CN101790683A - 用于诊断微生物感染的组合物和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明关于对在人类和动物中诊断微生物感染的、包括检测和表征微生物感染的新型、可靠、快速和廉价方法的需求，或对用于在各种环境诸如食物或饲料样品中检测和表征微生物感染的方法的需求。本发明提供用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的组合物、平台、试剂盒和方法。尤其是，本发明涉及用于诊断、检测和/或表征尿路感染的这种组合物、平台、试剂盒和方法。

Description

用于诊断微生物感染的组合物和装置
发明的技术领域
本发明涉及用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的组合物、平台、试剂盒和方法。尤其是，本发明涉及用于诊断、检测和/或表征尿路感染的这种组合物、平台、试剂盒和方法。
发明背景
尿路感染(UTI)：
尿路感染是通常实践中最常见的感染之一以及西方世界最常见的医院感染。总患病率是3-5％，每年在18/1,000居民发生1。
感染在女性最为普遍(风险比男性高六倍)，这通常解释为这样的事实，即尿道的开口处于与阴道菌群直接接触，且女性尿道相当短，相反男性尿道长4-5倍，从而保护了尿道。至于年龄组，感染在生命的早期即一岁以下、和生命的晚期即＞60岁的年龄最为常见。
尽管大多数感染是简单的下UTI即膀胱感染，通常不经抗菌素治疗而自身痊愈，但UTI还可以是复杂的，带有上行的肾感染，可以扩散到血液，导致败血症和败血性休克。大约50％的大肠杆菌(Escherichia coli)菌血症以尿道为病灶，尽管有有效的抗菌素，这些感染的死亡率是大约20％。尿毒症和透析治疗的肾损伤在超过三分之一的病例中是由慢性尿路感染导致的。对尿道的操作步骤和其它医原性的操作诸如膀胱镜检查、导管插入术等导致大量感染，如膀胱导管插入术导致一周后30-50％的患者的、一个月后几乎100％的菌尿。
致病机理和病原学：
UTI可以是由诸如腺病毒的病毒和由鞭毛虫类诸如阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)导致的，但大多数的感染(＞98％)是由细菌导致的，在多数病例中该细菌来源于患者自身直肠的菌群。由于偶然或卫生差，细菌可以从直肠和肛门经由会阴扩散到阴道，细菌可以在阴道和尤其是尿道外周围的区域形成菌落。根据这一点，由诸如如抑制局部免疫功能的低温等因素或由物理因素诸如性交帮助，细菌获得进入尿道的机会。如果该细菌含有特异性致病因子，帮助它们粘附到尿道和膀胱的粘膜上，细菌就可以渗入上皮并穿过上皮，进入下方的组织。传染过程接着发生的是细胞内微菌落形成，上皮细胞凋亡，细胞物质和细菌释放到膀胱腔，有重新感染的危险。在许多情况，免疫系统将大体上除去细菌并恢复膀胱壁组织的正常功能，但膀胱腔中的细菌可以提供足够时间经由输尿管再次上升到肾盂，在肾盂中细菌可以进一步扩散到肾脏的髓质和皮质，导致肾盂肾炎、肾周脓肿或肾内脓肿或其它不幸事件。
免疫反应可以通过尿和牵涉到的组织中增加数目的白细胞，大多数是粒细胞而观察到。在大多数持续病例中，在2-3周后也可以测量到针对侵入者的特定抗体。大肠杆菌是主要起因，造成60-90％的UTI，因为这种细菌通常保持有造成UTI必需的致病因子，即粘附性质(对膀胱上皮上的受体有特别嗜好的纤毛或菌毛)、细胞移动(鞭毛)和大量其它致病因子，这使得该细菌规避免疫功能并渗入人类组织。其余的感染是由其它肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌属(Klebsiella)和肠杆菌属(Enterobacterspp.)、变形杆菌属(Proteus spp.))和一些革兰氏阳性细菌(肠球菌(Enterococci)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophytics)、气球菌属(Aerococcus spp.))和很少的念珠菌属(Candida spp.)导致的。支原体(Mycoplasma)和脲原体属(Ureaplasma spp)在UTI中的可能作用仍有争论。
细菌可能见于不具有症状或其它体征(如白细胞尿)的患者的尿中，即所谓的无症状菌尿。这在老年患者尤其常见，在许多研究中已发现10-15％的普遍性。
临床表现：
膀胱感染导致局部疼痛，可以在耻骨后感觉到，或可能在腰部感觉到-但这通常是牵涉到肾的体征，以及排泄期间疼痛。还有，膀胱中的刺激将导致频繁排泄。还可演变为发热，尽管这通常在肾盂肾炎的情形常见。尿将改变颜色和浑浊度，变得发暗、浑浊和有时伴有血尿，即由于从受创的膀胱上皮的少量出血而存在红细胞。如果继发菌血症，患者将发展败血症的体征，伴有全身痛和不舒服、高热和战栗。
即使是患上简单的UTI，患者也将由于该疾患而丧失工作能力，因此将留在家里无法工作并寻求医学帮助。
UTI的诊断
因为尿道通常是无菌的并带有低数目白细胞，细菌和增加数目的白细胞的存在指示感染。UTI的诊断是基于典型症状以及无菌地获得的尿样中细菌和增加数目的白细胞的存在。由于尿道外部分通常形成菌落，难以在排泄期间获得样品而不污染样品。为了避免这种污染，获得无菌尿样的最佳途径是通过耻骨弓上穿刺，或经由膀胱导管或在肾盂感染的情形经由经皮肤的肾造口术。但因为后面这些方法是相当麻烦和通常在绝大多数情况下对患者是疼痛的，还需要入院，多数情况下收集的尿是中段尿(MSU)，即用无菌盐水润湿的棉签清洁尿道口，随后患者排泄少量第一部分的尿来清洁尿道，之后排泄-中段-在无菌容器中收集的样品-最后排泄剩余的尿体积到厕所。
还获取其它样品诸如尿道拭子或血培养物来指示尿道炎(如淋病)或菌血症。
用于诊断UTI的定量标准：
由于当以MSU获取尿样时污染和随后评价结果的问题，以及一些患者可能具有无症状菌尿的事实，直到十九世纪六十年代才在Edward Kass2的研究中发现，为了辨别无症状患者和肾盂肾炎患者，至少105细菌/ml尿的一种可能的尿病原体(见上述)必须存在于间隔至少24h获取的两份尿样中。
后来发现，低至103细菌/ml尿的计数的典型尿病原体(见上述)指示患者中的感染，该患者具有典型症状的UTI3，即Kass-标准2用于患有无症状菌尿的患者。
目前使用的诊断尿中细菌的方法：
a)直接方法
1.镜检术：细菌可以通过对湿涂片的相差镜检术或通过对革兰氏染色制品的简单光镜检术在尿样中可见。在湿涂片中，可观察到细菌的形状和可能的移动，但当然观察不到细菌的革兰氏类型。这可以通过对革兰氏染液的光镜检术来分辨，在两种情况都可以观察到白细胞并大致地定量。镜检术的问题是缺少特异性，即只能提供假定的细菌诊断，和敏感性，即细菌只有当以至少105细菌/ml尿的数目存在时才可见。此外，镜检术将不揭示细菌的抗菌素敏感性。关于以≥105细菌/ml的定量培养物作为UTI的标准4，相差镜检术具有58％的阳性预测值。
2.培养：诊断UTI的金标准。在实验室中，这通过定量培养进行，即标准化的环施加1μl或10μl尿到琼脂平板上。这允许通过计数培养的平板上菌落数目(菌落形成单位，CFU)来定量细菌。如果预期低数目的细菌(如耻骨弓上穿刺或导管样品)，可以培养达1ml尿，允许计数低至1-2CFU/ml尿。培养可导致通过生化和其它类型的实验室检查进一步诊断细菌。此外，可进行敏感性检验。方法的敏感性是通过定义100％，但在一些情况如果未使用特定的培养基、大气或温度条件，细菌可能不生长(一些气球菌属菌株可能只在血琼脂上和CO2中生长)，或如果患者已经开始抗菌素治疗，由于抗菌素阻遏，细菌可能不生长。特异性不是100％，因为阳性培养物仍然可能包含污染物-这一结果应该联合症状和体征以及尿中增加数目的白细胞的存在。定量环有+/-1/2log CFU/ml的偏差，这表示只能进行计数的大致估计5。实验室中定量培养物的缺点是尿必须被保持在这样的条件下：其中细菌在培养之前不繁殖；这可以通过在转移过程中冷却尿(即＜4℃)来获得或通过使用保存细菌而不促进生长的转移培养基，如通过使用硼酸来获得。因此近年来用于转移的包含硼酸的管已经变得常见，但这种方法具有固有的问题，即硼酸对人类有毒，如致癌。
其它培养方法：具有在一侧或两侧携带琼脂培养基、浸入尿中的塑料平板骨架的浸片(dipslide)已经使用了20-30年(如Uricult(Orion))。这些的优点是便于接种，且直接接种可以通过比较细菌生长与用于已知量细菌的培养物的浸片图片来定量。浸片还可用作转移培养基。已经开发了敏感性检验，其中在接种后将包含抗菌素的盘放在琼脂表面上(如Sensicult(Orion))。在一些情形中，敏感性检验的阳性预测值(PPV)已经低至0.6，这可以解释为缺少标准化的接种物和难以将盘周围的区域诠释在圆表面上，因为琼脂平板不是完全扁平的。同样，浸片的小表面(即大约2×5cm)使得难以评价细菌的生长特征，尤其是细菌是否是多于一种物种。此外，没有对细菌物种的了解，难以评价敏感性。最近Novamed在以色列销售了在一侧上带有显色琼脂的浸片(DipStreak)。
3.其它方法：近年来尝试了多种方法来定量尿中的细菌，诸如由分光光度法测量浊度、细胞离心法、ATP-测量法及其它方法。迄今为止，就我们所知，这些方法都不能适用于常规实验室，由于其成本和对技术技巧的需求，尤其是不能适用于基础医疗。
b)间接方法：
1.用于亚硝酸盐和白细胞-酯酶的浸渍片：尿中亚硝酸盐的确定用于诊断UTI，因为只有当尿中存在产硝酸盐还原酶的细菌时才存在这种物质。硝酸盐来自蛋白代谢，并取决于当天取样前蛋白的摄入，以不同浓度见于尿。然而，如果存在产生亚硝酸盐-还原酶的细菌(如大肠杆菌可包含两种类型的酶)，亚硝酸盐可能被除去。该检验不是很敏感，因为该反应需要培养约3小时，一些细菌产生亚硝酸盐-还原酶，而一些尿病原体根本不产生硝酸盐还原酶，如葡萄球菌。白细胞-酯酶检验更相关，因为这是证明白细胞存在的最容易方式；该酶只能来自白细胞，酶的量与白细胞数目相关。完整白细胞容易地和快速地裂解，这表示为了实现相关定量镜检术，对白细胞的尿镜检术必须在取样后一小时内进行，而由于酶的稳定性，酶检验可以在数小时后进行。然而，白细胞的存在仅仅预测50％患者的感染，因为白细胞尿可见于未感染的许多患者。共同地，由于上述因素，对组合的两种酶的检验(即一种阳性或两种阳性)具有相当低的PPV(60-80％)。
2.仅症状：在一般实践的许多情况，全科医生(GP)将仅根据症状就开始治疗。这可能是由于因为成本、地理或传统、对病原体敏感性的了解和/或使用推测覆盖所有可能病原体的广谱抗菌素而对诊断检查有所保留。
UTI的治疗：
在30％的简单UTI病例，感染将会自愈，即不经抗菌素治疗而消失6。但在大多数病例，尤其是在复杂病例，即除了14-60岁的年龄组中的女性以外的所有其它患者，抗菌素治疗是标准治疗。取决于疾患和所使用的抗菌素，简单感染将在3-7天后治愈，而肾盂肾炎需要10-14天的治疗，更慢性的病例需要更长时间的治疗，在一些病例可以是数月到数年。效果取决于细菌病原体的敏感性6，7。在实验室进行的标准检验花费时间，尤其是当进行盘敏感性检验时，因为该检验是基于多个条件被保持在某些限制中(接种物、培养时间、检验的读取、培养大气等等)。最重要的因素是接种物，其必须在某个狭窄的限值内以确保检验的质量，这就是难以直接在最初尿样进行有意义的盘扩散敏感性检验的原因，因为不知道细菌的准确数目。
WO 99/18232(Chen等人)提供了一种多区室检测装置，其基于组合使用能够维持全部微生物体生长的培养基、对特定目标有机体选择性的培养基和包含抗微生物剂敏感性解释培养基的培养基。这一申请教导使用液体培养基，没有提出允许区分同一样品中多个种群和/或菌株的微生物的存在并确定所述微生物的每个种群或菌株的抗微生物剂敏感性的设置。
后来Chen等人在WO03106696中公开了用于检测致病微生物和其抗微生物剂敏感性的方法和装置。可包括荧光底物或生色底物的使用以获得微生物存在的视觉信号，但未提到使用多种不同物质来确定不同物种。
WO0106000公开了用于鉴定和区分肠杆菌科的检验培养基。该培养基包含抗菌素来阻止肠杆菌科以外的微生物生长。
