ES2446943T5 - Composiciones y medios para diagnosticar infecciones microbianas - Google Patents

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Description

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DESCRIPCIÓN
Composiciones y medios para diagnosticar infecciones microbianas
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a composiciones, plataformas, kits y procedimientos de diagnóstico, detección y/o
5 caracterización de una infección o contaminación microbiana. En particular, la presente invención se refiere a tales composiciones, plataformas, kits y procedimientos de diagnóstico, detección y/o caracterización de una infección del tracto urinario.
Antecedentes de la invención
Infección del tracto urinario (ITU):
10 La infección del tracto urinario es una de las infecciones más comunes en la medicina general así como la infección hospitalaria más común en el mundo occidental. La prevalencia global es un 3-5 % y la incidencia de 18/1.000 habitantes por año1. Las infecciones son más prevalentes en mujeres (riesgo seis veces mayor que en hombres), lo cual se explica normalmente por el hecho de que la abertura de la uretra está en contacto directo con la flora vaginal y que la uretra en las mujeres es bastante corta, al contrario que la uretra de los hombres, 4-5 veces más larga y por
15 lo tanto más protegida. Con respecto a los grupos de edad, las infecciones son más comunes a edades tempranas, es decir, antes del año de edad, y avanzadas, es decir, > 60 años de edad.
Aunque la mayoría de las infecciones son ITU bajas sin complicaciones, es decir, infección de la vejiga, que a menudo se curan por sí solas sin tratamiento antibiótico, la ITU también puede complicarse con infecciones renales ascendentes que pueden propagarse a la sangre dando lugar a septicemia y choque séptico. Alrededor del 50 % de 20 las bacteriemias debidas a Escherichia coli tienen el tracto urinario como foco, y la mortalidad para estas infecciones está alrededor de un 20 % a pesar de la existencia de antibióticos eficaces. En más de un tercio de los casos, la insuficiencia renal con uremia y tratamiento de diálisis está causada por infecciones crónicas del tracto urinario. Los procedimientos operativos y otras manipulaciones iatrógenas del tracto urinario tales como la cistoscopia, cateterización, etc., dan como resultado una cantidad significativa de infecciones, por ejemplo, la cateterización de la
25 vejiga da lugar a una bacteriuria en un 30-50 % de los pacientes después de una semana y casi en un 100 % después de un mes.
Patogénesis y etiología:
La ITU puede estar causada por un virus tal como un adenovirus y por flagelados tales como Trichomonas vaginalis, pero la mayoría de las infecciones (>98 %) está causada por bacterias, que en la mayor parte de los casos proceden 30 de la flora rectal del propio paciente. Debido al azar o a una higiene deficiente, las bacterias pueden propagarse desde el recto y el ano a través del perineo hasta la vagina, donde pueden colonizar la vagina y especialmente el área circundante al orificio uretral externo. Desde este punto pueden acceder a la uretra, ayudados por factores tales como, por ejemplo, temperaturas bajas que inhiben la función inmunitaria local o mediante factores físicos tales como el coito. Si las bacterias contienen factores de virulencia específicos, que pueden ayudarlas a adherirse a las 35 membranas mucosas en la uretra y la vejiga, pueden penetrar en y atravesar el epitelio y el tejido subyacente. El resultado es un proceso infectivo con la formación de microcolonias intracelulares, apoptosis de las células epiteliales y liberación de material celular y bacterias en la luz de la vejiga con riesgo de renovación de la infección. En muchos casos el sistema inmunitario en general eliminará las bacterias y restaurará la función normal del tejido de la pared de la vejiga, pero las bacterias en la luz de la vejiga pueden con el tiempo suficiente ascender también a
40 través de los uréteres hasta la pelvis renal, donde pueden propagarse aún más hasta la médula y la corteza de los riñones provocando pielonefritis, abscesos peri-o intrarrenales u otros problemas.
Se puede apreciar la reacción inmune en forma de números crecientes de leucocitos, mayoritariamente granulocitos, en la orina y en los tejidos implicados. En los casos más persistentes también pueden medirse los anticuerpos específicos contra el intruso después de 2-3 semanas. E. coli es el principal culpable y provoca un 60-90 % de las 45 ITU ya que esta bacteria posee a menudo los factores de virulencia necesarios para provocar una ITU, es decir, propiedades de adherencia (fimbrias o pilosidades con una predilección especial por los receptores del epitelio de la vejiga), movimiento celular (flagelos) y una gran cantidad de otros factores de virulencia, que permiten a las bacterias sortear la función inmunitaria y penetrar en el tejido humano. El resto de las infecciones está provocado por otras Enterobacteriaceae (Klebsiella y Enterobacter ssp., Proteus ssp.) y algunas bacterias grampositivas
50 (Enterococci, Staphylococcus saprophyticus, Aerococcus spp.) y más raramente Candida spp. Todavía se debate sobre el posible papel de Mycoplasma y Ureaplasma spp en las ITU.
Las bacterias pueden encontrarse en la orina de un paciente que no tiene síntomas u otros signos (por ejemplo, leucocituria), es decir, la denominada bacteriuria asintomática. Esto es particularmente común en los pacientes ancianos y se ha observado una prevalencia del 10-15 % en varios estudios.
55 Cuadro clínico:
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La infección de la vejiga produce dolor localizado, el cual puede sentirse detrás de los huesos púbicos o tal vez en la fosa renal -pero este es a menudo un signo de la afectación de los riñones, así como dolor al miccionar. Asimismo, la irritación de la vejiga dará lugar a micciones frecuentes. También puede desarrollarse fiebre aunque esto es más
5 común en caso de pielonefritis. La orina cambiará su color y turbidez hasta ser oscura, turbia y a veces con hematuria, es decir, presencia de eritrocitos debidos a hemorragias leves del epitelio vesical cicatrizado. Si el resultado es una bacteriemia el paciente desarrollará signos de sepsis con malestar y dolor generalizados, fiebre alta y temblores.
Incluso en las ITU sin complicaciones, la afección invalida tanto al paciente que ella (o él) permanecerá en casa sin 10 ir a trabajar y buscará atención médica.
Diagnóstico de la ITU
Debido a que el tracto urinario está normalmente estéril con un número bajo de leucocitos, la presencia de bacterias y el aumento del número de leucocitos es indicativo de una infección. El diagnóstico de la ITU se basa en los síntomas típicos, así como en la presencia de bacterias y en el aumento del número de leucocitos en una muestra 15 de orina obtenida de forma estéril. Debido a la colonización normal de la parte externa de la uretra, es difícil obtener una muestra de orina estéril durante la micción sin contaminar la muestra. Para evitar esta contaminación la mejor manera de obtener una muestra de orina estéril es a través de punción suprapúbica, o a través de un catéter vesical o, en caso de infección pélvica renal a través de una nefrostomía percutánea. Pero debido a que estos últimos procedimientos son bastante engorrosos y a menudo dolorosos para el paciente en la gran mayoría de los casos y
20 también necesita el ingreso hospitalario, en la mayoría de los casos se recoge la orina como la Fracción Intermedia de la Orina (MSU, por sus siglas en inglés), es decir, se limpia el meato con un algodón impregnado en solución salina estéril, a continuación el paciente micciona una pequeña primera parte de la orina para limpiar la uretra y a continuación micciona -fracción intermedia -una muestra que se recoge en un recipiente estéril -para finalizar miccionando el resto del volumen de orina en el inodoro.
25 También se toman otras muestras tales como frotis de la uretra o cultivos de sangre si hay indicios de uretritis (por ejemplo, gonorrea) o bacteriemia.
Criterios cuantitativos para el diagnóstico de la ITU:
Debido a los problemas con la contaminación de la muestra de orina cuando se toma en forma de MSU y la posterior evaluación de los resultados, y el hecho de que algunos pacientes pueden tener una bacteriuria asintomática, se
30 encontró en los años 50, y no solo mediante los estudios de Edward Kass2, que a fin de discernir entre un paciente asintomático y un paciente con pielonefritis, deben estar presentes al menos 105 bacterias/ml de orina de un posible patógeno urinario (véase anteriormente) en dos muestras de orina tomadas al menos con 24 h de separación.
Posteriormente, se encontró que recuentos inferiores, de tan solo 103 bacterias/ml de orina de un patógeno urinario típico (véase anteriormente) son indicativos de infección en pacientes los cuales tienen síntomas típicos de ITU3, es
35 decir, los criterios de Kass2 se utilizan para pacientes con bacteriuria asintomática.
Los procedimientos actualmente empleados para diagnosticar bacterias en la orina:
a) Procedimientos directos:
1. Microscopía: Las bacterias pueden visualizarse en la muestra de orina bien mediante microscopía de contraste de fase de un frotis húmedo, o mediante microscopía óptica simple de una preparación teñida según el 40 procedimiento de Gram. En el frotis húmedo puede apreciarse la forma y el posible movimiento de las bacterias pero, naturalmente, no el tipo de la bacteria según Gram. Esto puede discernirse sometiendo a microscopía óptica la tinción de Gram, y en ambos casos los leucocitos pueden distinguirse y cuantificarse de manera aproximada. El problema con la microscopía es su falta de especificidad, es decir, únicamente puede darse un diagnóstico bacteriano presumible y la sensibilidad, es decir, las bacterias únicamente pueden visualizarse
45 cuando están presentes en un número de al menos 105 bacterias/ml de orina. Además, la microscopía no revelará la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos. La microscopía de contraste de fase tiene un valor predictivo positivo de un 58 % en relación con el cultivo cuantitativo con un criterio de ≥ 105 bacterias/ml para la ITU 4.
2. Cultivo: El procedimiento de referencia para el diagnóstico de la ITU. En el laboratorio se lleva a cabo
50 mediante un cultivo cuantitativo, es decir, una aplicación con un asa de siembra convencional de 1 o 10 µl de orina en una placa de agar. Esto permite la cuantificación de bacterias contando el número de colonias (unidades formadoras de colonias, UFC) en la placa incubada. Si se esperan números bajos de bacterias (por ejemplo, punción suprapúbica o muestra de catéter) puede cultivarse hasta un ml de orina que permite un recuento más bajo de tan solo 1-2 UFC/ml de orina. El cultivo puede dar lugar a un diagnóstico adicional de las bacterias
55 mediante pruebas bioquímicas u otro tipo de tratamientos de laboratorio. Además, puede llevarse a cabo un ensayo de susceptibilidad. La sensibilidad del procedimiento es por definición de un 100 %, pero en algunos casos las bacterias pueden no crecer si no se usa un medio, atmósfera o condiciones de temperatura especiales (algunas cepas de Aerococcus pueden crecer únicamente en agar sangre y en CO2) o si el paciente ha iniciado un tratamiento antibiótico las bacterias pueden no crecer debido a la supresión debida al antibiótico. La especificidad no es de un 100 % debido a que el cultivo positivo todavía puede contener contaminantes -el
imagen3
5 resultado debería combinarse con los síntomas y signos así como con la presencia de un número más elevado de leucocitos en la orina. Las asas de siembra cuantitativas tienen una variación de +/-½log UFC/ml, lo que significa que únicamente puede realizarse una estimación aproximada del recuento5. La desventaja de los cultivos cuantitativos en el laboratorio es que la orina debe guardarse en unas condiciones en las que las bacterias no se multipliquen antes del cultivo; esto puede lograrse enfriando la orina durante el transporte (es decir, <4 ºC) o utilizando un medio de transporte que mantenga las bacterias sin estimular su crecimiento, por ejemplo, utilizando ácido bórico. Se han popularizado los tubos que contienen ácido bórico para el transporte en los últimos años, pero este procedimiento conlleva el problema inherente de la toxicidad del ácido bórico, por ejemplo, resulta carcinogénico para los seres humanos. Otros procedimientos de cultivo: Los laminocultivos con una lámina base de plástico que tienen medio de agar en
15 una o en ambas caras que se sumergen en la orina llevan utilizándose 20-30 años (por ejemplo, Uricult (Orion)). La ventaja de estos es su fácil inoculación y que la inoculación directa puede cuantificarse comparando el crecimiento bacteriano con fotografías de laminocultivos utilizados para cultivos con cantidades conocidas de bacterias. El laminocultivo también puede utilizarse como un medio de transporte. Se ha desarrollado un ensayo de susceptibilidad, en el que los discos que contienen antibiótico se colocan sobre las superficies de agar tras la inoculación (por ejemplo, Sensicult (Orion)). El valor predictivo positivo (PPV, por sus siglas en inglés) del ensayo de sensibilidad ha sido en algunos casos de tan solo 0,6, que puede explicarse por la falta de inóculo estandarizado y la dificultad para interpretar la zona alrededor del disco sobre una superficie redondeada, ya que la placa de agar no es completamente plana. Además, la pequeña superficie del laminocultivo (es decir, aproximadamente 2 x 5 cm) hace difícil evaluar las características de crecimiento de las bacterias y,
25 especialmente, si está presente más de una especie. Adicionalmente, la evaluación de la sensibilidad resulta difícil si no se conocen las especies bacterianas. Novamed en Israel ha comercializado recientemente un laminocultivo con agar cromógeno en una de las caras (DipStreak).
3. Otros procedimientos: Durante los últimos años se han probado varios procedimientos para cuantificar bacterias en la orina tales como medidas de la turbidez por espectrofotometría, citocentrifugación, medidas de ATP y otros. Hasta la fecha, según los conocimientos de los presentes inventores, ninguno de estos se ha aplicado rutinariamente en los laboratorios y, especialmente, no en atención primaria debido a su coste y la necesidad de conocimientos técnicos.
b) Procedimientos indirectos:
1. Tiras reactivas para nitritos y leucocito-esterasa: La determinación de nitrito en la orina se utiliza para el
35 diagnóstico de la ITU debido a que esta sustancia únicamente puede estar presente si las bacterias productoras de nitrato-reductasa están presentes en la orina. El nitrato procede del metabolismo proteico y se encuentra en la orina en concentraciones variables dependiendo de la ingesta de proteínas el día antes de la toma de la muestra. Sin embargo, el nitrito puede retirarse si hay bacterias presentes que produzcan nitrito-reductasa (por ejemplo, E. coli puede contener ambos tipos de enzimas). Este ensayo no es muy sensible, ya que la reacción necesita aproximadamente una incubación de 3 horas, algunas bacterias producen nitrito-reductasa y algunos patógenos urinarios no producen nitrato-reductasa en absoluto, por ejemplo, los estafilococos. El ensayo de la leucocitoesterasa es más relevante, ya que es la manera más fácil de probar la presencia de leucocitos; la enzima únicamente puede proceder de los leucocitos y la cantidad enzimática se correlaciona con el número de leucocitos. Los leucocitos completos se lisan fácil y rápidamente, lo que significa que la microscopía urinaria para
45 determinar leucocitos debe llevarse a cabo dentro de la hora posterior a la toma de la muestra a fin de conseguir una microscopía cuantitativa relevante, mientras el ensayo enzimático puede llevarse a cabo varias horas más tarde debido a la estabilidad de la enzima. La presencia de leucocitos, sin embargo, es solamente predictiva de infección en un 50 % de los pacientes, ya que puede detectarse leucocituria en muchos pacientes sin infección. Juntas, el ensayo de las dos enzimas combinadas (es decir, uno o ambos son positivos) tiene un PPV bastante bajo (60-80 %) debido a los factores mencionados anteriormente.
2. Síntomas solos: En muchos casos en la medicina general, el médico de familia (MF) iniciará el tratamiento basado solamente en los síntomas. Esto puede deberse a reservas respecto a las pruebas diagnósticas debido al coste, geografía o tradición, conocimiento de la sensibilidad de los patógenos y/o uso de antibióticos de amplio espectro de los que se piensa que actúan sobre todos los patógenos posibles.
