FR2973041A1 - Detection de bacteries presentant une resistance enzymatique aux carbapenemes - Google Patents

Abstract

La présente invention porte sur un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ; b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ; c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes. Avantageusement, le milieu mis en œuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).

Description

Détection de bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes

La présente invention porte sur un procédé de détection et d'identification de bactéries résistantes aux carbapénèmes. Plus précisément, le procédé selon la présente invention a pour but de détecter les bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.

L'augmentation de la résistance aux antibiotiques de type beta-lactames, tels les pénicillines et les céphalosporines, rend complexe le traitement des infections causées par des souches de bactéries Gram négatives. Ces antibiotiques sont alors remplacés par d'autres antimicrobiens à large spectre. Parmi ces antimicrobiens à large spectre, les carbapénèmes ont pris une place importante, en particulier pour traiter des patients hospitalisés. Les carbapénèmes sont actifs contre la majorité des bactéries aérobies Gram positives et Gram négatives ainsi que sur certaines bactéries anaérobies. Cependant, de plus en plus de souches résistantes aux carbapénèmes apparaissent chez des patients hospitalisés.

Les bactéries concernées sont, de façon non exhaustive, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.

La susceptibilité réduite aux carbapénèmes peut être due : - à l'expression d'un gène de résistance aux beta-lactamines : (i) hyperproduction des beta-lactamases de type ampC, et/ou (ii) ESBL (ou BLSE, beta-lactamase à spectre étendu), combinée avec des modifications de la perméabilité de la paroi cellulaire (résistance par imperméabilité) et/ou avec l'efflux actif des antibiotiques (Pages et al., 2009 ; PIoS ONE, 4 (3)); et/ou - à l'existence d'enzymes dégradant les carbapénèmes, appelées carbapénémases. Les gènes de carbapénémases sont susceptibles d'être présents dans les chromosomes et/ou dans des plasmides. Du fait de cette présence sous forme de plasmides, ces résistances de type enzymatiques sont susceptibles de se disséminer de façon très importante et présentent, en conséquence, un risque majeur en terme d'épidémiologie. Les résistances dues à une imperméabilité membranaire aux carbapénèmes n'étant pas susceptibles de se disséminer, il est recommandé, dans le cadre du diagnostic, de la surveillance du portage ou de l'hygiène, de pouvoir faire la distinction entre les deux types de résistance.

Face à des souches de bactéries résistantes aux carbapénèmes, l'homme du métier a des difficultés pour différencier aisément les souches productrices de carbapénémases des souches résistantes par imperméabilité. Les deux types de bactéries étant capables de se développer en présence d'un carbapénème, le seul moyen de les différencier à ce jour consiste à réaliser des tests complémentaires. Parmi ces tests complémentaires, on citera : le test de Hodge modifié (CLSI M100-S20: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Informational Supplement.January 2010. Supplemental Table2A-S2), des tests de synergie par diffusion (ou disques combinés) en gélose, employant des inhibiteurs combinés au carbapénème, par exemple l'EDTA pour les carbapénèmases de classe B, l'acide phenyl-boronique pour la détection des carbapénèmases de classe A. Il est ainsi connu d'utiliser des disques combinant meropenem et composés de type acide boronique, à titre d'inhibiteurs des beta-lactamases, pour la détection phénotypique des carbapénèmases de type KPC (Pournaras et al., 2010 ; J. Antimicrob. Chemotherapy, 65(7): 1319-1321). De même, Giske et al. ont testé l'impact de la cloxacilline sur la discrimination entre les souches productrices de KPC et les souches combinant perte de porines et hyperproduction d'AmpC (Giske et al., 2010 ; Clin. Microbiol. Infect. ; 17 (4) : 552-6). Dans ce cas, la discrimination repose sur l'action inhibitrice de la cloxacilline sur les céphalosporinases codées par le gène AmpC restaurant l'action des beta-lactamines. Cependant, le résultat de ces tests doit souvent être confirmé par des techniques de biologie moléculaire (par exemple amplification par PCR ciblant les gènes de résistance aux carbapénèmes).

