JP5086246B2 - ビブリオ菌用反応媒体 - Google Patents

Description

本発明はビブリオ菌検出用の培養基に関する。さらに本発明は、この媒体の使用、及び、ビブリオ菌の識別方法にも関する。

コレラは、グラム陰性杆菌コレラ菌による伝染性の高い下痢疾患である。同様に、腸炎ビブリオは急性胃腸炎を引き起こす。これらの疾患の原因である細菌株は、汚染された水又は食糧から経口的に伝染する。これらの疾患は伝染性であるため、これらの細菌を、汚染された患者及び食糧や水等の環境中において、頻繁に検出する必要がある。

ビブリオ菌の検出に現在使用されている参照媒体は、ＴＣＢＳ（チオ硫酸塩、クエン酸塩、胆汁酸塩、ショ糖）媒体である。ＴＣＢＳ寒天は、病原性ビブリオ菌（標準ＮＦ ＩＳＯ ８９１４及び世界保健機構の推薦）の探索及び分離の際に推薦される選択媒体である。胆汁及びクエン酸塩が高濃度であり、さらにｐＨが高い（ｐＨ＝８．６）と、多くの細菌を除去することが可能である。主要な炭素源はショ糖である。ショ糖を使用するとｐＨが下がり、ｐＨ指示薬の色が緑色から黄色に変わる。従って、いくつかのビブリオ菌種、特にコレラ菌等のショ糖陽性コロニーは、黄色を呈する。腸炎ビブリオ等のショ糖陰性コロニーは緑色を呈する。しかし、この媒体の感度はそれほど高くなく、特異性もあまり高くないため、偽陽性が度々検出される（すなわち、実際はビブリオ菌ではない細菌が検出され、ビブリオ菌であると判断される）。

また、ＣＨＲＯＭａｇａｒビブリオ菌媒体もある。この選択的発色性媒体は、腸炎ビブリオ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びコレラ菌と他のビブリオ菌種とを区別することが可能である。腸炎ビブリオは紫色のコロニーの形を呈し、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びコレラ菌は青いコロニーを形成するが、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ等の他の種は無色のコロニーを形成する。この媒体は粉末の形態である。この媒体の原理は、腸炎ビブリオに特異的なβ−グルコシダーゼ活性と、コレラ菌及びＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓに特異的なβ−ガラクトシダーゼ活性との、高濃度のショ糖の存在下における同時検出に基づく。しかしこの媒体は、偽陽性と識別される種の他に、コレラ菌の検出に対してもやや感度がある。

本発明は、コレラ群ビブリオ菌（コレラ菌／ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びｍｉｍｉｃｕｓ）及び腸炎ビブリオの分離及び識別用の、感度がありかつ特異的な培養基を提供することにより、従来技術の欠点を解決するものである。

この点で、本発明は、以下を含む、コレラ群細菌（コレラ菌／ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びｍｉｍｉｃｕｓ）及び腸炎ビブリオ細菌用の反応媒体に関する：
・β−ガラクトシダーゼ酵素活性検出用の基質、
・糖、
・着色標識。

本発明の目的について、用語「反応媒体」は、微生物の生存及び／又は増殖に必要な要素をすべて含む媒体を意味するものである。

この反応媒体は、視覚化用の媒体としてのみ使用してもよいし、培養基及び視覚化用の媒体の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が培養基でもある。

反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形媒体」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。この媒体はゲル化媒体からなることが好ましい。微生物を培養するために微生物学において従来から使用されるゲル化剤は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースを使用することもできる。例えば、コロンビア寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ）、トリプカーゼ大豆寒天（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ａｇａｒ）、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。

本発明による培養基は、例えばペプトン、１つ以上の増殖因子、炭水化物、１つ以上の選択的な薬剤、緩衝液、１つ以上のゲル化剤等の、他の任意の添加物を含んでいてもよい。
この培養基は、液体、又は、調製済みのゲル、すなわちチューブ若しくはフラスコ又はペトリ皿内で接種可能な形態であってよい。培養基がフラスコ中にある場合には、ペトリ皿中に注ぐ前に、媒体をあらかじめ再生しておく（１００℃を通す）ことが好ましい。本発明による媒体は、選択媒体、すなわち、検出対象である細菌及び酵母の増殖阻害剤を含む媒体であることが好ましい。