US6750038描述了一种快速抗菌素敏感性检验。色原的使用没有用来鉴定微生物。
US6251624公开了用于检测、定量和表征微生物的装置和方法。抗菌素敏感性通过生长区抑制来检验。
WO2004050675公开了一种多室生长平板，其培养基中带有选择性肉汤以鉴定特定微生物，带有抗菌素用于检验敏感性。
因此，用于诊断、检测和表征微生物感染或污染，并提供区分这样的多个种群和/或菌株的微生物的可能性的改进技术将是有利的。尤其是，如果以合理的成本制造的有效、可靠和可能的平台形式提供，这样的技术将是有利的。
发明概述
因此，本发明的一个目的涉及用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的组合物、平台、试剂盒和方法。
因此，本发明的一方面涉及包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂的组合物。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的组合物的平台。
本发明的又另一方面提供包含根据本发明的组合物的试剂盒。
本发明的进一步方面提供：
一种包含根据本发明的平台的试剂盒。
根据本发明的组合物在检测和/或鉴定致病的微生物、尤其是致尿道病的微生物中的应用。
根据本发明的组合物在检测和/或诊断选自以下组成的组的感染的应用：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌(meningococci)感染、淋球菌(gonococci)感染、包括肺炎球菌(pneumococci)感染的链球菌(streptococci)感染。
用于检测和/或诊断选自以下组成的组的感染的根据本发明的组合物：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染、包括肺炎球菌感染的链球菌感染。
一种诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与根据本发明的平台接触。
一种诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂的检验组合物(诸如两种或多种检验组合物)接触，并与包含所述半固体生长培养基和所述两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)但不包含任何抗微生物剂/所述抗微生物剂的对照组合物接触。
一种制造根据本发明的组合物的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
一种制造根据本发明的平台的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
一种制造根据本发明的诊断试剂盒的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
附图简述
图1显示关于根据本发明的平台，目前两种优选的实施方案：根据图1A，该平台包括能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器的一个凹槽(10)。该凹槽借助一个或多个一体的分隔组件(17)被分为分开的区室(11、12、13、14、15和16)。每个区室包含含有半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物以及抗菌素的组合物；或含有半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物、但不包含抗微生物剂的组合物。根据图1B，该平台包括多个凹槽(18)，每个凹槽能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器。每个凹槽包含含有半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物以及抗菌素的组合物；或含有半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物、但不包含抗微生物剂的组合物。
图2说明本发明目前优选的实施方案之一，根据该方案该平台包括包含甲氧苄啶的根据本发明的组合物(19)、包含磺胺甲噻二唑的根据本发明的组合物(20)、包含氨苄西林的根据本发明的组合物(21)、包含美西林的根据本发明的组合物(22)和包含呋喃妥因的根据本发明的组合物(23)。该平台还包括其中没有抗微生物剂的根据本发明的组合物(24)。最后，该图说明又一优选的实施方案，根据该方案包含不含有抗微生物剂的所述组合物的凹槽或区室的大小是任何其它凹槽或区室的大小的两倍。
图3显示使用根据本发明优选的实施方案的(图2中说明的)平台确定分析的样品中大肠杆菌的量或滴度的标准。照片显示大肠杆菌以不同量的细菌血l尿的生长。示意的大肠杆菌对磺胺甲噻二唑和氨苄西林是耐药性的，因为在这两个抗菌素区室有生长，但其对甲氧苄啶、呋喃妥因和美西林敏感。
图4显示使用根据本发明优选的实施方案的平台确定分析的样品中尿病原体不同菌落类型的标准。普通尿道致病细菌的生长条件和颜色和其对Flexicult平板中五种抗菌素的敏感性/耐药性。
Figure GPA00001037598800101
本发明将在以下更详细描述。
发明详述
定义
在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下术语和惯用语：
微生物
在本上下文中，术语“微生物的”宽泛地解释为是指“有关微生物的”。术语“微生物”共同地是指细菌、真菌、古细菌和原生生物。
半固体生长培养基
本文所用的表述“半固体生长培养基”是指允许微生物在其表面上形成菌落的生长培养基，诸如具有凝胶样外观或以凝胶形式的培养基，凝胶是一种胶态系统，其中互连颗粒的多孔网络存在于整个液体培养基体积中。进一步应理解的是，凝胶主要是组合物中的液体，因此表现出于具体液体类似的稠度，然而具有固体的结构一致性。优选地，本文所用的半固体生长培养基是通过向液体生长培养基加入足量的物质来制备，该物质在加热时融化并当再次冷却时固化，诸如明胶或琼脂。应理解的是，培养基中互连颗粒的多孔网络将允许营养物和抗微生物剂在培养基中扩散，变得微生物可获得的。
生长培养基
在本发明上下文中，术语“生长培养基”是指在其中或在其上微生物可以生长的物质。该术语尤其包括营养肉汤(液体营养培养基)或Lysogeny肉汤(L-B培养基)和琼脂，琼脂对于微生物是最常见的生长培养基。
类似地，该术语涵盖其中微生物可以悬液生长的液体培养基，以及如上界定、允许微生物在其表面上形成菌落的半固体培养基。术语“生长培养基”还包括专门培养基，其有时是包括难养生物的某些微生物生长所需的，这些微生物由于复杂的营养需求而需要专门的环境。
大体上，生长培养基将包括用于细菌生长的碳源诸如葡萄糖或琥珀酸盐、水、提供微生物生长所需的必要元素的各种盐诸如镁、允许细菌合成蛋白和核酸的氮、磷和硫、以及氨基酸和氮的来源(如，牛肉、酵母提取物)。
还应理解的是，术语“生长培养基”包括确定成分培养基，也称为确定化学成分培养基，以及成分不确定培养基，也称为基础或复合培养基。微生物的确定成分培养基将具有已知量的所有成分，包括微生物所需的微量元素和维生素，和尤其是确定成分的碳源诸如葡萄糖或甘油，以及确定成分的氮源诸如铵盐或硝酸盐。相反，成分不确定培养基具有一些复杂成分，诸如酵母提取物或酪蛋白水解物，其由未知比例的许多化学物质的混合物组成。
生色底物
在本发明上下文中，术语“生色底物”、“生色物质”和“色原”互换地使用，是指生化色素的前体。尤其应理解的是，色原可以是底物、化合物或物质，其被微生物代谢时产生特有的颜色或色素，可用作检测和/或鉴定所述微生物的手段。
荧光底物
术语“荧光底物”与“荧光物质”互换地使用，是指荧光化合物的前体。荧光化合物是这样一种化合物，其中光子的分子吸收激发发射具有更长波长的另一光子，且其中吸收的光子与发射的光子之间的能量差以分子振动或热来结束。尤其是，吸收的光子在紫外线范围，发射的光子在可见光范围。因此荧光化合物的检测通常可以通过将其暴露于紫外光(UV光)，随后记录由荧光化合物发射的光(通常是可见光)来进行。尤其应理解的是，荧光底物可以是底物、化合物或物质，其被微生物代谢时发射光，可用作检测和/或鉴定所述微生物的手段。
抗微生物剂
本申请中术语“抗菌素”和“抗微生物剂”互换地使用，界定抑制或废除微生物诸如细菌、真菌或原生动物生长的化合物，即具有抗-细菌、抗-真菌和/或抗-寄生活性的化合物。该术语包括从活的生物体产生和分离的抗菌素或抗微生物化合物，例如，青霉菌属(Penicillium)中的真菌产生的青霉素类或来自链霉菌属(Streptomyces)的细菌的链霉素。该术语还包括通过化学合成获得的抗菌素或抗微生物化合物，诸如磺胺类药物。
该术语尤其包括抗-细菌的抗菌素，其是不具有针对病毒、真菌和其它非细菌微生物的活性的抗菌素。抗-细菌的抗菌素包括破坏细菌的杀菌抗菌素，和阻止细菌繁殖的抑菌抗菌素。抗细菌的抗菌素进一步包括靶向特定类型细菌诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的“窄谱的”抗菌素，和影响宽范围细菌的广谱抗菌素。类似地，抗细菌的抗菌素包括用于吞服的抗菌素，以及通常用于治疗严重感染诸如深部系统感染的用于静脉施用的抗菌素，和用于局部施用的抗菌素。抗细菌的抗菌素包括目前公认的以下类中的抗菌素：氨基糖苷类、安莎霉素类、β-内酰胺抗菌素(包括碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类(第一代、第二代、第三代和第四代)、单酰胺菌素类和青霉素)、糖肽类、大环内酯、林可酰胺类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、环状脂肽类、甘氨酰环素类、噁唑烷酮类、二氨基嘧啶类、硝基呋喃类、利福霉素类、抗菌肽类、酰胺醇类、硝基咪唑类、链阳性菌素类和磷霉素类。
本发明的各方面和实施方案
在第一和最宽的方面，本发明提供包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物和抗微生物剂的组合物。根据本发明采用半固体微生物生长培养基的事实具有微生物的生长可在所述培养基表面上作为单菌落观察的益处。生色物质或荧光物质或底物的组合使用，通过菌落中产生的色素颜色或荧光提供区别培养基上生长的微生物的多个类型或物种的可能性。同时，可能确定每个微生物类型或物种针对根据本发明的组合物中存在的抗微生物剂的敏感性。
本发明的另一益处是当该平台用于检验尿的感染时，半固体微生物生长培养基上形成的菌落数目直接与加入到平台的每体积尿的细菌数目相关。从而使得容易确定尿中细菌的浓度。
在本发明的优选实施方案，该半固体培养基包含色氨酸。包含色氨酸的益处在于，使得容易检测变形杆菌属-摩根氏菌属(Morganella)-普罗威登斯菌属(Providencia)的肠细菌，同时色氨酸不干扰抗菌素敏感性的确定。
在另一优选实施方案，根据本发明的组合物中的半固体培养基包含半乳糖聚合物(琼脂)或明胶。
优选地根据本发明的组合物包括选自以下组成的组的微生物生长培养基：Iso-sensitest琼脂、Danish血琼脂、Discovery培养基和Mueller-Hinton培养基。对于不固有地包含色氨酸的培养基，在这些培养基中包括色氨酸可能是进一步的益处。培养基中的色氨酸浓度可以在0.25-3.0克/升之间。
Iso-sensitest琼脂目前可从Oxoid获得，其组成列举在Oxoid手册1998。Iso-sensitest琼脂包括蒸馏水中的11g/l水解酪蛋白、3g/l蛋白胨、2g/l葡萄糖、3g/l氯化钠、1g/l可溶淀粉、2g/l磷酸氢二钠、1g/l乙酸钠、0.2g/l甘油磷酸镁、0.1g/l葡萄糖酸钙、0.001g/l硫酸钴、0.001g/l硫酸铜、0.001g/l硫酸锌、0.001g/l硫酸亚铁、0.002g/l氯化镁、0.001g/l甲萘醌、0.001g/l氰钴胺、0.02g/l L-盐酸半胱氨酸、0.02g/l色氨酸、0.003g/l吡哆醇、0.003g/l泛酸盐、0.003g/l烟酰胺、0.0003g/l生物素、0.00004g/l硫胺、0.01g/l腺嘌呤、0.01g/l鸟嘌呤、0.01g/l黄嘌呤、0.01g/l尿嘧啶、8g/l琼脂。
