CN114836513B - 一种改良群体分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物敏感性检测技术领域，公开了一种改良群体分析方法检测异质性耐药。本发明配置含有梯度抗菌药物的琼脂平板，药敏折点的药物浓度配置2倍数量平板；将实验菌株复苏后制备菌悬液，菌液比浊到0.5后再进行稀释获得两种稀释度的菌悬液；将高浓度菌液涂布在包含药敏折点及以上的浓度，将稀释的菌液涂布在包含药敏折点及以下的浓度，孵育过夜计数菌落；将平板上菌落数按抗菌药物浓度从低到高排列，实现细菌计数及结果判读。本发明提供的改良群体分析方法操作简单，经过步骤的简化，既不影响结果判读，也不影响准确性，却能大大降低PAP工作量。

Description

一种改良群体分析方法
技术领域
本发明属于药物敏感性检测技术领域，尤其涉及一种改良群体分析方法。
背景技术
目前细菌异质性耐药(heteroresistance，HR)是指细菌对抗菌药物发生耐药性群体变异，其中分离菌中不同亚群对特定抗菌药物表现出不同的敏感性和耐药性。其判断标准为耐药亚群的MIC值较不影响主要敏感菌群生长的药物最高浓度高8倍以上。
细菌异质性耐药检测的金标准是群体分析法(Population profile analysis，PAP)，其它方法包括Etest、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法等，但是存在一定的假阴性和假阳性，尤其是假阴性率高，导致很高比例的异质性耐药被漏检；而在开发中的新的基因型测试(例如液滴数字PCR、全基因组测序或线性探针测定)对异质性耐药的检测依赖对耐药性涉及的基因和突变的全面了解，因此尚不能应用于所有病原体和抗菌药物。而PAP方法本身比较繁琐，工作量巨大，不仅无法在临床实验室开展，在实验室条件下也难以对大量的菌株进行检测。方法学的限制极大地阻碍了对细菌异质性耐药的研究开展，亟需对细菌异质性耐药检测方法进行改进，既保证准确性，也能大大降低工作量。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的异质性耐药检测方法或者工作量巨大，或者准确性低，使实验室开展异质性耐药的检测及研究受阻。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改良群体分析方法。
本发明是这样实现的，一种改良群体分析方法，所述改良群体分析方法包括以下步骤：
步骤一，平板配置：配置含有梯度抗菌药物的琼脂平板，药敏折点的药物浓度配置2倍数量平板；
步骤二，菌株复苏：将实验菌株接种于琼脂平板上，恒温孵育过夜；
步骤三，菌液制备及稀释：将单菌落接种孵育，利用肉汤稀释制备及稀释获得两种稀释度的菌悬液；
步骤四，菌液涂布：将高浓度菌液涂布在包含药敏折点及以上的浓度，将稀释的菌液涂布在包含药敏折点及以下的浓度，孵育过夜计数菌落；
步骤五，细菌计数及结果判读：将平板上菌落数按抗菌药物浓度从低到高排列。
进一步，所述步骤一中的配置含有梯度抗菌药物的琼脂平板包括：
称取若干份MH琼脂干粉，分别加入若干瓶含1L蒸馏水的锥形瓶中，高压灭菌后分别加入抗菌药物母液，分别配置不同抗菌药物浓度的平板，凝固后备用，其中药敏折点的抗菌药物浓度的平板配置2倍数量。
进一步，所述步骤二中的菌株复苏包括：
将微量肉汤稀释法(Broth microdilution，BMD)鉴定为敏感的实验菌株接种于固体培养基上，孵育过夜。
进一步，所述步骤三中的菌液制备及稀释包括：
挑取经步骤二过夜培养后的单菌落，接种到含有肉汤的试管中，置于恒温振荡培养箱振荡孵育过夜；使用比浊仪将实验菌株用肉汤进行稀释，比浊至0.5麦氏单位；将比浊至0.5麦氏单位的菌悬液用肉汤进行1：105稀释；每个实验菌株分别获得两种浓度的菌液。
进一步，所述0.5麦氏单位相当于108菌落形成单位(colony forming units，CFU)/ml，所述菌悬液用肉汤进行1：105(V/V)稀释后的含菌量为103CFU/ml。
进一步，所述步骤四中的菌液涂布包括：
