CN102656276A

CN102656276A - 通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法

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Publication number: CN102656276A
Application number: CN2010800571296A
Authority: CN
Inventors: C·博利厄; Y·沙勒捷; J-P·沙里耶; S·沙泰利耶; P·迪富尔; C·弗兰切斯基; V·吉拉德; S·庞斯
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: CN102656276B; BR112012008537A2; JP2013508675A; FR2951548B1; WO2011045544A3; KR20120102634A; FR2951548A1; MX2012004310A; KR101833419B1; EP2488660A2; WO2011045544A2; US20120264156A1; US10077461B2; BR112012008537B1; MX341204B; EP2488660B1; RU2604199C2; RU2012119798A; JP5754742B2

Abstract

本发明涉及鉴定样品中至少一种微生物的方法，所述方法包括鉴别所述至少一种微生物及确定分型、对于至少一种抗微生物剂的潜在抗性、及毒力因子的性质，特征在于对于所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，通过使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记。

Description

通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法

本发明涉及微生物学领域。本发明更特别是涉及使用质谱分析从样品中鉴定微生物。

自从巴斯德发现了微生物，已经通过显微镜和生物化学分析对微生物进行了研究。这些常规方法通常费时且费力，很快就有需要寻求分析性的替代手段。因此，早在1975年J.Anhalt and C.Fenselau^[1]就开始通过质谱分析对细菌进行分析。

这些初步的研究之后是通过气相色谱结合质谱分析(GC-MS)对微生物壁脂肪酸进行研究^[2]。这种方法以FAME(脂肪酸甲酯)的名称普及。其目前是分类学研究的一种参考方法。然而，其使用仍限于某些掌握了经皂化、水解和衍生化而对样品进行处理的专门实验室，。

在1996年，M.Claydon et al.^[3]和T.Krishnamurthy and P.Ross^[4]的研究显示使用MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization–TimeOf Flight)型质谱分析仪鉴别各种细菌物种的可能性。该分析组合质谱分析的结果并通过专业软件解释。其极其简便且可以在几分钟内进行。然而，其仅在最近在医学检验实验室中展开使用^[5]。其临床应用目前限于鉴别细菌和酵母的物种。其既未用于分型(typing)也未用于鉴别抗微生物剂抗性，也未用于分析毒力。

然而，微生物的鉴别在临床和工业领域均是重要的。因此，例如，鉴别对于微生物剂如抗生素的抗性及检测毒力因子是保证患者最佳治疗的必要条件。同样，分型对于流行病学研究及对于对抗医院内感染是关键因素。

已经提议其它质谱分析方法、特别是串联质谱分析法以符合这些需要。例如可以提及的是C.Fenselau等使用四极-TOF(Q-TOF)鉴别β-内酰胺酶^[6]，D.Ding等用三节四极质谱仪检测葡萄球菌肠毒素C2(毒力因子SEC2)^[7]，或者R.Everley等用Q-TOF对梭菌(Clostridium)进行分型^[8]。

然而，这些研究结果不能应用于常规的临床应用。研究仪器需要高度专业的技术人员。分析时间通常超过1小时/样品，与微生物检验实验室的工作量不相匹配。最后，各个小组所获得的数据是应对特定的问题，但却并不同时应对所有的临床需要。

最近，S.Hofstadler等提出一种方法，其符合所有临床需求的要求^[9]。其组合了通过PCR扩增微生物基因组及通过电喷雾-TOF (ESI-TOF)检测PCR产物。这种方法目前是完全自动化的^[10]。然而，其需要PCR扩增，PCR扩增具有分子生物学中的固有缺陷，即探针的成本、提取收率等。

在本文中，本发明的目的是提出一种鉴定微生物的方法，即鉴别并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质，使得可以克服现有方法的缺点，即提供这样一种方法，该方法成本较低、不用特异于每个物种的试剂，特别是与分子生物学方法相比提供少于1小时的短时间结果，且可以在临床常规使用，不需要高度专业的技术人员。另外，鉴定微生物的整个方法可以用同一质谱分析仪有利地进行，从而简化了微生物检验实验室的设备。

为此，本发明提出一种在样品中鉴定至少一种微生物的新方法，该方法包括鉴别所述至少一种微生物并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于确定所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质是通过质谱分析进行，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对于至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。

因此，本发明的方法是，微生物的至少三种性质的鉴定是通过质谱分析技术进行的，使用代表待鉴定的微生物的蛋白质、肽或代谢物作为标记。

可以通过本发明的方法鉴定的微生物是在工业和临床上遇到的所有病原性或非病原性微生物。它们可以是细菌、病毒、原生动物或酵母。

短语“分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记”是指蛋白质或者代谢物来源的分子，其是所述性质的特征。

短语“对微生物分型”是指区分同一物种内的一些菌株。分型具有流行病学意义；临床医生获知分离自患者的菌株与表面上相同并分离自其它患者或环境的其它菌株是否来自同一来源。这样因而可以揭示在医院内感染的场所或者食物中毒的时间。在细菌中分型性质的标记的非限制性实例是具有特征性突变的肽，如大肠杆菌(Escherichia coli)的adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA基因的转录产物，以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的arc、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL基因的那些转录产物。在原生动物中分型性质的标记的非限制性实例是溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)和迪斯帕内阿米巴(E.dispar)的几丁质酶基因产物。在病毒中分型性质的非限制性实例是人免疫缺陷病毒的聚合酶基因产物。最后，在酵母中分型性质的标记的非限制性实例是白色念珠菌(Candidaalbicans)的aat1a、acc1、adp1、mpib、sya1、vps13和zwf1b基因片段的转录产物。

短语“确定对至少一种抗微生物剂的抗性”是指确定微生物对于抗微生物剂破坏的易感性。因此，如果微生物是细菌，其所针对而产生抗性的抗微生物剂是抗生素，如果是原生动物，所述抗微生物剂是抗寄生虫剂，如果是病毒，所述抗微生物剂是抗病毒剂，如果是酵母，所述抗微生物剂是抗真菌剂。参与抗性机制的蛋白质根据科和物种而有所不同。在细菌中使用的对于至少一种抗生素抗性的标记的非限制性实例是金黄色葡萄球菌的mecA基因的转录产物，赋予甲氧西林抗性，且使得可以显示出菌株是否是甲氧西林抗性的(MRSA菌株)还是甲氧西林敏感的(MSSA菌株)。也可以提及的是TEM-2蛋白质，其可以示出大肠杆菌菌株对于青霉素是否是抗性的，但是对于其它类抗生素如先锋霉素族抗生素或碳青霉烯类(carbapenems)敏感。另一标记是称作KPC(对于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)碳青霉烯酶(carbapenemase))的酶，其赋予对碳青霉烯类的抗性。金黄色葡萄球菌的抗性标记的另一实例是表达万古霉素抗性的代谢形式，如E.Alexander et al.,in the poster"Metabolomics-based approach toantibiotic resistance in Staphyloccocus aureus"presented at the ASMSconference,2009描述。原生动物中使用的至少一种抗寄生虫剂抗性的标记的非限制性实例是含铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和过氧化氧还蛋白(peroxyredoxin)，其增加的表达赋予甲硝唑(metronidazole)抗性。在病毒中使用的至少一种抗病毒剂抗性的标记的非限制性实例是人免疫缺陷病毒逆转录酶的突变，赋予对逆转录酶核苷抑制剂的敏感性降低。最后，酵母中使用的至少一种抗真菌剂抗性的标记的非限制性实例是白色念珠菌1,3-b-D-葡聚糖合成酶的突变，其赋予对棘球白素(echinocandins)敏感性降低。另一实例是在白色念珠菌中唑类抗真菌剂的抗性，特别是氟康唑(fluconazole)抗性。氟康唑的靶位是酶-羊毛甾醇去甲基酶，其参与麦角固醇的合成，麦角固醇是真菌壁的一种主要成分。对于氟康唑的抗性也许与在编码羊毛甾醇去甲基酶的erg11基因中出现点突变相关。