本発明の目的について、基質は、加水分解により、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を直接又は間接的に検出可能な物質となり得る任意の基質から選択される。好ましくは、この基質は以下を含む：
・明らかにしたい酵素活性に対して特異的な第一の部分（この第一の部分は、対象微生物に特異的な上記酵素と相互作用することができる）、
・蛍光性であっても発色性であってもよい、標識として作用する、第二の部分（以下、標識部分と呼ぶ）。

蛍光性基質としては、特に、ウンベリフェロン又はアミノクマリンに基づく基質、レソルフィンに基づく基質、又は、フルオレセインに基づく基質からできていてもよい。

本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。

反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０１〜２ｇ／ｌ、有利には０．０７５ｇ／ｌである。というのは、この基質濃度である場合には着色のコントラストが良好だからである。

本発明の好ましい実施形態によれば、上記基質はＸ−β−ガラクトシダーゼ発色性基質である（Ｘは標識部分を表す）。好ましくは、使用される基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである。好ましくは、この基質は、濃度０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜１．１５ｇ／ｌでし媒体中に含まれる。本発明の別の実施形態によれば、基質は、コレラ菌の検出に感度がある、ＲｅｄＡ−β−ガラクトシダーゼ、Ｍａｇｅｎｔａ−β−ガラクトシダーゼ、ＧｒｅｅｎＡ−β−ガラクトシダーゼ、Ｒｏｓｅ−β−ガラクトシダーゼ及びアリザリン−β−ガラクトシダーゼ等のβ−ガラクトシダーゼ基質から選択できる。

本発明の好ましい実施形態によれば、糖はＬ−アラビノースである。好ましくは、この糖は、濃度１〜３０ｇ／ｌ、好ましくは５〜１５ｇ／ｌで媒体中に含まれる。好ましくは、この濃度は約８ｇ／ｌである。また、糖は次の糖から選択できる：Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−セロビオース、Ｄ−グルコース、グルクロン酸塩及びガラクトース。

本発明の好ましい実施形態によれば、着色標識はニュートラルレッドである。好ましくは、この着色標識は、濃度０．０００１〜０．０５ｇ／ｌ、好ましくは０．００２〜０．０１０ｇ／ｌ、好ましくは０．００３〜０．００７ｇ／ｌで媒体中に含まれる。着色標識はブロモチモールブルーであってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、この濃度は約０．０１０ｇ／ｌである。

本発明の特定の実施形態によれば、媒体中に存在し得る他種の細菌に対する腸炎ビブリオ及びコレラ菌の検出の特異性を改善するため、反応媒体は第二の糖をさらに含む。好ましくは、この第二の糖はグルクロン酸塩である。好ましくは、この糖は、濃度１〜３０ｇ／ｌ、好ましくは５〜１５ｇ／ｌで媒体中に含まれる。好ましくは、この濃度は約８ｇ／ｌである。

本発明は、コレラ群ビブリオ菌（コレラ菌／ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びｍｉｍｉｃｕｓ）及び腸炎ビブリオを分離及び識別するための、上記に定義する媒体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。

この媒体を使用する場合、コレラ菌は、青色から緑色のコロニーを形成可能な特異的β−ガラクトシダーゼ活性によって検出される。腸炎ビブリオは、媒体が酸性になって着色標識（ニュートラルレッド）が無色から淡いピンク色に変わることに起因して、ピンク色（非常に濃い着色）のコロニーを形成可能なＬ−アラビノースを特異的に使用することによって顕現化される。胆汁酸塩の存在下で、着色がコロニーに集まった状態が維持されるため、媒体の読み取りが容易となる。他のビブリオ菌種は、紫色又は無色を呈する。

最後に、本発明は、コレラ菌と腸炎ビブリオ細菌とをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて識別する方法にも関し、これによって、β−ガラクトシダーゼ活性が検出されてコレラ菌が識別され、糖の酸性化が検出されて腸炎ビブリオが明らかにされる。

本発明の好ましい実施形態によれば、コレラ菌を識別するためのβ−ガラクトシダーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼ活性に対して特異的な発色性基質を使用して検出される。この基質は上記に定義され、Ｘ−β−ガラクトシドが好ましい。本発明の好ましい実施形態によれば、糖の酸性化は、糖の酸性化によってｐＨが変化すると変色する着色標識（好ましくはニュートラルレッド）を使用して検出される。