55 Tratamiento de la ITU:
En un 30% de los casos de ITU sin complicaciones, la infección se curará por sí misma, es decir, desaparecerá sin tratamiento antibiótico6. Pero en la mayoría de los casos y especialmente en los casos complicados, es decir, todos los pacientes distintos de mujeres en el grupo de edad de 14-60 años de edad, el tratamiento antibiótico es la norma convencional. Dependiendo de la afección y del antibiótico utilizado la infección sin complicaciones se curará en 3-7 días, mientras la pielonefritis necesita 10-14 días de tratamiento, y los casos más crónicos una duración mayor del tratamiento, que en algunos casos puede ser de meses a años. El efecto depende de la sensibilidad de los patógenos bacterianos6,7. El ensayo convencional que se lleva a cabo en un laboratorio requiere tiempo, especialmente cuando se lleva a cabo un ensayo de susceptibilidad de disco, ya que este ensayo se basa en diferentes condiciones que han de mantenerse dentro de unos ciertos límites (inóculo, tiempo de incubación, lectura del ensayo, atmósfera de incubación, etc.). El factor más importante es el inóculo, el cual debe estar comprendido en ciertos límites estrechos para garantizar la calidad del ensayo, por lo que es difícil llevar a cabo un ensayo de
imagen4
5 sensibilidad de difusión en disco significativo directamente sobre la muestra de orina primaria, ya que se desconoce el número exacto de bacterias.
El documento WO 99/18232 (de Chen y col.) proporciona un dispositivo de ensayo de varios compartimentos basado en el uso combinado de un medio capaz de permitir el crecimiento de todos los organismos microbianos, un medio que sea selectivo para el organismo diana particular y un medio que comprenda un medio de interpretación
10 de la sensibilidad antimicrobiana. La presente solicitud describe la utilización de un medio líquido y no sugiere una configuración que permita la diferenciación entre la presencia de múltiples grupos y/o cepas de microorganismos en la misma muestra y la determinación de la sensibilidad antimicrobiana de cada grupo o cepa de dichos microorganismos.
Posteriormente Chen y col. describieron en el documento WO03106696 procedimientos y dispositivos para la
15 detección de microorganismos patogénicos y su susceptibilidad antimicrobiana. Puede incluirse el uso de un sustrato fluorescente o cromógeno para obtener una señal visual de la presencia del microorganismo, pero no se menciona la utilización de varias sustancias diferentes para determinar diferentes especies.
El documento WO0106000 describe un medio de ensayo para la identificación y la diferenciación de enterobacteriaceae. El medio comprende un antibiótico para evitar el crecimiento de otros microorganismos que no
20 sean enterobacteriaceae.
El documento US6750038 describe un ensayo rápido de susceptibilidad antibiótica. No se utiliza el uso de un cromógeno para identificar los microorganismos.
El documento US6251624 describe un aparato y un procedimiento para detectar, cuantificar y caracterizar microorganismos. Se evalúa la susceptibilidad a antibióticos mediante la inhibición de la zona de crecimiento.
25 El documento WO2004050675 describe una placa de crecimiento con varias cámaras y con caldo selectivo para la identificación de microorganismos concretos y con antibióticos en el medio para evaluar la susceptibilidad.
El documento WO 2004/050675 describe una placa (o plataforma) con varias cámaras (con varios compartimentos) para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una contaminación o infección microbiana. El compartimento puede contener un medio de cultivo microbiano semisólido. Parte del medio utilizado en el documento WO 2004/050675
30 puede contener una única sustancia fluorescente o cromógena, por ejemplo, agar para pseudomonas P 64 y MUG MAC 65. Cada cámara en la placa de ensayo contiene un medio diferente. En el documento WO 2004/050675 se detectan los mismos microorganismos que en la presente solicitud, tales como, por ejemplo, Escherichia coli (cepa ATCC 25922) o Staphylococcus aureus, los cuales son conocidos uropatógenos.
El documento US 2002/076742 describe la utilización de medio líquido y no sugiere ningún tipo de configuración que 35 permita la diferenciación entre la presencia de múltiples grupos y/o cepas de microorganismos en la misma muestra.
El documento US 6 251 624 se refiere a la realización de una exploración de orina y a los instrumentos empleados para llevarlo a cabo, pero no se describe en el documento US 6 251 624 la combinación de ingredientes en el medio de cultivo semisólido, en concreto, de las tres o más sustancias cromógenas.
Por consiguiente, sería conveniente una tecnología mejorada para el diagnóstico, la detección y la caracterización
40 de contaminación o infecciones microbianas, que ofreciera la posibilidad de diferenciar entre tales cepas y/o grupos múltiples de microorganismos. En concreto, una tecnología tal sería ventajosa si se proporcionara en forma de una plataforma que sea eficiente, fiable y que sea posible fabricar con un coste razonable.
Sumario de la invención
De esta manera, un objeto de la presente invención se refiere a composiciones, plataformas, kits y procedimientos 45 para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una infección o contaminación microbiana.
Realizaciones de la invención:
1. Una plataforma que comprende un soporte sólido en la que dicho soporte sólido comprende una hendidura capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible infección o contaminación microbiana, estando dicha hendidura dividida en dos o más compartimentos, conteniendo cada compartimento una
50 composición de ensayo o una composición de control y uno o más miembros divisores integrados para dividir dicha hendidura en dichos compartimentos separados, en la que:
i) dicha composición de ensayo comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, un antimicrobiano y tres o más sustratos cromógenos seleccionados del grupo que consiste en 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato, 5bromo-4-cloro-3-indolil-3-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-3-D-galactopiranósido, 6-cloro-3
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indolil-f3-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-Dglucurónido; ii) en la que cada composición de ensayo comprende un antimicrobiano diferente; iii) dicha composición de control comprende el mismo medio de cultivo microbiano semisólido y los mismos
5 sustratos cromogénicos que en dicha composición de ensayo, pero no comprende un antimicrobiano como se ha definido en i);
y en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido comprende triptófano y uno o más inductores; y en la que dicha plataforma comprende una composición de control.
2. La plataforma de acuerdo con la realización 1, en la que el antimicrobiano de la composición de ensayo se
10 selecciona del grupo que consiste en aminoglucósidos, ansamicinas, antibióticos beta-lactámicos, glucopéptidos, macrólidos, lincosamidas, polipéptidos, quinolonas, sufonamidas, tetraciclinas, lipopéptidos cíclicos, glicilciclinas, oxazolidinonas, diaminopirimidinas, nitrofuranos, rifamicinas, péptidos antibióticos, anfenicoles, nitroimidazoles, estreptograminas y fosfomicinas.
3. La plataforma de acuerdo con la realización 1 o la realización 2, en la que dicha composición está presente en
15 cada uno de dichos compartimentos en una cantidad correspondiente a un 25-45 % del volumen del compartimento.
4.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, teniendo dicha plataforma 7 o más compartimentos.
5.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en la que dichos compartimentos
20 están separados mediante miembros divisores que se han tratado para evitar la difusión de un antimicrobiano entre los compartimentos.
6. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en la que dicho soporte sólido se fabrica a partir de un sustrato plástico/polimérico, a partir de un sustrato vítreo o a partir de un sustrato metálico.
7. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en la que dicho soporte sólido es una 25 placa Petri, opcionalmente con un diámetro de 80 a 100 mm.
8.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en la que cada uno de dichos compartimentos que comprende una composición de ensayo tiene un área de 4-9 cm2 y/o 25 en la que dicho compartimento que comprende una composición de control tiene un área de 15-25 cm2.
9.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en la que están presentes uno o más
30 inductores en dicha composición de ensayo y en dicha composición de control en 30 cantidades de 0,001 a 1,0 g/l.
10. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en la que dicho uno o más inductores se seleccionan del grupo que consiste en 4-aminofenil-3-D-galactopiranósido, isopropil-J3-Dtiogalactopiranósido, 1-O-metil-f3-D-galactopiranósido, metil-f3-D-tiogalactopiranósido, 1-O-metil-cL-D5
35 galactopiranósido, isopropil-f3-D-tioglucopiranósido, 1-O-metil-3-D-glucopiranósido, ácido isopropil-f3-Dtioglucourónico y ácido 1-O-metil-3-D-glucourónico, sal sódica.
11. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 10, en la que:
i) las colonias de E. coli, si están presentes, aparecerán de color salmón-rojo/rosa; ii) las colonias de Citrobacter sp., si están presentes, aparecerán de color azul-verdoso;
40 iii) las colonias de Klebsiella, Enterobacter o Citrobacter spp., aparecerán de color azul oscuro; iv) las colonias de Proteus mirabilis/Morganella morganii, si están presentes, aparecerán de color marrón claro; v) las colonias de Proteus vulgaris, si están presentes, aparecerán de color verde oscuro; vi) las colonias de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium, si están presentes, aparecerán de color
45 verdoso o azul; vii) las colonias de Staphylococcus saprophyticus, si están presentes, aparecerán de color rojo o salmón-rojo; viii) las colonias de Staphylococcus o Pseudomonas aeruginosa, si están presentes, aparecerán de color blanco o amarillo; y ix) las colonias de Candida spp., si están presentes, aparecerán de color blanco.
50 12. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-11, en la que dicho antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en: amikacina, amoxicilina, 5 amoxicilina-ácido clavulánico, anfotericina-B, ampicilina, ampiclina-sulbactam, apramicina, azitromicina, aztreonam, bacitracina, bencilpenicilina, caspofungina, cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefalotina, cefazolina, cefdinir, cefepima, cefixima, cefmenoxima, cefoperazona, cefoperazona-sulbactam, cefotaxima, cefoxitina, cefpiroma, cefpodoxima, cefpodoxima-ácido clavulánico,
55 cefpodoxima-sulbactam, 10 cefprozil, cefquinoma, ceftazidima, ceftibutino, ceftiofur, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, florfenicol, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol (trimtoprim/sulfametoxazol), dalbavancina, dalfopristín/quinopristín, daptomicina, dibekacina, dicloxacilina, doripenem, doxiciclina, enrofloxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, fluconazol, flucitosina, fosfomicina, ácido fusídico, garenoxacina, gatifloxacina,
60 gemifloxacina, gentamicina, imipenem, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, levofloxacina, lincomicina, linezolid, loracarbef, mecilinam (amdinocilina), meropenem, metronidazol, mezlocilina, mezlocilina-sulbactam, minociclina, moxifloxacina, mupirocina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, pefloxacina, penicilina V, piperacilina, piperacilina-sulbactam, piperacilina-tazobactam, rifampicina, roxitromicina, esparfloxacino, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulbactam, sulfametoxazol, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temocilina, tetraciclina, ticarcilina, ticarcilina-ácido clavulánico, tigeciclina, tobramicina, trimetoprim, trovafloxacina, tilosina, vancomicina, virginiamicina, voriconazol, preferentemente se selecciona a partir del grupo constituido por: amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, una
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5 fluoroquinolona, sulfametoxazol, trimetoprim, una cefalosporina oral, nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicinatrometerol) o se selecciona a partir del grupo que consiste en: 30 trimetoprim, sulfametoxazol, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam (amdinocilina) y combinaciones de los mismos.
13.
La plataforma de acuerdo con la realización 16, en la que dicha fluoroquinolona es ciprofloxacina y/o en la que dicha cefalosporina oral se selecciona del grupo que consiste en cefalexina, cefuroxima, cefadroxil y cefaclor.
14.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 13, en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido se selecciona del grupo que consiste en:
i) Un medio compuesto por: 11 g/l de caseína hidrolizada, 3 g/l de peptonas, 2 g/l de glucosa, 3 g/l de cloruro de sodio, 1 g/l de almidón soluble, 2 g/l de hidrogenofosfato disódico, 1 g/l de acetato de sodio, 0,2 g/l de
15 glicerofosfato de magnesio, 0,1 g/l de gluconato de calcio, 0,001 g/l de sulfato cobaltoso, 0,001 g/l de sulfato cúprico, 0,001 g/l de sulfato de zinc, 0,001 g/l de sulfato ferroso, 0,002 g/l de cloruro de magnesio, 0,001 g/l de menadiona, 0,001 g/l de cianobalamina, 0,02 g/l de clorhidrato de L-cisteína, 0,02 g/lde triptófano, 0,003 g/l de piridoxina, 0,003 g/l de 15 pantotenato, 0,003 g/l de nicotinamida, 0,0003 g/l de biotina, 0,00004 g/l de tiamina, 0,01 g/l de adenina, 0,01 g/l de guanina, 0,01 g/l de xantina, 0,01 g/l de uracilo, 8 g/l de agar, en agua destilada; ii) Un medio compuesto por: 2 g de Na2HPO4 12 H2O, 625 g de triptona, 250 20 g de almidón, 833,6 g de cloruro de potasio, 2,5 g de detergente, 74,8 g de caldo de carne (Oxoid CM975K), 800 g de monohidrato de D(+)glucosa, 1,75 g de xantina, 1,75 g de guanina, 17,5 g de sulfato de magnesio 7 H2O, 19,2 g de CaCl2 2 H2O, 2,720 g de agar, HCl 5 N hasta pH 7,4, solución de vitaminas y 12,5 l de sangre de caballo por 250 litros
25 de agua destilada; iii) Un medio que comprende: 14,5 g/l de peptona, 2 g/l de glucosa, 5,5 g/l de mezcla salina, 1 g/l de almidón soluble, 1,5 g/l de mezcla cromógena y 8 g/l de agar; y iv) Un medio que comprende: 2 g/l de polvo de extracto de carne de vacuno/extracto de carne de vacuno, 17,5 g/l de 30 digestión ácida de caseína, 1,5 g/l de almidón y 17 g/l de agar;
15.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en la que dichos 3 o más sustratos cromogénicos comprenden 5-bromo-4-cloro-3-indolil-3-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-3-Dgalactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-D-glucopiranósido.
16.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en la que dichas 3 o más sustancias cromogénicas se seleccionan del grupo que consiste en: 6-cloro-3-indolil-3-D-galactopiránosido, 5
35 bromo-4-cloro-3-indolil-3-D-glucopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-Dglucurónido y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-D-galactopiranósido.
17.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en la que dichas composiciones de control y de ensayo comprenden: 6-cloro-3-indolil-3-D-galactopiranósido combinado con 5-bromo-4-cloro-3indolil-f3-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-15 cloro-3-indolil-j3-D-glucurónido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-f3-Dgalactopiranósido y 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato.
18.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en la que dichas tres o más sustancias cromogénicas incluyen el grupo de: 5-bromo-6-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, 5-bromo-4cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranósido y 6-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido.
19.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 14, en la que dichas tres o más
45 sustancias cromogénicas incluyen el grupo de: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, 6-cloro-3indolil-beta-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranósido y 5-bromo-4-cloro-3-indolilbeta-D-glucurónido.
20.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 19, en la que dicha composición de ensayo y dicha composición de control comprenden cuatro sustratos cromogénicos.
21.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 20, en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido comprende 0,25-3,0 g/l de triptófano está presente.
22.
La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 21, en la que dicho soporte sólido es una placa Petri dividida en 5 compartimentos de ensayo y 1 compartimento de control.
23.
Un kit que comprende una plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 22.
55 24. El kit de acuerdo con la realización 23, comprendiendo dicho kit además un patrón que indica el grado de crecimiento sobre la plataforma, la cual es el resultado de poner en contacto dicha plataforma con una suspensión que tiene una concentración predeterminada de una cepa de referencia microbiana.
25.