对于Danish血琼脂，本领域技术人员已知其具有如下组成：每250升蒸馏水中2g Na2HPO4·12H2O、625g胰蛋白胨、250g淀粉、833.6g氯化钾、2.5g去垢剂、74.8g肉汤(Oxoid CM975K)、800g D(+)葡萄糖-一水合物、1.75g叶黄素、1.75g鸟嘌呤、17.5g硫酸镁7H2O、19.2g CaCl2·2H2O、2,720g琼脂、5N HCl调至pH 7.4、维生素溶液、和12.51马血。
Discovery培养基由Oxoid制造(产品号CM 1087)。根据制造商，该培养基具有以下组成：14.5g/l蛋白胨、2g/l葡萄糖、5.5g/l盐混合物、1g/l可溶淀粉、1.5g/l发色混合物和8g/l琼脂。
Mueller-Hinton培养基包括2g/l牛肉提取粉件肉提取物、17.5g/l酪蛋白的酸消化液、1.5g/l淀粉和17g/l琼脂。
应理解的是，所述培养基中每种成分的量有一些变化是可以接受的；大体上±20％的变化是可以接受的。然而，如本领域技术人员将理解的，某些组分可以改变甚至更大的程度：琼脂的量可以大致改变诸如从4-25g/l而不显著改变培养基的性能。因此通常优选地，根据本发明的组合物中的培养基包括从4-25g/l的半乳糖聚合物。
这些培养基连同其它合适的培养基的特征是，当用于确定对抗微生物剂的敏感性时提供大的可靠性。这种可靠性不是所有培养基都具有的，因为一些培养基包括干扰抗菌素的化合物，从而影响使用这些培养基来检验抗菌素敏感性的能力。大的可靠性例如由在这些培养基上的事实来证实：
i)加入16mg/l氨苄西林导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少5logCFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
ii)加入32mg/l呋喃妥因导致由参考菌株腐生性葡萄球菌ATCC49907形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少4logCFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
iii)加入700mg/l磺胺甲噻二唑导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少3log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
iv)加入16mg/l甲氧苄啶导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少3log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
v)加入16mg/l美西林导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少5log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的。
在进一步的实施方案，该微生物生长培养基是能够对其上生长的有机体施加选择压的选择培养基，诸如对革兰氏阴性细菌或对革兰氏阳性细菌选择性的培养基。
半固体培养基可进一步包括磺胺抑制剂和/或金属离子，因为这些可以影响抗菌素敏感性。例如Mg2+或Ca2+的浓度变化可以影响以氨基糖苷类和四环素检验铜绿假单胞菌(Ps.Aeruginosa)的结果。此外，过量锌离子可以减小碳青霉烯类的区域大小。过量的阳离子含量将减少抗菌素活性，而低的阳离子含量可以导致活性增强。尤其是Ca2+和Mg2+离子可以以可溶盐的形式存在于半固体培养基中。磺胺被胸苷抑制，细菌可以藉以使用胸苷并因此不顾磺胺而生长。胸苷-磷酸化酶的存在将抑制胸苷并因此恢复磺胺的功能。需要的胸苷-磷酸化酶浓度将取决于培养基中胸苷的浓度。
半固体培养基的另一参数是胸苷的浓度，因为其可能影响对葡萄球菌的甲氧苄啶和甲氧西林耐药性的检验。大多数琼脂培养基包含可能影响以培养基中低含量的抗菌素的敏感性检验结果的少量磺胺和甲氧苄啶拮抗剂(尤其是如果没有加入血液)。因此在特定实施方案，敏感性检验培养基应包含少于0.03mg/l胸苷，否则在甲氧苄啶琼脂上会观察到小的菌落。如果培养基包含比推荐的略微多的胸苷，可能通过加入胸苷-磷酸化酶来减少浓度：0.025至0.1IU酶/ml培养基或包含相同酶的5％溶血的马血。
尽管对于一些抗菌素和为了一些目的，根据本发明的组合物中仅存在一种抗菌素可以是期望的，根据本发明的组合物还可以包含2种或更多种抗微生物剂、诸如3种或更多种抗微生物剂、诸如4种或更多种抗微生物剂、或诸如5种或更多种抗微生物剂。
根据本发明的组合物特征为：抗微生物剂，或如果存在多于一种抗微生物剂，则至少一种该抗微生物剂，诸如2、3、4、5或更多种抗微生物剂或所有抗微生物剂选自以下组成的组：阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、两性霉素-B、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、苄青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑林、头孢地尼、头孢吡肟、头孢克肟、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢哌酮-舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊肟-克拉维酸、头孢泊肟-舒巴坦、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢噻呋、Ceftobiprole、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、氟苯尼考、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、复方磺胺甲噁唑(甲氧苄啶/磺胺甲噁唑)、达巴万星(Dalbavancin)、达福普汀/Quinopristin、达托霉素、地贝卡星、双氯西林、多利培南、多西环素、恩氟沙星、尔他培南(Ertapenem)、红霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、亚胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳头孢、美西林(氮卓西林)、美罗培南、双唑泰栓、美洛西林、美洛西林-舒巴坦、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦、哌拉西林-三唑巴坦、利福平、罗红霉素、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、替考拉宁、特拉万星(Telavancin)、泰利霉素、替莫西林、四环素、替卡西林、替卡西林-克拉维酸、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶、曲伐沙星、泰洛星、万古霉素、维吉霉素和伏立康唑。
可以单独或组合地掺入根据本发明的组合物的抗微生物剂的完整列表显示在表1。琼脂中使用的浓度优选地与具体药物的S/R分界点有关，然而，确定为了特定目的所需的确切浓度在本领域技术人员能力范围中。
表1.抗菌素、IUPAC编码和用在琼脂中的可能浓度的浓度范围列表。
Figure GPA00001037598800171
Figure GPA00001037598800191
Figure GPA00001037598800201
Figure GPA00001037598800211
Figure GPA00001037598800221
Figure GPA00001037598800231
Figure GPA00001037598800241
在包括大肠杆菌的所有细菌，抗菌素耐药性的流行已经增加并且正在继续增加，即使在基础医疗中，现在变得越来越需要联合尿培养物与敏感性检验。
在最近调查来自北美(USA和加拿大)的大肠杆菌的耐药率的研究中8，收集的1142大肠杆菌中，75.5％(862)从USA收集，280(24.5％)从加拿大收集。总之，对氨苄西林的耐药性是37.7％，随后是对SMX/TMP(21.3％)、呋喃妥因(1.1％)、环丙沙星(5.5％)和左氧氟沙星(5.1％)的耐药性。该研究报告门诊患者尿分离物中大肠杆菌的抗菌素耐药性，US比加拿大人比例更高，并证实对抗微生物剂耐药性的持续进化。在2002-3的欧洲人调查Eco-Sens研究中9，在一定范围的欧洲国家的大肠杆菌确定抗菌素耐药率。结果显示在表2。
表2.Eco-Sens研究中欧洲国家的大肠杆菌的抗微生物剂耐药性9。
Figure GPA00001037598800251
aAMP，氨苄西林；AMC，复合阿莫西克拉维；MEC，美西林；CFR，头孢羟氨苄；TMP，甲氧苄啶；SUL，磺胺甲噁唑；SXT，甲氧苄啶/磺胺甲噁唑；NAL，萘啶酸；CIP，环丙沙星；NIT，呋喃妥因；FOF，磷霉素；GEN，庆大霉素。
如同可以从这些数据演绎的，常用抗菌素诸如氨苄西林、磺胺和甲氧苄啶的耐药率现在如此高(即15-45％)，以致这些药物不能不经敏感性检验就根据经验使用。在一些国家仍然覆盖大多数尿病原体的有效广谱药物氟喹诺酮的使用与耐药性的发展直接相关，这即使在短期的规模也是有问题的，由于这些药物在医院用于治疗严重感染的重要性。由于耐药率在各地理区域之间变化，取决于使用根据本发明的组合物的目的，不同抗微生物剂可能是优选的。
在目前优选的实施方案，根据本发明的组合物包含一种或多种抗微生物剂，其中该抗微生物剂/至少一种抗微生物剂选自以下组成的组：氨基糖苷类、哌拉西林/三唑巴坦、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、脂肽类和抗微生物肽(如多霉素或粘菌素)以及这些的组合。
在同等优选的实施方案，开发根据本发明的组合物用于在丹麦和斯堪的那维亚国家诊断尿路感染。这些组合物中一种或多种抗微生物剂优选地选自以下组成的组：氨苄西林/阿莫西林、磺胺、甲氧苄啶、呋喃妥因、美西林和环丙沙星(或其它氟喹诺酮)以及这些的组合。
为了同样的目的，优选地该抗微生物剂选自以下组成的组：甲氧苄啶、磺胺甲二唑、氨苄西林、呋喃妥因和美西林(氮卓西林)以及这些的组合。
为了类似的原因，为了在斯堪的那维亚以外的欧洲用于UTI诊断，已经开发了组合物。这些组合物中一种或多种抗微生物剂优选地选自以下组成的组：阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)以及这些的组合。
为了在美国诊断UTI的目的，优选选自以下组成的组的一种或多种抗微生物剂：阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄/头孢克洛(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)以及这些的组合。
尤其应理解的是，可单独地包括阿莫西林或联合克拉维酸。类似地，可单独地包括氨苄西林或联合舒巴坦，可单独使用磺胺甲噁唑或联合甲氧苄啶。
为了诊断UTI以外的目的，该一种或多种抗微生物剂还可以选自以下组成的组：阿莫西林/克拉维酸(或舒巴坦)、苯氧甲基-青霉素、头孢菌素(如头孢呋辛酯、头孢氨苄)、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶(任选地组合用于口服治疗)、四环素(多西环素或任何其它四环素组)、氯霉素、磷霉素、大环内酯/克林霉素、和利福平以及这些的组合。