Une méthode de caractérisation par utilisation d'un milieu chromogène comprenant du méropénème et/ou de l'ertapénème a été proposée dans la demande WO 2010/010083 et mise en oeuvre dans les milieux CHROMagar® KPC (Samra et al., 2008 ; J. Clin. Microbiol., 46 (9) : 3110-3111; CHROMagarTM, Paris, France) et COLOREXTM KPC (BioMed Diagnostics Inc). Ce milieu ne permet pas la détection de l'ensemble des souches productrices de carbapénémases, notamment de métallo-beta-lactamases (Nordmann et al., 2011 ; J Clin Microbiol., 49(2) : 718-721).

Dans le contexte épidémiologique actuel, et notamment avec l'émergence de nouvelles résistances telles que les NDM-1, il reste à améliorer, en sensibilité et/ou en spécificité, le criblage de l'ensemble des mécanismes de résistance liés à la production des différents types de carbapénémases.

La Demanderesse a montré qu'il est possible d'améliorer la distinction directe, autrement dit notamment dans un dispositif unique de dépistage, entre la résistance enzymatique et la résistance par d'autres mécanismes parmi lesquels l'imperméabilité, par inhibition des souches présentant une résistance par imperméabilité ou un autre mécanisme de résistance non enzymatique, sans affecter la croissance et la détection des souches résistantes par production de carbapénémase. La Demanderesse a observé de façon surprenante un impact de la cloxacilline, associée ou non au PAbetaN, sur des souches résistantes aux carbapénèmes ne produisant pas de carbapénémase et ne produisant pas d'AmpC.

A cet égard, la présente invention est relative à un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant 30 au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ; b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ; c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.

Avantageusement, le milieu mis en oeuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).

La Demanderesse a montré, de façon surprenante, que l'addition de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN dans un milieu, chromogène ou non, comprenant des carbapénèmes permet d'améliorer la sensibilité et la spécificité de la détection des bactéries résistantes aux carbapénèmes par production de carbapénémases et d'identifier plus spécifiquement les souches productrices de carbapénémases. Plus particulièrement, la méthode selon l'invention permet de différencier, parmi les souches bactériennes résistantes aux carbapénèmes, les souches productrices de carbapénémases, des souches présentant une résistance par imperméabilité ou un autre mécanisme de résistance non enzymatique. Ainsi, de façon concrète, les mesures d'hygiène nécessaire pour prévenir la transmission des souches présentant une résistance enzymatique peuvent être mises en oeuvre sans délai.

Selon un premier mode de réalisation, la présente invention correspond à un procédé pour détecter et/ou identifier, dans un échantillon biologique, des bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ; b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ; c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes. Avantageusement, le milieu mis en oeuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).

Selon un second mode de réalisation, la présente invention correspond à un procédé de détection et/ou d'identification, dans un échantillon biologique, de bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes par production de carbapénémase, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un substrat chromogène, au moins un antibiotique de la classe des carbapénèmes, et de la cloxacilline ; b) incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries ; c) détecter les souches présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes. Avantageusement, le milieu mis en oeuvre à l'étape a) comprend également du phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide (PAbetaN).

Par échantillon bioloqique, on entend une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. Ce peut être un échantillon clinique, humain ou animal, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment, ou un échantillon de l'environnement de production ou de transformation d'aliments. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide. On peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang total, de sérum, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peau, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage, de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales, un échantillon pour contrôle de surface ou d'eau. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel ou, préalablement à l'analyse, subir une préparation de type enrichissement, dilution, extraction, concentration, purification, selon des méthodes connues de l'homme du métier.

Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Mueller Hinton ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).

Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines ... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant, un ou plusieurs indicateurs métaboliques, un ou plusieurs régulateurs métaboliques... Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture. L'homme du métier peut également utiliser une bi-boite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats ou différents mélanges sélectifs, sur lesquels on aura déposé un même échantillon biologique.

Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs agents sélectifs. Par agent sélectif, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme autre que le microorganisme cible. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 0,01 mg/I et 5 g/I est particulièrement adaptée à la présente invention.