El kit de acuerdo con la realización 24, en el que dicho patrón es una reproducción fotográfica o impresa de la plataforma.
26.
El kit de acuerdo con la realización 24, en el que dicho patrón se ha generado poniendo en contacto la plataforma con una cepa de referencia de la bacteria E. coli (opcionalmente E. coli ATCC 29522) y/o una cepa de referencia de Staphylococcus aureus (opcionalmente Staphylococcus aureus ATCC 25913).
27.
El kit de acuerdo con la realización 25, comprendiendo dicho kit además uno o más antimicrobianos empaquetados por separado.
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28. El uso de una plataforma de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 22 para detectar y/o diagnosticar infecciones seleccionadas a partir del grupo constituido por infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y los tejidos blandos, infecciones debidas a Staphylococcus aureus (incluida Staphylococcus aureus resistente a meticilina), infecciones debidas a meningococos, infecciones debidas a gonococos, infecciones debidas a estreptococos incluidas las infecciones debidas a neumococos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra dos realizaciones preferidas actualmente relacionadas con la plataforma de acuerdo con la presente invención: de acuerdo con la figura 1A, la plataforma comprende una hendidura (10) siendo capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible contaminación o infección microbiana. La hendidura se divide en compartimentos separados (11, 12, 13, 14, 15 y 16) por medio de uno o más miembros divisores integrados (17). Cada compartimento contiene una composición que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, dos o más sustratos o sustancias fluorógenos o cromógenos y un antibiótico; o una composición que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, dos o más sustratos o sustancias fluorógenos o cromógenos pero que no comprende un antimicrobiano. De acuerdo con la figura 1B la plataforma comprende múltiples hendiduras (18), siendo cada hendidura capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible contaminación o infección microbiana. Cada hendidura contiene una composición que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, dos o más sustratos o sustancias fluorógenos o cromógenos y un antibiótico; o una composición que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, dos
o más sustratos o sustancias fluorógenos o cromógenos, pero que no comprende un antimicrobiano.
La Figura 2 ilustra una de las realizaciones de la invención preferidas actualmente de acuerdo con la cual la plataforma comprende una composición de acuerdo con las invenciones que comprenden trimetoprim (19), una composición de acuerdo con las invenciones que comprende sulfametizol (20), una composición de acuerdo con las invenciones que comprende ampicilina (21), una composición de acuerdo con las invenciones que comprende mecilinam (22) y una composición de acuerdo con las invenciones que comprende nitrofurantoína (23). La plataforma además comprende una composición de acuerdo con la invención en la cual no hay ningún antimicrobiano (24). Finalmente, la figura ilustra además una realización preferida de acuerdo con la cual la hendidura o compartimento que contiene dicha composición que no comprende ningún antimicrobiano tiene un tamaño que es el doble del tamaño de cualquiera de las otras hendiduras o compartimentos.
La Figura 3 muestra un patrón para determinar la cantidad o concentración de E. coli en una muestra analizada utilizando la plataforma de acuerdo con una realización preferida de la invención (ilustrada en la Figura 2). Las fotos muestran el crecimiento de E. coli con diferentes cantidades de bacteria/ml de orina. La E. coli ejemplificada es resistente a sulfametizol y ampicilina ya que hay crecimiento en estos dos compartimentos con antibióticos pero es sensible a trimetoprim, nitrofurantoína y mecilinam.
La Figura 4 muestra un patrón para determinar los diferentes tipos de colonias de patógenos urinarios en una muestra analizada utilizando la plataforma de acuerdo con una realización preferida de la invención. Las condiciones de crecimiento y los colores para las bacterias patógenas ordinarias de las vías urinarias y su sensibilidad/resistencia a los cinco antibióticos de la placa Flexicult.
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La presente invención se describirá a continuación más detalladamente en lo siguiente.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de analizar la presente invención en más detalle, se definirán en primer lugar los siguientes términos, 5 expresiones y convenciones.
Microbiano
En el presente contexto, el término “microbiano” debe interpretarse de manera amplia con el significado de “pertenecer a un microbio”. El término “microbio” se refiere de manera colectiva a bacterias, hongos, arqueas y protistas.
10 Medio de cultivo semisólido
La expresión “medio de cultivo semisólido” como se usa en el presente documento, se refiere a un medio de cultivo que permite a los microorganismos formar colonias en su superficie, tal como un medio que tiene una apariencia similar a un gel o está en forma de gel, un gel siendo un sistema coloidal en el cual una red porosa de partículas interconectadas se extiende a lo largo del volumen de un medio líquido. Además, se sobreentiende que un gel tiene 15 una composición mayoritariamente líquida y, por lo tanto, exhibe densidades similares a las del líquido concreto y, sin embargo, tiene la coherencia estructural de un sólido. Preferentemente, el medio de cultivo semisólido, tal como se emplea en el presente documento, se prepara añadiendo a un medio de cultivo líquido una cantidad suficiente de una sustancia que se funde al calentarse y que solidifica cuando se vuelve a enfriar, tal como la gelatina o el agar. Se sobreentenderá que la red porosa de partículas interconectadas en el medio permitirá que los nutrientes y los
20 antimicrobianos difundan a lo largo del medio para estar disponibles para los microorganismos.
Medio de cultivo
En el contexto de la presente invención el término “medio de cultivo” se refiere a una sustancia en o sobre la que los microbios pueden crecer. El término en particular comprende un caldo nutriente (medio nutriente líquido) o caldo de lisogenia (medio L-B) y agar, que son los medios de cultivo más comunes para los microbios.
25 Igualmente, el término abarca el medio líquido en el cual los microbios pueden crecer en suspensión, así como el medio semisólido tal como se ha definido anteriormente, que permite a los microbios formar colonias en su superficie. El término “medio de cultivo” también comprende los medios especializados que a veces se requieren para el cultivo de ciertos microorganismos, incluidos los organismos de cultivo difícil, que requieren ambientes especializados debido a requerimientos nutricionales complejos.
30 En general, un medio de cultivo comprenderá una fuente de carbono tal como glucosa o succinato para el crecimiento bacteriano, agua, diversas sales que proporcionan elementos esenciales necesarios para el crecimiento microbiano, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre para permitir a la bacteria sintetizar proteínas y ácidos nucleicos, y una fuente de aminoácidos y nitrógeno (por ejemplo, carne de vacuno, extracto de levadura).
También se sobreentenderá que el término “medio de cultivo” incluye los medios definidos, también conocidos como
35 medios definidos químicamente, así como los medios no definidos, también conocidos como medios complejos o basales. Un medio definido para los microbios tendrá cantidades conocidas de todos los ingredientes, incluidos los oliogelementos y vitaminas requeridos por el microbio y especialmente una fuente de carbono definida tal como glucosa o glicerol, y una fuente de nitrógeno definida tal como tal como una sal de amonio o un nitrato. Por el contrario, un medio no definido tiene algunos ingredientes complejos, tales como extracto de levadura o hidrolisado
40 de caseína, los cuales están constituidos por una mezcla de muchas especies químicas en proporciones desconocidas.
Sustrato cromogénico
En el contexto de la presente invención, los términos “sustrato cromogénico”, “sustancia cromogénica” y “cromógeno” se utilizan intercambiablemente para referirse a un precursor de un pigmento bioquímico. Ha de
45 entenderse que, en concreto, el cromógeno puede ser un sustrato, un compuesto o una sustancia, que cuando se metaboliza por un microbio produce un pigmento o color característicos que es útil como un medio de detección y/o identificación de dicho microbio.
Sustrato fluorogénico
El término “sustrato fluorogénico” se usa intercambiablemente con “sustancia fluorogénica” y se refiere a un
50 precursor de un compuesto fluorescente. Un compuesto fluorescente es un compuesto en el cual la absorción molecular de un fotón provoca la emisión de otro fotón con una longitud de onda mayor y en el que la diferencia energética entre los fotones absorbido y emitido da lugar a vibraciones moleculares o calor. En concreto, el fotón absorbido está en el intervalo del ultravioleta y la luz emitida está en el intervalo del visible. Por lo tanto la detección
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de los compuestos fluorescentes puede realizarse normalmente exponiéndolos a la luz ultravioleta (luz UV) y registrando posteriormente a continuación la luz (a menudo luz visible) que emite el compuesto fluorescente. Ha de entenderse que, en concreto, el sustrato fluorescente puede ser un sustrato, un compuesto o una sustancia que emite luz al metabolizarse por un microbio y que resulta útil como un medio de detección y/o identificación de dicho microbio.
Antimicrobiano
En la presente solicitud los términos “antibiótico” y “antimicrobiano” se utilizan indistintamente para definir un compuesto químico que inhibe o suprime el crecimiento de los microorganismos, tales como las bacterias, hongos o protozoos, es decir, un compuesto químico con actividad antibacteriana, antifúngica y/o antiparasitaria. El término incluye compuestos antibióticos o antimicrobianos producidos y aislados a partir de organismos vivos, por ejemplo, la clase de penicilinas producidas por hongos del género Penicillium o la estreptomicina procedente de bacterias del género Streptomyces. Los términos también incluyen compuestos antibióticos o antimicrobianos obtenidos por síntesis química, tales como los fármacos de sulfonamida.
Los términos incluyen en particular los antibióticos antibacterianos, que son antibióticos que no poseen actividad contra virus, hongos y otros microbios no bacterianos. Los antibióticos antibacterianos incluyen los antibióticos bactericidas, que destruyen a las bacterias, y los antibióticos bacteriostáticos que evitan la multiplicación de las bacterias. Los antibióticos antibacterianos incluyen además los antibióticos de “espectro reducido” que tienen como objetivo tipos concretos de bacterias, tales como las bacterias gramnegativas o grampositivas, y los antibióticos de amplio espectro que afectan a gran diversidad de bacterias. De manera similar, los antibióticos antibacterianos incluyen los antibióticos para ingestión así como los antibióticos para administración intravenosa que se utilizan a menudo para tratar infecciones graves tales como las infecciones sistémicas profundas y los antibióticos para administración tópica. Los antibióticos antibacterianos comprenden antibióticos pertenecientes a las siguientes clases reconocidas actualmente: aminoglucósidos, ansamicinas, antibióticos beta-lactámicos (incluidos los antibióticos carbacefémicos, antibióticos carbapenémicos, cefalosporinas (de primera, segunda, tercera y cuarta generación), antibióticos monobactámicos y penicilinas), glucopéptidos, macrólidos, lincosamidas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, lipopéptidos cíclicos, glicilciclinas, oxazolidinonas, diaminopirimidinas, nitrofuranos, rifamicinas, péptidos antibióticos, anfenicoles, nitroimidazoles, estreptograminas y fosfomicinas.
Aspectos y realizaciones de la presente invención
En un primer y más amplio aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, tres o más sustratos o sustancias fluorescentes o cromógenos y un antimicrobiano. El hecho de que se emplee un medio de cultivo microbiano semisólido de acuerdo con la presente invención tiene la ventaja de que puede observarse el crecimiento microbiano en forma de colonias únicas sobre la superficie de dicho medio. El uso combinado de sustratos o sustancias fluorescentes o cromógenos ofrece la posibilidad de distinguir múltiples tipos o especies de microorganismos que crecen en el medio mediante el color del pigmento o la fluorescencia producida en las colonias. Simultáneamente, es posible determinar la sensibilidad de cada especie o tipo microbianos frente al antimicrobiano presente en la composición de acuerdo con la invención.
Otra ventaja de la presente invención es que cuando se utiliza la plataforma para estudiar la orina en búsqueda de infecciones, el número de colonias formadas sobre el medio de cultivo microbiano semisólido se correlaciona directamente con el número de bacterias por volumen de orina añadidas a la plataforma. De esta manera facilita la determinación de la concentración de bacterias en la orina.
El medio semisólido comprende triptófano. La ventaja de incluir triptófano es que permite la detección fácil de enterobacterias del grupo Proteus-Morganella-Providencia y a la vez el triptófano no interfiere con la determinación de la sensibilidad a los antibióticos.
El medio semisólido en la composición de acuerdo con la descripción comprende un polímero de galactosa (agaragar) o gelatina.
Preferentemente, la composición de acuerdo con la presente invención comprende un medio de cultivo microbiano seleccionado del grupo que consiste en: agar Iso-sensitest, agar sangre danés, medio Discovery y medio Mueller-Hinton. Para aquellos medios que no comprenden intrínsecamente triptófano, incluir triptófano en estos medios puede suponer una ventaja adicional. La concentración de triptófano en el medio puede estar entre 0,25 y 3,0 g/litro.
El agar Iso-sensitest está comercializado en la actualidad por Oxoid y su composición se especifica en The Oxoid Manual 1998. El agar Iso-sensitest está compuesto por: 11 g/l de caseína hidrolizada, 3 g/l de peptonas, 2 g/l de glucosa, 3 g/l de cloruro de sodio, 1 g/l de almidón soluble, 2 g/l de hidrogenofosfato de disodio, 1 g/l de acetato de sodio, 0,2 g/l de glicerofosfato de magnesio, 0,1 g/l de gluconato de calcio, 0,001 g/l de sulfato cobaltoso, 0,001 g/l de sulfato cúprico, 0,001 g/l de sulfato de zinc, 0,001 g/l de sulfato ferroso, 0,002 g/l de cloruro de magnesio, 0,001 g/l de menadiona, 0,001 g/l de cianobalamina, 0,02 g/l de clorhidrato de L-cisteína, 0,02 g/l de triptófano, 0,003 g/l de piridoxina, 0,003 g/l de pantotenato, 0,003 g/l de nicotinamida, 0,0003 g/l de biotina, 0,00004 g/l de tiamina, 0,01 g/l de adenina, 0,01 g/l de guanina, 0,01 g/l de xantina, 0,01 g/l de uracilo, 8 g/l de agar, en agua destilada.
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En lo que se refiere al agar con sangre danés, el experto en la materia sabe que tiene la siguiente composición: 2 g de Na2HPO4 · 12 H2O, 625 g de triptona, 250 g de almidón, 833,6 g de cloruro de potasio, 2,5 g de detergente, 74,8 g de caldo de carne (Oxoid CM975K), 800 g de D(+)Glucosa monohidratada, 1,75 g de xantina, 1,75 g de guanina, 17,5 g de sulfato de magnesio 7 H2O, 19,2 g de CaCl2 · 2 H2O, 2,720 g de agar, HCl 5 N hasta pH 7,4, solución de vitaminas y 12,5 L de sangre de caballo por 250 litros de agua destilada.
El medio Discovery se fabrica por Oxoid (código del producto CM 1087). De acuerdo con el fabricante, el medio tiene la siguiente composición: 14,5 g/l de peptona, 2 g/l de glucosa, 5,5 g/l de mezcla salina, 1 g/l de almidón soluble, 1,5 g/l de mezcla cromógena y 8 g/l de agar.
El medio Mueller-Hinton comprende 2 g/l de polvo de extracto de carne de vacuno/extracto de carne de vacuno, 17,5 g/l de digestión ácida de caseína, 1,5 g/l de almidón y 17 g/l de agar.
Debe entenderse que se tolerará una cierta variación en la cantidad de cada componente en dicho medio; en general, se admitirá una variación de ± 20 %. Sin embargo, el experto en la materia sabrá que ciertos componentes pueden variarse incluso en mayor grado: la cantidad de agar puede variarse sustancialmente, tal como desde 4-25 g/l sin alterar de manera significativa el rendimiento del medio. Por lo tanto, se prefiere generalmente que el medio en la composición de acuerdo con la descripción comprenda desde 4-25 g/l de un polímero de galactosa.