如果该检验将在医院实验室使用，还可以考虑用于静脉使用的抗菌素，包括选自以下组成的组的抗微生物剂：氨基糖苷类、头孢菌素类(头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢泊肟、头孢曲松及其它)、哌拉西林/三唑巴坦、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、脂肽类、利奈唑胺和抗微生物肽(如多霉素或粘菌素)以及这些的组合。
选择培养基的重要添加剂
磺胺抑制剂和金属离子：Mg和Ca的变化将影响以氨基糖苷类和四环素检验铜绿假单胞菌的结果。过量锌离子可以减小碳青霉烯类的区域大小。过量的阳离子含量将减少抗菌素活性，而低的阳离子含量可以导致活性增强。Ca和Mg应当以可溶盐的形式在半固体培养基中可获得。
培养基的胸苷含量影响对葡萄球菌的甲氧苄啶和甲氧西林-耐药性检验。大多数琼脂培养基包含可能影响以培养基中低含量的抗菌素的敏感性检验结果的少量磺胺和甲氧苄啶拮抗剂(尤其是如果没有加入血液)。敏感性检验培养基应包含少于0.03mg/l胸苷，否则在甲氧苄啶琼脂上会观察到小的菌落。如果培养基包含比推荐的略微多的胸苷，可能通过加入胸苷-磷酸化酶来减少浓度：0.025至0.1IU酶/ml培养基或包含相同酶的5％溶血的马血。
在将抗菌素加入半固体培养基之前，溶解抗菌素可能是有益处的。
尤其是用于溶解抗微生物剂的溶剂可能包括以下一种或多种：
水
生理盐水0.85％
磷酸盐缓冲剂，pH 6.0，0.1mol/L
磷酸盐缓冲剂，pH 8.0，0.1mol/L
磷酸盐缓冲剂，pH 7.2，0.01mol/L
碳酸氢钠饱和溶液
碳酸氢钠水溶液0.1％
乙醇95％
甲醇
冰醋酸
二甲基甲酰胺(DMF)
二甲基亚砜(DMSO)
DMSO 1/10vol
DMSO加冰醋酸
1/2体积水加数滴1mol/L氢氧化钠
1/2体积水加数滴0.1mol/L氢氧化钠
1/2体积水加数滴2.5mol/L氢氧化钠
氢氯酸0.04mol/L
溶于水的聚山梨酯-80(0.002％)
半固体培养基中抗微生物剂的稳定性可能取决于pH值。pH值必须不超出某些限值，因为这将影响抗微生物剂作用。通过调整半固体培养基的pH值到6.0，已经改进了氨苄西林和美西林的稳定性。
根据本发明，该组合物中存在的两种或多种生色物质优选地选自以下组成的组：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺、3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-联苯亚基)-双-2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、邻硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷、3，4-环己酮七叶苷-β-D-半乳糖苷、8-羟基喹啉-β-D-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、8-羟基喹啉-β-D-葡萄糖醛酸苷、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、4-氯-1-萘酚、3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐、邻苯二胺、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、4-[2-(4-辛酰基氧-3，5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-喹啉鎓-1-(丙烷-3-基-羧酸)-溴化物、5-溴-6-氯-3-吲哚基-辛酸酯、和5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-肌-肌醇-1-磷酸酯以及这些的组合。
如本领域技术人员将理解的，以上列出的组分通常以0.001-1.0g/l的量使用。
在下表3中，根据其用作底物的酶列出这些色原：
表3.发色酶底物
为了检测或诊断尿路感染的目的，所述两种或多种生色物质的至少一种优选地选自以下组成的组：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、和5-溴-6-氯-3-吲哚基-磷酸酯或这些的组合。该组合物包含2、3、4或5种都选自该组的生色物质可以是优选的。
根据本发明的组合物的荧光物质可以选自以下组成的组：4-甲基伞形基磷酸酯、4-甲基伞形基-β-D-吡喃型半乳糖苷、4-甲基伞形基β-D-吡喃型乳糖苷和4-甲基伞形基b-D-葡萄糖醛酸苷或这些的组合。
如此前描述的，特定实施方案中的半固体培养基可能包括色氨酸，诸如L-色氨酸。半固体培养基中存在的L-色氨酸将被表达色氨酸酶的细菌降解为吲哚、丙酮酸盐和氨。变形杆菌属-摩根氏菌属-普罗威登斯菌属的肠细菌形成来自L-色氨酸的色素，将菌落周围的琼脂染色成微红的棕色到棕色。属于变形杆菌属种群的细菌：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、彭氏变形杆菌(P.penneri)和产粘变形杆菌(P.myxofaciens)。属于摩根氏菌属种群的细菌：摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)。属于普罗威登斯菌属种群的细菌：雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)、产碱普罗威登斯菌(P.alcalifaciens)、拉氏普罗威登斯菌(P.rustigianii)、和亨氏普罗威登斯菌(P.heimbachae)。产生色氨酸脱氨酶的变形杆菌属、摩根氏菌属和普罗威登斯菌属将氨基酸L-色氨酸脱氨基为吲哚丙酮酸和氨。培养基中的吲哚丙酮酸、铁离子和肼化合物在培养基中产生微红到棕色的颜色。通过加入纸盘到皮氏培养皿的盖，可以进一步检测降解L-色氨酸为吲哚的细菌。随着培养期间形成吲哚蒸汽，以
Figure GPA00001037598800311
试剂(溶于乙醇/HCl中的对二甲基氨基苯甲醛)制备的纸盘将提供红色。
在进一步的实施方案，本发明的半固体培养基可以包括一种或多种诱导物，诱导物是可能积极地调节一种或多种基因表达的物质。诱导在导致物质的分解代谢的代谢途径中是常见的，诱导物通常是该途径的底物。诱导物的作用对许多常规测定的功能和敏感性可以是关键的。向培养基加入诱导物可增加着色。常用诱导物显示在下表4：
表4诱导物
如本领域技术人员将理解的，以上列出的成分通常以0.001-1.0g/l的量使用。
根据本发明的组合物可以包含3种或更多种生色底物或荧光底物，诸如4种或更多种生色底物或荧光底物、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、或10种或更多种生色底物或荧光底物。尤其是根据本发明的组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种生色底物或荧光底物。
根据本发明的组合物的特殊益处是其高稳定性。在优选实施方案，当在4℃或更低的温度储存时该组合物稳定长达12个月的期间，诸如长达11个月的期间、长达11个月的期间、长达9个月、长达8个月、长达7个月、达6个月、长达5个月、长达4个月、长达3个月、长达2个月、或诸如长达1个月的期间。
本发明的进一步方面提供用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的平台，其包含如上界定的组合物。
尤其是，根据本发明的平台可能包含如上界定的多种组合物，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50或90种组合物，其中至少2种组合物包含不同的抗微生物剂，诸如其中至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、14、15、20、50种组合物包含不同的抗微生物剂或其中每种组合物包含不同的抗微生物剂。
在进一步的实施方案，根据本发明的平台包含以下：
i)检验组合物，其包含如上界定的半固体微生物生长培养基、和两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)，诸如如上界定的生色物质或荧光物质(或底物)，以及一种或多种抗菌素，诸如如上界定的一种或多种抗菌素；
ii)对照组合物，其包含如上界定的半固体微生物生长培养基和如上界定的两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)，但不包含抗微生物剂，诸如如上界定的抗微生物剂。
不包括任何抗微生物剂、或至少不包括以上界定的任何抗微生物剂(即不同于检验组合物中存在的抗菌素的抗菌素)的对照组合物可用于确定给定样品中微生物的数目以及微生物的物种和/或种群。包括一种或多种抗菌素的检验组合物可用于确定这些物种和/或种群的微生物对检验组合物中存在的任何抗菌素的敏感性。
为了方便起见，根据本发明的平台包含固体支持物，使得容易操纵根据本发明的组合物。
尤其是，根据本发明的平台可能基于固体支持物，其中所述固体支持物包括以下：
i)凹槽(10)，其能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器，所述凹槽被分为两个或多个分开的区室(11-16)，每个区室包含如上界定的检验组合物或如上界定的对照组合物，即不包含上述任何抗微生物剂或完全不包含任何抗微生物剂的培养基；和一个或多个用于将所述凹槽分隔为所述分开的区室的一体的分隔组件(17)，或
ii)多个凹槽(18)，每个凹槽能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器，每个凹槽包含如上界定的检验组合物或如上界定的对照组合物。
数字是指图1中的图解，图1是根据本发明的平台的代表性实例。
根据本发明优选的实施方案，该平台包括包含选自以下组成的组的抗微生物剂的检验组合物：氨苄西林/阿莫西林、磺胺、甲氧苄啶、呋喃妥因、美西林、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)。根据该实施方案，该平台可能包括包含氨苄西林/阿莫西林的一种检验组合物、包含磺胺的一种检验组合物、包含甲氧苄啶的一种检验组合物、包含呋喃妥因的一种检验组合物、包含美西林的一种检验组合物、和/或包含环丙沙星(或其它氟喹诺酮)的一种检验组合物。这样的平台对于在斯堪的那维亚诊断UTI的目的可能是优选的。
类似地，该平台可包括包含甲氧苄啶的一种检验组合物、包含磺胺甲二唑的一种检验组合物、包含氨苄西林的一种检验组合物、包含呋喃妥因的一种检验组合物和包含美西林(氮卓西林)的一种检验组合物。
为了在非斯堪的那维亚的欧洲国家诊断UTI的目的，包括含有阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)的检验组合物的平台可以是优选的。
最后，为了在北美/美国诊断UTI的目的，包括含有阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄/头孢克洛(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)的检验组合物的平台可以是优选的。
为了服务于其目的，平台的凹槽或所述多个凹槽必须具有足够大以容纳合适体积样品的容积。在特定实施方案，该凹槽或所述多个凹槽具有从1-40mm，诸如从1-35mm、从1-30mm、从1-25mm、从5-40mm、从5-35mm、从5-30mm、从5-25mm、从10-40mm、从10-35mm、从10-30mm、从10-25mm、从15-40mm、从15-35mm、从15-30mm或诸如从25-25mm的深度。
