CN103443288A - 具有对碳青霉烯类的酶促抗性的细菌的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在生物学样品中检测和/或鉴定通过产生碳青霉烯酶而表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:a)使所述样品与包含至少一种碳青霉烯类抗生素和氯唑西林的反应培养基接触;b)进行整体温育以允许细菌生长;c)检测表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的菌株。有利地,步骤a)中采用的培养基还包含苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测和鉴定抗碳青霉烯类的细菌的方法。更具体地,本发明的方法的目的是检测表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的细菌。
背景技术
对β-内酰胺抗生素如青霉素和头孢菌素抗性的增加使治疗革兰氏阴性菌菌株引起的感染变得复杂。因此这些抗生素被其他广谱抗微生物剂代替。在这些广谱抗微生物剂中,碳青霉烯类已起到重要作用,特别是对于治疗住院患者。碳青霉烯类针对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧细菌以及某些厌氧细菌作用。
但是,越来越多抗碳青霉烯类的菌株出现在住院患者中。
相关的细菌非限制性地包括大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、气单胞菌(Aeromonas sp.)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、肠球菌(Enterococcus sp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。
对碳青霉烯类敏感性的减少可以归因于:
·抗β-内酰胺基因的表达:
(i)ampCβ-内酰胺酶的高产,和/或
(ii)ESBL(超广谱β-内酰胺酶),
联合细胞壁通透性(不透性抗性)的改变和/或抗生素的主动外排(Pageset al.,2009;PloS ONE,4(3));和/或
·分解碳青霉烯类的称为碳青霉烯酶的酶的存在。
碳青霉烯酶基因可以存在于染色体和/或质粒中。由于这种质粒形式的存在,这类酶促抗性能够很大程度地蔓延,结果在流行病学角度上构成重大风险。因为对碳青霉烯类的膜不透性抗性不可以蔓延,所以作为诊断的一部分,推荐监测携带或卫生能够区分两种类型的抗性。
当面对抗碳青霉烯的细菌菌株时,本领域技术人员难以容易地区分产生碳青霉烯酶的细菌菌株与不透性抗性的菌株。因为这两种类型的细菌均能够在碳青霉烯的存在下显色,目前区分它们的唯一方式在于进行额外的测试。在这些额外的测试中,可以提到:改良的Hodge测试(CLSI M100-S20:Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;TwentiethInformational Supplement.January2010.Supplemental Table2A-S2)、琼脂扩散(联合盘)协同测试,其采用与碳青霉烯联合的抑制剂,例如用于B类碳青霉烯酶的EDTA,或者用于检测A类碳青霉烯酶的苯基-硼酸。因此已知使用盘联合美罗培南和硼酸化合物作为β-内酰胺酶抑制剂,用于KPC碳青霉烯酶的表型检测(Pournaras et al.,2010;J.Antimicrob.Chemotherapy,65(7):1319-1321)。相似地,Giske等人测试了氯唑西林对区分产生KPC的菌株以及组合孔蛋白丧失与AmpC高产的菌株的影响(Giske et al.,2010;Clin.Microbiol.Infect.;17(4):552-6)。在这种情况下,区分基于氯唑西林对AmpC基因编码的头孢菌素酶的抑制作用,这恢复β-内酰胺的作用。但是,这些测试的结果经常必须通过分子生物学技术(例如靶向碳青霉烯-抗性基因的PCR扩增)来证实。