Estos medios, junto con otros medios adecuados, se caracterizan por ofrecer una gran fiabilidad cuando se utilizan para determinar la sensibilidad respecto a los antimicrobianos. No se aprecia tal fiabilidad en todos los medios ya que algunos medios comprenden compuestos que interfieren con los antibióticos y, de este modo, afectan a la posibilidad de utilizar estos medios para evaluar la sensibilidad a antibióticos. Por ejemplo, la mayor fiabilidad se observa, por ejemplo, en estos medios:
i) la adición de 16 mg/l de ampicilina provoca una reducción en el crecimiento/número de las colonias formadas por la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922 de al menos 5 log UFC/ml, tal como se determinó tras poner en contacto la composición con una suspensión que contenía 105 UFC/ml e incubar la composición durante 18-24 horas a 37 ºC y a atmósfera ambiente;
ii) la adición de 32 mg/l de nitrofurantoína provoca una reducción en el crecimiento/número de las colonias formadas por la cepa de referencia Staphylococcus saprophyticus ATCC 49907 de al menos 4 log UFC/ml, tal como se determinó tras poner en contacto la composición con una suspensión que contenía 105 UFC/ml e incubar la composición durante 18-24 horas a 37 ºC y a atmósfera ambiente;
iii) la adición de 700 mg/l de sulfametizol provoca una reducción en el crecimiento/número de las colonias formadas por la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922 de al menos 3 log UFC/ml, tal como se determinó tras poner en contacto la composición con una suspensión que contenía 105 UFC/ml e incubar la composición durante 18-24 horas a 37 ºC y a atmósfera ambiente;
iv) la adición de 16 mg/l de trimetoprim provoca una reducción en el crecimiento/número de las colonias formadas por la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922 de al menos 3 log UFC/ml, tal como se determinó tras poner en contacto la composición con una suspensión que contenía 105 UFC/ml e incubar la composición durante 18-24 horas a 37 ºC y a atmósfera ambiente;
v) la adición de 16 mg/L de mecilinam provoca una reducción en el crecimiento/número de las colonias formadas por la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922 de al menos 5 log CFU/ml, tal como se determinó tras poner en contacto la composición con una suspensión que contenía 105 CFU/ml e incubar la composición durante 18-24 horas a 37 ºC y a atmósfera ambiente.
En realizaciones adicionales, el medio de crecimiento microbiano es un medio selectivo capaz de aplicar una presión selectiva a los organismos que están creciendo en él, tal como un medio que sea selectivo para las bacterias gramnegativas o las bacterias grampositivas.
El medio semisólido puede además comprender inhibidores sulfa y/o iones metálicos ya que estos pueden afectar la sensibilidad antibiótica. Por ejemplo, variaciones en las concentraciones de Mg2+ o Ca2+, pueden afectar los resultados de los ensayos de tetraciclinas y aminoglucósidos con Ps. aeruginosa. Además, el exceso de iones zinc puede reducir los tamaños de la zona de los antibióticos carbapenémicos. Un contenido catiónico excesivo reducirá la actividad antibiótica, en cambio un contenido catiónico bajo puede dar como resultado una mayor actividad. En concreto, los iones Ca2+ y Mg2+ pueden estar presentes en el medio semisólido en forma de sales solubles. La sulfonamida se inhibe mediante la timidina, que las bacterias pueden utilizar y, por tanto, crecer a pesar de la sulfonamida. La presencia de timidina-fosforilasa inhibirá la timidina y por lo tanto restaurará la función de la sulfonamida. La concentración que se necesita de timidina-fosforilasa dependerá de la concentración de timidina en el medio.
Otro parámetro del medio semisólido es la concentración de timidina ya que esto puede afectar el estudio de estafilococos resistentes a meticilina y trimetoprim. La mayor parte del medio de agar contiene pequeñas cantidades de antagonistas de trimetoprim y sulfonamida que pueden afectar a los resultados del estudio de sensibilidad
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(especialmente si no se añade sangre) con un contenido antibiótico bajo en el medio. Por consiguiente, en una realización particular el medio del ensayo de sensibilidad debe contener menos de 0,03 mg/l de timidina, de otro modo se observan pequeñas colonias en el agar con trimetroprim. Si el medio contiene un poco más de timidina de lo recomendado, es posible reducir la concentración añadiendo timidina-fosforilasa: de 0,025 a 0,1 UI de enzima/ml de medio o un 5 % de sangre de caballo hemolisada, que contiene la misma enzima.
Mientras la presencia de únicamente un antibiótico en la composición de acuerdo con la invención puede ser deseable con respecto a algunos antibióticos y para algunos fines, la composición de acuerdo con la invención también puede comprender 2 o más antimicrobianos, tales como 3 o más antimicrobianos, tales como 4 o más antimicrobianos o tales como 5 o más antimicrobianos.
La composición de acuerdo con la presente invención puede caracterizarse porque el antimicrobiano o, si están presentes más de un antimicrobiano, que al menos uno de los antimicrobianos, tales como 2, 3, 4, 5 o más de los antimicrobianos o todos los antimicrobianos se seleccionan del grupo que consiste en: amikacina, amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, anfotericina-B, ampicilina, ampiclina-sulbactam, apramicina, azitromicina, aztreonam, bacitracina, bencilpenicilina, caspofungina, cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefalotina, cefazolina, cefdinir, cefepima, cefixima, cefmenoxima, cefoperazona, cefoperazona-sulbactam, cefotaxima, cefoxitina, cefpiroma, cefpodoxima, cefpodoxima-ácido clavulánico, cefpodoxima-sulbactam, cefprozil, cefquinoma, ceftazidima, ceftibutino, ceftiofur, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, florfenicol, ciprofloxacina, claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol), dalbavancina, dalfopristín/quinopristín, daptomicina, dibekacina, dicloxacilina, doripenem, doxiciclina, enrofloxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, fluconazol, flucitosina, fosfomicina, ácido fusídico, garenoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, gentamicina, imipenem, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, levofloxacina, lincomicina, linezolid, loracarbef, mecilinam (amdinocilina), meropenem, metronidazol, mezlocilina, mezlocilina-sulbactam, minociclina, moxifloxacina, mupirocina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, pefloxacina, penicilina V, piperacilina, piperacilina-sulbactam, piperacilina-tazobactam, rifampicina, roxitromicina, esparfloxacino, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulbactam, sulfametoxazol, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temocilina, tetraciclina, ticarcilina, ticarcilina-ácido clavulánico, tigeciclina, tobramicina, trimetoprim, trovafloxacina, tilosina, vancomicina, virginiamicina, voriconazol.
En la Tabla 1 se muestra una lista completa de antimicrobianos que podrían incorporarse en la composición de acuerdo con la presente invención, bien solos o en combinaciones. Las concentraciones utilizadas en el agar están relacionadas preferentemente con el punto de ruptura S/R para el fármaco concreto, sin embargo, el experto en la materia asumirá la tarea de determinar la concentración exacta necesaria para un propósito concreto.
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La prevalencia de la resistencia a los antibióticos ha aumentado y continua aumentando en todas las bacterias incluida E. coli y en la actualidad se está haciendo cada vez más necesario combinar cultivos de orina y un ensayo de sensibilidad incluso en atención primaria.
En un estudio reciente que estudiaba las tasas de resistencia en E. coli procedente de América del Norte (EE.UU. y
5 Canadá)8, de las 1142 E. coli recogidas, un 75,5 % (862) se recogieron en EE.UU. y 280 (24,5 %) de Canadá. En total, la resistencia a la ampicilina fue de un 37,7 %, seguido de SMX/TMP (21,3 %), nitrofurantoína (1,1 %), ciprofloxacina (5,5 %) y levofloxacina (5,1 %). Este estudio publicaba tasas de resistencia a antibióticos más altas en las colonias de E. coli aisladas en las muestras urinarias de pacientes ambulatorios procedentes de los EE.UU. en comparación con las de Canadá y demostraba la evolución continuada de resistencia a los agentes antimicrobianos.
10 En un estudio europeo de 2002-3, el estudio Eco-Sens9, se determinaron las tasas de resistencias a antibióticos en
E. coli procedente de una serie de países europeos. En la Tabla 2 se muestran los resultados.
Tabla 2. Resistencia antimicrobiana de E. coli en países europeos en el estudio Eco-Sens9.
Agente antimicrobianoa (resistencia en porcentaje)
País
n AMP AMC MEC CFR TMP SUL SXT NAL CIP NIT FOF GEN
Austria
126 17,5 2,4 1,6 0,8 9,5 25,4 9,5 2,4 0 0,8 0 0,8
Bélgica
137 30,7 2,9 1,5 0,7 13,9 32,8 14,6 6,6 2,9 0,7 0,7 0,7
Canadá
166 29,5 3,6 1,2 1,8 10,8 25,3 12,0 0,6 0 1,2 0,6 0,6
Dinamarca
85 22,4 1,2 1,2 1,2 10,6 21,2 8,2 3,5 0 1,2 1,2 0
Finlandia
182 19,8 4,9 0,5 1,6 5,5 15,4 4,9 1,6 0,5 0,5 1,1 0,5
Francia
199 27,6 1,5 1,5 1,0 15,6 31,7 15,1 3,5 2,0 1,0 1,0 0
Alemania
138 29,0 2,2 2,2 1,4 22,5 34,8 21,0 3,6 2,2 0,7 0 0,7
Grecia
132 22,0 0,8 0,8 3,0 13,6 19,7 11,4 6,8 1,5 3,0 1,5 0,8
Irlanda
154 44,8 5,8 0,6 0,6 22,1 40,3 20,8 1,9 0 0 1,3 0,6
Luxemburgo
24 41,7 0 0 0 16,7 25,0 16,7 8,3 4,2 4,2 0 0
Países Bajos
195 28,7 2,6 1,5 4,6 12,3 25,6 10,3 5,1 2,1 1,0 0,5 0,5
Noruega
168 23,8 3,6 0 2,4 13,1 25,0 11,3 1,2 0 0 1,2 0
Portugal
86 45,3 9,3 2,3 2,3 26,7 44,2 26,7 11,6 5,8 5,8 0 3,5
España
191 53,9 4,2 1,0 3,1 25,1 48,7 25,7 26,7 14,7 4,2 0,5 4,7
Suecia
193 15,5 5,7 1,6 5,2 8,8 16,6 8,3 2,6 0 0 0,5 0
Suiza
122 27,0 2,5 0 0,8 18,9 31,1 18,9 6,6 2,5 0,8 0,8 3,3
Reino Unido
180 37,2 2,8 1,7 1,7 13,3 31,7 12,2 2,2 0,6 0 0 0
Total
2478 29,8 3,4 1,2 2,1 14,8 29,1 14,1 5,4 2,3 1,2 0,7 1,0
aAMP, ampicilina; AMC, co-amoxiclav; MEC, mecilinam; CFR, cefadroxil; TMP, trimetoprim; SUL, sulfametoxazol; SXT, trimetoprim/sulfametoxazol; NAL, ácido nalidíxico; CIP, ciprofloxacina; NIT, nitrofurantoína; FOF, fosfomicina; GEN, gentamicina.
Tal como puede deducirse de estos datos, las tasas de resistencia para los antibióticos usados comúnmente, tales
15 como la ampicilina, sulfonamidas y trimetoprim, son tan elevadas en la actualidad (es decir, 15-45 %), que estos fármacos no pueden utilizarse empíricamente sin un ensayo de susceptibilidad. El uso de fluoroquinolonas, que son fármacos de amplio espectro eficaces y en algunos países aún actúan sobre la mayoría de los patógenos urinarios, está directamente relacionado con el desarrollo de resistencias, las cuales son problemáticas incluso en una escala a corto plazo debido a la importancia de estos fármacos para tratar infecciones graves en hospitales. Debido a que
20 las tasas de resistencia varían entre las áreas geográficas pueden preferirse diferentes antimicrobianos dependiendo del propósito para el cual se utiliza la composición de acuerdo con la invención.
En una realización actualmente preferida, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden uno o más antimicrobianos, donde el antimicrobiano o al menos uno de los antimicrobianos se seleccionan a partir del grupo constituido por: aminoglucósidos, piperacilina/tazobactam, antibióticos carbapenémicos, cefalosporinas,
25 glucopéptidos, lipopéptidos y péptidos antimicrobianos (por ejemplo, polimicina o colistina) y combinaciones de los mismos.
En una realización igualmente preferida, las composiciones de acuerdo con la invención se desarrollan para su uso en el diagnóstico de infecciones de las vías urinarias en Dinamarca y en los países escandinavos. En estas composiciones el antimicrobiano o los antimicrobianos se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en: 30 ampicilina/amoxicilina, sulfonamida, trimetoprim, nitrofurantoína, mecilinam y ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona) y
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combinaciones de los mismos.
Para el mismo propósito puede ser preferible que el antimicrobiano se seleccione a partir del grupo constituido por: trimetoprim, sulfametizol, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam (amdinocilina) y combinaciones de los mismos.
Por razones similares, se han desarrollado composiciones para su uso en el diagnóstico de ITU en Europa fuera de
5 Escandinavia. En estas composiciones, el antimicrobiano o antimicrobianos se selecciona o seleccionan preferentemente del grupo que consiste en: amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), sulfametoxazol, trimetoprim, cefalexina/cefuroxima/cefadroxil (u otra cefalosporina oral), nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicin-trometerol) y combinaciones de los mismos.
A efectos del diagnóstico de la ITU en los Estados Unidos puede preferirse que el antimicrobiano o antimicrobianos
10 se seleccione o seleccionen a partir del grupo constituido por: amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), sulfametoxazol, trimetoprim, cefalexin/cefuroxima/cefadroxil/cefaclor (u otra cefalosporina oral), nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicin-trometerol) y combinaciones de los mismos.
Debe sobreentenderse en particular que la amoxicilina puede incluirse bien sola o bien combinada con ácido clavulánico. De manera similar, la ampicilina puede incluirse sola o combinada con sulbactam, y el sulfametoxazol
15 puede utilizarse solo o combinado con trimetoprim.
A efectos diferentes del diagnóstico de las ITU, el antimicrobiano o los antimicrobianos también pueden seleccionarse del grupo que consiste en: amoxicilina/ácido clavulánico (o sulbactam), fenoximetil-penicilina, cefalosporinas (p.ej., cefuroxima axetil, cefalexina), ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina, fleroxacina, sulfametoxazol y trimetroprim (opcionalmente combinados tal como se utilizan en el tratamiento oral), tetraciclinas
20 (doxiciclina o cualquier otro grupo de tetraciclinas), cloranfenicol, fosfomicina, macrólido/clindamicina y rifampicina y combinaciones de los mismos.
Si el ensayo se va a utilizar en un laboratorio de hospital, también pueden considerarse los antibióticos para uso intravenoso, incluidos los antimicrobianos seleccionados a partir del grupo constituido por: aminoglucósidos, cefalosporinas (cefotaxima, ceftazidima, cefepima, cefpodoxima, ceftriaxona y otros), piperacilina/tazobactam,
25 antibióticos carbapenémicos, cefalosporinas, glucopéptidos, lipopéptidos, linezolid y péptidos antimicrobianos (por ejemplo, polimicina o colistina) y combinaciones de los mismos.
Aditivos importantes para el medio selectivo
Inhibidores de tipo sulfa e iones metálicos: La variación del Mg y Ca afectará a los resultados de los ensayos de aminoglucósidos y tetraciclinas con Ps. aeruginosa. El exceso de iones zinc puede reducir los tamaños de las zonas
30 de los antibióticos carbapenémicos. Un contenido catiónico excesivo reducirá la actividad antibiótica, mientras un contenido catiónico bajo dará como resultado una mayor actividad. Ca y Mg deben estar disponibles en el medio en forma de sales solubles.