对于尿路感染以及许多其它感染，考虑到一般实践中诊断的使用，施用特殊的策略。全科医生(GP)治疗经历UTI的大多数患者，治疗UTI的抗菌素消耗达到医院之外抗菌素使用总量的约25％一且因为西方社会中使用的抗菌素总量的90％是在社区使用，UTI的抗菌素使用是可观的。对于患者，有充足证据说明尽可能早地接受包括细菌敏感性的正确诊断是有益的。因此GP在诊所进行UTI诊断有很多好的原因：通过减少向远处、中心实验室运输的时间，并避免运输对培养物质量的影响，它缩短了治疗的时间。由于GP对微生物学的经验很少，培养方法应容易接种和读取，敏感性检验应当独立于接种物并也容易读取，即GP或其助手几乎没有时间来测量抑制区并将其解读到敏感性组。同时，如果需要更精密的细菌诊断检查，培养系统应当容易转移到实验室。其它重要因素：该检验应能够测量和读取低至103CFU/ml的计数，并应能够区分病原体和污染物。所有这些因素包括在根据本发明的平台中。
为了满足这些需求，根据本发明的平台优选地具有带有检验组合物的区室，每个区室具有从4-9cm2、诸如从5-8cm2、从6.5-7.5cm2的面积。类似地，优选地带有对照组合物的一个或多个区室具有从15-25cm2、诸如从17-23cm2、或从19.5-21.5cm2的面积。
目前最优选版本的平台具有带有检验组合物的凹槽或区室，其具有6.93cm2的面积和6.24cm3的容积，并具有带有对照组合物的区室或凹槽，其具有20.78cm2的面积和18.7cm3的容积。这一具体设计适于用在检测、诊断和/表征尿路感染中，基于经验：如果平台将用于检测包括尿路感染的微生物感染，其中微生物/细菌以103cfu/ml样品/尿的量存在，这些面积和容积是足够的。
所述检验组合物和对照组合物可能以对应凹槽或区室容积的从5-75％的量，诸如从10-75％、从10-65％、从10-55％、从10-45％、从10-35％、从20-75％、从20-65％、从20-55％、从20-45％、从20-35％、诸如从25-75％、从25-65％、从25-55％、从25-45％、从25-35％、或诸如以对应凹槽或区室容积的从25-35％的量在各自凹槽或区室中存在。
根据某些实施方案，在根据本发明的平台中所述凹槽可能被分隔为3个或更多个区室，诸如4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、40个或更多个、60个或更多个、或90个或更多个区室。
进一步地，根据本发明的平台可能具有3个或更多个凹槽，诸如4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、40个或更多个、60个或更多个、或90个或更多个凹槽。
根据某些有希望的实施方案，根据本发明的平台包括用于将所述凹槽分隔为分开的区室的分隔组件，其中所述分隔组件已被处理以防止抗微生物剂在区室之间扩散。预料当将根据本发明的组合物倒入平台的凹槽或孔时，如果没有特别小心，组合物中存在的表面张力导致抗微生物剂在区室之间扩散。为了避免这样，所述一个或多个分隔组件可被磨光以具有平滑表面。其它用于减少表面张力和抗微生物剂扩散的手段包括向根据本发明的组合物加入去垢剂诸如吐温。
尽管可能涵盖许多可用的设计，所述固体支持物优选地是以封闭或开放容器的形式，诸如盘、试管、瓶、多孔板、微量滴定板、条(stick)(浸渍条)或载玻片。
该固体支持物可以尤其是从塑料/聚合物基质、从玻璃基质或从金属基质制造的，所述塑料/聚合物基质诸如聚氯乙烯基质、聚乙烯基质、聚丙烯基质、聚碳酸酯基质、丙烯腈丁二烯苯乙烯基质、聚甲基丙烯酸甲酯基质或聚苯乙烯基质。
根据目前优选的实施方案，根据本发明的平台包含固体支持物，其是以皮氏培养皿的形式，诸如具有从50至150mm、从60-130mm、从70-110mm、或从80-100mm的直径的皮氏培养皿。根据一个具体实施方案，该支持物是以90mm皮氏培养皿的形式。
本发明的平台可适于用于尤其是检测和/或诊断选自以下组成的组的感染：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染和链球菌感染。
其它检验可以并入该平台，例如粘贴到覆盖所述支持物的盖子的内表面，粘贴到支持物内侧或粘贴到支持物中间部分上，例如所述分隔组件接合的部分。为了在这样的检验中使用，该平台可包括酶，诸如白细胞酯酶。当并入该平台时，白细胞酯酶使得能够相伴地诊断白细胞尿(也可对亚硝酸盐检验进行)。据此，酶可包含在所述支持物的分开的或一体的组件中。例如如此前描述的，可进一步检测降解L-色氨酸为吲哚的细菌，通过向皮氏培养皿的盖加入纸盘。随着培养期间形成吲哚蒸汽，以
Figure GPA00001037598800371
试剂(溶于乙醇/HCl中的对二甲基氨基苯甲醛)制备的纸盘将提供红色。
本发明的另一方面提供包含如上所述组合物的试剂盒。
相关方面提供包含如上所述平台的试剂盒。
这种试剂盒可尤其用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染。
根据任一方面，该试剂盒可进一步包含显示在如上界定的平台上生长量的标准，所述标准是将所述平台与具有预先确定滴度的微生物参考菌株的悬液接触获得的。代表性标准在本申请的图3阐释。
该试剂盒还可包含显示在如上界定的平台上生化色素和/或荧光显色的标准，所述标准是在一种或多种微生物参考菌株平台上生长获得的。代表性标准在本申请的图4阐释。
为了方便起见，该标准优选地是如上界定的平台的照相或印刷复制。
根据特定实施方案，通过将根据本发明的平台与大肠杆菌细菌的参考菌株诸如大肠杆菌(ATCC 29522)细菌、和/或金黄色葡萄球菌的参考菌株诸如金黄色葡萄球菌ATCC 25913接触产生显示平台上生长量的所述标准。
根据进一步特定实施方案，已经通过将根据本发明的平台与选自以下组成的组的一种或多种参考菌株接触而产生显示平台上生化色素和/或荧光的显现的所述标准：大肠杆菌，诸如大肠杆菌菌株ATCC 25922、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)，诸如肺炎克雷伯氏菌菌株ATCC 10031、阴沟肠杆菌(E.cloacae)诸如阴沟肠杆菌菌株ATCC 13047、奇异变形杆菌诸如奇异变形杆菌菌株ATCC 12453、普通变形杆菌诸如普通变形杆菌菌株ATCC13315、摩氏摩根氏菌诸如ATCC 25830、弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)诸如弗氏柠檬酸细菌菌株8090、铜绿假单胞菌诸如铜绿假单胞菌菌株ATCC27853、粪肠球菌(E.faecalis)诸如粪肠球菌菌株ATCC 29212、屎肠球菌(Efaecium)诸如屎肠球菌菌株ATCC 35667、腐生性葡萄球菌诸如腐生性葡萄球菌菌株49907、白色念珠菌(C.albicans)诸如白色念珠菌菌株ATCC200955。
可用于本发明上下文的标准显示在图4。
显示生长量的标准可由包括以下的方法产生：
i)提供密度为0.9％盐水中0.5McFarland/1+E08 CFU/mL所述一种或多种参考菌株的悬液；
ii)提供i)中所述悬液的一系列10倍稀释液，最低密度为+E03CFU/mL；
iii)将ii)中的每种所述稀释液与根据本发明的平台接触2-3秒，随后轻轻倒出所述溶液；
iv)在35℃在环境大气培养每个平台过夜。
根据进一步的实施方案，该试剂盒包含一种或多种分别包装的抗微生物剂。这样一种或多种抗菌素可被包括以由使用者实地加入平台的一个或多个区室。
根据目前优选的实施方案，根据本发明的试剂盒是用于医疗点(point-of-care)诊断和检验尿道病原体的敏感性的试剂盒。试剂盒开发为用于基础卫生医疗环境中的尿培养物。优选地将其设计为分为六个区室的9cm皮氏培养皿：所述六个区室为定量分析的一个较大区室和用于敏感性检验的五个较小区室。每个小区室中的琼脂包含以调整到分界点的浓度的五种抗微生物剂之一(对于丹麦和斯堪的那维亚优选地是：甲氧苄啶、磺胺甲二唑、氨苄西林、呋喃妥因和美西林(氮卓西林))，以使这些区室中的生长表示耐药性，不生长表示敏感性。皮氏培养皿优选地具有比通常培养皿即大约1.48cm更高的边缘，大约2.48cm。这允许将更大量、最多100ml的尿倒入培养皿用于接种。
平板中的琼脂优选地包括以下：
生色物质，
Isosensitest琼脂，
五个区室的琼脂中混杂的抗菌素：
磺胺甲二唑
甲氧苄啶
氨苄西林
呋喃妥因
美西林
该实施方案的阐释见于图2。
通过将尿(5-10ml足够)倾倒在平板上并用一只手转动平板以使液体覆盖所有六个区域而发生接种。此后倒掉尿；尿存在2-3秒足够接种。立即培养平板，优选地在35-37℃培养18-24h(室温对于大多数尿病原体是足够的，但生长较慢)。对平板的读取分为三个阶段：
1)评价生长量：如果存在任何生长，将其与显示以103、104、105、106和107CFU/ml的大肠杆菌的不同CFU量的图片方案比较。
2)通过再次与显示不同类型尿病原体的图片/颜色方案比较可以立刻评价生长类型。还记录不同菌落类型的数目，和根据以上方案的不同菌落类型的量。可以由颜色和菌落类型来区分细菌科/物种，如表5说明的：
表5：Flexicult平板上不同尿病原体的菌落和琼脂的颜色编码：
3)读取细菌生长的敏感性：单独读取每种细菌(如果多于一种)：将每种抗菌素区域中的生长与对照琼脂上的生长比较。如果抗菌素琼脂上有任何生长，且生长量与对照琼脂上的相似，那么认为该细菌对琼脂上的抗菌素耐药。如果没有生长(或显著地少于对照琼脂)，那么认为该细菌对该抗菌素敏感。如果生长是多于不生长和少于显著少的生长，则需要考虑是哪种抗菌素和哪种细菌：对于是抑菌药的磺胺甲二唑和甲氧苄啶，稀疏的微小菌落可能覆盖整个琼脂，但生长与对照琼脂相比显著减少：这记录为对所讨论的抗菌素敏感。当呋喃妥因和美西林用作抗菌素时，可观察到与对照琼脂上细菌相同类型的一些单菌落：这些不认为是耐药性突变体而是“耐药株”，即如果重复测试它们将表现为敏感。这还通常因为盘扩散而观察到，尤其对于美西林。
4)不同细菌的敏感性/耐药性还可用于诊断不同致病物种，因为一些细菌“天生”对一些抗菌素耐药；即它们固有地对一种或多种抗菌素耐药，相反耐药性细菌是因为暴露于抗菌素而获得的。这些耐药性-“模式”可见于表6。
表6：常见尿病原体的正常敏感性/耐药性。大多数细菌可以通过突变或转移含有耐药性机制的基因而变得对所讨论的抗菌素有耐药性
本发明的又另一方面提供根据本发明和如上界定的组合物在检测和/或诊断选自以下组成的组的感染中的应用：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染、包括肺炎球菌感染的链球菌感染。尤其是本发明提供所述组合物在检测和/或鉴定致尿道病的微生物中的应用。
又另一方面提供用于检测和/或诊断选自以下组成的组的感染的根据本发明和如上界定的组合物：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染、包括肺炎球菌感染的链球菌感染。
本发明进一步提供诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，其包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与如上界定的平台接触。
根据本发明，还提供了诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，其包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与如此前界定的检验组合物(诸如两种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、或7种或更多种检验组合物)接触并与还如此前界定的对照组合物接触。
如将理解的，检验组合物包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质或底物和抗微生物剂。如上解释的对照组合物包含所述半固体生长培养基和所述两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)但不包含任何抗微生物剂或包含不同于检验组合物中存在的抗微生物剂的抗微生物剂。
