CN104508140A - 检测产生oxa-048碳青霉烯酶的细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测和/或特异性鉴别生物学样品中产生OXA-048型碳青霉烯酶的细菌的方法，所述方法包括如下步骤：a)将可能含有所述细菌的生物学样品与反应培养基接触，所述培养基包含用于检测酶活性的至少一种生色底物及浓度等于或大于150mg/L的替莫西林，优选浓度为200-500mg/L，b)将所述样品在培养基中保温以使得细菌生长，及c)检测相应于产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的菌株。本发明还涉及步骤a)中使用的培养基。

Description

检测产生OXA-048碳青霉烯酶的细菌的方法
本发明涉及微生物学分析领域。更具体地，本发明涉及检测和/或鉴别产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的方法。
β-内酰胺抗生素类型如青霉素和头孢菌素类药物的抗生素抗性增加使得治疗由革兰氏阴性菌株导致的感染变得复杂。这些抗生素因此被其它广谱抗微生物制剂代替。碳青霉烯在这些广谱抗微生物制剂中发挥重要作用，特别是在治疗住院患者中。碳青霉烯对于大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧菌及对于某些厌氧菌起作用。
然而，在住院患者中出现增加数目的碳青霉烯抗性菌株。此外，需要快速检测呈现出碳青霉烯酶活性的菌株，以在适当情况中进行抗生素治疗，使得可以适当地治疗感染，并用以鉴别携带者以降低这些菌株在护理中心增殖的危险。
β-内酰胺酶是导致β-内酰胺抗生素抗性的细菌性酶，其命名不完全是标准化的。其基于其一级原始结构可以分为四种分子类别(A-D)(Ambler分类)，或者基于靶向的底物及其对抑制剂的抗性按功能分组(参见Bush andJacoby,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2010；54(3):969-976)。
碳青霉烯抗性细菌非限制性地是：大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、臭鼻克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、产气单胞菌(Aeromonas sp.)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、肠球菌(Enterococcus sp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)等。
这些细菌可产生能水解碳青霉烯的各种类型的β-内酰胺酶或者碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是非常广谱的β-内酰胺酶，能失活几乎所有β-内酰胺抗生素。根据Ambler分类法将其概括地分为三个类别：
A类，也称作丝氨酸碳青霉烯酶，特征在于通过克拉维酸及硼酸的衍生物的可变抑制。主要的代表物是KPC酶；
B类，也称作金属-碳青霉烯酶，特征在于通过阳离子螯合剂如EDTA的抑制。主要的代表物是NDM、VIM和IMP酶；
D类，其相应于OXA-型β-内酰胺酶，其中是变体OXA-48，其具有拥有碳青霉烯酶活性的特性。尽管不是常见的，但是存在通过点突变从OXA-48中衍生的其它变体，其保留这种碳青霉烯酶活性。可以提及的是OXA-162、OXA-163、OXA-181、OXA-204和OXA-232。
金属-β-内酰胺酶(MBL)和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)在肠杆菌中是普遍存在的，更特别是在北美洲、南美洲、以色列、意大利、希腊、印度、中国和巴基斯坦。苯唑西林酶-48(Oxacillinase-48，OXA-48)最近在土耳其、地中海盆地和在西欧已经分离。
碳青霉烯酶基因能存在于染色体和/或质粒中。由于在质粒形式中的这种存在，这些酶促类型抗性能非常明显地传播及因此在流行病学方面存在重大危险。
为了检测和/或鉴别碳青霉烯-抗性菌株，可以使用分子生物学技术，其是非常灵敏的并具有可以快速鉴别产生碳青霉烯酶的肠杆菌菌株的优势。然而，这些方法是昂贵且复杂的，大多数实验室中通常还不具备。
为了筛选、检测和/或鉴别产生碳青霉烯酶的肠杆菌(CPE)，本领域技术人员熟知基于培养的方法。这些方法是基于依次在通过加入碳青霉烯或者在产生示出碳青霉烯非敏感性抗菌谱之后而变为选择性的Mac-Conkey琼脂型常规培养基上或者在胰蛋白酶解的大豆肉汤中分离。在适当的情况中，可以使用浸渍了碳青霉烯或strips(bioMérieux)的培养皿。通过补加检测证实碳青霉烯酶的存在是必要的，可以提及的检测是：修改的Hodge检测(CLSI M100-S22:Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting；Twenty-Second Informational Supplement.January 2012.SupplementalTable 2A-S2)，及在琼脂中的扩散(或者组合的培养皿)协同检测，使用与碳青霉烯组合的抑制剂，例如对于B类碳青霉烯酶的EDTA，对于检测A类碳青霉烯酶的苯硼酸。Rosco公司提议一种多皿式方法以使用分离的菌株检测产生碳青霉烯酶的细菌(BioConnections KPC+MBL Confirm ID kit)，并建议加入包含30μg替莫西林的培养皿以检测OXA-48酶的存在。然而，这个检测示出替莫西林不抑制所有的KPC、AmpC和MBL菌株，因此其自身不能特异性检测OXA-48菌株。
