CN114164251A - 经由maldi-tof表征微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备分析板的表征区以通过使用被称为MALDI的基质辅助激光解吸/离子化质谱技术在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征的方法。所述方法包括以下连续步骤：‑涉及利用旨在经由MALDI技术表征并包括至少一个具有抗微生物剂的分析区的分析板的步骤；‑将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；‑涉及将分析板在足以允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下保持足够时间的孵育步骤；以及‑在分析区上沉积适用于MALDI技术的基质的步骤。本发明还涉及表征和功能化方法，并涉及相关的分析板和用途。

Description

经由MALDI-TOF表征微生物
本申请是申请日为2015年7月29日、申请号为201580041281.8、发明名称为“经由MALDI-TOF表征微生物”的分案申请。
本发明涉及微生物学领域。更确切地说，本发明涉及使用质谱法、特别是基质辅助解吸-离子化和飞行时间(被称为MALDI-TOF)质谱法(MS)表征至少一种微生物的群体。
几年来，MALDI-TOF技术已被用于在种的水平上快速鉴定微生物。适用于这种类型的表征的多种形式的仪器已由申请人以及还特别由Bruker Daltonics和Andromas销售。
根据微生物体内最为丰富的蛋白质的MALDI-TOF谱，通过与为了鉴定微生物的科、属、以及通常情况下是种的对照数据比较，来鉴定该微生物。通常来说，应用的方案包括在MALDI板上沉积微生物菌落的至少一部分，加入适合于MALDI技术的基质，采集质谱，以及通过与数据库中存储的对照数据比较来鉴定种。
最近，MALDI技术还被用于检测微生物对抗生素的耐药性，特别是鉴定由于β-内酰胺型酶(特别是碳青霉烯酶型)的分泌引起的负责水解β-内酰胺型抗生素的表型。就这一点而言，可以提及申请US 2012/0196309和WO 2012/023845。通过MALDI-TOF表征耐药性涉及在将可能含有能够产生β- 内酰胺酶的微生物样品与所述抗生素一起孵育之后，检测β-内酰胺抗生素的本体形式的损失和/或水解形式。
虽然在这些专利申请中没有记载待沉积的样品的制备，一般而言，可以想到预先将微生物与抗生素混合，然后将混合物沉积在MALDI板上或者使用微生物的裂解物(参见WO2012/023845，特别是权利要求15)。
文献WO 2013/113699设想使用质谱法来评价底物对β-内酰胺酶的抑制作用，该评价可能是在细菌的存在下进行的。
以下发表文献(Hrabak,Walkova et al.2011,Hooff,van Kampen et al. 2012,Hrabak,Studentova et al.2012,Sparbier,Schubert et al.2012)更详细地描述了为制备样品而实施的方案，所述方案包括以下步骤：
-制备包含微生物的菌落的接种物；
-对接种物进行离心；
-用抗生素溶液在存在或不存在裂解试剂的情况下再悬浮细菌沉淀；
-孵育30分钟至3小时；
-离心；以及
-将1微升上清液转移到MALDI板上，并加入1微升基质，采用 MALDI-TOF质谱法进行分析。
因此，在采用MALDI-TOF技术检测耐药性之前制备样品耗时长且乏味。事实上，采用MALDI-TOF技术检测耐药性的程序必须要制备具有高浓度的接种物和/或必须有一个或多个离心步骤。这些步骤需要材料、消耗品和专用设备，并因此消耗了消耗品、时间和操作者的专业知识。此外，考虑到每天进行大量样品的表征是不能想象的，该类型的在先制备使其难以常规使用MALDI-TOF技术来检测耐药性。事实上，在实施采用 MALDI-TOF技术鉴定耐药性现象的设备的可用性和必需的制备步骤后获得的样品的可用性之间经常存在着不匹配。另一个问题在于以下事实：用约10μL至50μL体积的抗生素孵育细菌，产生潜在的减少酶-抗生素相互作用的高风险。结果，可能降低酶活性的效力，这将影响检测灵敏度并因此影响技术的稳健性，特别是对于已知产生或分泌少量酶的微生物。
检测对抗微生物剂的耐药性还在申请WO 2011/045544和US 2012/0196309中被描述为能够通过使用其他质谱技术如质谱-质谱(MS-MS) 和多反应监测(MRM)进行。在这些情况中，不能对微生物进行质谱法分析和因此的离子化，但这能够对多种纯化操作后获得的蛋白质进行。
在本发明的上下文中，发明人提出了实施一种制备用于采用MALDI 技术表征微生物的表征区的新方法，该方法能够用于鉴定对抗生素的耐药性并且易于实施。而且，这一新方法与获得该表征区中存在的样品的多种表征相兼容，多种表征的至少一种对应于鉴定对抗生素的耐药性，而另一种可能对应于鉴定微生物。
本发明因此提供了一种使用MALDI-TOF技术表征含有至少一种微生物的样品的方法，该方法能够用于在相对短的时间内(大约几小时至1小时，甚至更短)鉴定存在的微生物的群体是否对至少一种抗微生物剂具有耐药性。
本发明还涉及制备分析板的表征区以便在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征的方法，所述表征涉及质谱法分析，其间根据被称为MALDI的基质辅助解吸-离子化质谱技术在通过用激光束轰击分析区对沉积在分析区上的至少一种微生物的群体进行至少一个离子化步骤；
制备该分析区的方法的特征在于其包括以下连续步骤：
-包括提供用于采用MALDI技术表征的分析板的步骤，该板包括至少一个携带抗微生物剂的分析区；
-将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；
-孵育步骤，包括使分析板保持在允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下，并持续足够的时间；以及
-将适合于MALDI技术的基质沉积到分析区上的步骤。
优选地，在根据本发明的制备方法的上下文中，沉积待表征的单一微生物的群体。因此，该表征区则可以用于表征单一微生物。
根据本发明，在没有在先的与抗微生物剂接触的步骤的情况下制备沉积的微生物的群体，即沉积的微生物的群体在被沉积之前不与表征区上存在的抗微生物剂混合。
有利地是，根据本发明的方法对浓缩、富集和/或纯化步骤后获得的微生物的群体和/或对应于在合适的培养基(特别是凝胶培养基)上生长后获得的菌落或菌落的一部分的微生物的群体进行。
举例来说，在本发明的上下文中，以诸如使其可以鉴定由β-内酰胺酶 (特别是碳青霉烯酶)的产生而引起的耐药性的方式来选择抗微生物剂。
抗微生物剂通常是抗生素，优选地选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类，特别是选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和法罗培南。
根据本发明的制备方法可以包括功能化步骤，以获得用于采用MALDI 技术表征的包括至少一个携带抗微生物剂的分析区(被称为功能化区)的分析板，所述功能化步骤优选地通过沉积抗微生物剂水溶液然后干燥来进行。
本发明还涉及表征至少一种微生物的群体的方法，所述表征至少包括测定对至少一种抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体存在与否；
该方法的特征在于其包括以下连续步骤：
-根据本发明的制备方法制备分析板的至少一个表征区；
-使用被称为MALDI-TOF的基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱法分析沉积在表征区上的微生物的群体至少一次以便能够推断出该表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体。