将每个菌株所制备的第一种稀释度的菌液(108CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度抗菌药物的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点及以上的浓度。
将每个菌株所制备的第二种稀释度的菌液(103CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度抗菌药物的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点及以下的浓度。
置于恒温培养箱孵育过夜后计数各平板上所生长菌落。
进一步，所述步骤五中的细菌计数及结果判读包括：
第一个细菌稀释度上涂布的含梯度抗菌药物的平板上生长的菌落数，按照抗菌药物的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个抗菌药物浓度为最高抑菌浓度。
第二个细菌稀释度涂布上的含梯度抗菌药物的平板上生长的菌落数，按照抗菌药物的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个抗菌药物浓度为最高非抑菌浓度。
进一步，最高的抑菌浓度与最高的非抑菌浓度之间的差距≥8。
上述实验进行三重复。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
PAP法是异质性耐药鉴定的金标准，在经典的PAP方法中，将不同稀释度的细菌群体加入到梯度抗菌药物浓度中(在平板上或在液体培养基中)，细菌在每一个浓度的生长被定量。
本发明改良后只设置两个细菌接种量，最高接种浓度约为108CFU/ml，每个抗菌药物平板上涂布的菌量为100μL(约为107CFU)，通过统计高细菌接种量不同抗菌药物浓度平板上的菌落计数，可获得抗菌药物显示对生长抑制作用最大的最低抑菌浓度(浓度1)。低接种浓度约为103CFU/ml，每个抗菌药物平板上涂布的菌量为100μL(约为102CFU)，不含抗菌药物(浓度为0μg/ml)平板上对应的菌落数约为100个，菌落计数较为准确，通过低细菌接种量不同抗菌药物浓度平板上的菌落计数统计，可获得最高的非抑菌浓度(浓度2)。根据异质性耐药的定义，浓度1比浓度2高8倍以上鉴定为异质性耐药。目前文献中采用的PAP均采用不用稀释度的菌液，涂布在不同梯度的抗菌药物平板上。本发明开展前期，菌株均采用13个抗菌药物浓度×6个菌液稀释度，工作量巨大，进展缓慢。后期经过改良，首先只选取比浊到0.5的原液和最大稀释度的菌液，足以确定异质性耐药判断标准中的最高抑菌浓度和最高非抑菌浓度；其次对抗菌药物设置范围进行改良，对于BMD判读为敏感的菌株，比浊0.5的原液只设置包括折点及以上的抗菌药物浓度，该菌浓度在低于折点的抗菌药物平板上由于菌落数过多而难以计数；最大稀释度的菌液只设置包括耐药折点及以下的抗菌药物浓度，该菌浓度在超过折点的抗菌药物平板上无菌落生长。通过此两步简化，既不影响结果判读，也不影响准确性，却能大大降低PAP工作量。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供的改良群体分析方法操作简单，经过步骤的简化，既不影响结果判读，也不影响准确性，却能大大降低PAP工作量。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
国内外目前对异质性耐药的检测多采用作为金标准PAP方法，但该方法繁琐，工作量巨大，无法开展大规模异质性耐药的检测；替代方法Etest、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法等准确性低，导致很高比例的异质性耐药漏检；而在开发中的新的基因型测试对异质性耐药的检测(例如液滴数字PCR、全基因组测序或线性探针测定)依赖对耐药性涉及的基因和突变的全面了解，因此尚不能应用于所有病原体和抗菌药物。而本发明对经典的PAP方法进行改良，简化了步骤，既不影响结果判读，也不影响准确性，却能大大降低PAP工作量。然而便捷且准确的多粘菌素改良群体分析方法对实验研究及临床鉴定至关重要，是其它相关研究开展的基础。