应注意抗性特异性标记也可以用作分型标记，如本申请人证实。

短语“确定微生物毒力”是指评估所述微生物的病原性、伤害性及毒力(violent)性质。细菌中毒力标记的非限制性实例是PVL(Panton-ValentineLeukocidin)，这是存在于金黄色葡萄球菌中的具有两个增效成分(LukFetLukS)的细胞溶解毒素，其是导致皮肤疾病、广泛蜂窝组织炎、骨髓炎和坏死性肺炎的最具毒性的毒素之一，且参与病毒双重感染。其它实例包含在肺炎链球菌中存在的自溶血素和肺炎球菌溶血素，其是与呼吸道感染、脑膜炎及菌血症相关的物种，以及艰难梭状芽孢杆菌毒素A和B，这是肠道共生细菌，其毒素导致肠上皮通透性改变(毒素A)，或者直接侵袭上皮细胞(毒素B)，或者随着时间而降低肠运输和肠吸收。导致腹泻(毒素A和B的组合作用)。也可以提及的是例如大肠杆菌中存在的Shiga毒素Stx1和Stx2。这两种细胞毒素被认为是肠出血性大肠杆菌的重要毒力因子。它们与并发症如溃疡性结肠炎或者溶血性尿毒症综合征相关。在原生动物中毒力标记的非限制性实例是在痢疾内阿米巴(Entamoeba histolytica)中存在的抗氧化剂(Fe-氢化酶2，过氧化还原酶，超氧化物歧化酶)，是与痢疾和肝脓肿相关的物种。在病毒中毒力标记的非限制性实例是1型人免疫缺陷病毒中的Nef蛋白质变体，是在人体中更具病原性的类型。最后，酵母中毒力标记的非限制性实例是白色念珠菌中脂肪酶8，这是对于浅表念珠菌感染相关的菌种，但是与念珠菌败血病和弥散性念珠菌病也相关。

应注意毒力特异性标记也可以用作分型标记，如本申请人证实。

本发明的方法可以用于鉴定细菌，所述抗微生物剂是抗生素，其构成本发明的一个实施方案。因此，例如可以提及的根据本发明的方法可以鉴定的细菌是：

-大肠杆菌，使用TEM-2作为抗性和分型标记，以及志贺毒素、OmpA作为毒力和分型标记。

-粪肠球菌和尿肠球菌，使用VanA和VanB作为抗性和分型标记，以及ESP (肠球菌表面蛋白)作为毒力和分型标记，

-金黄色葡萄球菌，使用已知为免疫球蛋白G-结合蛋白A的蛋白质(也称作蛋白质A)作为分型标记，PBP2a蛋白作为抗性标记或者甚至作为分型标记，以及PVL蛋白作为毒力标记或者甚至作为分型标记。

可以提及的根据本发明方法可以鉴定的其它微生物是：

-白色念珠菌，使用1,3-b-D-葡聚糖合成酶或者羊毛甾醇去甲基酶作为抗性和分型标记，以及脂肪酶8作为毒力和分型标记。

本发明方法使用的样品可以是能含有靶微生物的任何样品。所述样品可以是生物来源的，即源于动物、植物或者人。然后其可相应于生物体液样品(如全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、器官分泌物)、组织样品或者分离的细胞。只要鉴定所述微生物的标记在检测的样品中可获得或者在分析之前其可根据本领域技术人员已知的方法进行富集、提取、浓缩、纯化和/或培养类型制备，即可使用这种样品。

所述样品可以是工业来源的，即根据非穷举的列表，空气样品、水样品、取自表面、物体或生产的产品的的样品，或者食物来源的产品。在食物来源的样品中，非全部的可以提及的是乳制品样品(酸奶，奶酪)、肉制品、鱼制品、蛋制品、水果、蔬菜、水或者饮料(奶，果汁，苏打水等)。这些食物来源样品也可以来自调料或餐具。最后，食物样品可得自动物饲料(animalfeed)，如动物餐食(animal meals)。

当鉴定微生物的标记是蛋白质来源时，在通过质谱分析检测之前，优选将待分析的样品进行预处理，以从该样品中存在的所有蛋白质中产生肽，使这些蛋白质分解成肽，例如通过用分解蛋白质的酶(蛋白酶)消化，或者通过化学试剂的作用分解。事实上，蛋白质可以通过物理化学处理、通过生物学处理或者通过组合这两种处理方式而被裂解。在可以使用的处理中，可以提及的是羟基自由基，特别是H₂O₂。用羟基自由基处理导致肽键裂解，其随机发生在蛋白质的任何肽键上。羟基自由基的浓度调节所产生的裂解数目，因此调节所获得的肽的长度。也可以使用其它化学处理，例如用溴化氰(CNBr)处理，其在甲硫氨酰残基的羧基水平特异性破坏肽键。也可以通过在1000°C加热在三氟乙酸中蛋白质溶液而在天冬氨酰残基进行部分酸裂解。

然而，与通过物理化学方式处理相比，通过酶消化处理蛋白质是优选的，因为其更广泛地保护蛋白质结构，且易于控制。术语“酶消化”是指一或多种酶在合适的反应条件下的单一或组合作用。进行蛋白质分解的酶被称作蛋白酶，其在特定位点裂解蛋白质。每种蛋白酶通常识别这样的氨基酸序列，在其内总是进行相同裂解。某些蛋白酶识别单一氨基酸或者两个氨基酸的序列，在其间进行裂解，而其它蛋白酶仅识别较长的序列。这些蛋白酶可以是内切蛋白酶或者外切蛋白酶(exoproteases)。在已知的蛋白酶中，如在WO2005/098071中所述，可以提及的是：

-特异性酶，如胰蛋白酶，其在Arg和Lys残基的羧基基团水平分裂肽键；内溶素，其裂解赖氨酸-CO基团的肽键；糜蛋白酶，其在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)的羧基基团水平水解肽键；胃蛋白酶，其在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)的NH₂基团水平裂解；金黄色葡萄球菌的V8菌株的V8蛋白酶，其在Glu残基的羧基基团水平裂解肽键；

-非特异性酶，如源自嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)的嗜热菌蛋白酶，其水解疏水性氨基酸(Xaa-Leu、Xaa-Ile、Xaa-Phe)NH₂基团的肽键；枯草杆菌蛋白酶和链霉蛋白酶，其是细菌蛋白酶，实际上水解所有键，且在控制的反应条件(酶浓度和反应时间)下能将蛋白质转换为寡肽。