具体地，用于推断出该表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体的使用MALDI-TOF技术的质谱分析包括验证抗微生物剂和/ 或抗微生物剂的降解产物的存在。
有利地，根据本发明的表征方法包括至少两种表征。具体地，表征另外地包括鉴定沉积在表征区上的微生物的群体的科、属或优选地种。
优选地，根据本发明的表征方法包括：
·对应于离子化表征区的第一步骤，通过MALDI型质谱法进行第一分析并对该分析进行第一校准来鉴定沉积在表征区上的微生物的群体的科、属或优选地种；以及
·对应于离子化该相同表征区的第二步骤，通过使用MALDI-TOF技术的质谱法进行第二分析并对该分析进行第二校准来测定表征区上存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体的可能性。
在此类情况下，鉴定微生物群体的科、属或优选地种以及测定抗微生物剂存在的可能性优选地涉及相同微生物。
本发明还提供了表征至少一种微生物的群体的方法，所述表征至少包括：
·对应于离子化包含微生物的群体、抗微生物剂和适合于MALDI技术的基质的表征区的第一步骤，通过使用MALDI技术的质谱法进行第一分析来鉴定微生物群体的科、属或优选地种；
·对应于离子化包含至少一种微生物的群体、抗微生物剂和适合于 MALDI技术的基质的表征区的第二步骤，通过使用MALDI技术的质谱法进行第二分析，来测定对至少一种抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体的存在；
所述方法的特征在于：
-借助于离子化包含至少一种微生物的群体和抗微生物剂的相同表征区的不同的第一步骤和不同的第二步骤分别进行第一分析和第二分析；
-第一分析使用第一校准，第二分析使用不同于第一校准的第二校准。
优选地，沉积的群体包含待被表征的单一微生物。
这种类型的表征方法优选地应用根据本发明的制备分析板的表征区的方法。
在本发明的上下文中，相同的表征区并因此相同的微生物的群体连续经受两次离子化以便获得两种期望的表征：表征微生物对抗微生物剂的耐药性现象，和鉴定微生物。本发明还提供了功能化适合于MALDI技术的分析板的分析区的方法，功能化分析区的方法的特征在于其包括：
-功能化分析区以使该分析区携带抗微生物剂的步骤。
功能化步骤可以通过沉积抗微生物剂水溶液然后干燥来实施。
本发明还提供了一种旨接收待通过根据MALDI技术的质谱法在分析区上表征的至少一种微生物的群体的分析板，该板的特征在于其包括在该分析板的所述分析区上沉积的抗微生物剂(特别是以固体沉积物的形式)，形成被称为功能化的分析区。具体地，在这种类型的分析板中，携带抗微生物剂的功能化分析区不包括可被MALDI技术检测到的量的微生物，和/ 或携带抗微生物剂的功能化分析区是干燥的。
术语“干燥的”具体是指抗微生物剂不是以溶液形式，而是以粘附至其已沉积到的分析区的固体沉积物的形式。具体地，在被称为功能化的分析区上保持抗微生物剂可通过静电结合、离子结合、共价结合、亲和力结合或事实上借助于粘附剂来实现。具体地，粘附剂可以是可溶于水的聚合物。可以提及的可用于在一个或多个分析区上固定抗微生物剂的粘附剂的实例是七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精。
在一个具体实施方式中，在旨在接收待被表征的至少一种微生物的群体的分析板中，该功能化分析区或每个功能化分析区携带单一抗微生物剂。
根据本发明的用于接收至少一种微生物的群体的分析板可被包装在密封包装中。具体地，该密封包装可适用于保护板避光和避湿气。
功能化分析区可通过沉积抗微生物剂水溶液然后干燥而获得。
这种类型的板可包括多个功能化分析区，每个均携带抗微生物剂，特别是至少具有携带第一抗微生物剂的第一功能化分析区和携带与第一抗微生物剂不同的第二抗微生物剂的第二功能化分析区，该第二功能化分析区与第一区不同。
通常，这种类型的板包括至少一个旨在随后接收对照微生物的群体的对照分析区，并且其中该对照分析区的表面没有抗微生物剂。
本发明还提供了根据本发明的分析板在根据本发明的表征方法中的用途。
参照附图进行的以下描述有助于更好地理解本发明。
图1是MALDI板的示意性俯视图。
图2至图4是在借助于MALDI-TOF技术的实施例中获得的质谱。在这些附图中，强度标度是参照谱图中最强峰的相对标度。作为一个实例，在所选的质量范围(具体是200m/z至1200m/z)内，如果最强锋是100mV，其被表示为100％(如在质谱左侧提及的)。强度较弱的峰相对于最强锋来表示：因此，强度为75mV的峰达到标度(在含有100mV的最大强度峰的谱图上)的75％。结果，对于同一谱图，不能比较菌株之间的峰的强度水平。相比之下，对于同一菌株，这些谱图能够用于比较抗微生物剂的本体峰与其降解产物的峰之间的强度。对于同一菌株，还可以比较本体峰或水解峰与尚未进行由待测试的微生物的生物/酶活性所诱导的变化的对照峰之间的强度。以下峰可以被视为是对照峰：HCCA基质的峰、加入至基质中或已被干燥到分析区上的肽或对照分子的峰。
图5显示在用接种环刮取之前和之后，在粘附剂(heptakis)的存在和不存在下，抗生素法罗培南已沉积其上的分析区(点)的外观。
图6显示通过MALDI-TOF技术获得的本体法罗培南和水解法罗培南的峰与HCCA对照峰相比的强度比随着[Heptakis]/[法罗培南]比的变化。
图7表示在实施例5的第二系列采集期间获得的质谱。
图8显示在实施例5中304/308和304/330强度比随着用于测试的两种菌株的接种物的浓度的变化。
图9表示整合了可适合于沉积液体形式的微生物的群体的MALDI板的盒的实施方式。
MALDI分析板
MALDI分析板具有至少一个分析区，通常具有多个分析区。分析区为点形式，形状通常为圆形。为了促进后续离子化，至少在一个或多个分析区的水平上，板的表面是导电的。举例来说，这种类型的分析板由诸如聚丙烯的聚合物形成，所述聚合物用一层不锈钢涂覆。该聚合物可以含有导电材料如炭黑。举例来说，此类板可以是Shimadzu销售的板，被称为“FleximassTM DS一次性MALDI靶标(FleximassTM DS disposable maldi targets)”。
多种MALDI板是可商购获得的，如来自bioMérieux的Fleximass DS 板(一次性的或重复使用的)和来自Bruker Daltonics的Maldi Biotarget板。这种类型的板I通常包括48至96个分析区1或点以及至少1个、或甚至两个或三个对照分析区2，对照分析区2的尺寸如图1的实例中所示，其与分析区的尺寸不同。
在本发明的上下文中，术语“表征区”用于携带抗微生物剂、微生物的群体和适合于MALDI技术的基质的分析区。
功能化分析区
术语“抗微生物剂”是指能够降低微生物的活力和/或能够减少微生物的生长或繁殖的化合物。这种类型的抗微生物剂在其针对细菌时可以是抗生素。然而，本发明适用于细菌、酵母、霉菌或寄生虫类型的任何类型的微生物，并因此适用于相应的抗微生物剂。
优选地，抗微生物剂是抗体如β-内酰胺，特别是选自青霉素类、头孢菌素、头霉素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类，特别是选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和法罗培南。
碳青霉烯类特别是作为最后手段用于抵抗革兰氏阴性菌如肠杆菌科假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)。因此，当怀疑存在的微生物是可能对碳青霉烯类具有耐药性的肠杆菌或另一种革兰氏阴性菌种时，将这种类型的抗生素沉积在分析区上。
优选地，其从抗微生物剂水溶液进行沉积。