On peut citer comme agent sélectif, les antibiotiques, les antifongiques, les sels biliaires, le crystal violet, la fushine basique, le vert brillant, ... Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des beta-lactamines, des glycopeptides, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques cefotaxime, cefsulodine, ceftazidime, cefoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, vancomycine, gentamicine, Triméthoprime, tobramycine, moxalactam, fosfomycine, D-cylcosérine, Polymixine, Colistine, les quinolones telles que l'acide nalidixique. Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide. De façon préférentielle, les carbapénèmes utilisés dans le milieu mis en oeuvre à l'étape a) sont stables dans un milieu réactionnel. De façon préférentielle, ils sont choisis parmi : le meropenem, l'ertapenem, le doripenem, le faropenem, la thiénamycine, le biapenem, le lenapenem, le panipenem, la razupenem, le tomopenem, le tebipenem, le sulopenem, les beta-méthyle carbapénèmes décrits par Choi et al. dans la demande US 2010/0160284 Al Plus préférentiellement, ils sont choisis parmi : le meropenem, l'ertapenem, le doripenem et le faropenem. Préférentiellement, les concentrations en carbapénèmes sont comprises entre 0.05 et 32 mg/L. Plus préférentiellement, les concentrations en carbapénèmes sont comprises entre 2 et 32 mg/L pour le faropenem, entre 0.05 et 2 mg/L pour le doripenem, entre 0.05 et 10 2 mg/L pour le meropenem, entre 0.05 et 12 mg/L pour l'ertapenem. La cloxacilline correspond à un antibiotique de la classe des pénicillines. Elle est utilisée in vitro pour inhiber certaines beta-lactamases (Giske et al., 2010, supra). La dicloxacilline et la flucloxacilline sont avantageusement considérées comme équivalentes à la cloxacilline. De façon préférentielle, la cloxacilline est utilisée à une 15 concentration comprise entre 25 et 300 mg/L. Le PABN ou PAbetaN correspond au phenylalanine-arginine-beta-naphtylamide. Ce composé est connu comme inhibiteur des pompes à efflux, permettant par exemple de diminuer la concentration minimale inhibitrice (CMI) du chloramphenicol vis-à-vis des souches d'Enterobacter aerogenes (Mallea et al., 2002 ; Biochemical and 20 Biophysical Research Communications 293: 1370-3). De façon préférentielle, le PAbetaN est utilisé à une concentration comprise entre 1 et 50 mg/L. Par substrat chromogène, on entend un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Pour une détection directe, ce substrat peut 25 être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou coloré (Orenga et al., 2009 ; J. Microbiol. Methods ; 79(2):139-55). Pour une détection indirecte, le milieu réactionnel selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant le métabolisme des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un 30 fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le bromocresol pourpre, le bleu de bromothymol, le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de l'hydroxycoumarine ou les dérivés de la résorufine.

Selon la présente invention, le substrat chromogène est préférentiellement choisi parmi les substrats à base d'Indoxyl (3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl- 3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, AIdoITM ...) ; d'umbelliférone (4-Méthylumbelliférone, Cyclohexenoesculétine, ...) ; d'Alizarine; de p-Naphtolbenzéine; de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) ; d'Hydroxyquinoline; de Cathécol (Cathécol, Dihydroxyflavone, Hydroxyflavone, ...) ; de Résorufine; de Chlorophénol Red; de Fluorescéine; d'Aminophénol (para-Aminophénol, Dichloro-aminophénol, ...) ; de Naphtol (alpha-Naphtol, 2-Naphtol, Naphtol-ASBI, ...) ; d'Aminocoumarine (7-Amino-4-méthyl-coumarine, ...) ; de Naphtylamide; d'Acridine (Amino-phénylacridine...) ; d'Amino-phénoxazine (Amino-benzophénoxazinone, Amino-pentylresorufine, ...). A titre indicatif, les activités enzymatiques ciblées pas les substrats chromogènes peuvent appartenir au groupe des hydrolases, préférentiellement aux groupes des osidases, des estérases ou des peptidases. Préférentiellement, les activités enzymatiques ciblées par les substrats chromogènes sont choisies parmi : la glucuronidase, la glucosidase, la galactosidase, l'estérase, la sulfatase et la désaminase.

A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité betaglucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-betaglucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels.

Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels.

Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-N-méthyl-beta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucoside, l'Alizarine-beta-glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucoside, le Nitrophénylbeta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels. A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité estérase peuvent notamment être les esters d'acides gras linéaires saturés ou insaturés, ayant entre 6 et 14 carbones, préférentiellement entre 7 et 9 carbones et de 4-Méthylumbelliférone, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-3-indolyl ou d'Alizarine ou leurs sels. Préférentiellement, ils sont choisis parmi 4-Méthylumbellifyl-octanoate, 5-Bromo-4-chloro- 3-indoxyl-octanoate, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-octanoate, 6-Chloro- 3-indoxyl-octanoate, 5-Bromo-3-indolyl-octanoate ou d'Alizarine-octanoate. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité désaminase peuvent notamment être le L-Tryptophane, la L-Phénylalanine, la L-Tyrosine et la L-Histidine. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité sulfatase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-sulfate, le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-sulfate, le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-sulfate, le 3-Indoxyl-sulfate, le Phenolphtaléine-disulfate ou leurs sels. Préférentiellement, le substrat chromogène est choisi parmi : le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucopyranoside (X-glucoside), le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxylbeta-D-galactopyranoside (Magenta beta-Gal), le 6-Chloro-3-indoxyl- beta-D-glucuronide (Rose beta Gur), le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthylbeta-D-glucopyranoside (Green A beta Glu), le Méthyl-beta-D-glucopyranoside (methyl beta D glucoside), le L-Tryptophane. Par incuber, on entend porter et maintenir entre 1 et 48 heures, préférentiellement entre 4 et 24 heures, plus préférentiellement entre 16 et 24 heures, à une température appropriée, généralement comprise entre 20 et 50°C, préférentiellement entre 30 et 40°C. Par détecter, on entend déceler à l'oeil nu ou à l'aide d'un appareil optique l'existence d'une croissance des bactéries cibles. Avantageusement, lorsque le milieu mis en oeuvre comprend un substrat chromogène, la détection peut également permettre une identification des bactéries cibles. La détection se fait à l'aide d'un appareil optique pour les substrats fluorescents, ou à l'oeil nu ou à l'aide d'un appareil optique pour les substrats colorés. Par spécificité, on entend la capacité du procédé ou du milieu réactionnel à donner un résultat négatif lorsque la souche bactérienne cible n'est pas présente. En d'autres termes, selon la présente invention, une identification plus spécifique correspond à une réduction du nombre de faux positifs liés aux souches n'exprimant pas de carbapénémase, sans prétendre inhiber l'ensemble de ces souches. Par sensibilité, on entend la capacité à donner un résultat positif lorsque la souche bactérienne cible est présente dans l'échantillon. Par résistance enzymatique aux carbapénèmes, on entend, tel qu'indiqué supra, la résistance aux antibiotiques de type carbapénèmes due à l'expression de carbapénémases par les bactéries cibles.

Les bactéries résistantes aux carbapénèmes les plus fréquemment rencontrées sont, tel qu'indiqué supra : Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Providencia rettgeri, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Comamonas sp., Aeromonas sp., Morganella morganii, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium etc.

La présente invention porte également sur un milieu de culture pour détecter et/ou identifier des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes, ledit milieu de culture correspondant à un milieu de culture de base, comprenant en outre au moins un substrat chromogène, au moins un carbapénème, de la cloxacilline ou une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN.

Enfin, la présente invention porte sur l'utilisation de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN pour détecter et/ou identifier spécifiquement des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.

Les exemples développés ci-dessous ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention. Ils sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.

EXEMPLES

Exemple 1 Impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des souches résistantes par imperméabilité (RI) ou présentant un autre mécanisme de résistance non enzymatique, ou productrices de carbapénémases, en présence d'ertapenem.

L'effet de la cloxacilline et du PAbetaN sur les CMI des souches à l'ertapénème a été évalué dans un premier temps à l'aide de bandelettes E-test® en milieu Mueller Hinton. Dans un premier essai, l'impact sur les CMI à l'ertapénème de 19 souches présentant une résistance aux carbapénèmes non enzymatique (appelées résistantes par imperméabilité (RI) par la suite) a été évalué. Le second essai a consisté à évaluer l'impact de ces 2 composés sur les CMI à l'ertapénème de 29 souches productrices de carbapénémases (+ 1 BLSE).

1. Milieux et microorganismes

Essai B100904 : les 19 souches résistantes par imperméabilité (RI) appartiennent aux espèces suivantes : 10 Enterobacter aerogenes, 2 Enterobacter cloacae, 1 Citrobacter freundii, 1 Pseudomonas aeruginosa, 3 Proteus mirabilis et 2 Morgane/la morganii.