以下の実施例は、例示を目的とするものであり、いかなる場合も本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより明確に理解できるであろう。

１．菌株及び養分試料の選択
ａ−純粋な菌株を使用する媒体の評価
本発明による媒体は、ビブリオ菌２２株（コレラ菌 ８株、Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ ２株、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ２株、腸炎ビブリオ ４株、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ２株、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ２株、Ｖ．ｈｏｌｌｉｓａｅ １株及びＶ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ １株）；ブドウ球菌 ８株；
シュードモナス ６株；カンジダ ６株；エンテロコッカス ４株；腸内細菌 ３株；大腸菌 ２株；クレブシエラ ２株；プロテウス属腸内細菌 ２株；サルモネラ菌 ２株；シゲラ ２株；エルシニア属 ２株；アエロモナス属 ２株；モラクセラ属 ２株；プレシオモナス属 ２株；リステリア １株；アシネトバクター属 １株を含む６９株について試験した。

ｂ−人工汚染された食糧を使用する媒体の評価
次の４つの養分マトリックス：カキ、テナガエビ、急速冷凍されたシーバスの切り身及びシートラウト全身を、コレラ菌で汚染させた。上記以外の５マトリックス、タラ科の切り身、冷凍の地中海テナガエビ、イガイ、魚パテ及びすり身を、腸炎ビブリオで汚染させた。

使用するプロトコルは、標準ＮＦ ＩＳＯ ８９１４及びＮＦ ＥＮ ＩＳＯ ６８８７−３に記載されたものであり、その中では、３７℃でペプトン食塩水（ＳＰＷ）中において７〜８時間前増殖することが推薦されている。人工汚染は、１０^−５倍に希釈した０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの細菌懸濁液を使用して実施する。この希釈液１ｍｌ又は０．１ｍｌを使用して、魚／他の甲殻類及び貝類をそれぞれ汚染させる；この汚染は、養分マトリックスをＳＰＷ中ですりつぶして２〜８℃で２４時間おいた後であって、かつ、３７℃で７〜８時間インキュベートする前に実施する。その後、前増殖物１０μｌのサンプルを本発明による媒体上で培養し、３７℃で４８時間インキュベートする。同時に、対照試験を、人工汚染しない他は上記と同じ条件下で実施する。これによって、第一に各マトリックスの天然の叢を確認でき、第二に、本発明による媒体とビブリオ菌コロニーの検出とが不適合ではないことを確認できる。

２．本発明による調製
本発明による媒体は、塩基性媒体としてトリプカーゼ大豆媒体（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ｍｅｄｉｕｍ）（ビオメリュー社、商品番号４３０１１）を含み、かつ、次の要素（ｇ／ｌ）を含む選択媒体である。
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド） ０．０５
胆汁酸塩 ０．６
ニュートラルレッド ０．００５
Ｌ−アラビノース １０
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ０．１
さらに、第二の糖（グルクロン酸塩；１０ｇ／ｌ）を、腸炎ビブリオ及びコレラ菌の検出の特異性を改善するために添加する。

３．純粋な株を使用する媒体の播種
本出願人が保存している株に由来する細菌及び酵母の株を、生理食塩水中に懸濁して播種し、各媒体上に別々にコロニーを形成させた。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間又は４０時間以上インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。これらのコロニーの着色の強度を評価した後、菌株が着色強度の値が＞０．５であれば陽性であると考えて、それぞれの菌株を陽性と陰性とに分けた（所望の表現型を発現しているか、発現していないか）。

媒体の原理によれば、Ｘ−β−ガラクトシドを使用した場合にβ−ガラクトシダーゼ活性を発現するコレラ菌菌株は青緑色のコロニーを形成し、一方腸炎ビブリオの菌株は、Ｌ−アラビノースを使用して媒体を酸性化して着色標識を変色させ、淡いピンク色のコロニーを形成するであろう。他の属又は種は、紫色のコロニー（β−ガラクトシダーゼ活性に関連したアラビノースの使用）、又は、無色のコロニー（アラビノース（−）及びβ−ガラクトシダーゼ（−））を形成し得る。