在本发明方法中和通过使用根据本发明的组合物、平台或试剂盒分析的样品可选自以下组成的组：体液样品、粪便样品、粘液样品、皮肤样品、软组织样品、食物或食物成分样品、动物饲料样品和微生物(如细菌)纯培养物。
在优选实施方案，尤其是关于诊断、检测和/或表征尿路感染的实施方案，该样品是尿样。
如此提供的方法可进一步包括优选地在15-39℃的温度，且优选地在环境大气下培养所述平台10小时或更久，诸如11小时或更久、12小时或更久、13小时或更久、14小时或更久、15小时或更久、16小时或更久、17小时或更久、或18小时或更久的时期步骤。
该方法可进一步以包括目视检查平台的微生物生长的步骤为特征。这一目视检查组合物的微生物生长的步骤可尤其包括：
i)评价所述对照组合物上任何微生物生长的量，任选地通过参考显示不同量的菌落形成单位的标准；并
ii)评价包含所述半固体生长培养基和所述两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)，但不包含任何抗微生物剂/不同于检验组合物中存在的抗微生物剂的抗微生物剂的所述对照组合物上任何微生物生长的类型，任选地通过参考显示微生物不同种群或不同菌株生长的标准(诸如图片和/或颜色方案)；并
iii)通过比较所述检验组合物(诸如两种或更多种、3种或更多种、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、50或90种或更多种检验组合物)上的生长量与所述对照组合物上的生长量来确定所述微生物生长的抗微生物剂敏感性。
显示不同量的菌落形成单位的合适的标准和显示微生物不同种群或不同菌株生长的标准如上所述。
目视检查组合物的微生物生长的步骤可进一步包括确定如此前界定的所述检验组合物(诸如两种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、或7种或更多种组合物)上或所述对照组合物上不同菌落类型的数目和任选地每种类型的菌落的量。
该方法可进一步包括确定所述样品中的微生物是否对所述检验组合物中的抗微生物剂敏感，存在的敏感性由以下表示：
i)在所述检验组合物上或在一种或多种所述检验组合物上不存在微生物生长，而在所述对照组合物上存在微生物生长，或
ii)在所述检验组合物上或在一种或多种所述检验组合物上以及所述对照组合物上存在微生物生长，在所述检验组合物上或在一种或多种所述检验组合物上的菌落数目或面积比所述对照组合物上的数目或面积小至少100倍。
在进一步的方面，本发明提供制造根据本发明的组合物的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
类似地本发明公开制造根据本发明的平台的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
最后本发明提供制造根据本发明的诊断试剂盒的方法，包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
应注意的是，在本发明多个方面的一个方面上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其它方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用其全文并入本文。
在以下非限制性实施例，现在将进一步详细地描述本发明。
实施例
实施例1：基于6-区室皮氏培养皿(Flexicult)制备平台
制备Iso-sensitest琼脂并将其与包含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-磷酸酯的1.5g/l生色底物混合物组合。
可选地使用Discovery琼脂(Oxoid，CM 1087)。
制备抗菌素溶液：甲氧苄啶、磺胺甲噻二唑、氨苄西林、呋喃妥因和美西林。
制备热平板，由PT-100传感器调节温度：
1.将装有Iso-sensitest/Discovery琼脂的瓶在105℃融化60min。融化后，将瓶放置在56℃水浴大约60min。
2.准备填充Flexicult的设备：Variomag(Multitherm Stirring Block恒温器和Telemodul 40CT互连，然后连接到插座。Telemodul 40CT是控制温度和加热块的搅拌速度的部件。借助PT-100传感器调节温度，该传感器安装在Telemodul 40CT背面。
3.从水浴取出装有Iso-sensitest/Discovery琼脂的瓶并放置在Multitherm Stirring Block上；每个瓶备有无菌磁铁。
4.PT-100传感器的缆线安装在Telemodul 40CT背面，烤焦接触点，随后以外科用酒精润湿的无菌布彻底地擦拭。随后将接触点放在装有美西林的烧瓶中。Telemodul 40CT立刻调节琼脂中的温度到所需的设定点～大约50.0℃±2.0℃。磁力搅拌器的速率随着烧瓶的内容物调整(起始)：235/min。
准备分液器：
准备分液器(Fill-Master 251和Fill-Master 311)。向Fill-Master 251连接一个4mm无菌硅胶管，向Fill-Master 311连接五个2mm无菌硅胶管。将各分液器设置在正确的管大小(分别是2mm和4mm)。
设置填充体积以使填充的体积+培养皿的重量在31-33g的范围中。经常检查它。
加入抗菌素溶液：
注意：直到温度低于54.0℃，才应将5种抗菌素溶液加入琼脂。由Telemodul CT 40的显示，检查琼脂的温度。
甲氧苄啶(16μg/mL)：
用有刻度的移液管将甲氧苄啶母液加入到Iso-sensitest/Discovery琼脂。
在Multitherm热平板上彻底混合溶液。将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
磺胺甲噻二唑(700μg/mL)：
用有刻度的移液管将磺胺甲噻二唑母液加入到Iso-sensitest/Discovery琼脂。
在Multitherm热平板上彻底混合溶液。将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
氨苄西林(32μg/mL)：
用有刻度的移液管将氨苄西林母液加入到Iso-sensitest/Discovery琼脂。
在Multitherm热平板上彻底混合溶液。将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
呋喃妥因(32μg/mL)：
用有刻度的移液管将呋喃妥因母液加入到Iso-sensitest/Discovery琼脂。
在Multitherm热平板上彻底混合溶液。将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
美西林(16μg/mL)：
用有刻度的移液管将美西林母液加入到Iso-sensitest/Discovery琼脂。
在Multitherm热平板上彻底混合溶液。将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
无抗菌素的Iso-sensitest/Discovery琼脂：
将吸管放入瓶中并与合适的填充针头连接。
填充皮氏培养皿中的6个部分：
将6个填充针头放入分液器头，确保剂量与图2符合。
实施例2：稳定性检验
Flexicult中发色琼脂的稳定性通过检验在冰箱(＜4℃)中保存达4个月的Flexicult琼脂来确定，并在产生表2中提到的所有细菌的临床菌株1、2、3和4个月后检验了生长状况(量、菌落大小、菌落和琼脂的颜色)，产生后长达4个月(与产生后第1天出现的)观察到关于以下相同结果：
琼脂稳定性(水含量/干燥、形式)
细菌菌落的显色
对抗菌素(磺胺甲二唑、甲氧苄啶、氨苄西林、呋喃妥因和美西林的敏感性/耐药性。
实施例3：临床验证
已在两个GP诊所检验了Flexicult琼脂试剂盒。两个诊所都有9-10位GP在诊所工作，并由临床生化技师员工进行常规尿培养(由浸片或琼脂平板，随后在某些病例进行抗菌素盘扩散敏感性)。
对于该研究，将Flexicult平板接种来自基于病史和症状怀疑患有UTI的患者的尿，并对每个诊所的常规培养系统平行地进行。在35-37℃的环境大气中培养平板18-24h(在周五进行的检验，在周六不能读取而未包括)。由技师读取平板并记录结果(通过使用来自Statens Serum Institut的平板一起提供的材料：显示Flexicult平板上细菌量的图片方案，参见图3，和显示尿病原体不同菌落类型的图片方案，参见图4)。此后将平板转移到国家抗微生物剂和感染控制中心、Statens Serum Institut，在这里再次读取平板，将来自具有一种或两种可能的尿病原体相关生长的平板的菌落处理用于根据实验室常规使用API-20E、Vitec或生化检验的诊断。进一步地，通过在Mueller-Hinton琼脂中的琼脂稀释物根据CSLI(以前称为NCCLS)确定对于所有相关细菌，针对磺胺甲二唑、甲氧苄啶、氨苄西林、呋喃妥因和美西林的MIC。
结果：细菌的诊断记录在表7，显示试验性和实际的诊断、以及正确诊断的百分比(在种群水平或物种水平)。
表7.临床验证试验结果，检验读数的试验性诊断相比于随后细菌的最终诊断。
  总计   错误的诊断分离株数目   正确的诊断分离株数目   正确的诊断％总数
  大肠杆菌   205   16   189   92,2
  克雷伯氏菌属/肠杆菌属   23   0   23   100,0
变形杆菌/摩根氏菌  19   4   15   78,9
  其它肠杆菌科   4   4   0
  铜绿假单胞菌   6   0   6   100,0
  粪肠球菌   67   1   66   98,5
  B族链球菌   12   9   3   25,0
  腐生性葡萄球菌   6   0   6＊   100,0
  绿色气球菌   2   1   1   50,0
  其它   22   12   10   45,4
  念珠菌属   23   0   23   100,0
  总计   389   47   342   88
关于敏感性的确定，即比较细菌的测量的MIC与检验的读数，表7和8显示表8中革兰氏阴性细菌和表9中革兰氏阳性细菌的结果。根据如下分析了结果：结果的读数和报告是否可被分为错误(即对I是S、对R是I、对I是R、或对S是I的结果)、大的错误(即记录为R，但实际上是S，这表示患者可能被用另一种药物治疗)和非常大的错误(即报告为S但实际上是R，这可能带有使得患者被用不具有作用的抗菌素治疗的风险)。
表8：Flexicult琼脂上生长的革兰氏阴性细菌的敏感性/耐药性的读数结果，相比于随后由琼脂-稀释物确定的MIC。数字表示记录的结果的菌株数目(总数的％)。
  甲氧苄啶N＝248   磺胺甲噻二唑N＝231 氨苄西林N＝247 呋喃妥因N＝183 美西林N＝246
  错误S/R＞＜I 0   1(0.4％)   2(0.8％)   3(1.6％)   11(4.5％)
  大的错误R＞＜S 2(0.8％) 7(3.0％) 5(2.0％) 4(2.2％) 17(6.9％)
  非常大的错误S＞＜R 2(0.8％) 1(0.5％) 1(0.4％) 8＊(4.4％) 1(0.4％)
表9：Flexicult琼脂上生长的革兰氏阳性细菌的敏感性/耐药性的读数结果，相比于随后由琼脂-稀释物确定的MIC。数字表示记录的结果的菌株数目(总数的％)。
甲氧苄啶   磺胺甲噻二唑 氨苄西林N＝26 呋喃妥因N＝26 美西林
  错误S/R＞＜I - - 0(0％) 0(0％) -
  大的错误R＞＜S - - 1(3.8％) 0(0％) -
  非常大的错误S＞＜R    -   -   0(0％)   0(0％)   -
临床验证的结论：结果显示Flexicult关于在尿病原体种群或物种水平的诊断的高度准确性。