Essai B101001 : vingt-neuf souches productrices de carbapénémases se répartissent de la façon suivante : 27 souches Klebsiella pneumoniae productrices de carbapénémase de classe A type KPC (KPC) et 2 souches respectivement Klebsiella pneumoniae et Citrobacter freundii productrices de carbapénémase de classe B (type NDM-1). Cet essai comprenait également une souche Escherichia coli BLSE.

Les E-tests ont été réalisés en milieu Mueller-Hinton supplémenté ou non en cloxacilline et/ou PAbetaN selon le Tableau 1 : 11 Tableau I : milieux testés en vue d'évaluer l'impact de la cloxacilline et/ou du PabetaN sur les CMI des souches RI ou productrices de carbapénémases (boite de Petri 90 mm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T A B C Mueller Hinton Taux de reconstitution 38g/1 Cloxacilline (concentration en mg/I) - 200 - 200 PAbetaN concentration mg/1 - 25 25 2. Essai o Réalisation pour chaque souche d'une suspension à environ 0,5 McF en ampoule NaCI 0,85%. o Ensemencement des 4 milieux par écouvillonnage semi-automatique. o Séchage des boîtes à température ambiante 5 à 15 min. o Dépôt de la bandelette E-test® ertapénème. o Incubation 16 à 20 heures à 37°C. . Résultats Les résultats sont regroupés dans le Tableau II pour les souches RI et dans le 5 Tableau III pour les souches productrices de carbapénémases. Tableau II : impact de la cloxacilline (CLX) et/ ou du PAbetaN sur les CMI des souches RI (comparaison par rapport aux CMI du milieu sans cloxacilline ni PAbetaN). 10 CLX PAbetaN CLX+PAbetaN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de Pas impact* < 2 pas de > 2 pas de CMI CMI CMI CMI CMI CMI Enterobacter 1 - 11 10 - 2 - - 12 Citrobacter - - 1 1 - - - - 1 Proteus - - 3 3 - - - - 3 Morganella - - 2 2 - - - - 2 Pseudomonas - 1 - 1 - - - 1 - TOTAL 1 1 17 17 0 2 0 1 18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * ou impact non mesurable dans la gamme de concentration en ertapénème testée (cas des CMI > 32) Dans tous les cas (sauf 1) où la cloxacilline et/ou le PAbetaN ont un impact de plus

15 de 2 pas sur les CMI des souches RI testées, (les « pas » de CMI sont définis comme des dilutions de 2 en 2), il s'agit d'une diminution des CMI à l'ertapénème. Dans un cas (souche E. aerogenes 9306074), la CMI a augmenté en présence de PAbetaN seul (CMI=6 sans PAbetaN et CMI>32 en présence de PAbetaN).

Pour les 17 souches dont les CMI sont déjà diminuées de plus de 2 pas en présence

20 de cloxacilline, l'effet du PAbetaN est le suivant (par rapport aux CMI avec cloxacilline) :

o 7 ont des CMI diminuées de 2 pas de CMI supplémentaires en présence de cloxacilline + PAbetaN

o 5 ont des CMI diminuées de façon moins significative (<_ 2 pas de CMI) 25 o 1 n'est pas impactée

o pour 4 souches, l'impact n'est pas évaluable dans la gamme de concentration en ertapénème testée (CMI <0,002 en présence de cloxacilline seule, ou combinée au PAbetaN) 13 Pour les 2 dernières souches (peu ou pas impactées par la cloxacilline seule), une n'est pas affectée par l'ajout de PAbetaN en plus de la cloxacilline (P. aeruginosa), tandis que l'autre (E. cloacae) voit sa CMI très réduite en présence de cloxacilline+PAbetaN (CMI >32 si cloxacilline seule, et CMI=0,023 si cloxacilline+PAbetaN). Tableau III : impact de la cloxacilline et/ ou du PAbetaN sur les CMI des souches productrices de carbapénémases (comparaison par rapport aux CMI du milieu sans cloxacilline ni PAbetaN).