在申请WO2010/010083中提出特征在于使用包含美罗培南和/或厄他培南的显色培养基的方法,并且其在培养基KPC(Samra etal.,2008;J.Clin.Microbiol.,46(9):3110-3111;CHROMagarTM,Paris,France)和COLOREXTMKPC(BioMed Diagnostics Inc.)中实施。这种培养基不允许检测所有产生碳青霉烯酶的菌株,特别是金属-β-内酰胺酶(Nordmann et al.,2011;J Clin Microbiol.,49(2):718-721)。
在目前的流行病学背景下,特别是随着新抗性如NDM-1的出现,仍需要提高筛选所有与各种类型的碳青霉烯酶的产生相关的抗性机制的灵敏度和/或特异性。
申请人已证实可以改进直接区分(换句话说,特别是在单一筛选装置中)酶促抗性与通过其他机制(其中包括不透性)的抗性,这通过抑制表现出不透性抗性或其他非酶促抗性机制的菌株而不影响通过产生碳青霉烯酶来产生抗性的菌株的生长和检测。申请人令人惊讶地观察到与PAbetaN相关或无关的氯唑西林对不产生碳青霉烯酶且不产生AmpC的抗碳青霉烯菌株的影响。
发明内容
在这方面,本发明涉及一种在生物学样品中检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使所述样品与包含至少一种碳青霉烯类抗生素和氯唑西林的反应培养基接触;
b)进行整体温育以允许细菌生长;
c)检测表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的菌株。
有利地,步骤a)中采用的培养基还包含苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
申请人令人惊讶地证实,将氯唑西林或者氯唑西林与PAbetaN的组合加入包含碳青霉烯类的显色或非显色培养基使得可以提高通过产生碳青霉烯酶而对碳青霉烯类具有抗性的细菌的检测的灵敏度和特异性,并且更特异性地鉴定产生碳青霉烯酶的菌株。更具体地,本发明的方法使得可以在抗碳青霉烯细菌菌株中区分产生碳青霉烯酶的菌株与表现出不透性抗性或其他非酶促抗性机制的菌株。因此,可以立即实施预防表现出酶促抗性的菌株的传播所必需的卫生措施。
根据第一实施方案,本发明对应于一种在生物学样品中检测和/或鉴定通过产生碳青霉烯酶而表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使所述样品与包含至少一种碳青霉烯类抗生素和氯唑西林的反应培养基接触;
b)进行整体温育以允许细菌生长;
c)检测表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的菌株。
有利地,步骤a)中采用的培养基还包含苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
根据第二实施方案,本发明对应于一种在生物学样品中检测和/或鉴定通过产生碳青霉烯酶而表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使所述样品与包含至少一种显色底物、至少一种碳青霉烯类抗生素和氯唑西林的反应培养基接触;
b)进行整体温育以允许细菌生长;
c)检测表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的菌株。
有利地,步骤a)中采用的培养基还包含苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
具体实施方式
生物学样品应理解为用于分析的实体的一小部分或分离的少量。其可以是临床样品,人或动物的,来自生物液体的样本;或者是食物样品,来自任何类型的食物;或者是来自食物生产或加工环境的样品。因此该样品可以是液体或固体。可以以非限制性的方式举例:全血、血清、血浆、尿、粪便的临床样品,鼻、喉、皮肤、伤口、脑脊液的样本;水、饮料(如奶、果汁)、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品;来自动物饲料的食物样品,特别是例如动物食品样品,或者表面或水体对照的样品。这种样本可以直接使用,或者在分析之前按照本领域技术人员已知的方法通过富集、稀释、提取、浓缩或纯化来进行制备。
反应培养基应理解为包含代谢的表达和/或微生物的生长所必需的所有元素的培养基。反应培养基可以是固体、半固体或液体。例如,固体培养基应理解为胶凝培养基。琼脂是微生物学中用于微生物培养的常规胶凝剂,但是可以使用明胶、琼脂糖或者其他天然或人工的凝胶形成物质。许多制品可商购,例如Columbia琼脂、Trypcase-大豆琼脂、MacConkey琼脂、Mueller Hinton琼脂,或者更一般地,微生物学培养基手册(CRC Press)所述的那些制品。