El contenido de timidina del medio afecta al estudio de los estafilococos resistentes a meticilina y trimetoprim. La mayoría del medio de agar contiene pequeñas cantidades de antagonistas de trimetoprim y sulfonamida que pueden
35 afectar a los resultados del estudio de sensibilidad (especialmente si no se añade sangre) con un contenido antibiótico bajo en el medio. El medio para el ensayo de sensibilidad debe contener menos de 0,03 mg/l de timidina, de otro modo se aprecian pequeñas colonias en el agar con trimetoprim. Si el medio contiene un poco más de timidina de lo recomendado, es posible reducir la concentración añadiendo timidina-fosforilasa: de 0,025 a 0,1 UI de enzima/ml de medio o un 5 % de sangre de caballo hemolisada, que contiene la misma enzima.
40 Puede suponer una ventaja el disolver el antibiótico antes de añadir el antibiótico al medio semisólido.
En concreto, los disolventes utilizados para disolver el agente o los agentes antimicrobianos pueden incluir uno o más de los siguientes:
Agua
Solución salina fisiológica al 0,85 %
45 Tampón fosfato, pH 6,0, 0,1 mol/l Tampón fosfato, pH 8,0, 0,1 mol/l Tampón fosfato, pH 7,2, 0,01 mol/l Solución saturada de bicarbonato sódico Bicarbonato sódico acuoso al 0,1 %
50 Etanol al 95 % Metanol Ácido acético glacial Dimetilformamida (DMF) Sulfóxido de dimetilo (DMSO)
55 DMSO 1/10 vol DMSO más ácido acético glacial
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½ volumen de agua más gotas de hidróxido sódico 1 mol/l ½ volumen de agua más gotas de hidróxido sódico 0,1 mol/l ½ volumen de agua más gotas de hidróxido sódico 2,5 mol/lÁcido clorhídrico 0,04 mol/l
5 Polisorbato-80 (0,002 %) en agua
La estabilidad de los antimicrobianos en el medio semisólido puede depender del valor del pH. El valor del pH no debe exceder ciertos límites ya que esto influenciará el efecto antimicrobiano. La estabilidad de la ampicilina y mecilinam se ha mejorado ajustando el valor del pH del medio semisólido a 6,0.
De acuerdo con la invención, las dos o más sustancias cromógenas presentes en la composición se seleccionan
10 preferentemente a partir del grupo constituido por: 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato, 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato p-toluidina, cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4'-bifenilileno)-bis-2-(p-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio, 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 5-bromo-3-indolil-β-Dgalactopiranósido, 6-bromo-2-naftil-β-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 6-bromo-3-indolilβ-D-galactopiranósido, 1-metil-3-indolil-β-D-galactopiranósido, o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido, p-nitrofenil-β-D
15 galactopiranósido, 3,4-ciclohexenoesculetin-β-D-galactósido, 8-hidroxiquinolin-β-D-galactósido, 5-bromo-4-cloro-3indolil-α-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dglucurónido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido, 8-hidroxiquinolin-β-D-glucurónido, 2,2'-azino-bis(ácido 3etilbenzotiazolin-6-sulfónico), 4-cloro-1-naftol, tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina, o-fenilendiamina, 3,3',5,5'tetrametilbenzidina, bromuro de 4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)vinil]quinolinio-1-(ácido propan-3-ilcarboxílico),
20 5-bromo-6-cloro-3-indolilcaprilato y 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-myo-inositol-1-fosfato y combinaciones de los mismos.
Tal como sabrá el experto en la materia, los componentes enumerados anteriormente se utilizan normalmente en una cantidad de 0,001-1,0 g/l.
En la Tabla 3 a continuación, estos cromógenos se enumeran de acuerdo con la enzima para la cual actúan como sustrato.
25 Tabla 3. Sustratos de enzimas cromógenos
Enzima
Sustrato Concentración Color
Fosfatasa alcalina
5-Bromo-4-cloro-3-indolilfosfato 0,001 a 1,0 g/l Azul
5-Bromo-6-cloro-3-indolilfosfato p-toluidina
0,001 a 1,0 g/l Rojo
Cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4'-bifenilileno)-bis-2-(pnitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio
0,001 a 1,0 g/l Rojo
β-galactosidasa
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 0,001 a 1,0 g/l Azul
5-Bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Magenta
5-Bromo-3-indolil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Azul
6-Bromo-2-naftil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l -
6-Cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Salmón
6-Bromo-3-indolil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l -
1-Metil-3-indolil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Verde
o-Nitrofenil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Amarillo
p-Nitrofenil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l Amarillo
3,4-ciclohexenoesculetin-β-D-galactósido
0,001 a 1,0 g/l Marrón/Neg ro
8-hidroxiquinolin-β-D-galactósido
0,001 a 1,0 g/l -
α-galactosidasa
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-galactopiranósido 0,001 a 1,0 g/l Azul
β-glucosidasa
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido 0,001 a 1,0 g/l Azul
β-glucuronidasa
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido 0,001 a 1,0 g/l Azul
5-Bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido
0,001 a 1,0 g/l Magenta
8-hidroxiquinolin-β-D-glucurónido
0,001 a 1,0 g/l Negro
Peroxidasa
2,2'-Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) 0,001 a 1,0 g/l Verde
4-Cloro-1-naftol
0,001 a 1,0 g/l Azul
Cloruro de 3,3'-diaminobenzidina
0,001 a 1,0 g/l Marrón
o-Fenilendiamina
0,001 a 1,0 g/l -
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(continuación)
Enzima
Sustrato Concentración Color
Peroxidasa
3,3',5,5'-Tetrametilbencidina 0,001 a 1,0 g/l Azul
Esterasa
4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)vinil]quinolinio-1(ácido propan-3-ilcarboxílico)bromuro 0,001 a 1,0 g/l Borgoña
5-Bromo-6-cloro-3-indolilcaprilato
0,001 a 1,0 g/l Magenta
Fosfatidilinositolfosfolipasa C
5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-myo-inositol-1-fosfato 0,001 a 1,0 g/l Azul
A efectos de la detección o diagnóstico de las infecciones del tracto urinario se selecciona preferentemente al menos una de las dos o más sustancias cromogénicas mencionadas a partir del grupo constituido por: 5-bromo-4-cloro-3
5 indolil-β-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido y 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato o combinaciones de los mismos. Puede preferirse que la composición comprenda 3, 4 o 5 sustancias cromógenas, todas seleccionadas a partir de este grupo.
La sustancia fluorógena de la composición de acuerdo con la invención puede seleccionarse a partir del grupo
10 constituido por: 4-metilumbeliferilfosfato, 4-metilumbeliferil-β-D-galactopiranósido, 4-metilumbeliferil-β-Dgalactopiranósido y 4-metilumbeliferil-b-D-glucurónido o combinaciones de los mismos.
Tal como se ha descrito previamente, el medio semisólido puede comprender en una realización particular triptófano, tal como L-triptófano. Las bacterias que expresan la triptofanasa degradarán el L-triptófano presente en el medio semisólido para dar indol, piruvato y amoníaco. Las enterobacterias del grupo Proteus-Morganella-Providencia 15 forman un pigmento a partir del L-triptófano que colorea el agar que rodea la colonia de marrón rojizo a marrón. Algunas bacterias que pertenecen al grupo Proteus son: Proteus mirabilis, P. vulgaris, P. penneri y P. myxofaciens. Una bacteria que pertenece al grupo Morganella es: Morganella morganii. Algunas bacterias que pertenecen al grupo Providencia son: Providencia rettgeri, P. stuartii, P. alcalifaciens, P. rustigianii y P. heimbachae. Las Proteus spp., Morganella spp. y Providencia spp. que producen triptófano-desaminasa eliminarán el grupo amino del
20 aminoácido L-triptófano para dar ácido indolpirúvico y amoníaco. El ácido indolpirúvico, los iones férricos y los compuestos de tipo hidrazina en el medio de cultivo producen un color entre rojizo y marrón en el medio. Además, se pueden detectar las bacterias que degradan L-triptófano para dar indol mediante la adición de un disco de papel a la tapa de la placa de Petri. El disco preparado con el reactivo de Ehrlich-Böhme (paradimetilaminobenzaldehído disuelto en alcohol etílico/HCl) dará un color rojo junto con la formación de vapor de indol durante la incubación.
25 En una realización adicional, el medio semisólido de la presente invención también comprende uno o más inductores los cuales son sustancias que regulan de manera positiva la expresión de uno o más genes. La inducción es común en las rutas metabólicas que dan como resultado el catabolismo de una sustancia y el inductor normalmente es el sustrato de la ruta. Los efectos de los inductores pueden ser cruciales para la función y sensibilidad de muchos ensayos habituales. La adición de inductores al medio puede aumentar la coloración. En la Tabla 4 a continuación
30 se muestran algunos inductores comunes:
Tabla 4 Inductores
Enzima
Inductores Concentración
4-Aminofenil-β-D-galactopiranósido
0,001 a 1,0 g/l
B-galactosidasa
Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
1-O-Metil-β-D-galactopiranósido
Metil-β-D-tiogalactopiranósido
A-galactosidasa
1-O-Metil-α-D-galactopiranósido 0,001 a 1,0 g/l
B-glucosidasa
Isopropil-β-D-tioglucopiranósido 1-O-Metil-β-D-glucopiranósido 0,001 a 1,0 g/l
B-glucuronidasa
Sal sódica del ácido isopropil-β-D-tioglucurónico 0,001 a 1,0 g/l
Tal como sabrá el experto en la materia, los componentes enumerados anteriormente se utilizan normalmente en una cantidad de 0,001-1,0 g/l.
35 La composición de acuerdo con la presente invención puede comprender 3 o más sustratos fluorescentes o cromógenos, tal como 4 o más sustratos fluorescentes o cromógenos, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más
o 10 o más sustratos fluorescentes o cromógenos. En concreto, la composición de acuerdo con la invención puede comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 sustratos fluorescentes o cromógenos.
Una ventaja particular de la composición de acuerdo con la presente invención es su gran estabilidad. En realizaciones preferidas la composición es estable durante un periodo de hasta 12 meses, tal como durante un periodo de hasta 11 meses, un periodo de hasta 10 meses, de hasta 9 meses, de hasta 8 meses, de hasta 7 meses, de hasta 6 meses, de hasta 5 meses, de hasta 4 meses, de hasta 3 meses, de hasta 2 meses o tal como durante un
5 periodo de hasta 1 mes cuando se almacena a una temperatura de 4 ºC o menos.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una plataforma para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una contaminación o infección microbiana que comprende una composición como la definida anteriormente.
En concreto, la plataforma de acuerdo con la presente invención puede comprender una variedad de composiciones
10 tales como las definidas anteriormente, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50 o 90 composiciones, en la que al menos 2 de las composiciones comprenden diferentes antimicrobianos, tales como en la que al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, 14, 15, 20, 50 de las composiciones comprenden diferentes antimicrobianos o donde cada composición comprende un antimicrobiano diferente.
15 En realizaciones adicionales la plataforma de acuerdo con la invención comprende
i) una composición de ensayo que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido tal como el definido anteriormente y dos o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos, tales como una sustancia (o sustrato) fluorógeno o cromógeno tal como el definido anteriormente y uno o más antibióticos, tales como uno o más antibióticos como los definidos anteriormente;
20 ii) una composición de control que comprende un medio de cultivo microbiano semisólido tal como el definido anteriormente, y dos o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos, tales como los definidos anteriormente, pero que no comprende un antimicrobiano, tal como un antimicrobiano como el definido anteriormente.
La composición de control que no comprende ningún antimicrobiano, o que al menos no comprende ninguno de los
25 antimicrobianos definidos anteriormente (es decir, un antibiótico que es diferente del antibiótico o antibióticos presentes en la composición de ensayo), es útil para determinar el número de microorganismos así como las especies y/o grupos de microorganismos en una muestra dada. La composición de ensayo que comprende uno o más antibióticos es útil para determinar la sensibilidad de estas especies y/o grupos de microorganismos a cualquier antibiótico presente en la composición de ensayo.
30 Por motivos de conveniencia, la plataforma de acuerdo con la presente invención comprende un soporte sólido, lo que hace que las composiciones de acuerdo con la invención sean fáciles de manejar.
En particular, la plataforma de acuerdo con la presente invención puede tener como base un soporte sólido, en la que dicho soporte sólido comprende:
i) una hendidura (10) siendo capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible
35 contaminación o infección microbiana, en la que dicha hendidura se divide en tres o más compartimentos separados (11-16), conteniendo cada compartimento una composición de ensayo como la definida anteriormente
o una composición de control como la definida anteriormente, que es un medio que no comprende ninguno de los antimicrobianos mencionados anteriormente o que no comprende ningún antimicrobiano en absoluto; y uno o más miembros divisores (17) integrados para dividir dicha hendidura en compartimentos separados, o
40 ii) múltiples hendiduras (18), siendo cada hendidura capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible contaminación o infección microbiana, conteniendo cada una de ellas una composición de ensayo como la definida anteriormente o una composición de control como la definida anteriormente.
Los números se refieren a las ilustraciones en la Figura 1, las cuales son ejemplos representativos de plataformas de acuerdo con la presente invención.
45 De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la plataforma comprende composiciones de ensayo que contienen antimicrobianos seleccionados a partir del grupo constituido por: ampicilina/amoxicilina, sulfonamida, trimetoprim, nitrofurantoína, mecilinam, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona). De acuerdo con esta realización, la plataforma puede comprender una composición de ensayo que comprenda ampicilina/amoxicilina, una que comprenda sulfonamida, una que comprenda trimetoprim, una que comprenda nitrofurantoína, una que
50 comprenda mecilinam y/o una que comprenda ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona). Puede preferirse una plataforma de este tipo con el fin de diagnosticar las ITU en Escandinavia.
Igualmente, la plataforma puede comprender una composición de ensayo que comprenda rimetoprim, una que comprenda sulfametizol, una que comprenda ampicilina, una que comprenda nitrofurantoína y una que comprenda mecilinam (amdinocilina).
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Con el fin de diagnosticar las ITU en los países europeos no escandinavos puede preferirse una plataforma que comprenda composiciones de ensayo que contengan amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), sulfametoxazol, trimetoprim, cefalexin/cefuroxima/cefadroxil (u otra cefalosporina oral), nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicina-trometerol).
5 Finalmente, con el fin de diagnosticar las ITU en América del Norte/los Estados Unidos, puede preferirse una plataforma que comprenda composiciones de ensayo que contengan amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), sulfametoxazol, trimetoprim, cefalexin/cefuroxima/cefadroxil/cefaclor (u otra cefalosporina oral), nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicinatrometerol).
10 Con el fin de que sirva a su propósito, la hendidura o las múltiples hendiduras de la plataforma mencionadas deben tener un volumen lo suficientemente grande para acomodar un volumen de muestra adecuado. En realizaciones particulares la hendidura o las múltiples hendiduras mencionadas tiene o tienen una profundidad de desde 1-40 mm, tal como de 1-35 mm, de 1-30 mm, de 1-25 mm, de 5-40 mm, de 5-35 mm, de 5-30 mm, de 5-25 mm, de 10-40 mm, de 10-35 mm, de 10-30 mm, de 10-25 mm, de 15-40 mm, de 15-35 mm, de 15-30 mm o tal como de 25-25 mm.