(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
对细菌异质性耐药的研究首先要进行异质性耐药的检测，而异质性耐药的检测不同于传统的药敏检测方法，需要分析细菌群体中的不同亚群的作用，作为金标准的经典的PAP法本身比较繁琐，工作量巨大，在实验室条件下也导致难以对大量的菌株进行检测。其它各种改良方法都不同程度上以牺牲检测的准确性为代价，而本发明对经典的PAP方法进行改良，简化了步骤，既不影响结果判读，能获得用于异质性耐药鉴定的最高抑菌浓度和最高的非抑菌浓度，并能绘制菌落数与抗菌药物浓度相互作用的曲线图，不影响准确性的同时大大降低PAP工作量，是实验室开展大批量的异质性耐药检测及研究成为可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的28株HR CRKP菌株的多粘菌素E PAP结果示意图；
图2是本发明实施例提供的28株HR CRKP菌株的多粘菌素E PAP结果分布示意图；
图3是本发明实施例提供的改良群体分析方法流程图；
图4是本发明实施例提供的PAP方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改良群体分析方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图3所示，本发明实施例提供的改良群体分析方法包括以下步骤：
S101，平板配置：配置含有梯度多粘菌素E的琼脂平板；
S102，菌株复苏：将CRKP实验菌株接种于显色培养基上，恒温孵育过夜；
S103，菌液制备及稀释：将单菌落接种孵育，利用CAMHB稀释；
S104，菌液涂布：将菌液涂布在含多粘菌素E的平板上，孵育过夜；
S105，细菌计数及结果判读：将平板上菌落数按多粘菌素E浓度从低到高排列。
实施例：使用改良群体分析法进行CRKP对多粘菌素异质性耐药的检测
实例背景：
临床上碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiellapneumonia，CRKP)感染的致死率高，多粘菌素仍是目前治疗CRKP感染的关键药物。而有研究表明多粘菌素异质性耐药可导致多粘菌素临床治疗的失败，对多粘菌素作为治疗CRKP感染的最后一道防线提出了严峻挑战。对多粘菌素异质性耐药的研究首先要进行异质性耐药的检测，本实例利用改良PAP法对临床上分离的36株CRKP进行多粘菌素E异质性耐药的检测。
1、配置含有梯度多粘菌素E的琼脂平板
分别配置不同多粘菌素E浓度的MH平板，所述多粘菌素E的终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、32、64μg/ml共13个浓度，其中2μg/ml浓度多粘菌素E的平板配置2倍的数量。2μg/ml为欧洲药敏试验委员会(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing，EUCAST)标准中肠杆菌科细菌对多粘菌素E的药敏折点(≤2μg/ml敏感，＞2μg/ml耐药)，后续步骤4中2μg/ml多粘菌素E平板上需要涂布两种稀释度的菌液。
2、菌株复苏
将36株微量肉汤稀释法(Broth microdilution，BMD)鉴定为敏感的CRKP实验菌株接种于尿道显色培养基上，置于37℃恒温培养箱中孵育过夜。本实例仅选取BMD方法鉴定为敏感即MIC≤2μg/ml多粘菌素E的CRKP，因为临床上对于BMD鉴定为多粘菌素敏感的CRKP，多粘菌素是有限的选择之一。且2019年Andersson等建议更新El-Halfawy和Valvano提出的异质性耐药定义，将异质性耐药表型限定在细菌主要群体表型为敏感的范围内。
3、菌液制备及稀释
挑取上述过夜培养后的单菌落接种到CAMH肉汤(Cation-Adjusted MuellerHinton Broth，CAMHB)中振荡孵育过夜。使用比浊仪将36株CRKP用CAMHB比浊至0.5麦氏单位；将比浊至0.5麦氏单位的菌悬液用CAMHB进行1：105(V/V)稀释；每个实验菌株分别获得两种浓度的菌液。