因此。现有技术不能特异性检测OXA-48 CPE，需要三天的较长应答时间。此外，就预防多重抗性细菌感染而言，这些技术不太适于搜索用于寻找携带者的粪便或直肠样品中的CPE。
其它方法使用商业生色培养基如Brilliance CRE培养基 KPC培养基(CHROMagarTM,Paris,France)、Colorex KPC等价培养基(Biomed Diagnostics Inc.)，或者申请人的ESBL或CARBA培养基。后者的培养基证实能检测参考OXA-48菌株，但是条件是接种物量大(大约107CFU/ml)。已经描述了另一培养基(SuperCarba(Nordmann et al.,2012,J.Clin.Microbiol.,in press))，其能可靠地检测产生OXA-48的CPE，然而不能鉴别或特异性检测，因为产生其它类型碳青霉烯酶的细菌不被抑制。此外，这种培养基具有非常短的保存期限(大约一周)的缺点，这很大程度地限制其常规使用及其工业化。
因此，这些方法无一是同时足够敏感地、特异性地和快速地检测OXA-48菌株，并且还没有提出改良的解决方案。由于OXA-48菌株的检测在临床和流行病学方面是确实感兴趣的，因此仍然需要克服这个领域中现有培养基的缺点。
在此方面，本发明涉及一种特异性检测和/或鉴别生物学样品中产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的方法，所述方法包括如下步骤：
a)使可能含有所述细菌的生物学样品与反应培养基接触，所述培养基包含浓度高于或等于150mg/L、优选200-500mg/L的替莫西林及可以检测特异性酶活性的生色底物，
b)保温全部的混合物，以使得细菌生长，及
c)检测相应于产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的菌株。
实际上，本申请人的研究已经令人惊奇地示出高于或等于150mg/L的高浓度的替莫西林可以特异性区分OXA-48 CPE。优选地，使用的替莫西林的浓度为150-500mg/L。因此，本发明的方法可以敏感性、特异性及快速地检测(通常少于24小时)OXA-48 CPE，同时具有使用即用型培养基的优势，所述培养基具有较长的保存期限，使其可以工业化。有利地，本发明的方法也可以鉴别菌株。
替莫西林是替卡西林的6-α-甲氧基衍生物，其自身是青霉素，有时与克拉维酸组合使用。本文描述了针对多重抗性的肠杆菌科细菌的另一种治疗。
体外易感性测试已经由Livermore et al.(International Journal ofAntimicrobial Agents,2011；37:415-419)进行。他们表明最小抑制浓度(MIC)≥256mg/L，本领域技术人员对此的解释为，所检测的细菌可生长的最终测试替莫西林浓度为128mg/L。这些测试因此示出18/19的OXA-48菌株和32/35的具有金属-碳青霉烯酶的菌株对替莫西林具有抗性。这样阻止了本领域技术人员在特异性检测OXA-48的培养基中使用替莫西林。
给出以下定义以更清楚地理解本发明。
术语“生物学样品”是指分离的小部分或少量实体以进行分析。这个样品可以是人或动物临床样品，得自生物学液体样品，或者是食物样品，得自任何类型食物，或者是得自食物生产或运输环境的样品。这个样品因此可以是液体或固体。可以提及的非限制性的是全血、血清、血浆、尿液、粪便或脑脊液的临床样品，或者是鼻、咽喉、皮肤、直肠或伤口样品，食物样品，来自水、饮料如牛奶或果汁、来自酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等，食物样品，得自动物饲料如特别是得自动物肉的样品，或者地表或水处理样品。优选地，根据本发明，所述样品是临床样品。
样品可以现状使用或者在分析前可以经历富集、稀释、提取、浓缩和/或纯化等制备，根据本领域技术人员已知的方法制备。
术语“反应培养基”是指包含为代谢物表达和/或微生物生长所需的所有成分的培养基。反应培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体培养基”是指例如凝胶或琼脂培养基。琼脂是在微生物学中培养微生物的常规胶凝剂，但是可以单独或组合使用明胶、琼脂糖或其它天然或人工胶凝剂。某些制备物是可以商购的，例如Columbia琼脂、胰蛋白酶消化的大豆琼脂、Mac Conkey琼脂、Mueller Hinton琼脂，或者在Handbook ofMicrobiological Media(CRC Press)中描述的更通常的那些琼脂。
