CN112760358B - 一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板 - Google Patents

一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板 Download PDF

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Abstract

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板。所述显色平板包含特异性显色底物和选择性培养基；其中，所述选择性培养基，包括以下组分：酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E。该显色平板可用于临床耐碳青霉烯类抗生素耐药菌株的快速筛查，且准确率较高。

Description

一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板。
背景技术
肠杆菌科细菌属于革兰阴性杆菌，包括大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌等，常存在于人体的上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，可引起全身各器官、组织的感染。
亚胺培南和美罗培南等是临床常用的碳青霉烯类抗生素，因其具有抗菌谱广泛、抗菌活性强、对β-内酰胺酶稳定，以及毒性低等特点，已经成为临床上治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一，曾被认为是对抗ESBLs酶、AmpC酶稳定的β-内酰胺类抗菌药物，但是，随着临床上使用碳青霉烯类抗生素的增加，碳青霉烯类抗生素耐药的细菌也不断增加。碳青霉烯酶的出现及迅速传播，导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，几乎突破了临床抗感染治疗的最后一道防线。尤其是人们生活中普遍存在的大肠菌群被发现可携带耐药基因blaNDM-1，有报道指出blaNDM-1基因常与其他β-内酰胺酶基因共存于细菌可转移的基因元件上，使多重耐药性广泛传播，导致携带该类基因的细菌成为全球公共卫生威胁。
用于检测大肠菌群的方法有很多，主要依靠常规的细菌学培养方法、免疫学方法、核酸探针技术等。细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，一般需4到7天，操作繁琐、费时耗力并且敏感性低、特异性差，且无法检测受损菌及死菌；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针检测技术中也存在一定的问题，如灵敏度不够高；检测一种菌就需制备一种探针。纸片法也是大肠菌群快速检测常用的方法；但是容易受到待检产品本身性质的影响，造成准确率降低。
因此，开发一种快速、准确的耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)的显色平板，用于临床耐碳青霉烯类抗生素耐药菌株的快速筛查，具有重要的作用。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌(CRE)的筛查显色平板，可用于临床耐碳青霉烯类抗生素耐药菌株的快速筛查。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板，包含特异性显色底物和选择性培养基；其中，所述选择性培养基，包括以下组分：酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E。
优选地，按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：酵母提取物5-10份、水杨苷0.1-2份、阿拉伯胶0.5-2份、柠檬酸钠1-5份、叶酸0.01-0.05份、维生素B1 0.01-0.05份、维生素E 0.01-0.05份。
优选地，所述酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取酵母乳液，恒温自溶，酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
优选地，所述酵母乳液的有效含量为5-10％；
优选地，所述恒温自溶的温度为40-60℃；优选为45℃；
优选地，所述酶解用酶为β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶；
优选地，所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的质量比为1：2-3：1-2；
优选地，所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的总质量为0.05-0.1g/L酵母乳液；
优选地，所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的酶活力分别为5000-20000U/g；
优选地，所述酶解的温度为30-45℃，优选为35℃；
优选地，所述酶解的pH值为5-7，优选为6.5；
优选地，所述自溶过程中还包括加入自溶促进剂，所述促进剂为柠檬酸和氯化钾的混合物；
优选地，所述柠檬酸的用量为酵母乳液的0.05-0.1g/L；
优选地，所述氯化钾的用量为酵母乳液的0.1-0.2g/L。
优选地，所述特异性显色底物为5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
优选地，所述特异性显色底物浓度为0.01-5.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为0.01-5.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
优选地，所述选择性培养基为含碳青霉烯类抗生素的培养基。
优选地，所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南中的一种或多种；
优选地，所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
优选地，所述亚胺培南的有效浓度为0.1-50mg/L；所述美罗培南的有效浓度为0.1-50mg/L；所述厄他培南的有效浓度为0.1-30mg/L。
优选地，所述选择性培养基，还包括以下组分：
蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；
优选地，按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨5-15份、氯化钠5-10份、乳糖1-5份、牛肉浸粉5-10份、琼脂粉10-15份、纯化水1000-1500份。