进一步，所述0.5麦氏单位的菌液约相当于108CFU/ml，所述菌悬液用CAMHB进行1：105稀释后的含菌量约为103CFU/ml。
4、菌液涂布
将每个菌株所制备的第一种稀释度的菌液(108CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度多粘菌素E的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点(2μg/ml)及以上的浓度，即2、4、6、8、12、16、32、64μg/ml。
将每个菌株所制备的第二种稀释度的菌液(108CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度多粘菌素E的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点(2μg/ml)及以下的浓度，即0、0.125、0.25、0.5、1、2μg/ml。
该步对抗菌药物设置范围进行改良，对于BMD判读为敏感的菌株，比浊0.5的原液只设置包括折点及以上的抗菌药物浓度，该菌浓度在低于折点的抗菌药物平板上由于菌落数过多而难以计数；而最大稀释度的菌液只设置包括耐药折点及以下的抗菌药物浓度，该菌浓度在超过折点的抗菌药物平板上无菌落生长。
置于恒温培养箱孵育过夜后计数各平板上所生长菌落。
5、细菌计数及结果判读
第一个细菌稀释度上涂布的含梯度多粘菌素E的平板上生长的菌落数，按照多粘菌素E的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个多粘菌素E浓度为最高抑菌浓度。
第二个细菌稀释度涂布的含梯度多粘菌素E的平板上生长的菌落数，按照多粘菌素E的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个多粘菌素浓度为最高非抑菌浓度。
进一步，最高的抑菌浓度与最高的非抑菌浓度之间的差距≥8，该细菌即有异质性，且当最高抑菌浓度≥4μg/ml时，该细菌即判断为异质性耐药(heteroresistance)。
本发明实施例提供的PAP方法示意图如图4所示。
PAP法是异质性耐药鉴定的金标准，在这个方法中，将不同稀释度的细菌群体加入到梯度抗菌药物浓度中(在平板上或在液体培养基中)，细菌在每一个浓度的生长被定量。
改良的PAP实验只设置两个细菌接种量，最高接种浓度约为108CFU/ml，每个多粘菌素E平板上涂布的菌量为100μL(约为107CFU)，通过统计高细菌接种量不同多粘菌素E浓度平板上的菌落计数，可获得多粘菌素E显示对生长抑制作用最大的最低抑菌浓度(浓度1)。低接种浓度约为103CFU/ml，每个多粘菌素E平板上涂布的菌量为100μL(约为102CFU)，不含多粘菌素E(浓度为0μg/ml)平板上对应的菌落数约为100个，菌落计数较为准确，通过低细菌接种量不同多粘菌素E浓度平板上的菌落计数统计，可获得最高的非抑菌浓度(浓度2)。根据异质性耐药的定义，浓度1比浓度2高8倍以上鉴定为异质性耐药。目前文献中采用的PAP均采用不用稀释度的菌液，涂布在不同梯度的抗菌药物平板上。本研究开展前期，菌株均采用13个多粘菌素E浓度×6个菌液稀释度，工作量巨大，进展缓慢。后期经过改良，首先只选取比浊到0.5的原液和最大稀释度的菌液，足以确定异质性耐药判断标准中的最高抑菌浓度和最高非抑菌浓度；其次对抗菌药物设置范围进行改良，对于BMD判读为敏感的菌株，比浊0.5的原液只设置包括折点及以上的抗菌药物浓度，该菌浓度在低于折点的抗菌药物平板上由于菌落数过多而难以计数；最大稀释度的菌液只设置包括耐药折点及以下的抗菌药物浓度，该菌浓度在超过折点的抗菌药物平板上无菌落生长。通过此两步简化，既不影响结果判读，也不影响准确性，却能大大降低PAP工作量。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
步骤一，平板配置：配置含有梯度多粘菌素E的琼脂平板，2μg/ml的浓度配置2倍数量平板；