反应培养基可包含一或多种元件组合，如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。所述培养基也可包含染料。例如可以提及的染料是Evans蓝、中性红，绵羊血、马血，遮光剂如氧化钛或高岭土，硝基苯胺，孔雀绿，亮绿，或者一或多种代谢指示物，一或多种代谢调节物等。
反应培养基可以是展示培养基或者是培养和展示培养基。在第一种情况中，微生物的培养在接种之前进行；在第二种情况中，培养基还包含检测和/或鉴别培养基。鉴别是指微生物在感兴趣的种或群中的分类。
本领域技术人员也可以使用双平板或者包含两个隔室的Petri型培养皿，使得可以容易地对比包含不同底物或者不同的选择性混合物的两个培养基，其上已经沉积了相同的生物学样品。
反应培养基可包含一或多种选择剂。术语“选择剂”是指能阻止或减缓除了靶微生物之外的微生物生长的任何化合物。非限制性地，浓度在0.01mg/L-5g/L之间特别适于本发明。
作为选择剂，可以提及的是抗生素、抗真菌剂、胆盐、结晶紫、碱性品红、亮绿、表面活性剂如TergitolTM等。术语“抗生素”是指能阻止或减缓细菌生长的任何化合物。它们特别属于β-内酰胺抗生素、糖肽、氨基糖苷、多肽、磺胺、喹诺酮类。例如可以特别提及的抗生素是羧苄青霉素、替卡西林、替莫西林、福米西林、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、头孢泊污、氨曲南、厄他培南、法罗培南、多利培南、万古霉素、庆大霉素、甲氧苄啶、托普霉素、拉氧头孢、磷霉素、D-环丝氨酸、多粘菌素、粘菌素、喹诺酮类如萘啶酸。
术语“抗真菌剂”是指能阻止或减缓酵母或霉菌生长的任何化合物。例如可以特别提及的是两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、放线菌酮和氟胞嘧啶。
术语“生色底物”是指可以通过直接或间接可检测信号检测靶微生物的酶或代谢活性的底物。对于直接检测，这种底物可以与作为标记的成分结合，其是荧光或有色的(Orenga et al.,2009；J.Microbiol.Methods；79(2):139-55)。对于直接检测，本发明的反应培养基可另外包含pH指示剂，其对由于底物的消耗所致pH变化敏感及展示靶微生物的代谢。所述pH指示剂可以是生色团或者荧光团。生色团例如可以提及的是溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、苯胺蓝和溴甲酚蓝。荧光团包含例如4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物或者试卤灵衍生物。
根据本发明，生色底物优选选自基于如下基团的底物：吲哚酚(3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚酚、5-碘-3-吲哚酚、4-氯-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚、6-溴-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、6-氟-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚酚、N-甲基-3-吲哚酚、AldolTM等)；伞形酮(4-甲基伞形酮，环己烯七叶亭等)；茜素；p-萘酚苯；硝基酚(正-硝基酚，对-硝基酚等)；羟基喹啉；cathecol(cathecol，二羟基黄酮，羟基黄酮等)；试卤灵；氯酚红；荧光素；氨基苯酚(对-氨基苯酚，二氯氨基苯酚等)；萘酚(α-萘酚，2-萘酚，萘酚-ASBI等)；氨基香豆素(7-氨基-4-甲基香豆素等)；萘基酰胺；吖啶(氨基苯基吖啶等)；氨基吩噁嗪(氨基苯并吩噁嗪，氨基戊基试卤灵等)；氨基苯乙烯基化合物(氨基苯乙烯基喹啉，aminostyryllepidinium等)。
例如，由生色底物靶向的酶活性可以属于水解酶类，优选苷酶、酯酶或者肽酶类。优选地，由生色底物靶向的酶活性选自：葡糖苷酸酶、半乳糖苷酶、核糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶、磷脂酶、氨基肽酶和脱氨酶。
例如，用于检测β-葡糖苷酸酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-β-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸，6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸，AldolTM-β-葡糖苷酸，茜素-β-葡糖苷酸，环己烯七叶亭-β-葡糖苷酸，或者其盐。
用于检测β-半乳糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-β-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷，6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷，AldolTM-β-半乳糖苷，茜素-β-半乳糖苷，环己烯七叶亭-β-半乳糖苷，或者其盐。