CLX PAbetaN CLX + PAbetaN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Effet CMI Pas 2 pas > 2 pas de CMI Pas < 2 pas de CMI > 2 pas Pas < 2 pas de CMI > 2 pas impact* de CMI impact* de CMI impact* de CMI négatif positif négatif positif négatif - positif positif négatif positif BLSE 1 - - - - 1 - - - 1 - - NDM 2 - - - 2 - - - 2 - - - KPC 7 16 2 1 3 14 2 7 2 17 3 4 TOTAL 10 16 2 1 5 15 2 7 4 18 3 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * ou impact non mesurable dans la gamme de concentration en ertapénème testée (cas des CMI > 32)

4. Interprétation

L'ajout de cloxacilline dans le milieu Mueller Hinton permet de réduire très nettement (de plus de 2 pas de concentration) les CMI à l'ertapénème de la majorité des souches RI testées (16/19). L'ajout de PAbetaN seul n'a pas d'impact sur la majorité des souches de RI testées. A l'inverse, l'ajout de PAbetaN à un milieu contenant de la cloxacilline vient renforcer l'effet de celle-ci en diminuant encore les CMI des souches RI de façon significative (de plus de 2 pas de concentration pour 7 souches) ou plus modérée (2 pas de concentration ou moins pour 5 souches). La cloxacilline n'a pas d'impact (9 souches) sur les CMI à l'ertapénème des souches productrices de carbapénémases (NDM ou KPC) ou tend à les réduire faiblement (16 souches). A l'inverse, l'ajout de PAbetaN seul dans le milieu Mueller Hinton tend à augmenter légèrement (15 souches) ou très nettement (7 souches) les CMI à l'ertapénème de ces souches.

Le fait d'associer la cloxacilline et le PAbetaN permet d'avoir des résultats similaires au PAbetaN seul, même si l'effet positif du PAbetaN sur les CMI est légèrement diminué par celui négatif de la cloxacilline. 5. Conclusion

L'utilisation de la cloxacilline seule (200mg/L) permet de diminuer significativement les CMI à l'ertapénème de la majorité des souches RI testées. L'ajout de PAbetaN vient renforcer cet effet de la cloxacilline.

A l'inverse, l'association cloxacilline + PAbetaN permet une augmentation (modérée à forte) des CMI à l'ertapénème des souches productrices de carbapénémases. Ainsi, dans le cadre d'un milieu de criblage pour des souches productrices de carbapénémases, l'ajout de cloxacilline seule ou combinée avec le PabetaN permet de mieux inhiber la croissance indésirable des RI, tout en n'ayant pas d'effet, ou un effet légèrement positif, sur la croissance des souches productrices de carbapénémases.

Exemple 2 Impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des souches résistantes par imperméabilité (RI) ou présentant un autre mécanisme de résistance non enzymatique, ou productrices de carbapénémases, en présence de faropenem.

1. Milieux et microorganismes Soixante dix-sept souches de bactéries Gram négatives, dont 71 entérobactéries et 6 non entérobactéries (bactéries non fermentant), dont les caractéristiques de résistances sont détaillées dans le Tableau IV, ont été testées sur des milieux contenant différentes concentrations de faropénème et de cloxacilline, avec ou sans PAbetaN, afin d'établir la sensibilité et la spécificité de chaque formulation. Les milieux testés sont décrits dans le Tableau V.

Tableau IV : mécanismes de résistance aux antibiotiques caractérisant les souches testées. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nombre de souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . BLSE (7), Céphalosporinase AmpC (9) 16 Carbapénémase de Classe A type KPC (KPC) 10 Carbapénémase de Classe A autre que KPC (Class A) 5 Carbapénémase de Classe B type NDM-1 (NDM) 15 Carbapénémase de Classe B autre que NDM (Class B) 6 Carbapénémase de Classe D type OXA (OXA) 6 Résistance par imperméabilité RI 19 .......................................................................... .......................................................................... .............................. Tableau V : composition des milieux testés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Milieux T 1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12 13 16 19 14 17 20 15 18 21 Base hromogénique 47 g/L PABN (mg/L) 0 25 Cloxacilline(mg/L) ~ 50 100 F 200 50 1_ 100 200 Faropénème(mg/L) ( 0 8 16 1 32 8 [16 [ 32 8 116 [ 32 8 16 [ 32 8 [16 1, 32 8 [16 [ 32 8 16 32 2. Essai Les milieux chromogéniques sont répartis en boîtes carrées 120x120. L'ensemencement est effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37°C sur gélose trypcase soja. Pour chaque souche, une suspension à 0,5 McF en eau physiologique est réalisée. Chaque suspension est ensemencée en spot (1 à 2 pL) sur chaque milieu à l'aide d'un inoculateur multi-points selon la méthode de dilution en gélose (DEG). Des lectures sont effectuées après 24 heures d'incubation à 37°C. 3. Résultats Les résultats sont regroupés dans le Tableau VI. Une absence de croissance bactérienne ou un nombre de colonies inférieur ou égal à 3 sont considérés comme correspondant à une inhibition de croissance. La présence de 4 colonies ou plus est considérée comme croissance posiive.