步骤二，菌株复苏：将实验菌株接种于显色培养基上，恒温孵育过夜；
步骤三，菌液制备及稀释：利用肉汤稀释比浊稀释，获得两种稀释度的菌悬液；
步骤四，菌液涂布：将高浓度菌液涂布在包含2μg/ml及以上浓度，将稀释的菌液涂布在包含2μg/ml及以下浓度，孵育过夜计数菌落；
步骤五，细菌计数及结果判读：将平板上菌落数按多粘菌素E浓度从低到高排列，进行结果判读。
进一步，所述步骤一中的配置含有梯度多粘菌素E的琼脂平板包括：
称取14份42g的MH琼脂干粉，分别加入14瓶含1L蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀后于121℃高压灭菌15min，灭菌后取出放入54℃水浴锅中；平衡至少0.5h后，分别加入多粘菌素E母液，分别配置不同多粘菌素E浓度的平板，凝固后备用。所述多粘菌素E的终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、32、64μg/ml，其中2μg/ml浓度多粘菌素E的平板配置2瓶。
进一步，所述步骤二中的菌株复苏包括：
将36株保存于-80℃甘油肉汤中的BMD鉴定为敏感的CRKP实验菌株接种于尿道显色培养基上，置于37℃恒温培养箱中孵育过夜。
进一步，所述步骤三中的菌液制备及稀释包括：
挑取经步骤二过夜培养后的单菌落，接种到含有2ml CAMHB的15ml试管中，置于恒温振荡培养箱，37℃180rpm振荡孵育过夜；使用比浊仪将36株CRKP用CAMHB进行稀释，比浊至0.5麦氏单位；将比浊至0.5麦氏单位的菌悬液用CAMHB进行1：105(V/V)稀释；每个实验菌株分别获得两种浓度的菌液。
进一步，所述0.5麦氏单位的菌液约相当于108CFU/ml，所述菌悬液用CAMHB进行1：105稀释后的含菌量约为103CFU/ml。
进一步，所述步骤四中的菌液涂布包括：
将每个菌株所制备的第一种稀释度的菌液(108CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度多粘菌素E的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点(2μg/ml)及以上的浓度，包括2、4、6、8、12、16、32、64μg/ml。
将每个菌株所制备的第二种稀释度的菌液(108CFU/ml)取100μL均匀涂布在含不同浓度多粘菌素E的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点(2μg/ml)及以下的浓度，包括0、0.125、0.25、0.5、1、2μg/ml。
置于恒温培养箱，37℃孵育过夜后计数各平板上所生长菌落。
进一步，所述步骤五中的细菌计数及结果判读包括：
第一个细菌稀释度上涂布的含梯度多粘菌素E的平板上生长的菌落数，按照多粘菌素E的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个多粘菌素E浓度为最高抑菌浓度。
第二个细菌稀释度涂布的含梯度多粘菌素E的平板上生长的菌落数，按照多粘菌素E的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个多粘菌素浓度为最高非抑菌浓度。
进一步，最高的抑菌浓度与最高的非抑菌浓度之间的差距≥8，该细菌即有异质性，且当最高抑菌浓度≥4μg/ml时，该细菌即判断为异质性耐药(heteroresistance)。上述实验进行三重复。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
采用改良后的PAP进行异质性耐药的鉴定，36株BMD鉴定为多粘菌素E敏感的CRKP分离株中有28株表现为异质性耐药，8株表现为敏感，异质性耐药的比例为77.8％。
虽然用BMD法测得多粘菌素E对28株HR CRKP的MIC范围仅为0.5-2μg/ml(MIC50＝1μg/ml)(未提供)，却均能在4μg/ml的多粘菌素E平板上生长，随着多粘菌素E平板浓度的增加，有些菌呈现完全抑制，不能在高浓度多粘菌素E平板上生长，有8株菌的耐药亚群可在高达64μg/ml的多粘菌素E平板上生长(见图2)。另外8株多粘菌素E敏感CRKP不能在比2μg/ml更高的多粘菌素E平板上生长。