用于检测α-半乳糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-α-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷，6-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷，或者其盐。
用于检测β-葡糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-β-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-葡糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷，6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷，AldolTM-β-葡糖苷，茜素-β-葡糖苷，环己烯七叶亭-β-葡糖苷，硝基苯基-β-葡糖苷，二氯氨基苯基葡糖苷，或者其盐。
用于检测α-葡糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-α-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-葡糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-葡糖苷，6-氯-3-吲哚基-α-葡糖苷，硝基苯基-α-葡糖苷，或者其盐。
用于检测核糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-β-核糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-核糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-核糖苷，6-氯-3-吲哚基-β-核糖苷，茜素-β-核糖苷，硝基苯基-β-核糖苷，或者其盐。
例如，用于检测酯酶活性的底物可特别是饱和或不饱和的线性脂肪酸的酯，具有6-14个碳原子，优选具有7-9个碳原子，及4-甲基伞形酮、5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚基或者茜素的酯，或者其盐。优选地，其选自4-甲基伞形酮辛酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯，6-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-3-吲哚基辛酸酯或者茜素辛酸酯。
用于检测磷脂酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮-磷脂酰肌醇，4-甲基伞形酮-磷脂酰胆碱，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂酰肌醇，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂酰胆碱，硝基苯基-磷脂酰肌醇，硝基苯基-磷脂酰胆碱，或者其盐。
用于检测氨基肽酶活性的底物可特别是L-丙氨酰-7-酰胺-4-甲基香豆素，L-丙氨酰二氯酰胺苯基，L-丙氨酰-7-酰胺-1-戊基phenoxazinone，L-丙氨酰-4-amidostyrylquinaldinium，或者其盐。
用于检测脱氨酶活性的底物可特别是L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-组氨酸。
用于检测硫酸酯酶活性的底物可特别是4-甲基伞形酮硫酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚酚硫酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚硫酸酯，3-吲哚酚硫酸酯，酚酞二硫酸酯，或者其盐。
优选地，生色底物选自：5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-葡糖苷)，5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β-D-半乳糖苷(Magentaβ-Gal)，6-氯-3-吲哚酚-β-D-葡糖苷酸(Pink-β-Gur)，5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(GreenA-β-Glu)，甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(甲基-β-D-葡糖苷)，乳糖和L-色氨酸。
反应培养基也可以含有至少一种EDTA型阳离子螯合剂，以复合是B类碳青霉烯酶辅因子的锌，因此促进其抑制作用并因此能恢复β-内酰胺抗生素如替莫西林的活性。有利地，EDTA浓度在1.0-2.5mmol/L之间。
可以提及的其它螯合剂是：吡啶二羧酸，2-巯基乙醇及邻二氮杂菲衍生物。