如果作用方法是相容的，一些蛋白酶可同时使用，或者可相继使用。在本发明中，样品的消化优选通过蛋白酶如胰蛋白酶的作用进行。

使用化学试剂或蛋白酶产生肽可以通过简便的反应在溶液中获得。也可以用微波炉进行^[11]，或者在压力下^[12]，或者使用超声装置进行^[13]。在后三种情况中，所述方案将更快。

在由此获得的肽中，特异于蛋白质的肽被称作蛋白酶解肽。这些将通过质谱分析测定。

根据本发明的一个实施方案，鉴定标记是被鉴定的微生物的蛋白质。特别地，所述蛋白质被消化成肽，优选用酶，更优选用胰蛋白酶。

相似地，含有蛋白质源鉴定标记的样品也可以进行预处理纯化。当所述标记是蛋白质源时，这种纯化预处理可以在如上述产生肽的步骤之前或之后进行。

样品纯化预处理为本领域技术人员已知，可特别提及的是离心、过滤、电泳或者色谱技术。这些分离技术可以单独或者彼此组合使用，以获得多维分离。例如，多维色谱可以通过组合离子交换色谱与反相色谱进行，如T.Fortin et al.^[14]或H.Keshishian et al.^[15]所述。在这些出版物中，色谱介质可以是在柱中或者在盒子(固相提取)中。

蛋白酶解肽的电泳或色谱级分(或者在一维或多维色谱中的保留时间)是每种肽的特征，这些技术的实施因此使得可以选择待测定的蛋白酶解肽。产生的肽的这种分级分离使得可以增加随后通过质谱分析测定的特异性。

用于肽分级分离的代替电泳或色谱技术的技术包括特异性纯化N-糖肽([16]及专利申请WO 2008/066629)。然而，这种纯化仅使得可以量化经历N-糖基化类型翻译后修饰的肽。然而，不是所有的蛋白质均是糖基化的，因此限制了其应用。

本发明方法中使用的质谱分析为本领域技术人员已知是分析和检测各种类型分子的一种有效方式。通常地，可以电离的任何类型分子均可以使用质谱分析仪根据其分子量进行检测。根据检测的蛋白质或代谢物源的分子的性质，某些质谱分析技术更适合。然而，无论用于检测的质谱分析方法如何，后者包括使靶分子电离为称作分子离子的离子的步骤，在这种情况中鉴定标记电离步骤，以及获得的分子离子根据其分子量分离的步骤。

因此所有质谱分析仪均包含：

i）用于使分析样品中存在的标记电离的电离来源，即为这些标记提供正电荷或负电荷；

ii）用于根据其质量-电荷比率(m/z)分离电离标记或者分子离子的质量分析仪；

iii）用于测量由分子离子或者由分子离子产生的离子直接产生的信号的检测仪，如后文详细描述。

实施质谱分析必需的电离步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。所述电离来源可以使测定的分子成为离子和气体状态。可以使用的电离来源是研究正离子的正离子模式，或者研究负离子的负离子模式。现有一些类型的来源，根据希望的结果和分子的分子选择使用。可以提及的是：

-电子电离(EI)、化学电离(CI)以及解吸-化学电离(DCI)，

-快速原子轰击(FAB)、可代谢的原子轰击,亚稳态原子轰击(MAB)或者离子轰击(SIMS，LSIMS)，

-电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma)(ICP),

-大气压化学电离(APCI)及大气压光化电离(APPI),

-电喷雾电离(ESI)，

-基质辅助激光解吸电离(MALDI)，表面增强的激光解吸电离(SELDI)或者在硅上解吸/电离(DIOS)，

-通过与亚稳态种类(metastable species)相互作用的电离-解吸(DART)。

特别地，电离可以如下所述进行：将含有靶分子的样品导入电离源中，在此所述分子被电离成气态，因此被转换成相应于原始分子的分子离子。电喷雾型电离源(ESI，ElectroSpray Ionisation)使得可以电离分子，同时使其从液态转换为气态。然后获得的分子离子在正离子模式(positive mode)中相应于液态存在的分子，具有一个、两个或者甚至三个或更多个另外的质子，因此携带一个、两个或者甚至三个或更多个电荷。例如，当靶分子是蛋白质时，在借助于以正离子模式运行的电喷雾类型电离源，在靶蛋白质分级分离后获得的蛋白酶解肽的电离产生气态的多肽离子，具有一个、两个或或者甚至三个或更多个另外的质子，其因此携带一个、两个或者甚至三个或更多个电荷，使得从液态改变为气态形式^[17]。当靶分子或获得的蛋白酶解肽预先通过反相液相色谱分离时，这种类型的电离源特别适合。然而，样品中存在的分子电离收率可以根据存在的各物种的浓度和性质而变化。这种现象导致为本领域技术人员已知的基质效应。

MALDI电离源使得可以在固态从样品中电离分子。

在其中根据质量/电荷比率(m/z)进行分离电离的标记的步骤的质量分析仪是本领域技术人员已知的任何质量分析仪。可以提及的是低分辨率分析仪，四极(Q)、3D离子阱(IT)或者线性离子阱(LIT)类型，也称作离子阱；以及高分辨率分析仪，以测量分析物的精确质量，其特别使用结合至电力区(electrical sector)的磁力区(magnetic sector)，飞行时间(TOF)。

根据m/z比率分离分子离子可以在单一时间实施(单一质谱分析或MS)，或者可以进行一些连续的MS分离。当进行两个连续MS分离时，该分析被称作MS/MS或MS²。但进行三个连续MS分离时，该分析被称作MS/MS/MS或MS³，及更通常地，但进行n次连续MS分离时，该分析被称作MSn。

在实施几次连续分离的技术中，在检测或测定单一靶分子的情况中的SRM(选择的反应监测)模式或者在检测或测定几个靶分子的情况中的MRM(多个反应监测)模式中，特别使用MS²分离。相似地，MRM³模式特别使用通过MS/MS/MS分离。然后使用靶向质谱分析。

在单一MS模式检测的情况中，获得的分子离子的质量/电荷比与被检测的靶分子相关。

在MS/MS模式检测的情况中，与MS测定相比基本上加上两个步骤，这两个步骤是：

i）使分子离子碎裂，然后称作先驱离子，以提供称作第一代碎片离子的离子，以及

ii）根据其质量(m/z)₂分离称作第一代碎片离子的离子，比率(m/z)₁相应于先驱离子的比率(m/z)。

然后将因此获得的第一代碎片离子的质量/电荷比率与被检测的靶分子相关。术语“第一代碎片离子”是指在碎裂步骤后得自先驱离子的离子，其质量与电荷比率m/z与先驱离子不同。