反应培养基可以包含组合的一种或多种元素,例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。该培养基还可以包含染料。作为指示,可能的染料可以是伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿、一种或多种代谢指示剂、一种或多种代谢调节剂等。
反应培养基可以是显示培养基或者培养和显示培养基。在第一种情况下,微生物的培养在接种之前进行,而在第二种情况下,检测和/或鉴定培养基还构成用于培养的培养基。
本领域技术人员还可以使用双板,这使得可以容易地比较包含不同底物或不同选择性混合物的两种培养基,在这两种培养基上沉积相同的生物学样品。
反应培养基可以包含一种或多种选择剂。选择剂应理解为能够防止或减缓除靶微生物以外的微生物的生长的任何化合物。不受限制地,0.01mg/l-5g/l的浓度特别适合本发明。
作为选择剂,可以提到抗生素、抗真菌剂、胆盐、结晶紫、碱性品红、亮绿等。抗生素应理解为能够防止或减缓细菌生长的任何化合物。具体地,它们属于β-内酰胺、糖肽、氨基糖苷(aminoside)、多肽、磺酰胺和喹诺酮类组。作为提示,具体可以提到抗生素头孢噻肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南、万古霉素、庆大霉素、甲氧苄啶、妥布霉素、拉氧头孢、磷霉素、D-环丝氨酸、多链丝霉素、多粘菌素E以及喹诺酮类如萘啶酸。
抗真菌剂应理解为能够防止或减缓酵母或霉菌的生长的任何化合物。作为提示,具体可以提到两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和环己米特。
步骤a)中采用的培养基中所用的碳青霉烯类优选在反应培养基中是稳定的。它们优选自:美罗培南、厄他培南、多利培南、法罗培南、噻烯霉素、比阿培南、来那培南、帕尼培南、阿祖培南(razupenem)、托莫培南(tomopenem)、替比培南、硫培南以及Choi等人在申请US2010/0160284A1中所述的β-甲基碳青霉烯类。更优选地,它们选自:美罗培南、厄他培南、多利培南和法罗培南。
优选地,碳青霉烯浓度为0.05-32mg/L。
更优选地,碳青霉烯浓度对于法罗培南为2-32mg/L,对于多利培南为0.05-2mg/L,对于美罗培南为0.05-2mg/L,并且对于厄他培南为0.05-12mg/L。
氯唑西林对应于青霉素类抗生素。其体外使用以抑制某些β-内酰胺酶(上文的Giske et al.,2010)。有利地认为双氯西林和氟氯西林等同于氯唑西林。优选地,以25-300mg/L的浓度使用氯唑西林。
PABN或PAbetaN对应于苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺。这种化合物已知为外排泵抑制剂,例如,使得可以减少氯霉素对产气肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)(Mallea et al.,2002;Biochemical and Biophysical ResearchCommunications293:1370-3)。优选地,以1-50mg/L的浓度使用PAbetaN。
显色底物应理解为使得可以通过直接或间接的可检测信号检测靶微生物的酶促或代谢活性的底物。对于直接检测,这种底物可以连接至作为荧光或有色标记发挥作用的部分(Orenga et al.,2009;J.Microbiol.Methods;79(2):139-55)。对于间接检测,本发明的反应培养基还可以包含pH指示剂,其对底物消耗所诱导的pH变化敏感并且显示靶微生物的代谢。所述pH指示剂可以是发色团或荧光团。作为发色团的实例,可以提到溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、苯胺蓝和溴甲酚蓝。荧光团包括例如4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物或试卤灵衍生物。