术语“保温”是指在适当温度，通常在20-50℃之间，优选30-40℃维持1-48小时，优选4-24小时，更优选16-24小时。
术语“检测”是指用裸眼或者使用光学或数字仪器辨识靶细菌生长的尺度。有利地，当使用的培养基包含生色底物时，所述检测也可以对靶细菌进行分类鉴别。对于荧光底物及对于生色底物，检测是用裸眼或者使用光学或数字仪器进行。
术语“特异性”是指当寻找的细菌菌株不存在时，所述方法或反应培养基提供阴性结果的能力。换句话说，根据本发明，更特异性的鉴别相应于与不表达OXA-48碳青霉烯酶的菌株相关的假阳性数降低，而不是指抑制所有这些菌株。
术语“敏感性”是指当寻找的细菌菌株存在于样品中时提供阳性结果的能力。
因此，本发明涉及一种特异性检测和/或鉴别生物学样品中产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的方法，所述方法包括如下步骤：
a)将可能含有所述细菌的生物学样品与反应培养基接触，所述培养基包含生色底物及浓度高于或等于150mg/L、优选浓度为200-500mg/L的替莫西林，
b)保温全部的混合物，以使得细菌生长，及
c)检测相应于产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的菌株。
有利地，生色底物使得可以检测酶活性及鉴别检测的细菌。
有利地，所述反应培养基是培养基。
根据本发明的一个特定的实施方案，步骤a)中使用的反应培养基还包含EDTA型的二价阳离子螯合剂，优选浓度在1.0-2.5mM之间。
根据本发明的一个特定的实施方案，步骤a)中使用的培养基包含至少一种其它生色底物，其可以检测酶活性。
优选地，检测的以可以鉴别细菌的酶活性选自酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶和葡糖苷酸酶活性。
优选地，能产生OXA-48碳青霉烯酶的靶细菌是肠杆菌科细菌。
有利地，本发明的方法组合两种反应培养基，一种包含至少一种生色底物和替莫西林，另一种包含至少一种生色底物和碳青霉烯，优选法罗培南。优选地，两个隔室的Petri型培养皿，也称作双平板，可以组合这两种培养基。在保温后存在的菌落的对比可以鉴别相应于碳青霉烯抗性的菌株和/或产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌。
本发明还涉及即用型培养基以特异性检测和/或鉴别产生OXA-48碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌，其包含：
·营养性琼脂培养基，适于肠杆菌科细菌的生长，
·替莫西林，浓度高于或等于150mg/L，优选浓度为200-500mg/L，及
·至少一种生色底物。
有利地，所述培养基还包含EDTA型二价阳离子螯合剂，优选浓度为1.0-2.5mM。
最后，本发明涉及在琼脂或液体反应培养基中使用替莫西林，浓度高于或等于150mg/L，优选浓度为200-500mg/L，以特异性检测和/或鉴别可能包含于生物学样品中的产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌。
对于本发明，在存在样品的条件下，替莫西林在反应培养基中是均相的。替莫西林未浸渍在培养皿或试纸条上或是沉积在反应培养基上或之中的另一单独的容器上。
下文揭示的实施例的目的是便于理解本发明。这些实施例只是例证本发明而不限制本发明的范围。
实施例1：针对一组CPE菌株确定替莫西林的MIC(使用琼脂稀释方法)
使用的菌株集合：
反应培养基：基础是chromIDTMCPS培养基(bioMérieux,ref.43821-43829)，包含β-葡糖苷酸酶的生色底物、β-葡糖苷酶的生色底物、β-半乳糖苷酶的生色底物及脱氨酶底物。在这个基础培养基中加入替莫西林，浓度在后文示出。
检测的替莫西林范围：50-150-200-300mg/L(替莫西林二钠，EumedicaSA,Manage,Belgium)。
方法
通过沉积斑点接种培养基：于生理盐水中1μl的微生物悬浮液，0.5McF，稀释为1/10。
在37℃保温24小时。
在保温24小时后读取。其上获得阴性生长斑点的最小替莫西林浓度的培养基保留作为MIC。仅具有3个菌落或者生长不足或完全不生长的斑点被认为是阴性的。
结果
*IR:抗渗性介导的碳青霉烯抗性菌株。
结论
大多数非-OXA-48菌株的MIC≤200。大多数OXA-48菌株的MIC>300。仅小部分非-OXA-48菌株也具有MIC>300。
产生OXA-48碳青霉烯酶的菌株的检测(使用替莫西林浓度为200mg/L)：
因此，替莫西林呈现出在150mg/L浓度开始可以区分产生OXA-48碳青霉烯酶的菌株，在200mg/L可充分区分。
实施例2：通过导入特异性抑制剂优化检测特异性
通过加入EDTA抑制B类菌株(NDM、VIM、IMP)。
使用的菌株集合：
蛋白胨培养基：
与用于通过琼脂稀释确定替莫西林MICs的培养基相同(实施例1)。
替莫西林范围：50-150-200-300mg/L。
对于每种替莫西林浓度，检测EDTA二钠形式的活性EDTA的如下浓度：0、1.77、2.12、2.47和2.83mmol/L。
方法：与实施例1中使用的方法相同。