15 Para las infecciones del tracto urinario así como para muchas otras infecciones, se aplican normas particulares que conciernen al uso de herramientas diagnósticas en la medicina general. El médico de familia trata a la mayoría de los pacientes que padecen ITU y el consumo de antibióticos para tratar las ITU asciende a aproximadamente un 25 % de la utilización total de antibióticos fuera de los hospitales -y debido a que el 90 % de la cantidad total de antibióticos utilizados en la sociedad occidental se utiliza de manera extrahospitalaria, la utilización de antibióticos
20 para las ITU es sustancial. Se dispone de una amplia evidencia de que, para el paciente, es beneficioso recibir el diagnóstico correcto incluyendo la susceptibilidad bacteriana tan pronto como sea posible. Existen también muchas y buenas razones para que el MF lleve al cabo el diagnóstico de la ITU en la clínica: esto acorta el tiempo de tratamiento disminuyendo el tiempo de transporte a un laboratorio central y lejano, y al evitar el transporte se mejora la calidad del cultivo. Debido a que el MF dispone de poca experiencia en microbiología, el procedimiento del cultivo
25 debe ser de inoculación y lectura fáciles y el ensayo de sensibilidad debe ser independiente del inóculo y también de lectura fácil, es decir, el MF o su asistente tienen poco tiempo para medir una zona de inhibición y traducirlo en un grupo de sensibilidad. Al mismo tiempo, el sistema de cultivo debe ser fácil de transportar al laboratorio, en caso de que se necesite una evaluación diagnóstica bacteriana más sofisticada. Otros factores importantes son los siguientes: el ensayo debe ser capaz de medir y leer recuentos de tan solo 103 UFC/ml y debería ser capaz de
30 distinguir entre patógenos y contaminantes. Estos tres factores se incorporan en la plataforma de acuerdo con la presente invención.
Con el fin de cumplir con estos requisitos, la plataforma de acuerdo con la presente invención tiene preferentemente compartimentos con las composiciones de ensayo, donde cada uno de los cuales tiene un área de 4-9 cm2, tal como de 5-8 cm2, de 6,5-7,5 cm2. Igualmente, se prefiere que el compartimento o compartimentos con la composición de
35 control tengan un área de 15-25 cm2, tal como de 17-23 cm2 o de 19,5-21,5 cm2.
La versión más preferida actualmente de la plataforma tiene hendiduras o compartimentos con composiciones de ensayo que tienen un área de 6,93 cm2 y un volumen de 6,24 cm3, y un compartimento o una hendidura con una composición de control que tiene un área de 20,78 cm2 y un volumen de 18,7 cm3. Se ha adaptado este diseño particular para su uso en la detección, diagnóstico y caracterización de las infecciones de las vías urinarias en
40 función de la experiencia de que estas áreas y volúmenes son suficientes si la plataforma se va a usar para la detección de infecciones microbianas, incluidas las infecciones de las vías urinarias, en las cuales los microorganismos/bacterias están presentes en cantidades de 103 UFC/ml de muestra/orina.
Las composiciones de ensayo y de control mencionadas pueden estar presentes en las hendiduras o compartimentos respectivos en una cantidad correspondiente a un 5-75 % del volumen de la hendidura o
45 compartimento, tal como de un 10-75 %, de un 10-65 %, de un 10-55 %, de un 10-45 %, de un 10-35 %, de un 20-75 %, de un 20-65 %, de un 20-55 %, de un 20-45 %, de un 20-35 %, tal como desde un 25-75 %, de un 25-65 %, de un 25-55 %, de un 25-45 %, de un 25-35 % o tal como en una cantidad correspondiente a de un 25-35% del volumen de la hendidura o compartimento.
En la plataforma de acuerdo con la presente invención dicha hendidura puede, de acuerdo con ciertas realizaciones, 50 dividirse en 3 o más compartimentos, tal como 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15
o más, 20 o más, 40 o más, 60 o más o 90 o más compartimentos.
Además, la plataforma de acuerdo con la presente invención puede tener 3 o más hendiduras, tales como 4 o más, 5
o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 40 o más, 60 o más o 90 o más hendiduras.
55 De acuerdo con ciertas realizaciones prometedoras, la plataforma de acuerdo con la presente invención comprende miembros divisores para dividir dicha hendidura en compartimentos separados en los que se han tratado dichos miembros divisores para evitar la difusión de un antimicrobiano entre los compartimentos. Se considera que la tensión superficial presente en las composiciones de acuerdo con la presente invención cuando se vierten en las hendiduras o pocillos de la plataforma da lugar a la difusión de antimicrobianos entre los compartimentos si no se tiene un gran cuidado. Con el fin de evitar esto, dicho uno o más miembros divisores pueden pulirse para conseguir una superficie lisa. Otros medios para reducir la tensión superficial y la difusión de antimicrobianos implican la adición de un detergente tal como Tween a la composición de acuerdo con la invención.
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5 Aunque pueden considerarse muchos diseños útiles, el soporte sólido mencionado está preferentemente en forma de un recipiente abierto o cerrado, tal como una bandeja, un tubo de ensayo, una botella, una placa de varios pocillos, una placa de microtitulación, una tira (tira reactiva) o un portaobjetos.
El soporte sólido puede fabricarse en particular a partir de un sustrato plástico/polimérico, tal como un sustrato de cloruro de polivinilo, un sustrato de polietileno, un sustrato de polipropileno, un sustrato de policarbonato, un sustrato
10 de acrilonitrilo butadieno estireno, un sustrato de polimetilmetacrilato o un sustrato de poliestireno, a partir de un sustrato vítreo o a partir de un sustrato metálico.
De acuerdo con las realizaciones actualmente preferidas, la plataforma de acuerdo con la invención comprende un soporte sólido, el cual está en forma de una placa Petri, tal como una placa Petri que tiene un diámetro de 50 a 150 mm, de 60-130 mm, de 70-110 mm o de 80-110 mm. De acuerdo con una realización particular, el soporte está en
15 forma de una placa de Petri de 90 mm.
La plataforma de la invención puede adaptarse para su uso, en concreto, en la detección y/o diagnóstico de infecciones seleccionadas a partir del grupo constituido por infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y los tejidos blandos, infecciones debidas a S. aureus (incluida S. aureus resistente a meticilina), infecciones debidas a meningococos, infecciones debidas a gonococos e infecciones debidas a estreptococos.
20 Pueden incorporarse otros ensayos en la plataforma, por ejemplo, pegados a la superficie interna de una capa que cubre dicho soporte, a la cara interna del soporte o sobre una parte central del soporte, por ejemplo, una parte en la que dichos miembros divisores se unen. Para su uso en este tipo de ensayos, la plataforma puede comprender una enzima, tal como una leucocito-esterasa. Cuando se incorpora en la plataforma la leucocito-esterasa permite el diagnóstico simultáneo de la leucocituria (también puede llevarse a cabo para el ensayo de nitrito). De acuerdo con
25 la presente, la enzima puede estar contenida en un miembro integrado o separado de dicho soporte. Por ejemplo, tal como se ha descrito previamente, la bacteria que degrada L-triptófano para dar indol puede además detectarse añadiendo un disco de papel a la tapa de la placa Petri. El disco preparado con el reactivo de Ehrlich-Böhme (paradimetilaminobenzaldehído disuelto en alcohol etílico/HCl) generará un color rojo con vapor de indol formado durante la incubación.
30 Otro aspecto de la presente invención proporciona un kit que comprende una composición tal como se ha descrito anteriormente.
Un aspecto relacionado proporciona un kit que comprende una plataforma tal como se ha descrito anteriormente.
Los kits de este tipo pueden ser en concreto para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una contaminación o infección microbiana.
35 De acuerdo con cualquiera de los aspectos el kit puede comprender además un patrón que indique el grado de crecimiento sobre una plataforma tal como se ha definido anteriormente, la cual es el resultado de poner en contacto dicha plataforma con una suspensión que tiene una concentración predeterminada de una cepa de referencia microbiana. En la Figura 3 de la presente solicitud se muestra un patrón representativo.
El kit puede comprender además un patrón que indique el desarrollo de un pigmento bioquímico y/o fluorescencia
40 sobre una plataforma tal como se ha definido anteriormente, el cual es el resultado del crecimiento en la plataforma de una o más cepas de referencia microbianas. En la Figura 4 de la presente solicitud se ilustra un patrón representativo.
A efectos de conveniencia el patrón es preferentemente una reproducción fotográfica o impresa de una plataforma tal como se ha definido anteriormente.
45 De acuerdo con una realización particular, el patrón mencionado que indica la cantidad del crecimiento sobre la plataforma se ha generado poniendo en contacto una plataforma de acuerdo con la presente invención con una cepa de referencia de la bacteria E. coli, tal como una bacteria E. coli (ATCC 29522) y/o una cepa de referencia de Staphylococcus aureus, tal como Staphylococcus aureus, ATCC 25913.
De acuerdo con una realización particular adicional, el patrón mencionado que indica el desarrollo de un pigmento
50 bioquímico y/o fluorescencia en una plataforma se ha generado poniendo en contacto una plataforma de acuerdo con la presente invención con una o más cepas de referencia seleccionadas a partir del grupo constituido por: E. coli, tal como la cepa de E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae, tal como la cepa de K. pneumoniae ATCC 10031, E. cloacae, tal como la cepa de E. cloacae ATCC 13047, P. mirabilis, tal como la cepa de P. mirabilis ATCC 12453, P. vulgaris, tal como la cepa de P. vulgaris ATCC 13315, M. morganii, tal como la cepa ATCC 25830, C. freundii, tal
55 como la cepa de C. freundii 8090, P. aeruginosa, tal como la cepa de P.aeruginosa ATCC 27853, E. faecalis, tal como la cepa de E. faecalis ATCC 29212, E. faecium, tal como la cepa de E. faecium ATCC 35667, S. saprophyticus, tal como la cepa de S. saprophyticus 49907 y C. albicans, tal como la cepa de C. albicans ATCC 200955.
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En la Figura 4 se muestra un patrón que es útil en el contexto de la presente invención.
5 Los patrones que indican el grado de crecimiento pueden generarse mediante un procedimiento que comprende:
i) proporcionar una suspensión con una densidad de 0,5 McFarland/1+E08 UFC/ml de dicha cepa de referencia o cepas de referencia en salmuera al 0,9 %;
ii) proporcionar una serie de diluciones de 10 veces de dicha suspensión en i), hasta descender a una densidad de +E03 UFC/ml;
10 iii) poner en contacto cada una de dichas diluciones en ii) con una plataforma de acuerdo con la presente invención durante 2-3 segundos y posteriormente decantar las soluciones;
iv) incubar cada plataforma durante toda la noche a 35 ºC a atmósfera ambiente.
De acuerdo con realizaciones adicionales, el kit comprende uno o más antimicrobianos empaquetados por separado. Dicho uno o más antibióticos pueden incluirse por adición in situ por parte del usuario a uno o más compartimentos 15 de la plataforma.
De acuerdo con una realización actualmente preferida, el kit de acuerdo con la presente invención es un kit para el diagnóstico inmediato y el estudio de la sensibilidad de los patógenos del tracto urinario. El kit se desarrolló para el cultivo de orina en un marco de asistencia sanitaria primaria. Preferentemente se diseña como una placa Petri de nueve cm dividida en seis compartimentos: un compartimento mayor para el análisis cuantitativo y cinco 20 compartimentos más pequeños para los ensayos de sensibilidad. En cada compartimento pequeño el agar contiene uno de los cinco antimicrobianos (para Dinamarca y Escandinavia son preferentemente: trimetoprim, sulfametizol, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam (amdinocilina)) con una concentración que se ajusta al valor crítico, de modo que el crecimiento en estos compartimentos indica resistencia y la ausencia de crecimiento indica sensibilidad. La placa de Petri tiene preferentemente laterales más elevados, aproximadamente 2,48 cm, que la placa normal, es
25 decir, aproximadamente 1,48 cm. Esto permite verter una cantidad mayor, como máximo 100 ml, de orina en la placa para la inoculación.
El agar de la placa se compone preferentemente de:
Sustancias cromógenas Agar Isosensitest
30 Antibióticos mezclados en el agar en cinco compartimentos: Sulfametizol Trimetoprim Ampicilina Nitrofurantoína
35 Mecilinam
En la Figura 2 se muestra una ilustración de esta realización.
La inoculación tiene lugar vertiendo orina (5-10 ml son suficientes) sobre la placa y rotando la placa con una mano de modo que el fluido cubra las seis secciones. Posteriormente, se elimina la orina por decantación; la presencia de orina durante 2-3 segundos es suficiente para la inoculación. A continuación se incuba la placa, preferentemente a
40 35-37 ºC durante 18-24 h (la temperatura ambiente puede ser suficiente para la mayoría de los patógenos urinarios, pero el crecimiento será más lento). La lectura de la placa se realiza en tres fases: 1) Evaluación del grado de crecimiento: si aprecia cualquier crecimiento, se compara con un esquema de imágenes que muestra las diferentes cantidades de UFC para E. coli a 103, 104, 105, 106 y 107 UFC/ml. 2) A continuación puede evaluarse el tipo de crecimiento comparando de nuevo con esquemas de color/imágenes
45 que muestran los diferentes tipos de patógenos urinarios. Asimismo, se registra el número de los diferentes tipos de colonias y las cantidades de los diferentes tipos de colonias de acuerdo con el esquema anterior. Se pueden distinguir las especies/familias bacterianas por el color y el tipo de la colonia tal como se muestra en la Tabla 5:
Tabla 5: Códigos de color para las colonias y el agar de los diferentes patógenos urinarios en la placa Flexicult:
Especie/grupo Color Colonia en el agar (diámetro en mm)
E. coli Salmón-rojo/rosa Citrobacter sp Azul-verdoso Klebsiella/Enterobacter/Citrobacter spp Azul-oscuro
29
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(continuación)
Especie/grupo Color Colonia en el agar (diámetro en mm)
Proteus mirabilis/Morganella morganii Marrón Marrón claro
Proteus vulgaris Marrón Verde oscuro
Enterococcus faecalis Verde-azul Azul/verdoso (1-2 mm)
Enterococcus faecium Verde-azul Azul/verdoso (½-1 mm)
Staphylococcus saprophyticus Rojo/salmón-rojo
Staphylococcus, otros Blanco/amarillo (Blanco/amarillo -verdoso tras 24-36 h de
Pseudomonas aeruginosa Incoloro
incubación) Candida spp. Blanco (hifas tras 48 h)
3) Lectura de la susceptibilidad del crecimiento bacteriano: cada bacteria (si hay más de una) se lee individualmente. Se compara el crecimiento en cada una de las secciones con antibióticos con el crecimiento en el agar de control. Si 5 se aprecia cualquier crecimiento en un agar con antibiótico, y si el grado de crecimiento es similar al del agar de control, entonces se considera que la bacteria es resistente al antibiótico en el agar. Si no se aprecia crecimiento (o es sustancialmente menor que el del agar de control), entonces se considera que la bacteria es sensible al antibiótico. Si el crecimiento es mayor que el crecimiento nulo y menor que el crecimiento sustancialmente menor, es necesario considerar qué antibiótico y qué bacteria: para el sulfametizol y el trimetoprim, que son fármacos 10 bacteriostáticos, unas colonias escasas y diminutas pueden cubrir todo el agar, pero se reduce el crecimiento sustancialmente en comparación con el agar de control: esto se registra como susceptibles al antibiótico en cuestión. Cuando se utilizan la nitrofurantoína y el mecilinam como antibióticos, pueden observarse unas pocas colonias únicas del mismo tipo que las bacterias en el agar de control: estas no se consideran mutantes resistentes, sino “persistentes”, es decir, si se vuelven a evaluar aparecerán como susceptibles. Esto se observa comúnmente
15 también en la difusión en disco, especialmente para el mecilinam. 4) La sensibilidad/resistencia de las diferentes bacterias también puede utilizarse para diagnosticar diferentes especies patógenas, ya que algunas bacterias son resistentes a algunos antibióticos desde su “nacimiento”; es decir, tienen una naturaleza resistente a uno o más antibióticos a diferencia de la resistencia que las bacterias adquieren al exponerse a los antibióticos. Estos “patrones” de resistencia pueden apreciarse en la Tabla 6.