根据本发明,显色底物优选自基于吲哚氧基的底物(3-吲哚氧基、5-溴-3-吲哚氧基、5-碘-3-吲哚氧基、4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基、6-溴-3-吲哚氧基、6-氯-3-吲哚氧基、6-氟-3-吲哚氧基、5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚氧基、N-甲基-3-吲哚氧基、AldolTM等);基于伞形酮的底物(4-甲基伞形酮、环己酮七叶苷(Cyclohexenoesculetin)等);基于茜素的底物;基于对萘酚苯甲醇的底物;基于硝基苯酚的底物(邻硝基苯酚、对硝基苯酚等);基于羟基喹啉的底物;基于儿茶酚(Cathecol)的底物(儿茶酚、二羟黄酮、羟基黄酮等);基于试卤灵的底物;基于氯酚红的底物;基于荧光素的底物;基于氨基苯酚的底物(对氨基苯酚、二氯-氨基苯酚等);基于萘酚的底物(α-萘酚、2-萘酚、萘酚-ASBI等);基于氨基香豆素的底物(7-氨基-4-甲基-香豆素等);基于萘基酰胺的底物;基于吖啶的底物(氨基-苯基-吖啶等);基于氨基-吩噁嗪-的底物(氨基-苯并吩噁嗪酮、氨基-戊基-试卤灵等)。
作为指示,显色底物靶向的酶促活性可以属于水解酶组,并且优选氧化酶(osidase)、酯酶或肽酶组。优选地,显色底物靶向的酶促活性选自:葡糖醛酸酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶和脱氨酶。
作为指示,用于检测β-葡糖醛酸酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、茜素-β-葡糖苷酸、环己酮七叶苷-β-葡糖苷酸或它们的盐。
用于检测β-半乳糖苷酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、茜素-β-半乳糖苷、环己酮七叶苷-β-半乳糖苷或它们的盐。
用于检测β-葡糖苷酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、茜素-β-葡糖苷、环己酮七叶苷-β-葡糖苷、硝基苯基-β-葡糖苷、二氯氨基苯基葡糖苷或它们的盐。
作为指示,用于检测酯酶活性的底物具体可以是具有6-14个碳、优选7-9个碳的饱和或不饱和直链脂肪酸的酯,以及4-甲基伞形酮、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基、6-氯-3-吲哚氧基、5-溴-3-吲哚基或茜素的酯或它们的盐。优选地,它们选自4-甲基伞形酮基-辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、5-溴-3-吲哚基-辛酸酯或茜素-辛酸酯。
用于检测脱氨酶活性的底物具体可以是L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸。
用于检测硫酸酯酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-硫酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-硫酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-硫酸酯、3-吲哚氧基-硫酸酯、酚酞-二硫酸酯或它们的盐。
优选地,显色底物选自:5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-葡糖苷)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷(品红β-Gal)、6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸(玫瑰βGur)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(绿AβGlu)、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(甲基βD葡糖苷)和L-色氨酸。
温育应理解为表示在1-48小时之间,优选4-24小时之间,更优选16-24小时之间升至并维持在适当的温度,一般为20-50℃,优选30-40℃。
检测应理解为表示用裸眼或使用光学装置识别靶细菌生长的存在。有利地,当采用的培养基包含显色底物时,检测还可以使得能够鉴定靶细菌。对于荧光底物,使用光学装置进行检测,或者对于有色底物,用裸眼或使用光学装置进行检测。