成对的(m/z)₁和(m/z)₂被称作跃迁(transition)，其代表被检测的特征性离子。

被检测的以与靶分子关联的特征性离子的选择由本领域技术人员根据标准方法进行。其选择有利地使得测定在再现性和可靠性方面尽可能地灵敏、尽可能地特异性及尽可能地稳健(robust)。在选择蛋白酶解肽(m/z)₁及第一代碎片(m/z)₂而揭示的方法中，所述选择基本上基于反应的强度。更详细的描述可参见V.Fusaro et al.^[18]。本领域技术人员可以使用商购的软件如得自Applied Biosystems或MRMaid^[19]的MIDAS软件和MRM Pilot软件，以使其预测所有可能的跃迁对(transition pairs)。也可以使用由F.Desiere etal.^[20]构建的称作PeptideAtlas的数据库，以汇编由科学界描述的所有肽MRM跃迁。这个PeptideAtlas数据库可以在互联网上免费获得。多于非蛋白质分子，可以使用数据库，如得自Applied Biosystems (United States ofAmerica)公司的通过Cliquid软件登陆的数据库。

选择蛋白酶解肽(m/z)₁和(m/z)₂的另一种方法包括使用基于其它研究获得的MS/MS碎裂谱。这些研究可以是例如通过蛋白质组分析揭示和鉴别生物标记。这种方法由Thermo Scientific在用户聚会期间提出^[19]。这使得可以通过SIEVE软件(Thermo Scientific)从实验性鉴别的肽中产生一列候选跃迁。针对(m/z)₁和(m/z)₂离子选择的某些标准已经由J.Mead et al.^[19]详细描述及在下文详细描述：

·应避免具有内部裂解位点、即具有内部赖氨酸或精氨酸的肽，除非所述赖氨酸或精氨酸随后是脯氨酸。

·应避免具有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因为其可以去氨基。

·应避免具有N-末端谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因为其可以自发环化。

·应避免具有甲硫氨酸的肽，因为其可以被氧化。

·应避免具有半胱氨酸的肽，因为其在可能的变性、还原和阻断硫醇功能的步骤期间可以被非再现地修饰。

·具有脯氨酸的肽被认为是有利的，因为其在MS/MS中通常产生具有非常占优势的单峰的密集(intense)碎片。然而，非常占优势的单一碎片不能确证在复杂混合物中跃迁的性质。事实上，仅同时存在一些特征性碎片才可以证实希望的先驱离子确实被检测。

·避免具有脯氨酸的肽，所述脯氨酸与C末端相邻(位置n-1)或者在与C末端相关的第二个位置(位置n-2)，因为在这种情况中，第一代碎片肽的大小通常被认为太小以至于不足以是特异性的。

·优选选择质量大于先驱的碎片，以提升特异性。为此，需要选择双电荷的先驱离子及选择质量大于先驱的最致密的第一代碎片，即单电荷的第一代碎片离子。

选择的先驱离子的碎裂是在碎裂池中进行，如三元四极型分析仪模型^[21]，或者离子阱型模型^[22]，或者飞行时间(TOF)型模型^[23]，这也可以分离离子。所述碎裂通常通过在电场中用惰性气体如氩气或氮气碰撞而进行，通过光激发或光解离，使用强光源，用电子或自由基碰撞，应用电位差，例如在飞行时间管中，或者通过任何其它激活模式。电场的特征限制碎裂的强度和性质。因此，在例如四极分析仪中在存在惰性气体条件下施加的电场限制提供给离子的碰撞能量。这种碰撞能量可以由本领域技术人员优化，以增加被测定的跃迁(transition)的敏感性。例如，在得自Applied Biosystems公司(Foster City，United States of America)的AB SCIEX

5500质谱分析仪的q2中，可以改变碰撞能量为5-180e-V。相似地，碰撞步骤的时序时间及如在离子阱内的激发能量可以由本领域技术人员优化，以产生最敏感的测定。例如，在得自Applied Biosystems公司的AB SCIEX

5500质谱分析仪的Q3中，可以改变重编称作激发时间的这个持续时间为0.010-50ms，及激发能量为0-1(任意单位)。

最后，常规进行选择的特征性离子的检测，特别是通过检测仪和加工系统进行。所述检测仪收集离子并产生电子信号，其强度依赖于收集的离子的量。然后将获得的信号扩大以便可以通过计算机处理。处理数据的计算机装备使得可以将由检测仪接受的信息转换为质谱。

SRM模式或MRM模式的原理是特异性选择先驱离子，使其碎裂，然后特异性选择其碎片离子之一。对于这种应用，通常使用三元四极分析仪型或者三元四极-离子阱混合装置。

在MS²模式使用的三元四极分析仪(triple quadrupole)装置(Q1q2Q3)的情况中，为了测定或检测靶蛋白质，第一个四极分析仪(Q1)可以根据其质量与电荷的比率(m/z)过滤分子离子，相应于在先前的消化步骤期间测定和获得的蛋白质特征性蛋白酶解肽。仅具有蛋白酶解肽的质量/电荷比率为(m/z)₁的肽被传递至第二个四极分析仪(q2)并发挥先驱离子作用以进行随后的碎裂。q2分析仪可以使质量/电荷比率为(m/z)₁的肽碎裂成第一代碎片离子。所述碎裂通常通过在q2中用惰性气体如氮气或氩气碰撞前体肽而获得。第一代碎片离子被传递至第三个四极分析仪(Q3)，其根据特定的质量与电荷比率过滤第一代碎片离子，该比率称作(m/z)₂。仅具有所述蛋白酶解肽的特征性碎片的质量/电荷比率(m/z)₂的第一代碎片离子被传递至检测仪进行检测，或者甚至量化。

这种操作模式具有双重选择性，一方面，关于选择先驱离子，另一方面关于选择第一代碎片离子。SRM或MRM模式中的质谱分析因此有利于量化。

当本发明方法中的质谱分析是串联质谱分析(MS²、MS³、MS⁴或MS⁵)时，可以将一些质谱分析仪结合在一起。例如，第一个分析仪分离离子，碰撞室(collision cell)使得离子碎裂，第二个分析仪分离碎裂的离子。一些分析仪如离子阱或FT-ICR组合几个分析仪为一体，及使得可以碎裂离子并直接分析所得碎片。

根据本发明的优选实施方案，本发明的方法包括一或多个如下特征：

-质谱分析，用于确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，其是MS/MS型质谱分析，具有产生特异于被检测或量化的分子的碎片及因此提供具有更高特异性的测定方法的优势；

-所述MS/MS质谱分析是MRM，其具有使用在质谱分析仪中几十毫秒的分析循环时间的优势，使得可以高灵敏性检测或量化，及以多元方式检测或量化大量不同分子；

-确定分型、对抗微生物剂的抗性和毒力因子的性质是在同一质谱分析仪中进行，优选同时进行，其具有减少分析时间及仪器成本的优势，这也便于结果的处理和报告。

除了确定分型、对于抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质之外，可以鉴别检测样品中存在的微生物。

鉴别微生物的方法为本领域技术人员熟知，如P.R.Murray el al.,inManual of Clinical Microbiology，2007,9th edition,and in particular in Vol.I,Section III,chapters 15 and 16 for bacteria and yeasts,Vol.II,Section VI,chapter 82 for viruses,and Vol.II,Section X,chapter 135 for protozoa所述。对于常规的鉴别方法，可以提及的是确定生物谱，使用如Vitek 2鉴别卡(bioMérieux)，或者使用具有鉴别标准的分子生物学技术，基于研究某些基因的存在及基于研究其序列而进行。