适合于抗微生物剂的溶解性以及适合于优化最初靶向的耐药性的机制活性的缓冲剂也可用于制备抗微生物剂溶液。还可想到向抗微生物剂溶液添加锌盐(特别是氯化锌或硫酸锌型)用于优化金属-β-内酰胺酶的活性。
可以使整个分析区被覆盖的方式沉积抗微生物剂溶液液滴(例如大约1 至2微升)。然后将溶液中含有的水蒸发出去，例如简单地通过在环境空气和环境温度下干燥。举例来说，分析板可以被置于17℃至40℃范围内的温度下，特别是在环境温度(22℃)下。还可以将其转移至例如37℃的恒温器以加速干燥。
以非常简单的方式以水溶液形式沉积抗微生物剂，在这一沉积之后进行干燥操作。因此，获得携带抗微生物剂的分析区，将其称为被功能化的。还可以通过静电、离子、共价或亲和力结合或者借助于粘附剂将抗微生物剂固定在分析区上。简单地沉积抗微生物剂不会提供其令人满意的固定效果。具体地说，如果抗微生物剂没有充分粘附至表征区，这能够在沉积微生物的群体时导致抗微生物剂损失，沉积微生物群体则会要求操作者在生产沉积物时具有一定的敏捷度；或者这能够在储存MALDI板以供后续使用期间由于沉积物的脱离而导致抗微生物剂损失。此外，代替样品沉积，可通过使用已接枝至分析区的表面和接枝至抗微生物剂的生物素/链霉亲和素的相互作用，经由静电键、离子键或共价键，在使用或不使用任选的特异性连接体或臂(抗体、重组噬菌体蛋白质)的情况下，或通过适合于抗微生物剂性质和分析区表面的任何其他类型的键，或者借助于粘附剂，将抗微生物剂连接至分析区。然而，结合模式或沉积模式应以如下方式选择：使得抗微生物剂与微生物的任何相互作用不受影响，因为这可引起掩蔽耐药现象。特别地，为了防止改变抗微生物剂的构象以及为了确保能够适当地接近微生物可产生的酶的活性位点，优选通过使用粘附剂而不是通过共价结合或亲和力结合来固定抗微生物剂。
当使用粘附剂(即，粘附至板并因此改善抗微生物剂固定至板的试剂) 时，沉积粘附剂和抗微生物剂水溶液的混合物。具体地，粘附剂可以是可溶于水的聚合物。可以提及的能够用于将抗微生物剂固定至一个或多个分析区的粘附剂的实例是七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精。应当根据待被固定在分析区上的抗微生物剂来选择粘附剂。具体地，应当根据粘附剂的分子量以如下方式选择粘附剂：其存在不会影响后续的目的在于测定存在的抗微生物剂和/或其降解产物是否存在的MALDI检测。本领域技术人员应当调节所用粘附剂的量，其必须不能太高以确保当微生物群体已被沉积时抗微生物剂可接近微生物群体。作为一个实例，采用七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精时，七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精除以抗微生物剂的重量比可以选择为 1/20至1/2，优选地1/10至1/5。
本领域技术人员应当根据涉及的抗微生物剂调整沉积在分析区上的抗微生物剂的量。事实上，根据分子的离子化程度，必须沉积足够量以便能够在MALDI-TOF中检测到强度高于背景噪音的对应于抗微生物剂的峰。相比之下，太大量的抗微生物剂引起掩蔽检测最初待被表征的耐药性现象的风险，使得不能观察到对应于本体抗微生物剂的峰强度的减少。过量的抗微生物剂可特别影响检测具有低活性的β-内酰胺酶。作为一个实例，应当沉积0.04g/m2至4g/m2的抗微生物剂。出于这个目的，应当以0.1mg/mL 至10mg/mL的浓度沉积抗微生物剂的水溶液，特别是超纯水溶液。举例来说，对于氨苄西林，可沉积包含1.7mg/mL至10mg/mL氨苄西林的水溶液，对于法罗培南，可沉积包含0.1mg/mL至1mg/mL法罗培南的水溶液。
表征区应当优选地携带单一抗微生物剂，但是也不排除在同一分析区上使用多种抗微生物剂。携带多种抗微生物剂的表征区可用于同时测试多种酶的存在并因此测试不同的耐药现象。当使用携带多种抗微生物剂的表征区时，应当以如下方式选择抗微生物剂：在靶酶的作用下，它们的本体形式和/或它们的降解产物的质量不重叠，以使它们能够分别被MALDI-TOF检测到。作为一个实例，除了第一抗微生物剂之外，还可以沉积来自相同科或不同科的另一抗微生物剂。作为一个实例，某些碳青霉烯更适合于揭示特定碳青霉烯酶。因此，可以想到在同一表征区上具有多种类型的碳青霉烯或其他β-内酰胺。相比之下，如果在同一区上沉积两种抗微生物剂，应当以如下方式选择抗微生物剂：它们的活性谱不相互干扰并且能够通过MALDI-TOF分别检测它们。
除了抗微生物剂之外，也可以沉积另一化合物。采用β-内酰胺时，还可以沉积β-内酰胺酶抑制剂以便表征ESBL现象(超广谱β-内酰胺酶)，如特别是在申请WO 2012/023845中应用的。特别是，可沉积β-内酰胺与β- 内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦或他唑巴坦)的组合。当MALDI板包括多个分析区时，有利地是，至少两个区或甚至更多的区携带不同的抗微生物剂。然后，可以用单块板表征微生物的几种群体。每个区可携带不同的抗微生物剂。然而，通常，一式两份进行表征，以使在至少两个分析区或甚至更多个分析区上存在单一抗微生物剂。
这种类型的功能化的MALDI板可以直接供应至消费者，消费者仅需要沉积待研究的微生物的群体，以及在孵育步骤之后沉积MALDI基质。它们可以作为独立包装或包含几块板的包装进行销售。
制备和沉积微生物的群体
在本发明的上下文中，在用抗微生物剂功能化的MALDI板的分析区上沉积微生物的群体以便随后对其进行表征。
微生物的群体可以源自多种来源。可以提及的微生物的来源的实例是生物学来源，特别是动物或人类来源的样品。这种类型的样品可以对应于全血、血清、血浆、尿、脑脊髓液或有机分泌物类型的生物流体样品，或组织样品，或离体细胞。这种样品可以以其原样沉积，或者在优选情况下，其在被沉积到考虑中的分析区上之前，可以使用本领域技术人员已知的方法使其经历包括富集或培养类型的制备、浓缩、和/或提取或纯化步骤。然而，该类型的制备一定不能是对应于裂解步骤的类型的制备，裂解步骤将导致微生物分解并在被沉积在分析区上之前损失其含量。微生物的群体可以接种物的形式沉积。在本发明的上下文中，在分析区上沉积的微生物的群体优选地是活微生物的群体，但是也不排除使用可能影响活力的清洁剂从生物样品提取微生物的群体。然而，在此类情况中，为了采用MALDI 即时测试微生物的群体，可使用已存在的活性酶的储备液以通过检测任何耐药现象来表征微生物的群体。
微生物的群体的来源也可以是农产食品(agrifood product)，如肉、乳、酸乳和可能被污染的任何其他可消耗产品，或者是化妆产品或药用产品。在此再次地，可以对这种类型的产品进行富集或培养类型的制备、浓缩、和/或提取或纯化步骤，以便获得待沉积的微生物的群体。
通常，微生物的来源可以事先被置于肉汤中或凝胶上培养，以便在其中富集微生物。这种类型的凝胶或肉汤培养基是本领域技术人员熟知的。在凝胶上的富集是特别有利的，因为这能够用于获得能够直接沉积到分析区上的微生物菌落。
在本发明的上下文中，优选在分析区上沉积包含细菌群体而不是如采用MS/MS或MRM技术那样在提取或纯化步骤之后获得的一种或多种蛋白质的细胞培养基。优选地，沉积的微生物群体含有至少105cfu的微生物。举例来说，可沉积105cfu至109cfu的微生物。作为一个实例，可以直接进行沉积生物质、微生物在超纯水或缓冲液中的混悬液的液滴。可沉积微生物菌落或微生物菌落的一部分。
沉积的群体优选地包含单一种的微生物。然而，并不排除向分析区上沉积包含不同微生物的群体。在这种情况中，优选已知出现不同耐药机制的微生物，以便能够知晓哪些微生物存在被鉴定的耐药性。
在本发明的上下文中，不用进行待沉积的样品的特殊制备。具体地，沉积微生物的群体，而不需要事先使其与抗微生物剂接触。事实上，在本发明的上下文中，待沉积样品的耗时长且乏味的制备不是必需的；能够在无离心步骤的情况下制备被沉积的微生物的群体。