结果：
使用具有0mmol/L的EDTA的培养基获得的MICs的分布
使用具有1.77mmol/L活性EDTA的培养基获得的MICs的分布
使用具有2.12mmol/L活性EDTA的培养基获得的MICs的分布
使用具有2.47mmol/L活性EDTA的培养基获得的MICs的分布
使用具有2.83mmol/L活性EDTA的培养基获得的MICs的分布
结论：VIM和NDM型的B类CPE在存在EDTA条件下其MIC与使用的EDTA的浓度成比例地降低。另一方面，EDTA呈现出促进抗渗性介导的碳青霉烯抗性菌株(IR)的MIC略微增加。
在300mg/L浓度替莫西林获得的性能水平
导入EDTA从1.77mmol/L浓度开始使得特异性改良，如果其浓度保持≤2.12mmol/L则OXA-48菌株检测敏感性不降低。
实施例3：评估规定的原型培养基的性能水平
使用的菌株集合：
方法：
在55mm直径Petri培养皿中制备培养基。对于非-OXA-48菌株，使用在生理盐水中0.5McF细菌悬浮液接种；对于OXA-48菌株，使用1/100和1/10000稀释的0.5McF悬浮液接种。接种由3个1/4象限条纹组成，使用10μl接种测量杯：对于OXA-48菌株，理论上沉积104或102CFU；对于不产生OXA-48的菌株，为106CFU。
将培养基在37℃保温。在保温18和24小时后读取。
评估生长密度、菌落大小以及着色情况(颜色和强度)。
反应培养基与实施例1所用相同。还加入选择系统，其包含特异于非发酵的革兰氏阳性、酵母和革兰氏阴性菌的抗生素和抗真菌剂及邻氯青霉素和EDTA。
替莫西林范围：200、300、400和500mg/L。
检测不具有上述选择系统的具有200mg/L替莫西林的培养基。
在保温24小时的结果：
*包括3个菌株，仅检测到1个菌落
**包括2个菌株，仅1个菌落
***包括1个菌株，仅1个菌落
结论：所述选择系统的加入不影响OXA-48菌株的检测。在这个反应培养基配置中，从400mg/L的替莫西林开始，敏感性趋于略微降低。

Claims (11)

1.一种特异性检测和/或鉴别生物学样品中产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的方法，所述方法包括如下步骤：
a)使可能含有所述细菌的生物学样品与反应培养基接触，所述培养基包含使得可以检测酶活性的至少一种生色底物以及浓度为高于或等于150mg/L的替莫西林、优选浓度为200-500mg/L，
b)保温全部的混合物以使得细菌生长，及
c)检测相应于产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的菌株。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)中使用的培养基还包含EDTA型二价阳离子螯合剂，优选浓度为1.0-2.5mmol/L。
3.权利要求1或2的方法，其中可能存在于样品中的细菌是肠杆菌科细菌。
4.权利要求2或3的方法，其中在步骤a)中使用的培养基包含至少一种其它生色底物，使得可以检测酶活性。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述底物使得可以检测选自如下一组的至少一种酶活性：酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶及葡糖苷酸酶活性。
6.一种检测和/或鉴别生物学样品中的产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌和碳青霉烯-抗性细菌的方法，包括如下步骤：
a)将可能含有所述细菌的生物学样品与反应培养基接触，所述培养基包含可以检测酶活性的至少一种生色底物及浓度为高于150mg/L的替莫西林，且与另一种反应培养基接触，该另一种培养基包含可以检测酶活性的至少一种生色底物及碳青霉烯，优选法罗培南；
b)保温全部混合物以使得细菌生长，及
c)检测相应于碳青霉烯-抗性细菌和/或产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌的菌株。
7.权利要求7的方法，其中步骤a)在组合了步骤a)中所述的两种培养基的双平板上进行。
8.检测和/或鉴别产生OXA-48碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌的即用型培养基，包含：
·适于肠杆菌科细菌生长的营养性琼脂培养基，
·浓度高于或等于150mg/L的替莫西林、优选浓度为200-500mg/L，
·至少一种生色底物。
9.权利要求8的培养基，还包含EDTA型二价阳离子螯合剂，其浓度优选为1.0-2.5mM。
10.液体或琼脂反应培养基中浓度高于或等于150mg/L、优选浓度为200-500mg/L的替莫西林在检测和/或鉴别可能包含于生物培养基中的产生OXA-48碳青霉烯酶的细菌中的应用。
11.权利要求10的应用，其中将替莫西林与二价阳离子螯合剂组合，所述二价阳离子螯合剂的浓度优选为1.0-2.5mmol/L。
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