所述鉴别可以从在其中进行鉴别的样品中直接进行，或者样品中含有的微生物可以使用根据所述微生物物种适合的培养基和最佳培养条件通过本领域技术人员熟知的方法培养，如P.R.Murray et al.,in Manual of ClinicalMicrobiology,2007,9th edition,Vol.I,Section III,chapter 14,in particular inVol.I,Section IV，chapter 21 for bacteria,Vol.II,Section VI,chapter 81 forviruses,Vol.II,Section VIII,chapter 117 for yeasts,and Vol.II,Section X,chapter 134 for protozoa所述。

因此，通常在通过生物化学方法鉴别样品中细菌的情况中，首先需要其得以纯化培养，例如在琼脂上接种之后。在某些情况中可以对被分析的样品直接应用分子生物学技术(PCR)。

代替培养微生物，后者可以通过活性表面在样品中直接捕获而浓缩。这种方法已经由W.-J.Chen et al.^[11]描述，其通过磁珠用Fe₃O₄/TiO₂-激活的表面捕获了各种细菌物种。通过其它方式捕获也是可以的，如通过凝集素捕获^[24]，或者通过抗体捕获^[25]，或者通过万古霉素捕获^[26]。所述捕获使得可以浓缩微生物，及因此减少或者甚至消除培养步骤。这样使得明显节省时间。

所述鉴别也可以通过先前描述的质谱分析技术进行，优选通过MS、MS/MS或者通过MS及随后的MS/MS型质谱分析进行，这些技术组成本发明的一个实施方案。在这种情况中，样品可以预先进行培养步骤，如在琼脂上接种。

使用MS鉴别方法是有利的，因此其可以在几分钟内进行，及其需要具有单一分析仪的质谱分析仪，即与在MS/MS中使用的串联质谱分析仪相比复杂性降低的仪器。

使用MS鉴别方法及随后MS/MS型质谱分析也是有利的。这样可以保证鉴别在MS中观测到的离子的身份，这样增加了分析的特异性。

使用MRM型的MS/MS鉴别方法与常规MS及MS/MS方法具有更敏感和更简便的优势。这种方法既不需要有效软件处理获得MS质谱与MS/MS质谱之间的信息，也不需要调节连接MS与MS/MS质谱的机械参数中的任何改变。

通过MS的鉴别方法可以用在粗制样品上的电喷雾源进行，如S.Vaidyanathan et al.^[27]所述，或者如R.Everley et al.^[8]所述在色谱分离之后进行。不同范围的m/z使得可以鉴别微生物。S.Vaidyanathan等使用在200-2000Th之间的窗，R.Everley等使用在620-2450Th之间的窗。也可以对质谱进行去卷积(deconvoluted)，以评定与其电荷状态无关的蛋白质质量。R.Everley等因此利用在大约5000-50000Da之间的质量。或者，通过MS的鉴别模式也可以通过MALDI-TOF进行，如Claydon et al.^[3]和T.Krishnamurthy and P.Ross ^[4]所述。所述分析组合质谱的获得及通过专门的软件解释。这种方法是非常简便的，且可以在几分钟内进行。目前在医学检验实验室中开展这种鉴别方法^[28]。

通过MS及随后MS/MS通过样品中存在的其蛋白质鉴别细菌已经由许多小组广泛应用。例如可以提及的是由N.Manes et al.^[29]最近进行的研究，其研究了肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)的肽组(peptidome)，或者由R.Nandakumar et al.^[30]或L.Hernychova et al.^[31]进行的研究，其研究了在用胰蛋白酶消化蛋白质之后细菌的蛋白质组。常规的方法包括：i)获得MS质谱，ii)连续选择在MS质谱上观测到的具有强烈信号的每种先驱离子，iii)使每种先驱离子连续碎裂及获得其MS/MS质谱，iv)通过软件如Mascot(Matrix Science,London,United Kingdom)或SEQUEST(Thermo Scientific,Waltham,United States of America)搜索蛋白质数据库如SWISS-PROT或NCBI，以鉴别具有相应于观测到的MS/MS质谱的强概率的肽。如果鉴别了物种的特征性蛋白质或肽，则这种方法可以鉴别微生物。

根据另一实施方案，所述至少一种微生物的鉴别是通过常规鉴别方法进行的，本发明的方法包括证实所述至少一种微生物的鉴别的额外步骤，所述证实步骤根据先前描述的鉴别微生物的技术通过质谱分析进行。

根据一个特殊的实施方案，证实步骤的质谱分析是MS/MS型质谱分析，优选MRM。

使用质谱分析的一个优势在于这样的事实，即其特别适用于量化分子，在本发明中是分型及对于至少一种抗微生物剂的抗性的性质的标记。为此，使用与靶分子的量成比例的检测的电流强度。由此测量的电流强度可作为确定存在的靶分子的量的定量测量，其特征在于以国际系统(SI)单位mol/m³或kg/m³类型，或者这些单位的倍数或约数，或者SI单位的通常导数(usualderivative)，包括其倍数或约数。非限制性例如单位如ng/ml或fmol/l是鉴定定量测量的单位。

然而，校准是必需的，以能使相应于由检测的离子诱导的电流强度的测量的峰面积与测定的靶分子的量相关。为此，在本发明中可以实施在质谱分析中常规使用的校准。MRM测定常规使用外部标准校准，或者优选使用如T.Fortin et al.^[14]描述的内部标准校准。当靶分子是蛋白酶解肽时，可以测定感兴趣的蛋白质，使定量测量与靶蛋白酶解肽及因此的感兴趣的蛋白质的量之间的相关性通过校准相对于测定量已知的标准信号测量的信号获得。所述校准可以利用校准曲线进行，例如通过连续注射不同浓度的标准的蛋白酶解肽(外部校准)或者优选通过使用重肽作为内部标准的内部校准获得，例如根据后文详述的AQUA、QconCAT或PSAQ方法。术语“重肽”是指相应于蛋白酶解肽的肽，但其中一或多个碳12(¹²C)原子由碳13(¹³C)置换，和/或一或多个氮14(¹⁴N)原子由氮15(¹⁵N)置换。