以如下方式进行沉积：使得以一致的方式将微生物的群体沉积到分析区上。为了这个目的，可以使用如在商用MALDI-TOF仪器(如bioMérieux 销售的
Figure BDA0003401891360000111
MS仪器)的说明手册中描述的实施标准微生物鉴定的程序。
然而，除了微生物的群体外，还可以添加已知加速所考虑的耐药机制中出现的酶反应的化合物。该化合物可以是锌化合物，例如以ZnCl2或硫酸锌的形式，特别地，其是金属-β-内酰胺酶活性中的重要辅助因子。该化合物可以已经与抗微生物剂组合或在制备表征区期间的任何其他时间被沉积在分析区上。
最初能够借助于合适的试验、特别是其是在凝胶上分离的菌落这一事实测定分析区上的沉积物事实上确实含有至少一种微生物的群体的事实。优选地，在分析区上沉积单一微生物的单一群体。
孵育
在沉积微生物的群体后，对待被表征的携带抗微生物剂和微生物的群体的分析区进行孵育步骤以允许微生物和抗微生物剂相互作用，并因此在存在对该抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体时，允许最初的耐药性反应/现象发生。特别地，当待被检测的耐药现象是由于沉积的微生物所产生的酶的存在时，可以以诸如使得酶反应发生的方式进行孵育。
在本发明的上下文中，负责对抗微生物剂耐药的现象因此直接发生在 MALDI板上，并且在MALDI板上已在抗微生物剂的存在下沉积微生物的群体之前完全没有发生，如采用现有技术发生的。对应于表征区，负责抗对微生物剂耐药的现象以最小体积发生。因此，采用现有技术遇到的稀释问题是有限的。
本领域技术人员应当根据对待表征的耐药现象调整孵育条件和周期。
举例来说，分析板可以被置于17℃至40℃范围内的温度下，特别是在环境温度(22℃)。还可以将其转移至恒温器(例如37℃)以便促进可能在耐药现象最初时的酶反应。
湿度条件应当被调整为防止存在的微生物干燥，特别是在待检测的耐药现象应用水解反应时。在孵育期间板可被置于潮湿气氛中，至少使得由含有微生物的群体的沉积物直接提供的水分量是足够的。
在所选的条件下，孵育时间应当足以允许后续通过MS MALDI-TOF检测待检测的耐药现象，特别是用于酶介导的耐药现象的酶反应。孵育通常进行至少5分钟，更优选至少20分钟，还更优选45至90分钟。
在本发明的上下文中，已表明如果除了检测耐药现象外还进行此类表征，则执行这种类型的孵育步骤不以任何方式对后续的微生物鉴定具有有害的影响。
沉积MALDI基质
总体而言，在MALDI技术中使用的基质是光敏的并在微生物的群体的存在下结晶，同时保持分子和存在的微生物的完整性。这种类型的基质，特别是适合于MALDI-TOF MS技术的基质，是熟知的，并且例如由选自以下的化合物构成：3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、阿魏酸和2,5-二羟基苯甲酸。许多其他化合物对于本领域技术人员而言也是已知的。还存在在大气压力下或者减压下不结晶的液体基质。可使用任何其他可用于在激光束的作用下离子化表征区中存在的分子的化合物。
为了生产基质，这种类型的化合物被溶解，通常被溶解在水中，优选“超纯”品质的水，或者水和有机溶剂的混合物中。可以提及的常规使用的有机溶剂的实例是丙酮、乙腈、甲醇和乙醇。有时可添加三氟乙酸(TFA)。举例来说，基质的一个实例由20mg/mL的在50/50/0.1(v/v)的乙腈/水/TFA 混合物中的芥子酸构成。有机溶剂允许存在的疏水性分子溶解成溶液，而水能够用于溶解亲水性分子。诸如TFA的酸的存在通过质子俘获(H+)激励分子的离子化。
构成基质的溶液直接被沉积到分析区上，然后覆盖其上存在的微生物群体和抗微生物剂。
任选地，根据本发明的方法还可以包括在离子化表征区的步骤之前使存在的基质结晶的步骤。通常，通过使基质在环境空气中干燥使基质结晶。因此例如通过将分析板置于例如17℃至30℃的温度下，特别是环境温度 (22℃)下几分钟，例如5分钟至2小时，使基质中存在的溶剂被蒸发掉。溶剂的这种蒸发使得其中分布微生物的群体和抗微生物剂的基质结晶。
离子化和获得质谱
对在MALDI基质中放置并形成表征区的微生物的群体和抗微生物剂进行软离子化。
用于离子化的激光束可以具有任何有利于使基质升华或蒸发的波长。优选地，使用紫外波长或甚至红外波长。举例来说，可以采用发射337.1nm 的紫外(UV)辐射的氮激光器进行这种离子化。
在离子化期间，对微生物的群体和抗微生物剂进行激光激发。然后基质吸收光能，并且该能量的恢复导致基质升华，导致在微生物的群体和抗微生物剂中存在的分子被解吸，并导致材料以被称为等离子体的状态出现。在该等离子体中，在基质分子、微生物分子和抗微生物剂分子之间交换电荷。作为一个实例，质子从基质中被扯下并转移到表征区中存在的蛋白质、肽和有机化合物。该步骤能够用于实施软离子化存在的分子而不诱导它们的破坏。然后微生物的群体和抗微生物剂释放不同大小的离子。这些离子然后被电场加速并在减压下在被称为飞行管的管中自由飞行。在离子化期间以及在加速生成的离子期间施加的压力通常在10-6至10-9毫巴(mbar)的范围内。最小的离子则比较大的离子“飞行”得更快，从而允许它们被分开。检测器位于飞行管的末端。离子的飞行时间(TOF)用于计算它们的质量。因此，获得质谱，其表示对应于相同质荷比(m/z)的离子化的分子数量的信号强度作为击中检测器的分子的m/z比的函数。质荷比(m/z)用汤姆逊[Th] 表示。一旦引入至质谱仪中，非常快速地、通常在不到一分钟的时间内获得表征区的光谱。
适合用于根据本发明的用途的MALDI-TOF质谱方法包括以下连续步骤以便获得质谱：
-提供包含在适合于MALDI光谱法的基质中的待研究的微生物的群体和至少一种抗微生物剂的表征区；
-任选地，对其中设置微生物的群体和抗微生物剂的基质进行结晶；
-使用激光束离子化微生物的群体和抗微生物剂以及基质的混合物；
-借助于电势差加速获得的离子化的分子；
-允许加速的离子化的分子在减压下在管中自由运动；
-在管的出口处以诸如以下的方式检测至少一部分的离子化分子：测量它们在减压下通过管所花费的时间并获得对应于在给定时间到达检测器的离子化分子的数量的信号；以及
-以诸如以下的方式计算检测分子的质荷比(m/z)：获得作为检测分子的m/z比的函数的对应于具有相同质荷比(m/z)的离子化分子的数量的信号。
总体来说，通过考虑以连接减压管中的离子化分子的质荷比(m/z)和飞行时间的方程的形式应用的质谱仪的初始校准来计算m/z比。
校准包括使用提供覆盖对应于设想的表征的质量范围的离子化分子的分子或微生物(取决于表征)。这些离子化分子的m/z比作为标准以允许仪器适当地测量质量。
为了鉴定微生物，可使用离子化分子具有覆盖用于鉴定的质量范围(对于酵母菌、霉菌、细菌或寄生虫而言通常在2000道尔顿(Da)至20000Da 的范围内)的m/z比的细菌菌株来进行校准。为了检测对应于抗微生物剂的信号，能够使用小质量的肽的混合物进行校准。在本发明的上下文中，例如，可使用覆盖350Da至1000Da质量范围的校准物pepMIX 6(LaserBio Labs)。
可使用任何类型的MALDI-TOF质谱仪来生成质谱。这种类型的质谱仪包括：
i)离子化源(一般为UV激光器)，用于离子化微生物的群体和抗微生物剂以及基质的混合物；
ii)离子化分子加速器，施加电势差；
iii)减压管，加速的离子化分子在其中运动；
iv)质量分析器，旨在根据它们的质荷比(m/z)分离形成的分子离子；和
v)检测器，旨在测量分子离子直接产生的信号。
在本发明的上下文中，MALDI-TOF分析优选地是单纯的MALDI-TOF 分析，但是并不排除MALDI-TOF TOF分析。为了改进某些情况中的检测灵敏度，特别可想到MALDI-TOF-TOF分析，尽管其更复杂，并且其需要适合于这种类型的分析的仪器。
检测对抗微生物剂的耐药性
术语“耐药性”是指一种现象，在该现象中当微生物暴露于一定浓度的抗微生物剂时，该抗微生物剂在不存在耐药性的情况下被认为是对所述微生物是有效的，微生物没有表现出其活力的降低或其生长或其繁殖的降低。