４．媒体の読み取り
着色強度の読み取り尺度
この尺度は、試験した全生体試料及び媒体に共通の任意のものである。この尺度は、この実験と、後続の実験についても有効である。次のように定義することができる：
＊ ０ 活性がないことに相当する。
＊ ０．１ わずかな着色に相当する。
＊ ０．５ 非常に薄い着色に相当する。
＊ １ 明瞭かつ強度の弱い着色に相当する。
＊ ２ 強度が中程度で明確な着色に相当する。
＊ ３ 濃い着色に相当する。
＊ ４ 非常に濃い着色に相当する。

ａ）純粋な菌株について
結果は、２４時間インキュベート後の感度及び特異性について全試験に対する正確な診断の％で表し、下記表中に、媒体上における真の陽性の検出数を真の陽性の総検出数で割った値に相当する％感度、及び、媒体上における真の陰性の検出数を真の陰性の総検出数で割った値に相当する％特異性で表す。

これらの結果から、第１に、コレラ菌菌株のすべてが予想された色のコロニーを実際に形成し（感度１００％）、第２に、非コレラ菌菌株５７株のいずれもコレラ菌に特有の色を発色しない（特異性１００％）ということが示される。腸炎ビブリオ菌株４株も、予想された色のコロニーを形成する（感度１００％）。非腸炎ビブリオ菌株６５株のうち３株のみが、偽陽性であると分類され（２／２のＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ及び１／２のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、腸炎ビブリオに特有のピンク色のコロニーを形成する（特異性９５．５％）。

ｂ）養分マトリックスについて
以下の表中に示す結果は、３７℃で２４時間インキュベートした後で観察されたものである。人工汚染されたマトリックスから得られた媒体をそれぞれ、対照媒体（人工汚染されていない養分マトリックスから得られた）と比較することによって、関連する叢のうち、養分を汚染するのに理論上使用される細菌種を特定する。上記で特定されたそれぞれのコロニーを分離し、その後、従来の試験によって識別する。識別が確認された場合、そのコロニーは真の＋と考えられ、逆の場合には偽の＋である。さらに、予想される色のコロニー以外に、予想されていないが特有の着色を示す他のコロニーに対しても、識別を実行する。識別によって、予想外の種に属するがコレラ菌群（ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、ｍｉｍｉｃｕｓ）又は腸炎ビブリオの一部である種が確認される場合、真の＋であり、養分中に天然に存在する；一方、識別によりコレラ菌（ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、ｍｉｍｉｃｕｓ）又は腸炎ビブリオが確認されない場合、その種は偽の＋であると考えられる。

養分マトリックスの汚染に使用される菌株はすべて、本発明による媒体上で前増殖及び単離をした後のものである。関連する叢の中から、関連する叢が多量である場合であっても陽性の青緑色又はピンク色のコロニーを容易に特定できるため、媒体の読み取りやすさは非常に満足のいくものである。

５．ビブリオ菌ＩＤ媒体の利点
ビブリオ菌ＩＤ媒体は、感度及び特異性の点から性能が良好である。さらに、読み取りやすさ、すなわち陽性コロニーを検出する能力又は陰性コロニーを除外する能力も非常に良好である。感度は、汚染度の低いサンプルの場合に非常に良好である。

Claims (7)

1. 以下を含む、コレラ群ビブリオ菌（コレラ菌／ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びｍｉｍｉｃｕｓ）及び腸炎ビブリオ細菌用の反応媒体：
   ・β−ガラクトシダーゼ酵素活性検出用の基質、
   ・Ｌ−アラビノース及びグルクロン酸塩からなる群より選択される少なくとも１つの糖、
   ・ｐＨが変化すると変色する着色標識。
2. 前記着色標識はニュートラルレッド又はブロモチモールブルーである
   ことを特徴とする請求項１に記載の反応媒体。
3. 前記着色標識はニュートラルレッドである
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の反応媒体。
4. 前記糖はＬ−アラビノース及びグルクロン酸塩である
   ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応媒体。
5. 前記基質はＸ−β−ガラクトシド発色性基質である
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応媒体。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の媒体を用いてコレラ菌と腸炎ビブリオ細菌とをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて識別する方法であって、これによって、β−ガラクトシダーゼ活性が検出されてコレラ菌が識別され、糖の酸性化が検出されて腸炎ビブリオが明らかにされる方法。
7. コレラ群ビブリオ菌（コレラ菌／ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ及びｍｉｍｉｃｕｓ）及び腸炎ビブリオを分離及び識別するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の媒体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用。