使用重肽作为内部标准(AQUA)也已经在专利申请US 2004/0229283中提议。原理是人工合成蛋白酶解肽，其具有包含比通常的天然同位素重的同位素的氨基酸。这种氨基酸例如通过用碳13(¹³C)置换一些碳1212(¹²C)原子，或者通过用氮1515(¹⁵N)置换一些氮1414(¹⁴N)原子而获得。由此合成的人工肽(AQUA)与天然肽具有严格相同的物理化学性质(除了较高质量之外)。其通常以指定浓度在质谱分析测定之前加入样品中，例如在使感兴趣的样品的蛋白质裂解的处理与在所述处理步骤之后获得的肽的分级分离之间进行。结果，AQUA肽与待测定的天然肽在所述肽的分级分离期间共纯化。这两个肽因此被同时注射进质谱分析仪中进行测定。它们然后在电离源中经历相同的电离收率(ionization yield)。对比天然与AQUA肽的峰面积，其浓度已知，由此可计算天然肽的浓度，及因此推出测定的蛋白质的浓度。AQUA技术的一种变化方式由J.-M.Pratt et al.^[32]以QconCat名称提议。这种变化方式也在专利申请WO 2006/128492中描述。其在于并置各种AQUA肽及产生重重组蛋白质形式的人工多肽。合成所述重组蛋白质，其具有包含重同位素的氨基酸。以此方式，可以获得校准以较低成本同时测定多个蛋白质的标准。QconCAT标准在开始时、在使得蛋白质裂解的处理之前及在蛋白质分级分离、变性、还原及随后阻断蛋白质的硫醇官能团的步骤之前加入，如果这些步骤存在的话。因此，QconCAT标准经历与天然蛋白质相同的导致蛋白质裂解的处理循环，从而可以考虑从导致蛋白质裂解的处理步骤中的收率。这是因为天然蛋白质的处理、特别是消化是不全的。在这种情况中，使用AQUA标准将获得低于估计值的天然蛋白质的量。对于绝对测定，因此重要的是考虑来自导致蛋白质裂解的处理的收率。然而，V.Brun et al.^[33]已经示出有时QconCAT标准不精确再现来自天然蛋白质处理、特别是消化的收率，无疑是由于QconCAT蛋白质的不同三维构象所致。

V.Brun等^[33]因此提议使用称作PSAQ的方法，其在专利申请WO2008/145763中描述。在这种情况中，内部标准是重组蛋白质，其具有与天然蛋白质相同的序列，但是已经被合成为具有重氨基酸。所述合成是在离体用重氨基酸进行。这个标准具有与天然蛋白质严格相同的物理化学性质(除了较高的质量之外)。其在从开始时在蛋白质分级分离步骤(当所述步骤存在时)之前加入。因此在蛋白质分级分离步骤期间其与天然蛋白质共纯化。其在经处理、特别是通过消化处理呈现出与天然蛋白质相同收率。如果进行肽分级分离步骤的话，在裂解后获得的重肽也与天然肽共纯化。这两个肽因此被同时注射进质谱分析仪中，以进行量化测定。它们然后在电离源中经历相同的电离收率。在PSAQ方法中对比天然肽与参考肽的峰面积使得可以计算测定的蛋白质浓度及考虑到测定方法的所有步骤。

所有这些技术，即AQUA、QconCAT或PSAQ或者用于通过质谱分析的测定及特别是在MRM或MS测定中使用的任何其它校准技术均可以用于在本发明中进行校准(calibration)。

根据一个优选的实施方案，本发明的方法可以鉴定金黄色葡萄球菌。特别地，金黄色葡萄球菌的鉴定使用如下至少一种肽：

1.分型

属于具有如下SEQ ID No.1序列的蛋白质A：

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.2、3、4、5、6、7和8所示序列的肽。

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.1中的位置
			2	DDPSQSANVLGEAQK	70-84
3	DQQSAFYEILNMPNLNEEQR	103-122
			4	DDPSQSTNVLGEAK	131-144
5	EQQNAFYEILNMPNLNEEQR	161-180
			6	DDPSQSANLLAEAK	189-202
7	DDPSVSK	305-311
			8	IAADNK	437-442

2.对于至少一种抗生素的潜在抗性

属于具有如下SEQ ID No.9序列的PBP2a蛋白质的至少一种肽：

MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKDSSYISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGVKDINIQDRKIKKVSKNKKRVDAQYKIKTNYGNIDRNVQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENLKSERGKILDRNNVELANTGTAYEIGIVPKNVSKKDYKAIAKELSISEDYIKQQMDQNWVQDDTFVPLKTVKKMDEYLSDFAKKFHLTTNETESRNYPLEKATSHLLGYVGPINSEELKQKEYKGYKDDAVIGKKGLEKLYDKKLQHEDGYRVTIVDDNSNTIAHTLIEKKKKDGKDIQLTIDAKVQKSIYNNMKNDYGSGTAIHPQTGELLALVSTPSYDVYPFMYGMSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTAMIGLNNKTLDDKTSYKIDGKGWQKDKSWGGYNVTRYEVVNGNIDLKQAIESSDNIFFARVALELGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPFYNAQISNKNLDNEILLADSGYGQGEILINPVQILSIYSALENNGNINAPHLLKDTKNKVWKKNIISKENINLLTDGMQQVVNKTHKEDIYRSYANLIGKSGTAELKMKQGETGRQIGWFISYDKDNPNMMMAINVKDVQDKGMASYNAKISGKVYDELYENGNKKYDIDE

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.10-17序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.9中位置
			10	IYNSLGVK	69-76
11	DINIQDR	77-83
			12	ELSISEDYIK	189-198
13	FQITTSPGSTQK	395-406
			14	ILTAMIGLNNK	407-417
15	YEVVNGNIDLK	446-456
			16	VALELGSK	470-477
17	SYANLIGK	590-597

3.毒力

属于分别具有如下SEQ ID No.18和22序列的PVL蛋白质亚基LukS和LukF的至少一种肽：

SEQ ID No.18:

MIFMVKKRLLAATLSLGIITPIATSFHESKADNNIENIGDGAEVVKRTEDTSSDKWGVTQNIQVDFVKDKKYNKDALILKMQGFINSKTTYYNYKNTDHIKAMRWPFQYNIGLKTNDPNVDLINYLPKNKIDSVNVSQTLGYNIGGNFNSGPSTGGNGSFNYSKTISYNQQNYISEVERQNSKSVQWGIKANSFITSLGKMSGHDPNLFVGYKPYSQNPRDYFVPDNELPPLVHSGFNPSFIATVSHEKGSGDTSEFEITYGRNMDVTHATRRTTHYGNSYLEGSRIHNAFVNRNYTVKYEVNWKTHEIKVKGHN

SEQ ID No.22:

MKKIVKSSVVTSIALLLLSNTVDAAQHITPVSEKKVDDKITLYKTTATSDSDKLKISQILTFNFIKDKSYDKDTLILKAAGNIYSGYTKPNPKDTISSQFYWGSKYNISINSDSNDSVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTVGYSYGGDINISNGLSGGGNGSKSFSETINYKQESYRTSLDKRTNFKKIGWDVEAHKIMNNGWGPYGRDSYHSTYGNEMFLGSRQSNLNAGQNFLEYHKMPVLSRGNFNPEFIGVLSRKQNAAKKSKITVTYQREMDRYTNFWNQLHWIGNNYKDENRATHTSIYEVDWENHTVKLIDTQSKEKNPMS

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.19、20、21、23和24序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.18中位置
			19	TNDPNVDLINYLPK	115-128
20	SVQWGIK	184-190
			21	ANSFITSLGK	191-200
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.22中位置
			23	MPVLSR	237-242
24	GNFNPEFIGVLSR	243-255

4.鉴别

属于如下蛋白质的至少一种肽：50S核糖体蛋白L30(RL30)，50S核糖体蛋白L331(RL331)，葡萄球菌分泌抗原ssaA2(SSAA2)，UPF0337蛋白SA0772(Y772)，双功能自溶素(ATL)，延长因子Tu(EFTU)，可能的转糖基酶isaA(ISAA)以及UPF0457蛋白SA1975.1(Y197A)，其分别具有如下序列SEQ ID No.25、28、31、33、36、39、41和43。