通过在得到的质谱图上检测具有给定质量的峰或该质量峰与对照质谱比较、特别是与所述表征区中存在的抗微生物剂的质谱比较的变化，从所考虑的表征区所获得的质谱可以识别出耐药机制。
在本发明的上下文中，已证实在抗微生物剂的存在下直接对微生物进行MALDI-TOF质谱法应当允许与测定对所述抗微生物剂的耐药性有关的关注分子被检测到。对微生物群体的任何耐药性的测定因此可以包括以下步骤：
a1)提供例如抗微生物剂和/或其降解产物的对照质谱；这种类型的降解产物是耐药现象的结果，并且特别是由于降解酶的存在引起的；
b1)向沉积在分析区上并进入到存在的基质中的微生物的群体和抗微生物剂施加离子化(对应于根据本发明的表征区)；
c1)在用于测定耐药性的关注质量范围内采集这一离子化之后获得的质谱；以及
d1)比较在步骤c1)中获得的质谱与对照谱图，并由此推断是否存在耐药性。
在步骤d1)中，例如，如果在步骤c1)中获得的质谱上，具有抗微生物剂特征质量的一个或多个峰消失了，和/或出现了抗微生物剂的一种或多种降解产物的特征质量的一个或多个峰，则能够推断出存在对该抗微生物剂具有耐药性的微生物。举例来说，可根据具有抗微生物剂或其降解产物之一的特征质量的峰与具有外部校准物的特征质量的峰之间的强度比，或根据具有抗微生物剂的特征质量的峰与具有抗微生物剂的降解产物的特征质量的峰之间的强度比，进行解释。
还可以比较具有抗微生物剂的特征质量的一个或多个峰或具有抗微生物剂的一种或多种降解产物的特征质量的一个或多个峰与已存在的未进行由待测试的生物/酶活性诱导的变化的化合物的一个或多个对照峰。可以考虑的对照峰的实例是MALDI基质的一个或多个峰、添加至基质或已在分析区上干燥的肽或对照分子的一个或多个峰、或对应于存在的微生物的分子(例如代谢产物)的一个或多个峰，该分子总是存在的并且在几个种中是不变的。
当测定耐药性时，在对应于低质量的质量范围中，通常是在200Da至 1200Da的范围中，并优选地在200Da至600Da的范围中，进行校准。在步骤c1)中获得的质谱也包括在这一质量范围内。为了进行这种校准，举例来说，可以将2微升由肽的混合物(pepMIX6，LaserBio Labs)和HCCA基质α-氰基-4-羟基肉桂酸组成的校准溶液沉积到对照分析区上。在离子化表征区之前，在这一对照分析区上离子化校准物。校准物的离子化分子的m/z 比则用作标准以便使仪器能够用于适当地测量质量。
根据本发明的方法可以特别地用于检测由于微生物分泌已知降解β-内酰胺型抗生素的酶的能力导致的耐药性，所述酶特别选自青霉素酶、头孢菌素酶、头霉素酶和碳青霉烯酶。本发明还适合用于检测基于引起抗微生物剂质量变化的降解或酶修饰的其他耐药现象。举例来说，可以提及以下耐药机制，如由酯酶引起的大环内酯类的降解或由环氧酶引起的磷霉素的降解；氨基糖苷类、氯霉素或链阳菌素类的乙酰化；氨基糖苷类、大环内酯类、利福平或肽抗生素类的磷酸化；四环素的羟基化；氨基糖苷类和林可胺类的腺苷酰化；利福平的ADP-核糖基化；和大环内酯类和利福平的糖基化。
术语“降解产物”包括对应于由于存在的微生物的作用引起的抗微生物剂的化学结构的修饰的任何产物。除了上面提及的降解和酶修饰机制以外，还可以涉及添加在MALDI-TOF中可检测的并且使抗微生物剂失活或阻止抗微生物剂与其靶标结合的基团。
用于检测耐药性的这种类型的方法可以采用预功能化MALDI板在可商购获得的MALDI-TOF仪器的帮助下进行。为了使耐药性能够被检测，仅需要调整校准和解释步骤。在本发明的上下文中，在许多临床情况中可能是至关重要的检测对抗微生物剂的耐药性、特别是以常规方式快速测定对给定抗生素的耐药性现已是可能的。
根据本发明的表征方法能够用于在非常短的时间内鉴定对抗生素具有耐药性的微生物的存在，这对于快速诊断而言是特别令人关注的。检测产碳青霉烯酶肠杆菌(CPE)尤其是这样。根据本发明的方法能够用于在医院环境中实施快速检验，以便以快速方式调整施用的抗生素治疗。
微生物的鉴定
可以通过本发明的方法鉴定的微生物是在工业环境和临床环境中遇到的所有类型的微生物、病原体或其他，其可能对抗微生物剂存在耐药现象。它们可以是并优选地是细菌、霉菌、酵母菌或寄生虫。本发明特别适用于研究细菌。可以提及的这种类型的微生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和分枝杆菌(Mycobacteria)。可以提及的革兰氏阴性菌的属的实例是：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希式菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、摩根氏菌属(Morganella)、肠球菌属 (Enterococcus)和普罗威登斯菌属(Providencia)，并且特别是大肠杆菌 (Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、丛毛单胞菌 (Comamonas sp.)、气单胞菌(Aeromonas sp.)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、肠球菌(Enterococcus sp.)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、山夫登堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。可以提及的革兰氏阳性菌的属的实例是肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria) 和梭菌属(Clostridium)。
通过MALDI-TOF对这种类型的微生物获得的对应于它们的主要蛋白质的对照谱图是可得的并存储在商用MALDI-TOF仪器附赠的数据库中，允许通过比对鉴定此类微生物的存在。
鉴定微生物的群体的存在因此可以包括以下步骤：
a2)提供至少一种微生物、通常是一系列微生物的对照质谱；
b2)对沉积在分析区上并在基质的存在下的微生物的群体和抗微生物剂施加离子化(对应于根据本发明的表征区)；
c2)在用于鉴定该微生物的关注质谱范围内采集这一离子化后获得的质谱；以及
d2)比较在步骤c2)中获得的质谱与对照谱图，并由此推断出至少一种微生物的科、属或优选地种。
当鉴定微生物时，在对应于高质量的质量范围中，通常在2000Da至 20000Da的范围中，并优选地在3000Da至17000Da的范围中，进行校准。在步骤c2)中获得的质谱也包括在这一质量范围中。
可以通过将对照微生物的群体放置在板上存在的对照分析区中并通过 MALDI-TOF对其进行分析来进行校准。举例来说，这种类型的对照微生物可以是细菌大肠杆菌。对于这一校准，可以使用在商用MALDI-TOF仪器(如 bioMérieux销售的
Figure BDA0003401891360000191
MS仪器)的说明手册中描述的实施标准微生物鉴定的程序。
可以使用两个对照分析区进行校准：一个用于鉴定微生物，另一个用于表征耐药性。还可以使用同一对照区来进行这两种校准。在此种情况中，对照区应当用待研究的耐药性的抗微生物剂功能化。
在本发明的上下文中，以优选的但不是必要的方式，当以下两种表征都需要进行时：检测耐药性和鉴定微生物，后检测耐药性，即在鉴定微生物必需的步骤之后在表征区上进行检测耐药性所必需的离子化和分析步骤。
当在同一表征区上进行两种表征时，这可以在不从用于MALDI-TOF 分析的质谱仪取出分析板的情况下进行。这种双表征因此可以包括以下步骤：
a3)提供至少一种微生物，通常是一系列微生物的对照质谱1以及抗微生物剂和/或其降解产物的质谱2；
b3)借助于用于鉴定并已被沉积在对照分析区上的校准物校准使用的质谱仪；
c3)对沉积在分析区上并在基质的存在下的微生物的群体和抗微生物剂施加离子化(对应于根据本发明的表征区)；