优选地，按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨5-15份、氯化钠5-10份、乳糖1-5份、牛肉浸粉5-10份、琼脂粉10-15份、纯化水1000-1500份；酵母提取物5-10份、水杨苷0.1-2份、阿拉伯胶0.5-2份、柠檬酸钠1-5份、叶酸0.01-0.05份、维生素B1 0.01-0.05份、维生素E 0.01-0.05份。
本发明的另一目的在于提供所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；配制培养基，
(2)将培养基进行高压灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，混合均匀，分装平板，即可。
优选地，步骤(1)中，所述二甲基甲酰胺或二甲基亚砜的添加量为0.1-0.5ml/L培养基；
优选地，步骤(2)中，所述高压灭菌的压力为0.15-0.25Mpa。
优选地，步骤(3)中，所述过滤使用0.2-0.5μm的滤膜进行；
优选地，步骤(4)中，所述混合的温度为45-50℃。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明旨在使用显色培养基的原理和药敏试验相结合的手段，利用不同细菌具有不同特异性酶的特性人工合成适合于大肠杆菌和大肠菌群的特异性显色底物，当大肠杆菌和大肠菌群细菌在在生长过程中会产生不同的酶，分别作用于显色底物，将显色底物分解为发色团和糖类，糖类被细菌利用，而发色团将细菌的菌落染成不同的颜色，同时在培养基中添加碳青霉烯类抗生素，使得培养基中只有具有碳青霉烯酶的细菌才能够生长，而不具有碳青霉烯酶的细菌被抑制。
(2)耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的显色平板，整个检测过程在24小时内完成，即可一步实现分离、鉴定和耐药性检测。
(3)本发明提供的显色平板鉴定耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌具有较好的敏感度和特异性。
(4)酵母提取物制备过程中，氯化钾的加入一方面可以促进酵母的自溶，另一方面可以促进酶的活力。本发明中酵母提取物对细菌检测敏感度具有较大的影响，合理的选择酵母提取物的制备方法对提高细菌检测的灵敏度具有重要的意义。
(5)本发明提供的显色培养基，能够抑制其他无关菌的生长，提高了选择性；同时通过调整培养基中的营养，使一些无关菌因为缺少营养而不能生长，而目标菌的营养在该显色培养基中能被满足，因此能够生长。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取有效含量为6％的酵母乳液，45℃下，加入0.06g/L的柠檬酸和0.15g/L的氯化钾，恒温自溶，加入0.06g/L的质量比为1：3：1的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为6000、6000、10000U/g)，35℃、pH值为6.5下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为3.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为1.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为10mg/L；所述美罗培南的有效浓度为5mg/L；所述厄他培南的有效浓度为10mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、水杨苷1份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠3份、叶酸0.02份、维生素B1 0.03份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加0.3ml/L的二甲基甲酰胺；配制培养基，
(2)将培养基在0.20Mpa压力下进行灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，0.3μm的滤膜进行过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，45℃下混合均匀，分装平板，即可。
实施例2
(1)取有效含量为10％的酵母乳液，40℃下，加入0.05g/L的柠檬酸和0.2g/L的氯化钾，恒温自溶，加入0.05g/L的质量比为1：2：2的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为5000、5000、20000U/g)，30℃、pH值为5下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为0.01g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为5.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为0.1mg/L；所述美罗培南的有效浓度为50mg/L；所述厄他培南的有效浓度为0.1mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨5份、氯化钠10份、乳糖1份、牛肉浸粉10份、琼脂粉10份、纯化水1500份；酵母提取物5份、水杨苷2份、阿拉伯胶0.5份、柠檬酸钠5份、叶酸0.01份、维生素B1 0.01份、维生素E 0.05份。
所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加0.1ml/L的二甲基亚砜；配制培养基，
(2)将培养基在0.15Mpa压力下进行灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，0.5μm的滤膜进行过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，50℃下混合均匀，分装平板，即可。
实施例3
(1)取有效含量为5％的酵母乳液，60℃下，加入0.1g/L的柠檬酸和0.1g/L的氯化钾，恒温自溶，加入0.1g/L的质量比为1：3：1的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为6000、5000、8000U/g)，45℃、pH值为7下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为5.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为0.01g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为50mg/L；所述美罗培南的有效浓度为0.1mg/L；所述厄他培南的有效浓度为30mg/L。