SEQ ID No.25:

MAKLQITLTRSVIGRPETQRKTVEALGLKKTNSSVVVEDNPAIRGQINKVKHLVTVEEK

SEQ ID No.28:

MRVNVTLACTECGDRNYITTKNKRNNPERVEMKKFCSRENKQTLHRETK

SEQ ID No.31:

MKKIATATIATAGFATIAIASGNQAHASEQDNYGYNPNDPTSYSYTYTIDAQGNYHYTWKGNWHPSQLNQDNGYYSYYYYNGYNNYNNYNNGYSYNNYSRYNNYSNNNQSYNYNNYNSYNTNSYRTGGLGASYSTSSNNVQVTTTMAPSSNGRSISSGYTSGRNLYTSGQCTYYVFDRVGGKIGSTWGNASNWANAAARAGYTVNNTPKAGAIMQTTQGAYGHVAYVESVNSNGSVRVSEMNYGYGPGVVTSRTISASQAAGYNFIH

SEQ ID No.33:

MADESKFEQAKGNVKETVGNVTDNKNLENEGKEDKASGKAKEFVENAKEKATDFIDKVKGNKGE

SEQ ID No.36:

MAKKFNYKLPSMVALTLVGSAVTAHQVQAAETTQDQTTNKNVLDSNKVKATTEQAKAEVKNPTQNISGTQVYQDPAIVQPKTANNKTGNAQVSQKVDTAQVNGDTRANQSATTNNTQPVAKSTSTTAPKTNTNVTNAGYSLVDDEDDNSEHQINPELIKSAAKPAALETQYKAAAPKAKTEATPKVTTFSASAQPRSVAATPKTSLPKYKPQVNSSINDYIRKNNLKAPKIEEDYTSYFPKYAYRNGVGRPEGIVVHDTANDRSTINGEISYMKNNYQNAFVHAFVDGDRIIETAPTDYLSWGVGAVGNPRFINVEIVHTHDYASFARSMNNYADYAATQLQYYGLKPDSAEYDGNGTVWTHYAVSKYLGGTDHADPHGYLRSHNYSYDQLYDLINEKYLIKMGKVAPWGTQFTTTPTTPSKPTTPSKPSTGKLTVAANNGVAQIKPTNSGLYTTVYDKTGKATNEVQKTFAVSKTATLGNQKFYLVQDYNSGNKFGWVKEGDVVYNTAKSPVNVNQSYSIKSGTKLYTVPWGTSKQVAGSVSGSGNQTFKASKQQQIDKSIYLYGSVNGKSGWVSKAYLVDTAKPTPTPIPKPSTPTTNNKLTVSSLNGVAQINAKNNGLFTTVYDKTGKPTKEVQKTFAVTKEASLGGNKFYLVKDYNSPTLIGWVKQGDVIYNNAKSPVNVMQTYTVKPGTKLYSVPWGTYKQEAGAVSGTGNQTFKATKQQQIDKSIYLFGTVNGKSGWVSKAYLAVPAAPKKAVAQPKTAVKAYTVTKPQTTQTVSKIAQVKPNNTGIRASVYEKTAKNGAKYADRTFYVTKERAHGNETYVLLNNTSHNIPLGWFNVKDLNVQNLGKEVKTTQKYTVNKSNNGLSMVPWGTKNQVILTGNNIAQGTFNATKQVSVGKDVYLYGTINNRTGWVNAKDLTAPTAVKPTTSAAKDYNYTYVIKNGNGYYYVTPNSDTAKYSLKAFNEQPFAVVKEQVINGQTWYYGKLSNGKLAWIKSTDLAKELIKYNQTGMTLNQVAQIQAGLQYKPQVQRVPGKWTDANFNDVKHAMDTKRLAQDPALKYQFLRLDQPQNISIDKINQFLKGKGVLENQGAAFNKAAQMYGINEVYLISHALLETGNGTSQLAKGADVVNNKVVTNSNTKYHNVFGIAAYDNDPLREGIKYAKQAGWDTVSKAIVGGAKFIGNSYVKAGQNTLYKMRWNPAHPGTHQYATDVDWANINAKIIKGYYDKIGEVGKYFDIPQYK

SEQ ID No.39:

MAKEKFDRSKEHANIGTIGHVDHGKTTLTAAIATVLAKNGDSVAQSYDMIDNAPEEKERGITINTSHIEYQTDKRHYAHVDCPGHADYVKNMITGAAQMDGGILVVSAADGPMPQTREHILLSRNVGVPALVVFLNKVDMVDDEELLELVEMEVRDLLSEYDFPGDDVPVIAGSALKALEGDAQYEEKILELMEAVDTYIPTPERDSDKPFMMPVEDVFSITGRGTVATGRVERGQIKVGEEVEIIGLHDTSKTTVTGVEMFRKLLDYAEAGDNIGALLRGVAREDVQRGQVLAAPGSITPHTEFKAEVYVLSKDEGGRHTPFFSNYRPQFYFRTTDVTGVVHLPEGTEMVMPGDNVEMTVELIAPIAIEDGTRFSIREGGRTVGSGVVTEIIK

SEQ ID No.41:

MKKTIMASSLAVALGVTGYAAGTGHQAHAAEVNVDQAHLVDLAHNHQDQLNAAPIKDGAYDIHFVKDGFQYNFTSNGTTWSWSYEAANGQTAGFSNVAGADYTTSYNQGSNVQSVSYNAQSSNSNVEAVSAPTYHNYSTSTTSSSVRLSNGNTAGATGSSAAQIMAQRTGVSASTWAAIIARESNGQVNAYNPSGASGLFQTMPGWGPTNTVDQQINAAVKAYKAQGLGAWGF

SEQ ID No.43:

MAMTVKKDNNEVRIQWRVADIKIPTSEIKNITQDQDIHAVPKLDSKDVSRIGSTFGKTNRVIIDTEDHEYIIYTQNDQKVYNELTK

所述肽优选选自如后文定义的具有序列SEQ ID No.26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44和45的肽。

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.25中位置
			26	LQITLTR	4-10
27	TNSSVVVEDNPAIR	31-34
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.28中位置
29	VNVTLACTECGDR	3-15
			30	NYITTK	16-21
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.31中位置
			32	AGYTVNNTPK	200-209
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.33中位置
			34	EFVENAKEK	42-50
35	ATDFIDKVK	51-59
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.36中位置
37	LYSVPWGTYK	696-705
			38	AYLAVPAAPK	747-756
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.39中位置
			40	TVGSGVVTEIIK	383-394
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.41中位置
			42	LSNGNTAGATGSSAAQ-IMAQR	148-168
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.43中位置
			44	NITQDQDIHAVPK	30-42
45	LDSKDVSR	43-50

应注意，如前所述，对于分型而言，本发明的方法也可使用具有SEQ IDNo.:10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44和45所示序列的至少一种肽，其用于确定对于至少一种抗生素的潜在抗性或者毒力因子，如先前所述。

当然，术语“至少一种肽”是指代表希望检测的标记的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或者更多种肽。优选地，每个特征使用至少两种或者甚至至少三种、或者甚至至少四种肽。