d3)在用于鉴定微生物的关注质量范围内采集这一离子化后获得的质谱；
e3)借助于用于检测耐药性并已被沉积在对照分析区上的校准物第二次校准使用的质谱仪；
f3)对沉积在分析区上并在基质的存在下的微生物的群体和抗微生物剂再次施加离子化(对应于根据本发明的表征区)；
g3)在用于测定耐药性的关注质量范围内采集这一离子化后获得的质谱；
h3)比较在步骤d3)中获得的质谱与一个或多个对照谱图1，并由此推断出存在的至少一种微生物的科、属，或优选推断出存在的至少一种微生物的种；以及
i3)比较在步骤g3)中获得的质谱与对照谱图2，并由此推断出是否存在耐药性。
步骤c3)和f3)因此在同一表征区上进行并因此对微生物的同一种群进行，因此，这意味着能够减少制备和操作步骤。
在本发明的上下文中，使用在单一分析区上的微生物的同一种群及其单一沉积物，以便产生表征区，对该表征区连续施加两次离子化以便获得两种表征(对微生物对抗微生物剂的耐药性现象的表征和对微生物的鉴定)。
事实上，这出人意料地表明了抗微生物剂的存在和实施检测耐药性现象必需的在先孵育步骤不以任何方式阻碍鉴定微生物的可能性。
比较步骤h3)和i3)可以在方法结束时或在涉及的每次采集之后实施。
优选地，沉积的群体对应于单一微生物的群体并且两种表征(检测耐药性和微生物鉴定)涉及相同的微生物。
总之，本发明能够用于：
-从同一表征区快速获得信息，特别是既表征对抗微生物剂的耐药性现象又鉴定微生物；
-简化MALDI-TOF分析方法，在将样品沉积在MALDI板上以表征对抗微生物剂的耐药性现象之前无需耗时长且乏味的样品制备；
-直接在MALDI板上产生微生物和抗微生物剂的最佳接触，有时对耐药性现象的检测灵敏度具有积极影响；
-减少了就实施通过MALDI-TOF表征对抗微生物剂的耐药性现象的消耗品和人工操作而言的时间和成本；以及
-鉴于在将其沉积在MALDI板上之前在抗微生物剂的存在下的事先孵育不是必需的，对被分析的样品获得了更好的可追踪性和更好的管理。
下面的实施例旨在举例说明本发明，但它们不以任何方式限制。采用 bioMérieux销售的
Figure BDA0003401891360000211
MS仪器进行分析。在下面的每个实施例中在采集结束时进行分析。对整个表征区采集光谱，然后进行分析：
·对于鉴定，借助于VITEK MS引擎和Spectra Identifier Version:2.1.0 软件中包含的数据库V2.0.0分析谱图；
·对于水解，借助于Launchpad V2.8采集软件可视化谱图的峰。
实施例1
进行初步实验以表明在MALDI板的分析区上沉积与用于MALDI技术的适当基质混合的含有抗生素的溶液的液滴后可以通过MALDI-TOF检测β-内酰胺型抗生素的峰。在本实验中，将MALDI板(
Figure BDA0003401891360000212
MS一次性样品板TO-430(
Figure BDA0003401891360000213
MS disposable slidesTO-430))的分析区用β-内酰胺类抗生素处理并测试以便评价抗生素被β-内酰胺酶裂解的能力。使用氨苄西林作为抗生素β-内酰胺的模型。通过实施以下步骤进行实验：
-将2μL的浓度为10mg/mL的氨苄西林水溶液以液滴的形式沉积到 MALDI板的分析区上。在37℃孵育板，直到液滴完全变干。
-2μL重组β-内酰胺酶(来自绿脓假单胞菌的β-内酰胺酶， Sigma-Aldrich批号L6170-550UN，CAS:9073-60-3)。
-使用在补充有硫酸锌形式的锌(0.76毫摩尔(mM))以促进酶活性的水中稀释的2μL的水中浓度为1mg/mL的重组β-内酰胺酶，将其沉积到携带氨苄西林的干分析区上。同时还通过将2μL的含0.76mM锌但不含酶的水滴沉积到以相同方式用氨苄西林处理的另一分析区上来设置阴性对照。
-将板在环境温度下孵育1小时以使酶反应可以发生。
-将1μL HCCA基质α-氰基4-羟基肉桂酸(VITEK MS CHCA基质， bioMérieux Ref：411071)沉积到存在或不存在重组β-内酰胺酶的已含有氨苄西林的分析区上。
-采用
Figure BDA0003401891360000214
MS仪器使用2μL HCCA和pepMIX 6(购自LaserBio Labs)的混合物作为校准物来进行MALDI-TOF质谱分析，该校准物已被沉积在对照分析区上，用于就低质量校准仪器。通过将1体积的pepMix6(10X) 添加至9体积的HCCA来制备这一混合物。根据生产商的推荐程序，在稀释剂(0.01％的三氟乙酸超纯水溶液)中制备pepMix6(10X)溶液。在200Da 至1200Da的低质量范围内采集峰，并研究对应于本体的氨苄西林分子或其水解后的降解副产物的分子的存在。
一式两份在板上对所有样品进行分析。
图2绘制了获得的质谱并表明氨苄西林在板上是不稳定的，以及其在孵育后被β-内酰胺酶有效降解。事实上，在图2中，在对应于存在β-内酰胺酶的分析区的上部谱图中，观察到368.09m/z处的主峰，其对应于氨苄西林的水解形式(对氨苄西林的单钠形式计算的质量对应于368.4m/z)，但 372.09m/z处的本体形式(对氨苄西林的单钠形式计算的质量对应于 372.4m/z)则完全消失。相比之下，对于阴性对照(下部谱图)，主峰在 372.09m/z处，其对应于氨苄西林的单钠本体形式。在阴性对照中也观察到氨苄西林的少量自发水解。这表明通过使用根据本发明的制备表征区的方法，采用MALDI-TOF技术能够检测β-内酰胺的酶水解反应。
实施例2
进行本实验以研究如实施例1中所述在沉积氨苄西林溶液并干燥后，在将菌落直接沉积到携带氨苄西林的分析区上之后，氨苄西林被各种细菌菌株降解。
细菌菌株及其特性在下面的表1中示出。
表1
Figure BDA0003401891360000221
*MIC：菌株的最小抑制浓度
**毒力因子：对应于已知的分泌的酶
通过进行下面的步骤来实施试验：
-将2μL补充有锌(0.76mM)的浓度为10mg/mL的氨苄西林水溶液沉积到MALDI板的分析区上(与实施例1的步骤相同)。
-在37℃孵育板，直到沉积的溶液的液滴完全变干。
-对于每种细菌菌株，将在凝胶培养基上生长24h后获得的菌落的一部分一式两份沉积到携带氨苄西林的分析区上。如在鉴定微生物的
Figure BDA0003401891360000231
MS程序中描述的那样获得每个点。
-将板在环境温度(20-25℃)下在湿润气氛中孵育1小时。为了这个目的，使用含有水的密闭容器作为板的孵育室。
-将1μL HCCA基质添加至携带抗生素和细菌二者的分析区。
-采用
Figure BDA0003401891360000232
MS仪器，在板被置于仪器的室中后处于真空中的情况下，通过进行以下两个步骤进行MALDI-TOF质谱分析：
ο在根据携带沉积的大肠杆菌菌株(E-cal)的对照区校准仪器后，第一次采集表征区的光谱；
ο在用pepMIX 6作为校准物就小质量校准仪器后，第二次采集相同的表征区；在不破坏室的真空，而且也不从仪器取出板的情况下，在第一次采集之后立即进行第二次采集。
-收集数据并与数据库中含有的数据进行比较以鉴定种。
-在低质量范围内观察峰以检测抗生素的本体形式或水解形式。
在板上一式两份分析所有的样品。
图3绘制在第二系列采集期间获得的质谱，并表明在使用的实验条件下氨苄西林耐药型菌株全部都能够水解氨苄西林，而在已知对氨苄西林敏感的菌株大肠杆菌ATCC25922的情况中没有观察到氨苄西林的降解。事实上，在低质量的第二次采集之后，对于敏感型菌株和阴性对照，观察到对应于氨苄西林的本体形式的372.15m/z处的主峰，而对于所有的氨苄西林耐药型菌株，主峰位于368.15m/z，对应于氨苄西林的水解形式，并且本体形式消失。
在第一次采集并获得相应的谱图之后，鉴定全部的细菌菌株，并具有高置信度。
如下面的表2所示，对于所有的表征区，根据第一系列采集，可通过 MALDI-TOF正确地鉴定细菌，置信水平在99.9％至100％的范围内，表明该实验条件也能够区别不同的种。