特异性应理解为如果靶细菌菌株不存在,方法或反应培养基给出阴性结果的能力。换句话说,根据本发明,更特异性的鉴定对应于与不表达碳青霉烯酶的菌株相关的假阳性数量的减少,不声称抑制所有这些菌株。
灵敏度应理解为如果样品中存在靶细菌菌株,给出阳性结果的能力。
如上文所示,对碳青霉烯类的酶促抗性应理解为表示由于靶细菌表达碳青霉烯酶而导致的对碳青霉烯抗生素的抗性。
如上文所示,最常见的抗碳青霉烯类的细菌有:大肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、雷氏普罗威登斯菌、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、丛毛单胞菌、气单胞菌、摩氏摩根菌、肠球菌、奇异变形杆菌、森夫顿堡沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等。
本发明还涉及一种用于检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的细菌的培养基,所述培养基对应于基本培养基,其还包含至少一种显色底物、至少一种碳青霉烯、氯唑西林或者氯唑西林和PAbetaN的组合。
最后,本发明涉及氯唑西林或者氯唑西林和PAbetaN的组合在特异性地检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的细菌中的用途。
下文展开的实施例的目的是促进对本发明的理解。它们以解释的方式给出而不是为了限制本发明的范围。
实施例
实施例1
在厄他培南的存在下,氯唑西林和/或PAbetaN对不透性-抗性(IR)或表现出其他非酶促抗性机制或产生碳青霉烯酶的菌株的最小抑制浓度(MIC)的影响。
首先,在有厄他培南的的情况下,使用Mueller Hinton培养基中的带评价氯唑西林和PAbetaN对菌株的MIC的影响。第一个测试评价厄他培南对表现出对碳青霉烯类的非酶促抗性(此后称为不透性-抗性(IR))的19个菌株的MIC的影响。第二个测试在于评价在有厄他培南的情况下这2种化合物对29个产生碳青霉烯酶的菌株的MIC的影响(+1ESBL)。
1.培养基和微生物
测试B100904:19个不透性-抗性(IR)菌株属于以下物种:10株产气肠杆菌、2株阴沟肠杆菌、1株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、1株铜绿假单胞菌、3株奇异变形杆菌和2株摩氏摩根菌。
测试B101001:29个产生碳青霉烯酶的菌株划分如下:27个产生A类KPC碳青霉烯酶(KPC)的肺炎克雷伯氏菌菌株,以及产生B类碳青霉烯酶(NDM-1)的分别为肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌的2个菌株。这个测试还包含ESBL大肠杆菌菌株。
在根据表I补充或未补充氯唑西林和/或PAbetaN的Mueller-Hinton培养基中进行E-测试。
表I:目的在于评价氯唑西林和/或PabetaN对IR或产生碳青霉烯酶的菌株的MIC的影响而进行测试的培养基(90mm培养皿)
2.测试
о对每个菌株制备0.85%NaCl安瓿中的约0.5McF悬浮液。
о通过半自动化擦拭接种4种培养基。
о将皿在环境温度下干燥5-15min。
о在37℃下温育16-20小时。
3.结果
对于IR菌株,结果集中在表II中,而对于产生碳青霉烯酶的菌株,结果集中在表III中。
表II:氯唑西林(CLX)和/或PAbetaN对IR菌株的MIC的影响(与没有氯唑西林或PAbetaN的培养基的MIC比较)。
*或者在测试的厄他培南浓度范围中不可以测量的影响(这里MIC>32)
在有厄他培南的情况下,在其中氯唑西林和/或PAbetaN对测试的IR菌株的MIC有超过2步的影响(MIC“步”定义为2倍稀释)的所有情况下(除了一个),MIC有减少。在一种情况下(产气肠杆菌(E.aerogenes)菌株9306074),在PAbetaN单独存在下,MIC增加(没有PAbetaN,MIC=6,而在PAbetaN的存在下MIC>32)。
对于在氯唑西林的存在下MIC已减少超过2步的17个菌株,PAbetaN的影响如下(针对有氯唑西林的MIC):
о在氯唑西林+PAbetaN的存在下,7个具有减少2个额外MIC步的MIC