而且，并入Flexicult检验的敏感性检验的结果与盘-扩散检验相当，具有＜5％的非常大的错误。当然，检验可用于诊断患者的UTI，通过发现在所有相关计数的细菌的量以诊断尿病原体(多达约90％的病原体被正确地诊断到种群或物种水平)。对此前患有过UTI的患者的再检验将帮助显示是否存在相同或新类型的病原体，即在某些程度上将可能区分复发或新感染。当包括所讨论的分离株的敏感性时，通过观察发现的分离株的“resisto-型”，这可以帮助诊断可能的复发/再感染。
实施例4：基础医疗中Flexicult相比于其它诊断方法。比较Flexicult与一般实践中用于诊断的其它可获得的方法和尿病原体的敏感性检验：
表10：对基础医疗中UTI不同诊断检验的比较。
Figure GPA00001037598800491
*NA，不适用
参考文献
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Claims (66)

1.一种组合物，其包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)和抗微生物剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述半固体生长培养基包含色氨酸。
3.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述半固体微生物生长培养基是这样一种培养基，在其上：
i)加入16mg/l氨苄西林导致由参考菌株大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少5logCFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
ii)加入32mg/l呋喃妥因导致由参考菌株腐生性(saprophytics)ATCC49907形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少4logCFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
iii)加入700mg/l磺胺甲噻二唑导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少3log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
iv)加入16mg/l甲氧苄啶导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少3log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的；
v)加入16mg/l美西林导致由参考菌株大肠杆菌ATCC 25922形成的菌落的生长或菌落的数目减少至少5log CFU/ml，如将该组合物与包含105CFU/ml的悬液接触并在37℃和环境大气培养该组合物18-24小时后确定的。
4.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述半固体培养基包含半乳糖聚合物(琼脂)或明胶。
5.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述微生物生长培养基选自以下组成的组：Iso-sensitest琼脂、Danish血琼脂和Mueller-Hinton培养基。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述培养基包含从4-25g/l半乳糖聚合物。
7.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述微生物生长培养基是对其上生长的有机体(被处理以施加)或(能够施加)选择压的选择培养基，诸如对革兰氏阴性细菌或对革兰氏阳性细菌选择性的培养基。
8.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，所述组合物包含2种或更多种抗微生物剂，诸如3种或更多种抗微生物剂，诸如4种或更多种抗微生物剂，或诸如5种或更多种抗微生物剂。
9.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂或至少一种所述抗微生物剂选自以下组成的组：阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、两性霉素-B、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、苄青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑林、头孢地尼、头孢吡肟、头孢克肟、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢哌酮舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊肟-克拉维酸、头孢泊肟-舒巴坦、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢噻呋、Ceftobiprole、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、氟苯尼考、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、复方磺胺甲噁唑(甲氧苄啶/磺胺甲噁唑)、达巴万星、达福普汀/Quinopristin、达托霉素、地贝卡星、双氯西林、多利培南、多西环素、恩氟沙星、尔他培南、红霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、亚胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳头孢、美西林(氮卓西林)、美罗培南、双唑泰栓、美洛西林、美洛西林-舒巴坦、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林-舒巴坦、哌拉西林-三唑巴坦、利福平、罗红霉素、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、替考拉宁、特拉万星、泰利霉素、替莫西林、四环素、替卡西林、替卡西林-克拉维酸、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶、曲伐沙星、泰洛星、万古霉素、维吉霉素、伏立康唑。
10.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂或至少一种所述抗微生物剂选自以下组成的组：氨基糖苷类、哌拉西林/三唑巴坦、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、脂肽类、抗微生物肽(如多霉素或粘菌素)。
11.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：氨苄西林/阿莫西林、磺胺、甲氧苄啶、呋喃妥因、美西林、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)。
12.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：甲氧苄啶、磺胺甲二唑、氨苄西林、呋喃妥因和美西林(氮卓西林)。
13.根据权利要求1-10任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)。
14.根据权利要求1-10任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：阿莫西林、克拉维酸/氨苄西林、舒巴坦、环丙沙星(或其它氟喹诺酮)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、头孢氨苄/头孢呋辛/头孢羟氨苄/头孢克洛(或其它口服头孢菌素)、呋喃妥因和磷霉素(磷霉素-trometerole)。
15.根据权利要求1-10任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：阿莫西林/克拉维酸(或舒巴坦)、苯氧甲基-青霉素、头孢菌素(如头孢呋辛酯、头孢氨苄)、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(任选地组合用于口服治疗)、四环素(多西环素或任何其它四环素组)、氯霉素、磷霉素、大环内酯/克林霉素和利福平。
16.根据权利要求1-10任一项所述的组合物，其中所述抗微生物剂选自以下组成的组：氨基糖苷类、头孢菌素类(头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢泊肟、头孢曲松及其它)、哌拉西林/三唑巴坦、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、脂肽类、利奈唑胺、抗微生物肽(如多霉素或粘菌素)。
17.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述两种或多种生色物质选自以下组成的组：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺、3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-联苯亚基)-双-2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、邻硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷、3，4-环己酮七叶苷-β-D-半乳糖苷、8-羟基喹啉-β-D-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、8-羟基喹啉-β-D-葡萄糖醛酸苷、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、4-氯-1-萘酚、3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐、邻苯二胺、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、4-[2-(4-辛酰基氧-3，5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-喹啉鎓-1-(丙烷-3-基-羧酸)-溴化物、5-溴-6-氯-3-吲哚基-辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-肌-肌醇-1-磷酸酯。
18.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述两种或多种生色物质的至少一种选自以下组成的组：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-磷酸酯。
19.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述荧光物质选自以下组成的组：4-甲基伞形基磷酸酯、4-甲基伞形基-β-D-吡喃型半乳糖苷、4-甲基伞形基β-D-吡喃型乳糖苷和4-甲基伞形基b-D-葡萄糖醛酸苷。
20.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中每种所述生色物质或荧光物质以0.001-1.0g/l的量存在。
21.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含3种或更多种生色物质或荧光物质，诸如4种或更多种生色物质或荧光物质、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、或10种或更多种生色物质或荧光物质。