表2
Figure BDA0003401891360000241
实施例3
进行其他试验以证实根据同一表征区可以鉴定种并检测碳青霉烯酶的产生。为了这个目的，使用法罗培南作为抗生素碳青霉烯的模型，并且使用与实施例2中使用的方案相同的方案。制备法罗培南浓度为0.5mg/mL 的法罗培南溶液。
使用的细菌菌株详见下表3。
表3
Figure BDA0003401891360000242
图4绘制在第二系列采集期间获得的质谱，并表明可通过MALDI-TOF 在这些条件下借助于第二系列采集检测碳青霉烯酶活性。虽然在这一实验中没有检测到法罗培南的水解形式，可以证实由于细菌产生碳青霉烯酶，法罗培南的两个本体形式的消失。
在低质量采集后，对于敏感型菌株，观察到308.13m/z处的主峰和 330.13m/z处的次峰，分别对应于法罗培南的两种本体形式(对应于计算质量308.3和330.3m/z)。在将法罗培南与产生碳青霉烯酶IMP-1的粘质沙雷氏菌菌株一起孵育时这两个峰都消失。
在第一采集并获得谱图之后，可正确地鉴定这两种菌株，并具有高的置信水平。以类似于实施例2的方式，在表征区中存在法罗培南并不影响 MALDI-TOF鉴定种的能力和区分大肠杆菌型细菌与粘质(marcescens)型细菌的可能性，如通过表4中显示的根据第一采集系列获得的结果所示。
表4
Figure BDA0003401891360000251
实施例4
进行这一试验以增加抗生素与MALDI板的分析区的粘附。事实上，干燥沉积在板上的抗生素溶液导致形成弱粘附于表面的膜。使用七(2,6-二 -O-甲基)-β-环糊精(Heptakis，Sigma-Aldrich编号H0513)将法罗培南结合到 MALDI板的表面。除其粘附性质之外，根据其分子量为1331.36克/摩尔 (g.mol-1)促使选择使用Heptakis，其不干扰法罗培南或其水解产物的质量峰。在这一实验期间，测试[Heptakis]/[法罗培南]的两个质量比以评价干法罗培南的粘附性和Heptakis对检测法罗培南的本体峰和水解峰的影响。
使用的细菌菌株详见下表5。
表5
Figure BDA0003401891360000261
通过进行下面的步骤来实施试验：
-在补充有锌(硫酸锌，0.76mM)的NaCl缓冲液(0.45％)中制备2种含有Heptakis和法罗培南的混合物的溶液和1种不含Heptakis的法罗培南溶液。Heptakis和法罗培南在这些溶液中的最终浓度如下所示：
ο0mg/mL的Heptakis和1mg/mL的法罗培南；
ο0.1mg/mL的Heptakis和1mg/mL的法罗培南(重量比为1:10)；
ο0.2mg/mL的Heptakis和1mg/mL的法罗培南(重量比为1:5)；
-将2μL的每种溶液沉积到MALDI板的分析区上(根据实施例1的步骤)，
-将板在环境温度下孵育，直到沉积溶液的液滴已完全变干；
-为了评价粘附性，借助于接种环刮擦每个用法罗培南或用Heptakis/ 法罗培南功能化的分析区，以模拟菌落的沉积，并对样品板(slide)照相；
-为了评价Heptakis的浓度对法罗培南峰的检测的影响，一式四份将在凝胶培养基上生长24h后获得的菌落的一部分沉积在携带单独的法罗培南或携带法罗培南和Heptakis的混合物的分析区上；
-将板在37℃、潮湿气氛下孵育2h；
-将1μL的HCCA基质加入至还携带抗生素或Heptakis/抗生素混合物和细菌的分析区；
-采用
Figure BDA0003401891360000262
MS仪器进行MALDI-TOF质谱分析，以采集低质量谱图；
-观察到法罗培南的308.3m/z处的本体形式的峰(法罗培南+Na)和304.3m/z处的水解形式的峰(水解法罗培南+H)以及212.03m/z处的 HCCA峰；
-对于所有的试验条件，记录这三个峰的强度，并计算308/212和 304/212的比。在这一实施例中使用212m/z处的HCCA峰作为强度不变的对照峰。
一式四份在板上分析所有的样品。
图5显示在用接种环刮取之前和之后分析区(点)的外观。照片显示在刮取后Heptakis/法罗培南混合物良好地分散在[Heptakis]/[法罗培南]比为1/10 和1/5的点的整个表面上，在刮取后具有良好稳定性。无Heptakis的已干燥的抗生素在样品板的表面上不是非常稳定，并且在用接种环刮取期间膜完全或部分地脱离。
图6显示当在样品板上干燥抗生素时，本体法罗培南和水解法罗培南的峰与HCCA对照峰的强度比随着使用的[Heptakis]/[法罗培南]比的变化。值以四个点的平均值表示。对于1/10和1/5的比，检测与不含Heptakis的条件是相当的，在存在Heptakis时具有额外的重现性优点。事实上，在不存在Heptakis时观察到的较大的可变性(大的误差棒)是由于在沉积菌落期间某些点上的抗生素的全部或部分损失。关于在与产生KPC型碳青霉烯酶的菌株一起孵育后水解峰的出现，我们观察到相同的现象，即采用1/10和 1/5的[Heptakis]/[法罗培南]比具有良好的检测。
这一实验的结果表明以合适的浓度(对于1mg/mL的法罗培南，0.1 mg/mL或0.2mg/mL)使用Heptakis意味着抗生素能够在稳定在样品板上进行储存，同时确保在沉积菌落期间与细菌的最佳混合。在这些相同的浓度下，Heptakis还能够用于改进点之间的结果的重现性，并且不干扰检测峰或不干扰法罗培南水解反应。
实施例5
进行这一试验以评价由液体沉积物(即细菌接种物)在MALDI板的功能化的分析区上进行水解反应的可能性。事实上，在菌落沉积期间遇到的问题是沉积的微生物的量以及沉积物随操作者的变化性缺乏标准化。因此，在用于常规MALDI-TOF鉴定应用的样品板上沉积菌落需要技术培训，乃至不能完全消除由于多样化的沉积带来的结果可变性的风险。此外，将具有已知浓度的细菌接种物施加至MALDI板的功能化分析区。
使用的细菌菌株在上表5中陈述。
通过进行下面的步骤实施试验：
-将2μL在补充有锌(硫酸锌，0.76mM)的NaCl缓冲液(0.45％)中制备的浓度为1mg/mL的法罗培南溶液沉积到MALDI板的分析区上，并在环境温度下干燥；
-一式四份将2μL的浓度为3McFarland或6McFarland的细菌接种物施加至该功能化的分析区；
-将板在37℃、潮湿气氛中孵育2h；
-将1μL的HCCA基质加入至携带抗生素和细菌这二者的分析区；
-采用
Figure BDA0003401891360000281
MS仪器对两次采集进行MALDI-TOF质谱分析：一次为低质量谱图的采集以观察法罗培南峰，另一次为高质量谱图的采集用于鉴定(根据实施例2)；以及
-观察到308.3m/z(法罗培南+Na)和330.3m/z(法罗培南+2Na)处的本体形式的峰以及304.3m/z(水解法罗培南+H)处的水解形式的峰；
-对于所有的试验条件，记录这三个峰的强度，并计算304/308和 304/330的比以量化法罗培南的水解。
一式四份对板上的所有样品进行分析。
图7绘制在第二系列采集期间获得的质谱，并表明在以6McFarland 强度沉积细菌接种物之后可通过MALDI-TOF检测碳青霉烯酶的活性。事实上，可以证实由于细菌产生碳青霉烯酶，法罗培南的两种本体形式消失以及出现水解形式。
在以低质量采集之后，采用敏感型菌株，观察到在308.03m/z处的主峰，并观察到在330.02m/z处的次峰，分别对应于法罗培南的两种本体形式(对应于计算质量308.3和330.3m/z)。当法罗培南与产生碳青霉烯酶KPC 的肺炎克雷伯菌菌株一起孵育时，这两个峰消失，并观察到出现304.06m/z 处的峰，对应于法罗培南的水解形式(计算质量为304.03)。
在第一采集并获得谱图之后，可正确地鉴定这两种菌株，并具有高置信水平。在表征区中存在法罗培南和沉积接种物不影响通过MALDI-TOF 鉴定种的能力，也不影响区分大肠杆菌型细菌与肺炎克雷伯菌型细菌的可能性，如可以从表6中所示的第一系列采集获得的结果所看出。