о5个具有较不显著减少的MIC(≤2个MIC步)
о1个不受影响
о对于4个菌株,在测试的厄他培南浓度范围中不可以评价影响(在单独的氯唑西林或与PAbetaN组合存在下MIC<0.002)
对于最后2个菌株(几乎不受单独的氯唑西林影响或不受影响),一个除氯唑西林以外加入PAbetaN仍不受影响(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)),而另一个(阴沟肠杆菌(E.cloacae))的MIC在氯唑西林+PAbetaN的存在下大大减少(单独氯唑西林时MIC>32,而氯唑西林+PAbetaN时MIC=0.023)。
表III:氯唑西林和/或PAbetaN对产生碳青霉烯酶的菌株的MIC的影响(与没有氯唑西林或PAbetaN的培养基的MIC比较)
*或者在测试的厄他培南浓度范围中不可以测量的影响(这里MIC>32)
4.解释
在有厄他培南的情况下,将氯唑西林加入Mueller Hinton培养基使得可以很明显地减少(超过2个浓度步骤)大部分测试的IR菌株的MIC(16/19)。单独加入PAbetaN对大部分测试的IR菌株没有影响。相反地,将PAbetaN加入包含氯唑西林的培养基加强其效果,进一步显著(对于7个菌株,超过2个浓度步)或更温和地(对于5个菌株,2个浓度步或更少)减少IR菌株的MIC。
在有厄他培南的情况下,氯唑西林对产生碳青霉烯酶的菌株(NDM或KPC)的MIC没有影响(9个菌株),或者倾向于略微减少它们(16个菌株)。相反地,在有厄他培南的情况下,将单独的PAbetaN加入Mueller Hinton培养基倾向于略微(15个菌株)或非常明显地(7个菌株)增加这些菌株的MIC。
将氯唑西林与PAbetaN关联使得可以获得与单独PAbetaN相似的结果,即使PAbetaN对MIC的正效应被氯唑西林的负效应略微减少。
5.结论
在有厄他培南的情况下,单独使用氯唑西林(200mg/L)使得可以显著减少大部分测试的IR菌株的MIC。加入PAbetaN增强氯唑西林的这种效应。
相反地,在厄他培南的情况下,关联氯唑西林+PAbetaN允许增加(温和至强烈)产生碳青霉烯酶的菌株的MIC。
因此,在用于筛选产生碳青霉烯酶的菌株的培养基的框架内,加入单独的氯唑西林或与PabetaN的组合使得可以更好地抑制不期望的IR生长,同时对产生碳青霉烯酶的菌株的生长没有影响或略微正向影响。
实施例2
在法罗培南的存在下,氯唑西林和/或PAbetaN对不透性-抗性(IR)或表现出其他非酶促抗性机制或产生碳青霉烯酶的菌株的最小抑制浓度(MIC)的影响。
1.培养基和微生物
在有或无PAbetaN的包含不同浓度的法罗培南和氯唑西林的培养基上测试77个革兰氏阴性菌菌株,其中71个为肠细菌且6个为非肠细菌(非发酵细菌),它们的抗性特征在表IV中示出,以建立每种制品的灵敏度和特异性。测试培养基如表V所述。
表IV:表征测试菌株的对抗生素抗性的机制
表V:测试培养基的组成
2.测试
将显色培养基分入120x120方形皿中。
在trypcase大豆琼脂上于37℃下从24-h预培养物进行接种。对于每种菌株,制备生理水中的0.5McF悬浮液。根据琼脂稀释(AD)法,借助在多点接种器,将每种悬浮液点状接种(1-2μL)于各培养基上。在37℃下温育24小时后进行读数。
3.结果
结果集中在表VI中。
认为不存在细菌生长或者少于或等于3个的菌落数对应于生长抑制。认为存在4个菌落或更多个是阳性生长。
表VI:在法罗培南的存在下,氯唑西林和/或PAbetaN对产生碳青霉烯酶或通过其他抗性机制抗β-内酰胺的菌株的生长(显色菌株的数量)的影响
4.解释
表VII:对于产生碳青霉烯酶或通过其他抗性机制抗β-内酰胺的菌株,在氯唑西林的存在下,联合或不联合PAbetaN,包含法罗培南的培养基的灵敏度和特异性。
4a.氯唑西林和PAbetaN对IR菌株的影响
表VIII:与PAbetaN相关或无关的氯唑西林对测试的19个IR菌株的生长的影响
在高达16mg/L的浓度下,单独的法罗培南对这些菌株有很少影响。
从加入50mg/L氯唑西林的时刻观察到IR菌株的抑制,并且对于测试的最高浓度的法罗培南(16和32mg/L)甚至更显著。这种抑制效应随着氯唑西林的浓度增加(例如,对于浓度为16mg/L的法罗培南,加入50mg/L或200mg/L氯唑西林分别允许抑制6个和9个额外的IR菌株)。观察到法罗培南浓度和氯唑西林浓度对IR菌株的联合效应。
