专业的训练，并且需要培养72-96h才能获得药敏结果。

鉴于以上原因，特提出本发明。

发明内容

为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种幽门螺杆菌药敏检测方法，本发明采用微量肉汤稀释法，只需要两个48孔板便可以一次性检测一例临床分离菌株对多种抗菌药物的MIC值，极大提高了药敏检测效率，药敏结果与金标准即琼脂稀释法一致性较高，操作简便。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种幽门螺杆菌药敏检测方法，包括如下步骤：

(1)含抗生素液体培养基制备：将抗生素原液倍比稀释，分别取每个稀释浓度的抗生素1mL，加入到15mL BD管中，每个BD管中加入9mL布鲁氏培养基，混合均匀，得到含抗生素液体培养基：

(2)幽门螺杆菌药敏板配制：取250μL所述的含抗生素液体培养基加入到48板孔中，同时设置阴性对照组和阳性对照组；

(3)准备待检菌液：收集在哥伦比亚血平板上培养72h的幽门螺杆菌，用所述的含抗生素液体培养基将其浓度调至0.5×10⁸～1×10⁸CFU/mL，加入到步骤(2)配制的幽门螺杆菌药敏板孔中，放置在37℃微需氧环境中培养；

(4)检测：测定待检菌液的OD₆₀₀值，初步判定药敏情况；

(5)染色：配制染色液，加入到每个待检菌液药敏板孔中染色，根据染色情况判定药敏情况；

(6)若步骤(4)和(5)同时敏感，则最终的药敏结果为敏感，否则为不敏感。

进一步的，步骤(1)中抗生素原液倍比稀释为5120ug/mL、2560ug/mL、1280ug/mL、640ug/mL、320ug/mL、160ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL。

进一步的，步骤(1)中布鲁氏培养基中含有8-12％的胎牛血清。

进一步的，布鲁氏培养基中含有10％的胎牛血清。

本发明人经过大量试验发现采用上述含量的胎牛血清有助于菌的生长。

进一步的，步骤(2)中阴性对照组为不加幽门螺杆菌且不含抗生素液体的培养基，所述的阳性对照组为含有幽门螺杆菌但不含抗生素液体的培养基。

进一步的，步骤(3)中幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上培养为通过接种环接种幽门螺杆菌于哥伦比亚血平板上，置于37℃微需氧环境中培养72h。

进一步的，所述的微需氧环境为含有5％氧气、85％氮气和10％二氧化碳。

进一步的，步骤(3)中培养为在转速90-110rpm下摇瓶培养46-50小时。

进一步的，步骤(3)中培养为在转速100rpm下摇瓶培养48小时。

上述的培养条件是本发明经过大量试验，筛选得到的，这是由于转速过慢，菌会沉降；转速过快，会产生高的液体剪切力伤害细菌，影响细菌生长。培养时间过短菌没有生长起来也会影响药敏结果判读；培养时间长，效率低，且都会影响药敏结果判读。

进一步的，步骤(4)中待检菌液的OD₆₀₀值-阴性对照组OD₆₀₀值＜0.05，则表示无菌生长，即敏感。

进一步的，步骤(5)中染色液浓度为0.08-0.12％，每个药敏板孔中加入50μL染色液染色0.8-1.2min。

进一步的，染色液为NNNN-四甲基对苯二胺二盐酸盐。

进一步的，步骤(5)中染色为蓝色则表示有菌生长，与阴性对照组颜色一致则表示无菌生长，即敏感。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明采用微量肉汤稀释法，本发明采用的方法是从金标准变化而来，幽门螺杆菌摇菌的起始浓度为1×10⁸CFU/mL，在微需氧环境下，液体摇菌只需要48h就能得出药敏结果，缩短培养时间，且只需要两个48孔板便可以一次性检测一例临床分离菌株对多种抗菌药物的MIC值，极大提高了药敏检测效率，药敏结果与金标准即琼脂稀释法一致性较高，操作简便，而且药敏结果检测已实现半自动化；

(2)本发明的方法操作简单耗费少，与琼脂稀释法相比不需要配置大量的板子，梯度稀释的抗生素液体和培养基的加入可以由工作站完成，而且比E-test试纸条成本低，药敏结果可以用酶标仪检测，通过染色液染色，能够直观明了的显示出抗菌效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明实施例1的染色图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

一种幽门螺杆菌药敏检测方法，包括如下步骤：

(1)含抗生素液体培养基制备：将抗生素原液倍比稀释，稀释为5120ug/mL、2560ug/mL、1280ug/mL、640ug/mL、320ug/mL、160ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL，分别取每个稀释浓度的抗生素1mL，加入到15mL BD管中，每个BD管中加入9mL布鲁氏培养基，布鲁氏培养基中含有10％的胎牛血清，混合均匀，得到含抗生素液体培养基：