优选地，按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨15份、氯化钠5份、乳糖5份、牛肉浸粉5份、琼脂粉15份、纯化水1000份；酵母提取物10份、水杨苷0.1份、阿拉伯胶2份、柠檬酸钠1份、叶酸0.05份、维生素B1 0.05份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加0.5ml/L的二甲基甲酰胺；配制培养基，
(2)将培养基在0.25Mpa压力下进行灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，0.2μm的滤膜进行过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，45℃下混合均匀，分装平板，即可。
对比例1
与实施例1相比，区别在于酵母提取物的制备方法不同。
一种酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取有效含量为6％的酵母乳液，45℃下，恒温自溶，加入0.06g/L的质量比为1：3：1的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为6000、6000、10000U/g)，35℃、pH值为6.5下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为3.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为1.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为10mg/L；所述美罗培南的有效浓度为5mg/L；所述厄他培南的有效浓度为10mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、水杨苷1份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠3份、叶酸0.02份、维生素B1 0.03份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，步骤同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别在于酵母提取物的制备方法不同。
一种酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取有效含量为6％的酵母乳液，45℃下，加入0.06g/L的柠檬酸，恒温自溶，加入0.06g/L的质量比为1：3：1的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为6000、6000、10000U/g)，35℃、pH值为6.5下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为3.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为1.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为10mg/L；所述美罗培南的有效浓度为5mg/L；所述厄他培南的有效浓度为10mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、水杨苷1份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠3份、叶酸0.02份、维生素B1 0.03份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，步骤同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别在于酵母提取物的制备方法不同。
一种酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取有效含量为6％的酵母乳液，45℃下，加入0.15g/L的氯化钾，恒温自溶，加入0.06g/L的质量比为1：3：1的β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶(酶活力分别为6000、6000、10000U/g)，35℃、pH值为6.5下酶解；制得酶解液；
(2)取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液。
所述特异性显色底物浓度为3.00g/L的5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和浓度为1.00g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为10mg/L；所述美罗培南的有效浓度为5mg/L；所述厄他培南的有效浓度为10mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、水杨苷1份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠3份、叶酸0.02份、维生素B1 0.03份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，步骤同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别在于选择性培养基组成不同，用柠檬酸钠替换水杨苷。
一种酵母提取物的制备方法，同实施例1。
所述特异性显色底物同实施例1。
所述的碳青霉烯类抗生素同实施例1。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠4份、叶酸0.02份、维生素B1 0.03份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加0.3ml/L的二甲基甲酰胺；配制培养基，
(2)将培养基在0.20Mpa压力下进行灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，0.3μm的滤膜进行过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，45℃下混合均匀，分装平板，即可。
对比例5
与实施例1相比，区别在于选择性培养基组成不同，用维生素B1替换叶酸。
一种酵母提取物的制备方法，同实施例1。
所述特异性显色底物同实施例1。
所述的碳青霉烯类抗生素同实施例1。
按照重量份数计，所述选择性培养基，包括以下组分：
蛋白胨10份、氯化钠7份、乳糖4份、牛肉浸粉6份、琼脂粉13份、纯化水1000份；酵母提取物8份、水杨苷1份、阿拉伯胶0.9份、柠檬酸钠3份、维生素B1 0.05份、维生素E 0.01份。
所述显色平板的制备方法，包括以下步骤：