这些结果还证实在氯唑西林+PAbetaN的存在下IR菌株的更好抑制。这种效应对于测试的大多数氯唑西林和法罗培南浓度是可见的,但是在200mg/L氯唑西林的存在下非常显著(无论法罗培南浓度)。
4b.氯唑西林和PAbetaN对产生碳青霉烯酶的菌株的影响
在法罗培南的存在下获得的结果证实,单独的氯唑西林对产生碳青霉烯酶的菌株的生长有很少影响或没有影响(在测试的3个法罗培南浓度下)。它们还证实将PAbetaN与氯唑西林关联使得可以增加某些菌株对碳青霉烯类的MIC,只要法罗培南浓度保持低于32mg/L。因此,与50或100mg/L氯唑西林相关的8或16mg/L法罗培南的存在下的检测灵敏度大于PAbetaN的存在下的检测灵敏度。对于200mg/L氯唑西林以及8或16mg/L法罗培南,加入PAbetaN不改变检测灵敏度。
5.结论
这些结果证实在碳青霉烯的存在下,氯唑西林对不透性抗性菌株的抑制作用。这些结果还证实当氯唑西林与PAbetaN相关时IR菌株的优异抑制。因此,加入氯唑西林和PAbetaN使得可以极大地增加培养基的灵敏度。
将氯唑西林(在测试的3个浓度下)和PAbetaN(25mg/l)加入培养基中不改变8或16mg/L法罗培南的存在下检测产生碳青霉烯酶的菌株。这证实加入PAbetaN倾向于改进它们在与50或100mg/L氯唑西林相关的等于8或16mg/L的法罗培南浓度下的检测。
因此,在法罗培南的存在下,证实通过厄他培南观察到的结果(E-测试),即通过加入氯唑西林的更好的IR菌株抑制,以及在PAbetaN的存在下检测产生碳青霉烯酶的菌株的改进。
Claims (12)
1.一种检测生物学样品中产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
о使所述样品与包含至少一种碳青霉烯和氯唑西林的反应培养基接触,
о进行整体温育以允许产生碳青霉烯酶的细菌生长,以及
о检测对应于产生碳青霉烯酶的细菌的菌株。
2.一种检测和/或鉴定生物学样品中产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
о使所述样品与包含至少一种碳青霉烯、氯唑西林和至少一种显色底物的反应培养基接触,
о进行整体温育以允许产生碳青霉烯酶的细菌生长,以及
о检测对应于产生碳青霉烯酶的细菌的菌株。
3.权利要求1或2的方法,其中所述反应培养基还包含苯丙氨酸-精氨酸β-萘基酰胺(PAbetaN)。
4.权利要求1-3之一的方法,其中所述碳青霉烯选自:厄他培南、美罗培南、多利培南和法罗培南。
5.权利要求1-4之一的方法,其中所述氯唑西林浓度为25-300mg/L。
6.权利要求3-5之一的方法,其中所述PAbetaN浓度为1-50mg/L。
7.权利要求2-6之一的方法,其中所述显色底物检测选自以下的活性:葡糖醛酸酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶和脱氨酶。
8.权利要求2-7之一的方法,其中所述显色底物选自:5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-葡糖苷)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷(品红β-Gal)、6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸(玫瑰βGur)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(绿AβGlu)和L-色氨酸。
9.权利要求1-8之一的方法,其中所述反应培养基为液体或固体培养基。
10.一种用于检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯的酶促抗性的细菌的培养基,所述培养基包含基本培养基、至少一种显色底物、至少一种碳青霉烯和氯唑西林。
11.权利要求10的培养基,其还包含苯丙氨酸-精氨酸β-萘基酰胺(PAbetaN)。
12.氯唑西林或者氯唑西林和PAbetaN的组合在特异性地检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的酶促抗性的细菌中的用途。
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