(2)幽门螺杆菌药敏板配制：取250μL所述的含抗生素液体培养基加入到48板孔中，同时设置阴性对照组和阳性对照组，其中，对照组为不加幽门螺杆菌且不含抗生素液体的培养基500μL，所述的阳性对照组为含有幽门螺杆菌但不含抗生素液体的培养基500μL；

(3)准备待检菌液：收集在哥伦比亚血平板上培养72h的幽门螺杆菌，幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上培养为通过接种环接种幽门螺杆菌于哥伦比亚血平板上，置于37℃微需氧环境中培养72h，用所述的含抗生素液体培养基将其浓度调至1×10⁸CFU/mL，加入到步骤(2)配制的幽门螺杆菌药敏板孔中，放置在37℃微需氧环境中转速100rpm下摇瓶培养48小时，所述的微需氧环境为含有5％氧气、85％氮气和10％二氧化碳；

(4)检测：利用酶标仪在600nm处读数，测定待检菌液的OD值，酶标仪检测的在不同抗生素浓度下C035和C041的OD值如表1所示。

表1

注：表1中CK-即为阴性对照，CK+即为阳性对照，表中的C035和C041分别代表两株不同的幽门螺杆菌分离菌株，CLR代表：克拉霉素；LEV代表：左氧氟沙星，CLR和LEV下标注的数字即代表培养基中含有的抗生素浓度为：256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L和0.125mg/L。

根据酶标仪检测结果进行初步判读：受试分离株C035的MIC值分别为256mg/L和16mg/L；受试分离株C041的MIC值分别为0.25mg/L和0.5mg/L。

再根据染色结果进行判定；

(5)染色：配制染色液，染色液浓度为0.1％，染色液为NNNN-四甲基对苯二胺二盐酸盐，每个药敏板孔中加入50μL染色液染色1min，加入到每个待检菌液药敏板孔中染色，根据染色情况判定药敏情况，染色为蓝色则表示有菌生长，与阴性对照组颜色一致则表示无菌生长，即敏感。

本实施例的染色情况如图1所示，其中图1中Negative即为阴性对照，Positive即为阳性对照，图A中的C035和图B中的C041分别代表两株不同的幽门螺杆菌分离菌株，CLR代表：克拉霉素；LEV代表：左氧氟沙星，孔位上标注的数字即代表培养基中含有的抗生素浓度为：256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L和0.125mg/L。

从图中可以看出，受试分离株C035的MIC值分别为128mg/L和8mg/L(相应孔中无可见生长)；受试分离株C041的MIC值分别为0.125mg/L和0.5mg/L(相应孔中无可见生长)。

本发明的步骤(4)和(5)敏感结果一致。

实施例2

一种幽门螺杆菌药敏检测方法，包括如下步骤：

(1)含抗生素液体培养基制备：将抗生素原液倍比稀释，稀释为5120ug/mL、2560ug/mL、1280ug/mL、640ug/mL、320ug/mL、160ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL，分别取每个稀释浓度的抗生素1mL，加入到15mL BD管中，每个BD管中加入9mL布鲁氏培养基，布鲁氏培养基中含有8％的胎牛血清，混合均匀，得到含抗生素液体培养基：

(2)幽门螺杆菌药敏板配制：取250μL所述的含抗生素液体培养基加入到48板孔中，同时设置阴性对照组和阳性对照组，其中，对照组为不加幽门螺杆菌且不含抗生素液体的培养基，所述的阳性对照组为含有幽门螺杆菌但不含抗生素液体的培养基；

(3)准备待检菌液：收集在哥伦比亚血平板上培养72h的幽门螺杆菌，幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上培养为通过接种环接种幽门螺杆菌于哥伦比亚血平板上，置于37℃微需氧环境中培养72h，用所述的含抗生素液体培养基将其浓度调至0.5×10⁸CFU/mL，加入到步骤(2)配制的幽门螺杆菌药敏板孔中，放置在37℃微需氧环境中转速90rpm下摇瓶培养50小时，所述的微需氧环境为含有5％氧气、85％氮气和10％二氧化碳；

(4)检测：利用酶标仪测定待检菌液的OD值，初步判定药敏情况；

(5)染色：配制染色液，染色液浓度为0.08％，染色液为NNNN-四甲基对苯二胺二盐酸盐，每个药敏板孔中加入50μL染色液染色1.2min，加入到每个待检菌液药敏板孔中染色，根据染色情况判定药敏情况，染色为蓝色则表示有菌生长，与阴性对照组颜色一致则表示无菌生长，即敏感。