20 Tabla 6. Resistencia/susceptibilidad normal de los patógenos urinarios comunes. La mayoría de las bacterias pueden volverse resistentes a los antibióticos en cuestión por mutación o transferencia de genes que albergan mecanismos de resistencia.
Bacterias
susceptible = S o Resistente = R
Trimetoprim
Sulfonamida Ampicilina Nitrofurantoína Mecilinam
E. coli
S S S S S
Citrobacter
S S R S S
Klebsiella
S S R S/R S
Enterobacter
S S R S/R S
P. mirabilis
S S S S/R S/R
P. vulgaris
S S R R R
Bacterias
susceptible = S o Resistente = R
Trimetoprim
Sulfonamida Ampicilina Nitrofurantoína Mecilinam
Morganella
S S R R R
S. saprophyticus
S S S S S/R
E. faecalis
S R S S R
E. faecium
S R S S R
S. agalactiae
S S S S R
Pseud. Aeruginosa
R R R R R
Candida sp.
R R R R R
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Otro aspecto más de la presente invención proporciona la utilización de una composición de acuerdo con la presente invención y tal como se ha definido anteriormente en la presente en la detección y/o diagnóstico de infecciones seleccionadas a partir del grupo constituido por infecciones de las vías urinarias, infecciones de la piel y los tejidos blandos, infecciones debidas a S. aureus (incluida S. aureus resistente a meticilina), infecciones debidas a
5 meningococos, infecciones debidas a gonococos e infecciones debidas a estreptococos incluidas las infecciones debidas a neumococos. En concreto, la presente invención proporciona la utilización de dicha composición en la detección y/o identificación de microorganismos uropatógenos.
Otro aspecto más de la invención proporciona una composición de acuerdo con la invención y tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, para su utilización en la detección y/o diagnóstico de infecciones
10 seleccionadas del grupo que consiste en infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y los tejidos blandos, infecciones debidas a S. aureus (incluida S. aureus resistente a meticilina), infecciones debidas a meningococos, infecciones debidas a gonococos e infecciones debidas a estreptococos incluidas las infecciones debidas a neumococos.
La presente invención proporciona además un procedimiento para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una 15 contaminación o infección microbiana que comprende las etapas de:
i) proporcionar una muestra con una posible contaminación o infección microbiana; y
ii) poner en contacto dicha muestra con una plataforma tal como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, también se proporciona un procedimiento para diagnosticar, detectar y/o caracterizar una contaminación o infección microbiana que comprende las etapas de:
20 i) proporcionar una muestra con una posible contaminación o infección microbiana; y ii) poner en contacto dicha muestra con una composición de ensayo (tal como dos o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más o 7 o más composiciones de ensayo) tal como se ha definido en la presente anteriormente y con una composición de control también como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Como se entenderá, la composición de ensayo comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, dos o más
25 sustratos o sustancias fluorógenos o cromógenos, y un antimicrobiano. La composición de control, tal como se ha explicado anteriormente, comprende el medio de cultivo semisólido mencionado y las dos o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos mencionados pero no comprende ningún antimicrobiano ni comprende un antimicrobiano diferente del antimicrobiano o antimicrobianos presentes en la composición de ensayo.
La muestra que se analiza en el procedimiento y mediante la utilización de la composición, plataforma o kit de
30 acuerdo con la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en: una muestra de líquido corporal, una muestra fecal, una muestra de mucosa, una muestra de piel, una muestra de un tejido blando, una muestra de un alimento o un ingrediente de un alimento, una muestra de pienso animal y un cultivo puro microbiano (por ejemplo, bacteriano).
En realizaciones preferidas, en concreto realizaciones relacionadas con el diagnóstico, detección y/o caracterización 35 de infecciones de las vías urinarias, la muestra es una muestra de orina.
El procedimiento que se proporciona de esta manera puede comprender además un paso de incubación de dicha plataforma durante un periodo de 10 horas o más, tal como de 11 horas o más, 12 horas o más, 13 horas o más, 14 horas o más, 15 horas o más, 16 horas o más, 17 horas o más, o 18 horas o más, preferentemente a una temperatura de 15-39 ºC y, preferentemente, a atmósfera ambiente.
40 El procedimiento puede caracterizarse adicionalmente mediante la inclusión de un paso de inspección visual de la plataforma para determinar el crecimiento bacteriano. Esta etapa de inspección visual de las composiciones para determinar el crecimiento bacteriano puede comprender en concreto:
i) evaluar una cantidad de cualquier crecimiento bacteriano en dicha composición de control, opcionalmente haciendo referencia a un patrón que muestras cantidades diferentes de unidades formadoras de colonias; y
45 ii) evaluar un tipo de cualquier crecimiento microbiano en dicha composición de control que comprende el medio de crecimiento semisólido mencionado y las dos o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos mencionados pero que no comprende ningún antimicrobiano/antimicrobiano diferente del o de los antimicrobianos presentes en la composición de ensayo, opcionalmente haciendo referencia a un patrón (tal como un esquema de color y/o imágenes) que ejemplifique el crecimiento de diferentes grupos o cepas de
50 microorganismos; y iii) determinar la susceptibilidad antimicrobiana de dicho crecimiento microbiano comparando el grado de crecimiento en dichas composiciones de ensayo (tal como dos o más, 3 o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 50 o 90 o más composiciones de ensayo) con el grado de crecimiento de dicha composición de control.
55 Se han descrito anteriormente patrones adecuados que muestran diferentes cantidades de unidades formadoras de colonias y patrones que ejemplifican el crecimiento de diferentes grupos o cepas de microorganismos.
imagen25
La etapa de inspección visual de las composiciones para determinar el crecimiento microbiano puede comprender además la determinación del número de los diferentes tipos de colonias y opcionalmente la cantidad de colonias de cada tipo en dicha composición de ensayo (tal como en dos o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más o 7 o más composiciones) tal como se ha definido anteriormente en la presente o en dicha composición de control.
5 El procedimiento además puede comprender la determinación de si un microorganismo en dicha muestra es susceptible a un antimicrobiano en dicha composición de ensayo, indicándose la susceptibilidad por:
i) la ausencia de crecimiento microbiano en dicha composición de ensayo o en una o más de dichas composiciones de ensayo, mientras está presente en dicha composición de control; o
ii) la presencia de crecimiento microbiano en dicha composición de ensayo o en una o más de dichas
10 composiciones de ensayo así como en dicha composición de control, donde el número de colonias/área en dicho ensayo o en una o más de dichas composiciones de ensayo es al menos 100 veces inferior al número/área en dicha composición de control.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para producir la composición de acuerdo con la presente invención, que comprende la etapa de combinar un medio de crecimiento microbiano 15 semisólido, tres o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos y un antimicrobiano.
Igualmente, la presente invención describe un procedimiento para producir una plataforma de acuerdo con la presente invención, que comprende la etapa de combinar un medio de crecimiento microbiano semisólido, tres o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos y un antimicrobiano.
Finalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para producir el kit de diagnóstico de acuerdo con la 20 presente invención, que comprende la etapa de combinar un medio de crecimiento microbiano semisólido, tres o más sustancias (o sustratos) fluorógenos o cromógenos y un antimicrobiano.
Nótese que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a otros aspectos de la presente invención.
Todas las referencias a patentes y documentos que no son patentes citadas en la presente solicitud se incorporan a 25 la presente en su totalidad por referencia.
La presente invención se describirá a continuación en más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de una plataforma basada en una placa Petri de 6 compartimentos (Flexicult)
Se produjo agar Iso-sensitest y se combinó con 1,5 g/L de una mezcla de un sustrato cromógeno que comprendía 530 bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dglucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido, 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato.
Como alternativa se utilizó agar Discovery (Oxoid, CM 1087).
Se produjeron soluciones antibióticas: trimetoprim, sulfametizol, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam.
Preparación de placas calientes y regulación de la temperatura mediante un sensor PT-100:
35 1. Las botellas con agar Discovery/Isosensitest se fundieron a 105 ºC durante 60 min. Tras la fusión, se colocaron las botellas en un baño de agua a 56 ºC durante aprox. 60 min.
2. Se preparó el equipamiento para rellenar el Flexicult: Variomag (Multitherm Stirring Block Thermostat) y Telemodul 40 CT se interconectaron y a continuación se conectaron a un enchufe. Telemodul 40 CT es la unidad que controla tanto la temperatura como la velocidad de agitación del bloque calefactor. Se ajustó la temperatura
40 mediante un sensor PT-100, el cual se instaló en la parte posterior del Telemodul 40 CT.
3.
Se retiraron las botellas con el agar Discovery/Isosensitest del baño de agua y se colocaron sobre el bloque Multitherm Stirring Block; se equipó cada botella con un imán estéril.
4.
Se instaló el cable para el sensor PT-100 en la parte posterior del Telemodul 40 CT, se quemó el punto de contacto y se limpió completamente a continuación con un paño estéril empapado en alcohol para fricciones. A
45 continuación se colocó el punto de contacto en el matraz con mecilinam. El Telemodul 40 CT ajustó a continuación la temperatura en el agar al punto prefijado requerido – aprox. 50,0 ºC ± 2,0 ºC. Se ajustó la velocidad del agitador magnético respecto a los contenidos del matraz (inicio): 235/min.
imagen26
Preparación de los dispensadores:
Se prepararon los dispensadores (Fill-Master 251 y Fill-Master 311). Se unió un tubo de silicona estéril de 4 mm al Fill-Master 251 y cinco tubos de silicona estériles de 2 mm al Fill-Master 311. Los dispensadores respectivos se ajustaron al tamaño de tubo adecuado (2 mm y 4 mm, respectivamente).
5 Se fijó el volumen de llenado de modo que el volumen lleno + el peso de la placa estuviera comprendido en el intervalo de 31 -33 g. Esto se verificó regularmente.
Adición de soluciones antibióticas:
Nota: Las 5 soluciones antibióticas no deben añadirse al agar hasta que la temperatura esté por debajo de 54,0 ºC. La temperatura del agar se verificó en la pantalla del Telemodul CT 40.
10 Trimetoprim (16 µg/ml):
Se añadió la solución madre de trimetoprim al agar Discovery/Isosensitest con una pipeta graduada. Se mezcló completamente la solución en la placa caliente Multitherm. Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se conectó a la aguja de llenado correcta.
Sulfametizol (700 µg/ml):
15 Se añadió la solución madre de sulfametizol al agar Discovery/Isosensitest con una pipeta graduada. Se mezcló completamente la solución en la placa caliente Multitherm. Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se conectó a la aguja de llenado correcta.
Ampicilina (32 µg/ml):
Se añadió a continuación la solución madre de ampicilina al agar Discovery/Isosensitest con una pipeta graduada.
20 Se mezcló completamente la solución en la placa caliente Multitherm. Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se conectó a la aguja de llenado correcta.
Nitrofurantoína (32 µg/ml):
Se evaluó la solución madre de nitrofurantoína en el agar Discovery/Isosensitest con una pipeta graduada. Se mezcló completamente la solución en la placa caliente Multitherm. Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se
25 conectó a la aguja de llenado correcta.
Mecilinam (16 µg/ml):
Se añadió a continuación la solución madre de mecilinam al agar Discovery/Isosensitest con una pipeta graduada. Se mezcló completamente la solución en la placa caliente Multitherm. Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se conectó a la aguja de llenado correcta.
30 Agar Discovery/Isosensitest sin antibióticos:
Se colocó el tubo de aspiración en la botella y se conectó a la aguja de llenado correcta.
Llenado de la placa Petri en 6 partes:
Se colocaron las 6 agujas de llenado en el cabezal del dispensador para garantizar que la dosificación correspondiera a la de la Figura 2.
35 Ejemplo 2: Ensayo de estabilidad
Se determinó la estabilidad del agar cromógeno en el Flexicult evaluando los agares Flexicult que se habían guardado hasta 4 meses en el frigorífico (< 4 ºC) y se evaluaron para las condiciones de ensayo (cantidad, tamaño de la colonia, color de las colonias y agar) 1, 2, 3 y 4 meses después de la producción de cepas clínicas para todas las bacterias mencionadas en la Tabla 2, y se observaron los mismos resultados durante hasta 4 meses tras la
40 producción (presencia igual que en el 1.er día tras la producción) en lo que respecta a:
Estabilidad del agar (contenido acuoso/sequedad, forma) Coloración de las colonias bacterianas Sensibilidad/resistencia respecto a los antibióticos (sulfametizol, trimetoprim, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam).
45 Ejemplo 3: Validación clínica
El kit del agar Flexicult se evaluó en dos clínicas de MF. Ambas clínicas tenían 9-10 MF trabajando en la clínica y realizaban los cultivos de orina habituales (bien mediante laminocultivo o placas de agar con la sensibilidad debida a la difusión en disco del antibiótico posterior en ciertos casos), realizados por el personal técnico bioquímico clínico.
imagen27
Para el estudio, la placa Flexicult se inoculó con orina de los pacientes en los que se sospechaba una ITU basándose en su historial y síntomas en paralelo con los sistemas de cultivo habituales para cada clínica. Las placas se incubaron a 35-37 ºC en atmósfera ambiente durante 18-24 h (los ensayos realizados en viernes, que no 5 pudieron leerse el sábado, no se incluyeron). Los técnicos leyeron las placas y registraron los resultados (mediante la utilización del material proporcionado junto con las placas procedentes del Statens Serum Institut: un esquema de imágenes muestra las cantidades de bacterias en la placa Flexicult, véase la Figura 3, y un esquema de imágenes muestra los diferentes tipos de colonias de los patógenos urinarios, véase la Figura 4). Posteriormente, las placas se transportaron al Centro Nacional de Antimicrobianos y Control de Infecciones, Statens Serum Institut, donde las
10 placas se leyeron de nuevo y a partir de las placas con un crecimiento relevante, se procesaron una o dos colonias de patógenos urinarios potenciales para el diagnóstico utilizando API-20E, Vitec o ensayos bioquímicos de acuerdo con procedimientos habituales de laboratorio. Además, para todas las bacterias relevantes se determinó la CMI de sulfametizol, trimetoprim, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam mediante dilución en agar con agar de Mueller-Hinton de acuerdo con CSLI (previamente NCCLS).
15 Resultados: Los diagnósticos de las bacterias se registraron en la Tabla 7, que muestra el diagnóstico provisional y el definitivo y el porcentaje de diagnósticos correctos (a nivel de especies o grupo).
Tabla 7. Resultados del estudio de validación clínico, diagnóstico provisional tras la lectura de los ensayos en comparación con el diagnóstico final posterior de la bacteria.
Total
Diagnóstico erróneo N.º de colonias aisladas Diagnóstico correctoN.º de colonias aisladas Diagnóstico correcto % del total
E. coli
205 16 189 92,2
Klebsiella/ Enterobacter sp
23 0 23 100,0
Prot/Morg
19 4 15 78,9
Enterobacteriaceae, otras
4 4 0
Ps.aeruginosa
6 0 6 100,0
E. faecalis
67 1 66 98,5
Gr.B strep
12 9 3 25,0
S.saprophyticus.