Tableau VI : impact de la cloxacilline et/ou du PAbetaN sur la croissance (nombre de souches se développant) des souches productrices de carbapénémases ou résistantes aux beta-lactamines du fait d'un autre mécanisme de résistance, en présence de faropénème25 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Milieux T 1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12 13 16 19 14 17 20 15 18 21 pABN (mg/L) 25 ICloxacilline(mg/L) 0 50 100 200 50 100 200 1Faropénème(mg/L) 0 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 8 16 32 BLSE 7 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 3 1 0 1 0 0 1 0 0 AmpC 9 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 4 3 2 3 2 2 2 2 0 RI 19 16 15 10 14 9 4 11 6 2 11 6 1 11 10 5 10 5 1 7 1 1 Total non 35 20 18 12 17 11 6 14 8 4 14 8 2 18 14 7 14 7 3 10 3 1 carbapénémases Classe A 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Classe B 6 4 3 3 4 4 3 3 3 3 3 3 3 5 3 2 4 2 2 4 2 2 KPC 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 NDM 15 12 8 8 12 8 6 12 9 7 12 8 7 14 12 8 12 12 6 10 9 6 OXA 6 4 4 2 4 4 1 4 3 2 4 4 1 5 4 0 5 4 0 5 4 0 Total 42 35 30 28 35 31 25 34 30 27 34 30 26 39 34 25 36 33 23 34 30 23 carbapénémases ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 4. Interprétation Tableau VII : sensibilité et spécificité de milieux contenant du faropénème en présence de cloxacilline, combinée ou on au PAbetaN, vis-à-vis de souches productrices de carbapénèmases ou résistantes aux beta-lactamines du fait d'un

autre mécanisme de résistance. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4a. Impact de la cloxacilline et du PAbetaN sur les souches RI

Tableau VIII : effets de la cloxacilline associée ou non au PAbetaN sur la croissance des 19 souches RI testées. 13 16 19 14 17 20 15 18 21 .......................................................................... .................. 25 100 Milieux ................................. PABN (mg/L) Cloxacilline (mg/L) Faropénème (mg/L) Sensibilité (%) Spécificité (%) T 1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12 0 200 32 100 0 0 0 8 50 100 32 32 32 16 16 16 8 8 8 71 77 83 43 64 89 60 83 74 69 71 49 81 60 83 51 67 66 81 60 16 71 77 62 94 8 32 32 32 16 16 16 8 8 81 71 55 91 86 60 93 49 55 97 60 80 81 60 79 80 71 91 50 200 PAbetaN (mg/L) Cloxacilline(mg/L) Faropénème(mg/L) N RI se développani 25 50 0...~ 100 200 1 50 ~ 100 200 0 0 1 8 1 16 1 32 1 8 1 16 1 32 1 8 1 16 1 32 1 8 1 16 1 32 8 1 16 1 32 1 8 1 16 1 32 1 8 1 16 1 32 ««««««««««««««<<19Î «19«~«16«<« 5«<« 0«~«<14«<~«<9««~«<4««~«~ ~«<~«<6««~«<2 «<~ ~ ~<6 <1 11~0 510 51 7««~«<1««~«<1««~ Le faropénème seul a peu d'impact sur ces souches, jusqu'à une concentration de 16 mg/L. On observe une inhibition des souches RI dès ajout de 50 mg/L de cloxacilline, encore plus marquée pour les concentrations les plus élevées en faropénème testées (16 et 32 mg/L). Cet effet inhibiteur augmente avec la concentration de cloxacilline (par exemple, pour une concentration de 16 mg/L de faropénème, l'ajout de cloxacilline à 50 mg/L ou 200 mg/L permet respectivement l'inhibition de 6 et 9 souches de RI supplémentaires). On observe un effet combiné de la concentration en faropénème et de celle en cloxacilline sur les souches RI.