实施例3

一种幽门螺杆菌药敏检测方法，包括如下步骤：

(1)含抗生素液体培养基制备：将抗生素原液倍比稀释，稀释为5120ug/mL、2560ug/mL、1280ug/mL、640ug/mL、320ug/mL、160ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL，分别取每个稀释浓度的抗生素1mL，加入到15mL BD管中，每个BD管中加入9mL布鲁氏培养基，布鲁氏培养基中含有12％的胎牛血清，混合均匀，得到含抗生素液体培养基：

(3)准备待检菌液：收集在哥伦比亚血平板上培养72h的幽门螺杆菌，幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上培养为通过接种环接种幽门螺杆菌于哥伦比亚血平板上，置于37℃微需氧环境中培养72h，用所述的含抗生素液体培养基将其浓度调至0.75×10⁸CFU/mL，加入到步骤(2)配制的幽门螺杆菌药敏板孔中，放置在37℃微需氧环境中转速110rpm下摇瓶培养46小时，所述的微需氧环境为含有5％氧气、85％氮气和10％二氧化碳；

(4)检测：利用酶标仪测定待检菌液的OD值，初步判断药敏情况；

(5)染色：配制染色液，染色液浓度为0.12％，染色液为NNNN-四甲基对苯二胺二盐酸盐，每个药敏板孔中加入50μL染色液染色0.8min，加入到每个待检菌液药敏板孔中染色，根据染色情况判定药敏情况，染色为蓝色则表示有菌生长，与阴性对照组颜色一致则表示无菌生长，即敏感。

本发明人也对其他实施例做了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。

试验例1

采用琼脂糖稀释法和实施例1的药敏检测方法获得24株幽门螺杆菌克拉霉素(CLR)和左氧氟沙星(LEV)的药敏结果，其中CLR和LEV的MIC>1判断为耐药，用R表示；其MIC≤1为敏感，用S表示，具体结果见表2。并对两种抗菌药物的药敏结果进行了一致性分析，其中CLR有一株菌株，左氧氟沙星有3株菌株药敏结果与金标准不同，其一致性较高，且本发明的方法操作简便，而且药敏结果检测已实现半自动化。

表2

注：表中R表示抗生素耐药，S表示抗生素敏感；1代表药敏结果一致，0代表药敏结果不一致。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种非诊断目的的幽门螺杆菌药敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)含抗生素液体培养基制备：将抗生素原液倍比稀释，抗生素原液倍比稀释为5120ug/mL、2560ug/mL、1280ug/mL、640ug/mL、320ug/mL、160ug/mL、80ug/mL、40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL，分别取每个稀释浓度的抗生素1mL，加入到15mL BD管中，每个BD管中加入9mL布鲁氏培养基，布鲁氏培养基中含有10％的胎牛血清，混合均匀，得到含抗生素液体培养基：

(3)准备待检菌液：收集在哥伦比亚血平板上培养72h的幽门螺杆菌，用所述的含抗生素液体培养基将其浓度调至0.5×10⁸～1×10⁸CFU/mL，加入到步骤(2)配制的幽门螺杆菌药敏板孔中，放置在37℃微需氧环境中培养，培养为在转速90-110rpm下摇瓶培养46-50小时；

(4)检测：测定待检菌液的OD₆₀₀值，初步判定药敏情况；待检菌液的OD₆₀₀值-阴性对照组OD₆₀₀值＜0.05，则表示无菌生长，即敏感；

(5)染色：配制染色液，染色液浓度为0.08-0.12％，染色液为NNNN-四甲基对苯二胺二盐酸盐，加入到每个待检菌液药敏板孔中染色，每个药敏板孔中加入50μL染色液染色0.8-1.2min，根据染色情况判定药敏情况；染色为蓝色则表示有菌生长，与阴性对照组颜色一致则表示无菌生长，即敏感；

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的幽门螺杆菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(2)中阴性对照组为不加幽门螺杆菌且不含抗生素液体的培养基，所述的阳性对照组为含有幽门螺杆菌但不含抗生素液体的培养基。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的的幽门螺杆菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(3)中幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上培养为通过接种环接种幽门螺杆菌于哥伦比亚血平板上，置于37℃微需氧环境中培养72h。

4.根据权利要求1或3所述的非诊断目的的幽门螺杆菌药敏检测方法，其特征在于，所述的微需氧环境为含有5％氧气、85％氮气和10％二氧化碳。