22.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种生色物质或荧光物质。
23.根据前述权利要求的任一项所述的组合物，其中当在4℃或更低的温度储存时所述组合物稳定长达12个月的期间。
24.一种平台，其包含根据权利要求1-23任一项所述的组合物。
25.根据权利要求24所述的平台，其中所述平台是为了诊断、检测和/或表征微生物感染或污染。
26.根据权利要求24或25任一项所述的平台，其包含多种根据权利要求1-23任一项所述的组合物，其中至少2种组合物包含不同的抗微生物剂包含不同的抗微生物剂或其中每种组合物包含不同的抗微生物剂。
27.根据权利要求24-26任一项所述的平台，其中所述平台包含以下：
i)检验组合物，其包含半固体微生物生长培养基，诸如权利要求2-7任一项界定的半固体微生物生长培养基，和两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)，诸如权利要求17-22任一项界定的生色物质或荧光物质(或底物)，以及抗微生物剂，诸如权利要求9-16任一项界定的抗微生物剂，和
ii)对照组合物，其包含半固体微生物生长培养基，诸如权利要求2-7任一项界定的半固体微生物生长培养基，和两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)，诸如权利要求17-22任一项界定的生色物质或荧光物质(或底物)，但不包含抗微生物剂，诸如权利要求9-16任一项界定的抗微生物剂。
28.根据权利要求24-27任一项所述的平台，其中所述平台包含固体支持物。
29.根据权利要求28所述的平台，其中所述固体支持物包括以下：
i)凹槽(10)，其能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器，所述凹槽被分为两个或多个分开的区室(11-16)，每个区室包含如权利要求1-23任一项界定的组合物(检验组合物)、或如权利要求27ii)界定的对照组合物，和一个或多个用于将所述凹槽分隔为所述分开的区室的一体的分隔组件(17)，或
ii)多个凹槽18，每个凹槽能够作为可能有微生物感染或污染的样品的容器，每个凹槽包含如权利要求1-23任一项界定的组合物、或如权利要求27ii)界定的对照组合物。
30.根据权利要求29所述的平台，其中所述凹槽或所述多个凹槽具有从1-40mm，诸如从1-35mm、从1-30mm、从1-25mm、从5-40mm、从5-35mm、从5-30mm、从5-25mm、从10-40mm、从10-35mm、从10-30mm、从10-25mm、从15-40mm、从15-35mm、从15-30mm或诸如从25-25mm的深度。
31.根据权利要求29-30任一项所述的平台，其中所述组合物以对应所述凹槽或孔容积的从5-75％的量，诸如从10-75％、从10-65％、从10-55％、从10-45％、从10-35％、从20-75％、从20-65％、从20-55％、从20-45％、从20-35％、诸如从25-75％、从25-65％、从25-55％、从25-45％、从25-35％、或诸如以对应凹槽或区室容积的从25-35％的量在每个凹槽或每个孔中存在。
32.根据权利要求29i)所述的平台，其中所述凹槽被分隔为3个或更多个区室，诸如4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、40个或更多个、60个或更多个、或90个或更多个区室。
33.根据权利要求29ii)所述的平台，所述平台具有3个或更多个凹槽，诸如4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、40个或更多个、60个或更多个、或90个或更多个凹槽。
34.根据权利要求29i)所述的平台，其中所述分隔组件已被处理以防止抗微生物剂在区室之间扩散。
35.根据权利要求28-34任一项所述的平台，其中所述固体支持物是以封闭或开放容器的形式，诸如盘、试管、瓶、多孔板、微量滴定板、条(浸渍条)和载玻片。
36.根据权利要求28-35任一项所述的平台，其中所述固体支持物是从塑料/聚合物基质、从玻璃基质或从金属基质制造的，所述塑料/聚合物基质诸如聚氯乙烯基质、聚乙烯基质、聚丙烯基质、聚碳酸酯基质、丙烯腈丁二烯苯乙烯基质、聚甲基丙烯酸甲酯基质或聚苯乙烯基质。
37.根据权利要求28-36任一项所述的平台，其中所述固体支持物是皮氏培养皿，诸如具有从50至150mm的直径的皮氏培养皿。
38.根据权利要求28-37任一项所述的平台，其中所述平台适于用于检测和/或诊断选自以下组成的组的感染：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌(meningococci)感染、淋球菌(gonococci)感染和链球菌(streptococci)感染。
39.根据权利要求24-38任一项所述的平台，所述平台包含酶。
40.根据权利要求39所述的平台，其中所述酶是白细胞酯酶。
41.根据权利要求39-40任一项所述的平台，其中所述酶包含在所述支持物的分开的或一体的组件中。
42.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-23任一项所述的组合物。
43.一种试剂盒，其包含根据权利要求24-41任一项所述的平台。
44.根据权利要求42或43任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于诊断、检测和/或表征微生物感染或污染。
45.根据权利要求42-44任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含显示在如权利要求24-41任一项界定的平台上生长量的标准，所述标准是将所述平台与具有预先确定滴度的微生物参考菌株的悬液接触获得的。
46.根据权利要求42-44任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含显示在如权利要求24-41任一项界定的平台上生化色素和/或荧光显色的标准，所述标准是在一种或多种微生物参考菌株平台上生长获得的。
47.根据权利要求45-46任一项所述的试剂盒，其中所述标准是如权利要求24-41任一项界定的平台的照相或印刷复制。
48.根据权利要求45-46任一项所述的试剂盒，其中通过将如权利要求24-41任一项界定的平台与以下接触而产生所述标准：
i)大肠杆菌细菌的参考菌株，诸如大肠杆菌(ATCC 29522)细菌、和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的参考菌株，诸如金黄色葡萄球菌ATCC 25913。
49.根据权利要求45所述的试剂盒，其中通过以下步骤产生所述标准：
i)提供密度为0.9％盐水中0.5McFarland/1+E08CFU/mL所述参考菌株的悬液；
ii)提供i)中所述悬液的一系列10倍稀释液，最低密度为+E03CFU/mL；
iii)将ii)中的每种所述稀释液与如权利要求24-41任一项界定的平台接触，优选地2-3秒，随后轻轻倒出所述溶液；
iv)在35℃在环境大气培养每个平台过夜。
50.根据权利要求42-49任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种分别包装的抗微生物剂。
51.根据权利要求1-23任一项所述的组合物在检测和/或鉴定致尿道病的微生物中的应用。
52.根据权利要求1-23任一项所述的组合物在检测和/或诊断选自以下组成的组的感染的应用：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染、包括肺炎球菌(pneumococci)感染的链球菌感染。
53.用于检测和/或诊断选自以下组成的组的感染的根据权利要求1-23任一项所述的组合物：尿路感染、皮肤和软组织感染、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)感染、脑膜炎球菌感染、淋球菌感染、链球菌感染和肺炎球菌感染。
54.一种诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与如权利要求24-41任一项界定的平台接触。
55.一种诊断、检测和/或表征微生物感染或污染的方法，其包括以下步骤：
i)提供可能有微生物感染或污染的样品；并
ii)将所述样品与如权利要求27i)界定的、包含半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)、和抗微生物剂的检验组合物接触，并与如权利要求27ii)界定的、包含所述半固体生长培养基和所述两种或多种生色物质或荧光物质(或底物？)但不包含任何抗微生物剂或所述抗微生物剂的对照组合物接触。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述样品选自以下组成的组：体液样品、粪便样品、粘液样品、皮肤样品、软组织样品、食物或食物成分样品、动物饲料样品和微生物(如细菌)纯培养物。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述样品是尿样。
58.根据权利要求55-56任一项所述的方法，所述方法包括在15-37℃的温度、优选地在环境大气培养所述平台18小时或更久时期的另外步骤。
59.根据权利要求55-58任一项所述的方法，所述方法包括目视检查平台的微生物生长。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述目视检查所述组合物的微生物生长的步骤包括：
iv)评价所述对照组合物上任何微生物生长的量，任选地通过参考显示不同量的菌落形成单位的标准；并
v)评价如权利要求27ii)界定的、包含所述半固体生长培养基和所述两种或多种生色物质或荧光物质(或底物)但不包含任何抗微生物剂或所述抗微生物剂的所述对照组合物上任何微生物生长的类型，任选地通过参考显示微生物不同种群或不同菌株生长的标准(诸如图片和/或颜色方案)；并
vi)通过比较如权利要求27i)界定的所述检验组合物上的生长量与所述对照组合物上的生长量来确定所述微生物生长的抗微生物剂敏感性，任选地通过参考标准。
61.根据权利要求59-60任一项所述的方法，其中所述目视检查组合物的微生物生长的步骤包括确定如权利要求1-22任一项界定的所述组合物上或所述对照组合物上不同菌落类型的数目，和任选地每种类型菌落的量。
62.根据权利要求60-61任一项所述的方法，其中所述标准是如权利要求45-49任一项界定的标准。
63.根据权利要求54-62任一项所述的方法，其包括确定所述样品中的微生物是否对所述检验组合物中的抗微生物剂敏感，存在的敏感性由以下表示：
i)在所述检验组合物上或在一种或多种所述检验组合物上不存在微生物生长，而在所述对照组合物上存在微生物生长，或
ii)在所述检验组合物上或在一种或多种所述检验组合物上以及所述对照组合物上存在微生物生长，在所述检验上或在一种组合物上的菌落数目或面积比所述第一组合物上的数目或面积小至少100倍。
64.制造根据权利要求1-23任一项所述的组合物的方法，其包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
65.制造根据权利要求24-41任一项所述的平台的方法，其包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
66.制造根据权利要求42-50任一项所述的诊断试剂盒的方法，其包括组合半固体微生物生长培养基、两种或多种生色物质(或底物)和抗微生物剂的步骤。
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