(1)在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加0.3ml/L的二甲基甲酰胺；配制培养基，
(2)将培养基在0.20Mpa压力下进行灭菌；
(3)取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，0.3μm的滤膜进行过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
(4)将抗生素溶液添加到培养基中，45℃下混合均匀，分装平板，即可。
对比例6
与实施例1相比，区别在于碳青霉烯类抗生素的组成不同。
一种酵母提取物的制备方法，同实施例1。
所述特异性显色底物同实施例1。
所述的碳青霉烯类抗生素为亚胺培南和厄他培南的混合物；
其中，所述亚胺培南的有效浓度为15mg/L；所述厄他培南的有效浓度为10mg/L。
按照重量份数计，所述选择性培养基，组成同实施例1。
所述显色平板的制备方法，步骤同实施例1。
效果例
1.显色鉴定
将耐碳青霉烯类抗生素的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分别划线接种于平板，35℃温箱培养18-24小时，观察结果；大肠杆菌生长良好，菌落显紫红色，肺炎克雷伯菌生长良好菌落显蓝色。
2.敏感度和特异度试验
菌株来源为临床病例送检尿液分离标本，经VITEK-2compact全自动细菌鉴定仪及GN鉴定卡鉴定，共207株CRE菌株：分别为肺炎克雷伯菌95株、大肠杆菌112株；86株非CRE菌株：分别为碳青霉烯类抗生素药物敏感的大肠杆菌59株、绿脓杆菌21株、阴沟肠杆菌6株，置于-80℃下冷冻保存。
将冻存的207株CRE菌株和86株非CRE菌株接种于血平板，挑取单个菌落，以生理盐水配置成0.5麦氏浓度的菌悬液，从中分别取10μL的菌悬液接种至实施例1-3和对比例1-6制备的显色平板上，然后将平板置于35℃孵箱培养，24h后观察菌落显色情况。以VITEK-2compact全自动细菌鉴定仪的鉴定结果作为标准，计算实施例1-3及对比例1-6显色平板鉴定大肠杆菌的敏感度和特异度。
敏感度＝生长并显色CRE菌株数/所有CRE菌株数×100％；
特异度＝未生长非CRE菌株数/所有非CRE菌株数×100％。
其中，生长并显色计为阳性，未生长计为阴性。结果见表1。
表1敏感度和特异性参数
Figure BDA0002919346780000121
由此可知，本发明提供显色平板具有较高的敏感度和特异性，能够快速、准确的检测耐碳青霉烯类抗生素的菌株，尤其是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。同时，本发明提供的显色培养基对目标细菌的选择性具有较大的影响，其能够抑制其他无关菌的生长，提高目标菌的选择性；进一步提高了细菌检测的敏感度和特异性。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板，包含特异性显色底物和选择性培养基；其中，所述选择性培养基，由以下组分组成：蛋白胨，氯化钠，乳糖，牛肉浸粉，琼脂粉，纯化水，酵母提取物，水杨苷，阿拉伯胶，柠檬酸钠，二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，叶酸，维生素B1，维生素E和碳青霉烯类抗生素；
按照重量份数计，蛋白胨5-15份、氯化钠5-10份、乳糖1-5份、牛肉浸粉5-10份、琼脂粉10-15份、纯化水1000-1500份；酵母提取物5-10份、水杨苷0.1-2份、阿拉伯胶0.5-2份、柠檬酸钠1-5份、叶酸0.01-0.05份、维生素B1 0.01-0.05份、维生素E 0.01-0.05份；
所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南和厄他培南的混合物；其中，所述亚胺培南的有效浓度为0.1-50mg/L；所述美罗培南的有效浓度为0.1-50mg/L；所述厄他培南的有效浓度为0.1-30mg/L；
所述二甲基甲酰胺或二甲基亚砜的浓度为0.1ml/L-0.5ml/L；
其中，所述酵母提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取酵母乳液，恒温自溶，酶解；制得酶解液；
（2）取酶解液的上清液，减压浓缩，制得酵母提取液；
所述自溶过程中还包括加入自溶促进剂，所述促进剂为柠檬酸和氯化钾的混合物；
所述柠檬酸的用量为酵母乳液的0.05-0.1g/L；所述氯化钾的用量为酵母乳液的0.1-0.2g/L；所述酶解用酶为β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶。
2.如权利要求1所述的耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板，其特征在于，所述恒温自溶的温度为40-60℃；
所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的质量比为1：2-3：1-2；所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的总质量为0.05-0.1g/L 酵母乳液；所述β-木糖苷酶、木瓜酶和葡聚糖酶的酶活力分别为5000-20000U/g；所述酶解的温度为30-45℃；所述酶解的pH值为5-7。
3.如权利要求1所述的耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板，其特征在于，所述恒温自溶的温度为45℃；所述酶解的温度为35℃；所述酶解的pH值为6.5。
4.如权利要求1所述的耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板，其特征在于，
所述特异性显色底物为5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷；
其中，5-溴-6-氯3-吲哚-β葡萄糖苷的浓度为0.01-5.00g/L，5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷的浓度为0.01-5.00 g/L。
5.如权利要求1所述的耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板的制备方法，包括以下步骤：
（1）在纯化水中加入蛋白胨、氯化钠、乳糖、牛肉浸粉、琼脂粉、纯化水；酵母提取物、水杨苷、阿拉伯胶、柠檬酸钠、叶酸、维生素B1、维生素E，加入显色底物，再添加二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；配制培养基，
（2）将培养基进行高压灭菌；
（3）取碳青霉烯类抗生素，加纯化水溶解，过滤除碳青霉烯类抗生素菌，制得抗生素溶液；
（4）将抗生素溶液添加到培养基中，混合均匀，分装平板，即可。
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