在28株HR CRKP株中能够在4μg/ml多粘菌素E平板上生长的耐药亚群比例的数量级为0.00001到0.0000001(1.09×10-5至3.81×10-7)；随着多粘菌素E浓度的增加，耐药亚群比例逐渐降低，8μg/ml多粘菌素E平板上生长的耐药亚群比例的数量级只有为0.0000001到0.00000001(5.59×10-6至1.00×10-8)；64μg/ml多粘菌素E平板上生长的耐药亚群比例的数量级只有为0.0000001到0.00000001(1.14×10-7至1.00×10-8)。
经过改良的PAP方法同样能够鉴定多粘菌素异质性耐药，获得最低的抑菌浓度和最低的非抑菌浓度两个用于判读是否异质性耐药的关键浓度，而且可以获得CRKP在高于4μg/ml多粘菌素E平板上生长的具体菌落数，可以进行菌株间耐药亚群数量和比例的比较及与其它研究间的比较，既不影响准确性，也不损失关键的信息。针对多粘菌素异质性耐药的研究，经典的PAP通常设置包括108、107、106、105、104、103在内的6种细菌稀释度，而本发明改良后，工作量至少降低了3/2，而且对于BMD法已经鉴定为敏感的实验菌株，两种细菌浓度以药敏折点为临界点分别只涂布约一半抗菌药物浓度的平板，进一步降低了工作量，使工作量减少至约1/6，同时又不影响准确性及重要信息。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种改良群体分析方法，其特征在于，所述改良群体分析方法为非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：
步骤一，平板配置：配置含有梯度抗菌药物的琼脂平板，药敏折点的药物浓度配置2倍数量平板；
步骤二，菌株复苏：将实验菌株接种于琼脂平板上，恒温孵育过夜；
步骤三，菌液制备及稀释：将单菌落接种孵育，利用肉汤稀释制备及稀释获得两种稀释度的菌悬液；
步骤四，菌液涂布：将高浓度菌液涂布在包含药敏折点及以上的浓度，将稀释的菌液涂布在包含药敏折点及以下的浓度，孵育过夜计数菌落；
步骤五，细菌计数及结果判读：将平板上菌落数按抗菌药物浓度从低到高排列，进行结果判读；
所述步骤一为：配置含有梯度多粘菌素E的琼脂平板，药敏折点的抗菌药物浓度的平板配置2倍数量；
所述步骤三中的菌液制备及稀释包括：使用比浊仪将实验菌株用肉汤进行稀释，比浊至0.5麦氏单位；将比浊至0.5麦氏单位的菌悬液用肉汤进行1：105稀释；每个实验菌株分别获得两种浓度的菌液；其中，所述0.5麦氏单位相当于108CFU/ml，所述菌悬液用肉汤进行1：105稀释后的含菌量为103CFU/ml。
2.如权利要求1所述的改良群体分析方法，其特征在于，所述步骤四中的菌液涂布包括：
将每个菌株所制备的第一种稀释度108CFU/ml的菌液取100μL均匀涂布在含不同浓度抗菌药物的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点及以上的浓度；
将每个菌株所制备的第二种稀释度103CFU/ml的菌液取100μL均匀涂布在含不同浓度抗菌药物的平板上，所涂布的浓度包括药敏折点及以下的浓度。
3.如权利要求1所述的改良群体分析方法，其特征在于，所述步骤五中的细菌计数及结果判读包括：
第一个细菌稀释度上涂布的含梯度抗菌药物的平板上生长的菌落数，按照抗菌药物的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的上一个抗菌药物浓度为最高抑菌浓度；
第二个细菌稀释度涂布上的含梯度抗菌药物的平板上生长的菌落数，按照抗菌药物的浓度从低到高排列，菌落数显著降低的平板所对应的更低一个多粘菌素E浓度为最高非抑菌浓度；
其中，最高的抑菌浓度与最高的非抑菌浓度之间的差距≥8。
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