6 0 6* 100,0
A.viridans
2 1 1 50,0
otras
22 12 10 45,4
Candida
23 0 23 100,0
Total
389 47 342 88
20 En lo que respecta a la determinación de la sensibilidad, es decir, la comparación de las CMI medidas con la lectura del ensayo, de las bacterias, las Tablas 7 y 8 muestran los resultados para las bacterias gramnegativas en la Tabla 8 y para las bacterias grampositivas en la Tabla 9. Los resultados se han analizado teniendo en cuenta si la lectura y notificación del resultado podría clasificarse como un error (es decir, que el resultado fuera S para I, I para R, R para I o I para S), un error importante (es decir, registrado como R pero de hecho era S, lo que significa que podría
25 tratarse al paciente con otro fármaco) y un error muy importante (es decir, se registró como S pero era R, lo que puede conllevar el riesgo de tratar al paciente con un antibiótico que no tiene ningún efecto).
Tabla 8. Resultados de la lectura de la susceptibilidad/resistencia de las bacterias gramnegativas que crecen en el agar Flexicult en comparación con la CMI determinada posteriormente mediante dilución en agar. Los números indican el número de cepas con resultado registrado (% del total). Tabla 9. Resultados de la lectura de susceptibilidad/resistencia de bacterias grampositivas que crecen en el agar Flexicult en comparación con la CMI determinada posteriormente mediante dilución en agar. Los números indician el número de cepas con resultado registrado (% del total).
Trimetoprim N= 248
Sulfametizol N= 231 Ampicilina N= 247 Nitrofurantoína N= 183 Mecilinam N= 246
Error S/R >< I
0 1 (0,4%) 2 (0,8%) 3 (1,6%) 11 (4,5%)
Error importante R><S
2 (0,8%) 7 (3,0%) 5 (2,0%) 4 (2,2%) 17 (6,9%)
Error muy importante S><R
2 (0,8 %) 1 (0,5 %) 1 (0,4 %) 8* (4,4 %) 1 (0,4 %)
imagen28
Trimetoprim
Sulfametizol Ampicilina N= 26 Nitrofurantoína N= 26 Mecilinam
Error S/R >< I
- - 0 (0 %) 0 (0 %) -
Error importante R><S
- - 1 (3,8 %) 0 (0 %) -
Error muy importante S><R
- - 0 (0 %) 0 (0 %) -
5 Conclusión de la validación clínica: Los resultados muestran un grado elevado de precisión del Flexicult en lo que respecta al diagnóstico a nivel de la especie o grupo de los patógenos urinarios. Además, el resultado del ensayo de susceptibilidad incorporado en el ensayo Flexicult es comparable con un ensayo de difusión en disco en que tiene <5% de errores muy importantes. Ciertamente, el ensayo puede utilizarse para diagnosticar la ITU en un paciente detectando la cantidad de bacterias en todos los recuentos relevantes, para diagnosticar el patógeno urinario (hasta
10 aproximadamente un 90 % de los patógenos se diagnosticaron correctamente a nivel de especie o grupo). Un segundo ensayo de un paciente con una ITU anterior podría ayudar al mostrar si está presente el mismo tipo de patógeno o uno diferente, es decir, sería posible, dentro de ciertos límites, distinguir entre una recaída o una infección nueva. Cuando se incluye la sensibilidad de la colonia aislada en cuestión, esto podría ayudar en el diagnóstico de una posible recaída/reinfección examinando el “tipo de resistencia” de los aislados detectados.
15 Ejemplo 4: Flexicult frente a otros procedimientos diagnósticos en atención primaria. La comparación de Flexicult con otros medios disponibles para el diagnóstico en la medicina de familia y ensayo de sensibilidad de patógenos urinarios:
Tabla 10: Comparación de diferentes ensayos de diagnóstico para la ITU en atención primaria
Ensayo Nivel de Velocidad del Diagnóstico de Ensayo de Comentario
UFC/ml resultado de un un patógeno sensibilidad posible diagnóstico directamente y susceptibilidad
Microscopio 105 NA* NA NA Tira reactiva (nitrito/ 105 NA NA NA leucocito) Sí, algunos PPV del ensayo laminocultivos de sensibilidad
Laminocultivo 103 3 días NA
utilizan agar poco cromógeno satisfactoria Placa de
Dependeagar con
del asa de 3 días NA NAdifusión en siembra disco subs.
Flexicult 103 2 días Sí Sí
*NA, no aplicable
20 Referencias
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Laupland KB et al., Infection, 2007, 35: 150-3.
(2)
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(3)
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(9)
Kahlmeter G et al., J Antimlcrob Chemother. 2003, 51: 69-76.
30

Claims (20)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Una plataforma que comprende un soporte sólido en la que dicho soporte sólido comprende una hendidura capaz de actuar como un receptáculo para una muestra con una posible contaminación o infección microbiana, estando dicha hendidura dividida en tres o más compartimentos, conteniendo cada compartimento una composición de
    5 ensayo o una composición de control y uno o más miembros divisores integrados para dividir dicha hendidura en dichos compartimentos separados, en la que:
    i) dicha composición de ensayo comprende un medio de cultivo microbiano semisólido, un antimicrobiano y tres o más sustratos cromogénicos seleccionados del grupo que consiste en 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato, 5bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-β
    10 D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido; ii) en la que cada composición de ensayo comprende un antimicrobiano diferente; iii) dicha composición de control comprende el mismo medio de cultivo microbiano semisólido y los mismos sustratos cromogénicos que en dicha composición de ensayo, pero no comprende un antimicrobiano tal como se ha definido en i);
    15 y en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido comprende triptófano y uno o más inductores; y en la que dicha plataforma comprende una composición de control.
  2. 2. La plataforma de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antimicrobiano de la composición de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoglucósidos, ansamicinas, antibióticos beta-lactámicos, glucopéptidos, macrólidos, lincosamidas, polipéptidos, quinolonas, sufonamidas, tetraciclinas, lipopéptidos cíclicos, glicilciclinas,
    20 oxazolidinonas, diaminopirimidinas, nitrofuranos, rifamicinas, péptidos antibióticos, amfenicoles, nitroimidazoles, estreptograminas y fosfomicinas.
  3. 3. La plataforma de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha composición está presente en cada uno de dichos compartimentos en una cantidad correspondiente a un 25-45 % del volumen del compartimento.
    25 4. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, teniendo dicha plataforma 7 o más compartimentos.
  4. 5. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichos compartimentos están separados mediante miembros divisores que se han tratado para evitar la difusión de un antimicrobiano entre los compartimentos.
    30 6. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho soporte sólido se fabrica a partir de un sustrato plástico/polimérico, a partir de un sustrato vítreo o a partir de un sustrato metálico.
  5. 7.
    La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho soporte sólido es una placa Petri, opcionalmente con un diámetro de 80 a 100 mm.
  6. 8.
    La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que cada uno de dichos
    35 compartimentos que comprende una composición de ensayo tiene un área de 4-9 cm2 y/o en la que dicho compartimento que comprende una composición de control tiene un área desde 15-25 cm2.
  7. 9.
    La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que están presentes uno o más inductores en dicha composición de ensayo y en dicha composición de control en cantidades de 0,001 a 1,0 g/l.
  8. 10.
    La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho uno o más inductores
    40 se seleccionan del grupo que consiste en 4-aminofenil-β-D-galactopiranósido, isopropil-β-D-tiogalactopiranósido, 1O-metil-β-D-galactopiranósido, metil-β-D-tiogalactopiranósido, 1-O-metil-α-D-galactopiranósido, isopropil-β-Dtioglucopiranósido, 1-O-metil-β-D-glucopiranósido, ácido isopropil-β-D-tioglucourónico y ácido 1-O-metil-β-Dglucourónico, sal sódica.
  9. 11. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que:
    45 i) las colonias de E. coli, si están presentes, aparecerán de color salmón-rojo/rosa; ii) las colonias de Citrobacter sp., si están presentes, aparecerán de color azul-verdoso; iii) las colonias de Klebsiella, Enterobacter o Citrobacter spp., aparecerán de color azul oscuro; iv) las colonias de Proteus mirabilis/Morganella morganii, si están presentes, aparecerán de color marrón claro; v) las colonias de Proteus vulgaris, si están presentes, aparecerán de color verde oscuro;
    50 vi) las colonias de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium, si están presentes, aparecerán de color verdoso o azul; vii) las colonias de Staphylococcus saprophyticus, si están presentes, aparecerán de color rojo o salmón-rojo; viii) las colonias de Staphylococcus o Pseudomonas aeruginosa, si están presentes, aparecerán de color blanco
    o amarillo; y
    36
    imagen2
    ix) las colonias de Candida spp., si están presentes, aparecerán de color blanco.
  10. 12. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en: amikacina, amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, anfotericina-B, ampicilina, ampiclina-sulbactam, apramicina, azitromicina, aztreonam, bacitracina, bencilpenicilina, caspofungina, 5 cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefalotina, cefazolina, cefdinir, cefepima, cefixima, cefmenoxima, cefoperazona, cefoperazona-sulbactam, cefotaxima, cefoxitina, cefpiroma, cefpodoxima, cefpodoxima-ácido clavulánico, cefpodoxima-sulbactam, cefprozil, cefquinoma, ceftazidima, ceftibuteno, ceftiofur, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, florfenicol, ciprofloxacina (u otra fluoroquinolona), claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol), dalbavancina, dalfopristín/quinopristín, 10 daptomicina, dibekacina, dicloxacilina, doripenem, doxiciclina, enrofloxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, fluconazol, flucitosina, fosfomicina, ácido fusídico, garenoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, gentamicina, imipenem, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, levofloxacina, lincomicina, linezolid, loracarbef, mecilinam (amdinocilina), meropenem, metronidazol, mezlocilina, mezlocilina-sulbactam, minociclina, moxifloxacina, mupirocina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, pefloxacina, 15 penicilina V, piperacilina, piperacilina-sulbactam, piperacilina-tazobactam, rifampicina, roxitromicina, esparfloxacino, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulbactam, sulfametoxazol, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temocilina, tetraciclina, ticarcilina, ticarcilina-ácido clavulánico, tigeciclina, tobramicina, trimetoprim, trovafloxacina, tilosina, vancomicina, virginiamicina, voriconazol, preferentemente se selecciona a partir del grupo constituido por: amoxicilina, ácido clavulánico/ampicilina, sulbactam, una fluoroquinolona, sulfametoxazol, trimetoprim, una
    20 cefalosporina oral, nitrofurantoína y fosfomicina (fosfomicina-trometamol) o se selecciona a partir del grupo que consiste en: trimetoprim, sulfametoxazol, ampicilina, nitrofurantoína y mecilinam (amdinocilina) y una combinación de los mismos.
  11. 13. La plataforma de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicha fluoroquinolona es ciprofloxacina y/o en la que dicha cefalosporina oral se selecciona del grupo que consiste en cefalexina, cefuroxima, cefadroxil y cefaclor.
    25 14. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido se selecciona del grupo que consiste en:
    i) Un medio compuesto por: 11 g/l de caseína hidrolizada, 3 g/l de peptonas, 2 g/l de glucosa, 3 g/l de cloruro de sodio, 1 g/l de almidón soluble, 2 g/l de hidrogenofosfato disódico, 1 g/l de acetato de sodio, 0,2 g/l de glicerofosfato de magnesio, 0,1 g/l de gluconato de calcio, 0,001 g/l de sulfato cobaltoso, 0,001 g/l de sulfato
    30 cúprico, 0,001 g/l de sulfato de zinc, 0,001 g/l de sulfato ferroso, 0,002 g/l de cloruro de magnesio, 0,001 g/l de menadiona, 0,001 g/l de cianobalamina, 0,02 g/l de clorhidrato de L-cisteína, 0,02 g/l de triptófano, 0,003 g/l de piridoxina, 0,003 g/l de pantotenato, 0,003 g/l de nicotinamida, 0,0003 g/l de biotina, 0,00004 g/l de tiamina, 0,01 g/l de adenina, 0,01 g/l de guanina, 0,01 g/l de xantina, 0,01 g/l de uracilo, 8 g/l de agar, en agua destilada; ii) Un medio compuesto por: 2 g de Na2HPO4 · 12 H2O, 625 g de triptona, 250 g de almidón, 833,6 g de cloruro
    35 de potasio, 2,5 g de detergente, 74,8 g de caldo de carne (Oxoid CM975K), 800 g de D(+)glucosa monohidratada, 1,75 g de xantina, 1,75 g de guanina, 17,5 g de sulfato de magnesio 7 H2O, 19,2 g de CaCl2 · 2 H2O, 2,720 g de agar, HCl 5 N hasta pH 7,4, solución de vitaminas y 12,5 l de sangre de caballo por 250 litros de agua destilada; iii) Un medio que comprende: 14,5 g/l de peptona, 2 g/l de glucosa, 5,5 g/l de mezcla salina, 1 g/l de almidón
    40 soluble, 1,5 g/l de mezcla cromógena y 8 g/l de agar; y iv) Un medio que comprende: 2 g/l de polvo de extracto de carne de vacuno/extracto de carne de vacuno, 17,5 g/l de digestión ácida de caseína, 1,5 g/l de almidón y 17 g/l de agar;
  12. 15. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dichos 3 o más sustratos
    cromogénicos comprenden 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, 45 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido.
  13. 16. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dichas 3 o más sustancias cromogénicas se seleccionan del grupo que consiste en 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiránosido, 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-glucopiranósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido y 5-bromo-4cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido.
    50 17. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha composiciones de control y de ensayo comprenden 6-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido en combinación con con 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranósido y 5-bromo-6-cloro-3-indolilfosfato.
  14. 18. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dichas tres o más
    55 sustancias cromogénicas incluyen el grupo de: 5-bromo-6-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro3-indolil-beta-D-glucopiranósido y 6-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido.
  15. 19. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dichas tres o más sustancias cromogénicas incluyen el grupo de: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, 6-cloro-3-indolil
    37
    imagen3
    beta-D-galactopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranósido y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-Dglucurónido.
  16. 20. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha composición de ensayo y dicha composición de control comprenden cuatro sustratos cromogénicos.
    5 21. La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que dicho medio de cultivo microbiano semisólido comprende 0,25-3,0 g/l de triptófano que está presente.
  17. 22.
    La plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que dicho soporte sólido es una placa Petri dividida en 5 compartimentos de ensayo y 1 compartimento de control.
  18. 23.
    Un kit que comprende una plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
    10 24. El kit de acuerdo con la reivindicación 23, comprendiendo dicho kit además un patrón que indica el grado de crecimiento sobre la plataforma, que resulta de poner en contacto dicha plataforma con una suspensión que tiene un título predeterminado de una cepa de referencia microbiana.
  19. 25. El kit de acuerdo con la reivindicación 24 en el que dicho patrón es una reproducción fotográfica o impresa de la plataforma.
    15 26. El kit de acuerdo con la reivindicación 24 en el que dicho patrón se ha generado poniendo en contacto la plataforma con una cepa de referencia de la bacteria E. coli (opcionalmente E. coli ATCC 29522) y/o una cepa de referencia de Staphylococcus aureus (opcionalmente Staphylococcus aureus ATCC 25913).
  20. 27. El kit de acuerdo con la reivindicación 25, comprendiendo dicho kit además uno o más antimicrobianos empaquetados por separado.
    20 28. Uso de una plataforma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en la detección y/o diagnostico de infecciones seleccionadas del grupo que consiste en infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y los tejidos blandos, infecciones por Staphylococcus aureus (incluido Staphylococcus aureus resistente a meticilina), infecciones por meningococos, infecciones por gonococos, infecciones por estreptococos incluyendo infecciones por neumococos.
    25
    38
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