表6
Figure BDA0003401891360000291
图8显示304/308和304/330强度比随着所用的2种测试菌株的接种物的浓度的变化。对于不水解抗生素的野生型菌株，不管细菌接种物的浓度如何，均未观察到两种比的显著变化。对于产生KPC型碳青霉烯酶的菌株，均观察到这两种比的显著增加，其与接种物的浓度成比例。比的这种增加导致本体峰强度降低和水解峰强度增加，如图7中所示。
这一实验的结果表明沉积接种物也适合于MALDI板上的水解反应以及适合于通过MALDI-TOF质谱法的鉴定。此外，对四个沉积物的平均值观察到的小误差棒表明非常良好的结果重现性。
图9表示可适合于沉积液体形式的微生物群体的并入MALDI板的盒的实施方式。将具有已被干燥的抗生素覆盖的分析区的MALDI样品板置于通道中，其内已模塑了多个孔(在所述的模型中为12个)。在同轴上对其的6个孔含有脱水形式的不透明对照，其他6个孔是空的。含有样品板的通道被置于具有盖子的盒体中。为了储存，这一盒体特别可以密封方式包装以避光和避湿气。
可以在以下步骤中描述使用这种产品的方案：
-从盒体上取下盖；
-用50μL至100μL体积的水或生理缓冲液填充12个孔。填充含有不透明对照的6个孔致使形成浑浊溶液；
-通过添加菌落或菌落的一部分在其他6个孔中制备接种物以获得与对面孔的不透明对照相当的浊度；
-将2μL的每种接种物沉积到携带抗生素的分析区上；
-借助于移液管向盒体加入水以产生潮湿气氛；
-盖上盖并在37℃孵育1h至2h(或更少的时间)；
-向携带抗生素和细菌这两者的分析区加入1μL的HCCA基质；以及
-恢复样品板进行MALDI-TOF质谱分析。
添加不透明对照意味着可以避免通过使用密度或浊度测量装置来制备接种物，并因此可以节省时间。此外，常规使用的测量装置如密度计适合于大体积(1mL至3mL)，因此需要使用大量的细菌。
接种物还可以使用从生物样品直接获得的固体或液体细菌提取物(例如：从血培养物提取的细菌)来制备。
图9所示的实施方式允许测试6种不同的菌株。该模型还可以根据常规测试的菌株的数量来调整，特别通过增加孔的数量。
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Claims (21)

1.一种用于使用MALDI技术的质谱法的分析板，其包括功能化的分析区，旨在接受待通过使用MALDI技术的质谱法表征的至少一种微生物的群体，所述分析板的特征在于所述功能化的分析区携带有已经以固体沉积物的形式沉积的0.04至4g/m2的抗微生物剂。
2.根据权利要求1所述的分析板，其特征在于所述固体沉积物附着在其已经沉积的所述分析区上。
3.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述功能化的分析区是通过沉积所述抗微生物剂的水溶液然后干燥而获得的。
4.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂通过静电结合、离子结合、共价结合或亲和力结合或者通过粘附剂的方式固定在所述功能化的分析区上，所述粘附剂选自可溶于水的聚合物。
5.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂通过粘附剂七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精的方式固定在所述功能化的分析区上。
6.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述功能化的分析区适合于允许微生物的群体与所述抗微生物剂在孵育步骤中相互作用，并且因此，当存在对所述抗微生物剂有耐药性的微生物的群体时，允许由于所述耐药性而发生耐药反应或现象。
7.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板适合沉积在所述功能化的分析区上的至少一种微生物的群体的表征，所述表征至少包括在以下连续步骤之后，使用被称为MALDI-TOF的基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱法，确定对所述抗微生物剂有耐药性的微生物的群体的存在或不存在：
-将至少一种微生物的群体沉积到所述功能化的分析区上与所述抗微生物剂接触的步骤；
-孵育步骤，包括使所述分析板保持在允许所述抗微生物剂与存在的所述微生物相互作用的条件下，并持续足够的时间；以及
-将适合于MALDI-TOF技术的基质沉积到所获得的功能化的分析区上的步骤。
8.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂是β-内酰胺抗生素。
9.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂是选自青霉素类、头孢菌素类、头孢霉素类、碳青霉烯和单环β-内酰胺类的抗生素。
10.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂是选自青霉素类、头孢菌素类、头孢霉素类和单环β-内酰胺类的抗生素。
11.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述抗微生物剂选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和法罗培南。
12.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于至少在所述功能化的分析区的水平，所述分析板的表面是导电的。
13.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板由被一层不锈钢覆盖的聚合物形成。
14.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述功能化的分析区是圆形点的形式。
15.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板包括多个功能化的分析区，每个功能化的分析区都携带抗微生物剂。
16.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述板至少包括携带第一抗微生物剂的第一功能化的分析区和携带不同于第一抗微生物剂的第二抗微生物剂的第二功能化的分析区，所述第二功能化的分析区不同于第一功能化的分析区。
17.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述功能化的分析区或每个功能化的分析区携带单一抗微生物剂。
18.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板包括至少一个旨在随后接收对照微生物的群体的对照分析区，以及在于所述对照分析区的表面不含抗微生物剂。
19.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板被包装在密封包装中。
20.根据权利要求1或2所述的分析板，其特征在于所述分析板作为独立包装或者包含数个分析板的包装进行销售。
21.一种用于使用MALDI技术的质谱法的分析板，其包括功能化的分析区，旨在接受待通过使用MALDI技术的质谱法表征的至少一种微生物的群体，所述分析板的特征在于以固体沉积物的形式在所述功能化的分析区上沉积有抗微生物剂，在于所述分析板被包装在密封包装中，并且在于所述抗微生物剂选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、美罗培南和法罗培南。
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