Ces résultats confirment également la meilleure inhibition des souches RI en présence de cloxacilline + PAbetaN. Cet effet est visible pour la plupart des concentrations de cloxacilline et faropénème testées, mais est très nettement marqué en présence de 200 mg/L de cloxacilline (quelle que soit la concentration en faropénème).

4b. Impact de la cloxacilline et du PAbetaN sur les souches productrices de carbapénémases Les résultats obtenus en présence de faropénème confirment que la cloxacilline seule a peu ou pas d'impact sur la croissance des souches productrices de carbapénémases (aux 3 concentrations de faropénème testées). Ils confirment également que le fait d'associer le PAbetaN à la cloxacilline permet d'augmenter la CMI de certaines souches aux carbapénèmes tant que la concentration en faropénème reste inférieure à 32 mg/L. Ainsi, la sensibilité de détection en présence de 8 ou 16 mg/L de faropénème associé à 50 ou 100 mg/L de cloxacilline est supérieure en présence de PAbetaN. Pour 200 mg/L de cloxacilline et 8 ou 16 mg/L de faropénème, l'ajout de PAbetaN ne modifie pas la sensibilité de détection. 5. Conclusion

Ces résultats confirment le rôle inhibiteur de la cloxacilline sur les souches résistantes par imperméabilité, en présence d'un carbapénème. Ces résultats confirment également la meilleure inhibition des souches RI lorsque la cloxacilline est associée au PAbetaN. L'ajout de cloxacilline et de PAbetaN permet ainsi d'augmenter très fortement la spécificité du milieu. L'ajout dans le milieu de cloxacilline (aux 3 concentrations testées) et de PAbetaN (25 mg/L) n'altère pas la détection des souches productrices de carbapénémases en présence de 8 ou 16 mg/L de faropénème. Il est confirmé que l'ajout de PAbetaN tend à améliorer leur détection à des concentrations de faropénème égales à 8 ou 16 mg/L, associées à la cloxacilline à 50 ou 100 mg/L. En présence de faropénème, on confirme donc les résultats observés avec l'ertapénème (E-test), à savoir une meilleure inhibition des souches RI par l'ajout de cloxacilline et une amélioration de la détection des souches productrices de carbapénémases en présence de PAbetaN.

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de détection de bactéries productrices de carbapénémases dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à : o mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un carbapénème et de la cloxacilline, o incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries productrices de carbapénémases, et o détecter les souches correspondant aux bactéries productrices de carbapénémases.
2. 2. Procédé de détection et/ou d'identification de bactéries productrices de carbapénémases dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à : o mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un carbapénème, de la cloxacilline, et au moins un substrat chromogène, o incuber l'ensemble de façon à permettre la croissance des bactéries productrices de carbapénèmases, et o détecter les souches correspondant aux bactéries productrices de carbapénémases.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le milieu réactionnel comprend également du phenylalanine-arginine beta-naphtylamide (PAbetaN).
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel les carbapénèmes sont choisis parmi : l'ertapénème, le méropénème, le doripénème, le faropénème.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la concentration en cloxacilline est comprise entre 25 et 300 mg/L.30
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, dans lequel la concentration en PAbetaN est comprise entre 1 et 50 mg/L.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, dans lequel le substrat chromogène détecte une activité choisie parmi : la glucuronidase, la glucosidase, la galactosidase, l'estérase, la sulfatase et la désaminase.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, dans lequel le substrat chromogène est choisi parmi : le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- beta-D-glucopyranoside (X-glucoside), le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxylbeta-D-galactopyranoside (Magenta beta-Gal), le 6-Chloro-3-indoxylbeta-D-glucuronide (Rose beta Gur), le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthylbeta-D-glucopyranoside (Green A beta Glu), le L-Tryptophane
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le milieu réactionnel est un milieu de culture liquide ou solide.
10. 10. Milieu de culture pour détecter et/ou identifier des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes, comprenant un milieu de culture de base, au moins un substrat chromogène, au moins un carbapénème et de la cloxacilline.
11. 11. Milieu de culture selon la revendication 10, comprenant en outre du phenylalanine-arginine beta-naphtylamide (PAbetaN).
12. 12. Utilisation de cloxacilline ou d'une combinaison de cloxacilline et de PAbetaN pour détecter et/ou identifier spécifiquement des bactéries présentant une résistance enzymatique aux carbapénèmes.25