根据另一优选的实施方案，本发明的方法可以鉴定大肠杆菌。

特别地，大肠杆菌的鉴定使用如下至少一种肽：

1.分型

属于如下的至少一种肽：天冬氨酸氨-裂解酶蛋白(ASPA)，ATP合成酶α亚基(ATPA)，10kDa伴侣蛋白(CH10)，60kDa伴侣蛋白(CH60)，DNA-结合蛋白HU-β(DBHB)，谷氨酸脱羧酶(DCEB)，琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基(DHSA)，在饥饿蛋白期间DNA保护(DPS)，DNA-结合蛋白H-NS(HNS)，苹果酸脱氢酶(MDH)，磷酸甘油酸激酶(PGK)，磷酸核糖酰氨咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶(PUR7)，50S核糖体蛋白L4(RL4)，30S核糖体蛋白S1(RS1)，UPF0076蛋白yjgF(YJGF)，其分别具有如下SEQ ID No.138-152所示序列：

SEQ ID No.138

MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ

SEQ ID No.139

MQLNSTEISELIKQRIAQFNVVSEAHNEGTIVSVSDGVIRIHGLADCMQGEMISLPGNRYAIALNLERDSVGAVVMGPYADLAEGMKVKCTGRILEVPVGRGLLGRVVNTLGAPIDGKGPLDHDGFSAVEAIAPGVIERQSVDQPVQTGYKAVDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTALAIDAIINQRDSGIKCIYVAIGQKASTISNVVRKLEEHGALANTIVVVATASESAALQYLAPYAGCAMGEYFRDRGEDALIIYDDLSKQAVAYRQISLLLRRPPGREAFPGDVFYLHSRLLERAARVNAEYVEAFTKGEVKGKTGSLTALPIIETQAGDVSAFVPTNVISITDGQIFLETNLFNAGIRPAVNPGISVSRVGGAAQTKIMKKLSGGIRTALAQYRELAAFSQFASDLDDATRKQLDHGQKVTELLKQKQYAPMSVAQQSLVLFAAERGYLADVELSKIGSFEAALLAYVDRDHAPLMQEINQTGGYNDEIEGKLKGILDSFKATQSW

SEQ ID No.140

MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA

SEQ ID No.141

MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMGGMGGMGGMM

SEQ ID No.142

MNKSQLIDKIAAGADISKAAAGRALDAIIASVTESLKEGDDVALVGFGTFAVKERAARTGRNPQTGKEITIAAAKVPSFRAGKALKDAVN

SEQ ID No.143

MDKKQVTDLRSELLDSRFGAKSISTIAESKRFPLHEMRDDVAFQIINDELYLDGNARQNLATFCQTWDDENVHKLMDLSINKNWIDKEEYPQSAAIDLRCVNMVADLWHAPAPKNGQAVGTNTIGSSEACMLGGMAMKWRWRKRMEAAGKPTDKPNLVCGPVQICWHKFARYWDVELREIPMRPGQLFMDPKRMIEACDENTIGVVPTFGVTYTGNYEFPQPLHDALDKFQADTGIDIDMHIDAASGGFLAPFVAPDIVWDFRLPRVKSISASGHKFGLAPLGCGWVIWRDEEALPQELVFNVDYLGGQIGTFAINFSRPAGQVIAQYYEFLRLGREGYTKVQNASYQVAAYLADEIAKLGPYEFICTGRPDEGIPAVCFKLKDGEDPGYTLYDLSERLRLRGWQVPAFTLGGEATDIVVMRIMCRRGFEMDFAELLLEDYKASLKYLSDHPKLQGIAQQNSFKHT

SEQ ID No.144

MKLPVREFDAVVIGAGGAGMRAALQISQSGQTCALLSKVFPTRSHTVSAQGGITVALGNTHEDNWEWHMYDTVKGSDYIGDQDAIEYMCKTGPEAILELEHMGLPFSRLDDGRIYQRPFGGQSKNFGGEQAARTAAAADRTGHALLHTLYQQNLKNHTTIFSEWYALDLVKNQDGAVVGCTALCIETGEVVYFKARATVLATGGAGRIYQSTTNAHINTGDGVGMAIRAGVPVQDMEMWQFHPTGIAGAGVLVTEGCRGEGGYLLNKHGERFMERYAPNAKDLAGRDVVARSIMIEIREGRGCDGPWGPHAKLKLDHLGKEVLESRLPGILELSRTFAHVDPVKEPIPVIPTCHYMMGGIPTKVTGQALTVNEKGEDVVVPGLFAVGEIACVSVHGANRLGGNSLLDLVVFGRAAGLHLQESIAEQGALRDASESDVEASLDRLNRWNNNRNGEDPVAIRKALQECMQHNFSVFREGDAMAKGLEQLKVIRERLKNARLDDTSSEFNTQRVECLELDNLMETAYATAVSANFRTESRGAHSRFDFPDRDDENWLCHSLYLPESESMTRRSVNMEPKLRPAFPPKIRTY

SEQ ID No.145

MSTAKLVKSKATNLLYTRNDVSDSEKKATVELLNRQVIQFIDLSLITKQAHWNMRGANFIAVHEMLDGFRTALIDHLDTMAERAVQLGGVALGTTQVINSKTPLKSYPLDIHNVQDHLKELADRYAIVANDVRKAIGEAKDDDTADILTAASRDLDKFLWFIESNIE

SEQ ID No.146

MSEALKILNNIRTLRAQARECTLETLEEMLEKLEVVVNERREEESAAAAEVEERTRKLQQYREMLIADGIDPNELLNSLAAVKSGTKAKRAQRPAKYSYVDENGETKTWTGQGRTPAVIKKAMDEQGKSLDDFLIKQ

SEQ ID No.147

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDATPALEGANVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAAEVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGVSFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAYVEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEKNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

SEQ ID No.148

MSVIKMTDLDLAGKRVFIRADLNVPVKDGKVTSDARIRASLPTIELALKQGAKVMVTSHLGRPTEGEYNEEFSLLPVVNYLKDKLSNPVRLVKDYLDGVDVAEGELVVLENVRFNKGEKKDDETLSKKYAALCDVFVMDAFGTAHRAQASTHGIGKFADVACAGPLLAAELDALGKALKEPARPMVAIVGGSKVSTKLTVLDSLSKIADQLIVGGGIANTFIAAQGHDVGKSLYEADLVDEAKRLLSTCNIPVPSDVRVATEFSETAPATLKSVNDVKADEQILDIGDASAQELAEILKNAKTILWNGPVGVFEFPNFRKGTEIVANAIADSEAFSIAGGGDTLAAIDLFGIADKISYISTGGGAFLEFVEGKVLPAVAMLEERAKK

SEQ ID No.149

MQKQAELYRGKAKTVYSTENPDLLVLEFRNDTSAGDGARIEQFDRKGMVNNKFNYFIMSKLAEAGIPTQMERLLSDTECLVKKLDMVPVECVVRNRAAGSLVKRLGIEEGIELNPPLFDLFLKNDAMHDPMVNESYCETFGWVSKENLARMKELTYKANDVLKKLFDDAGLILVDFKLEFGLYKGEVVLGDEFSPDGSRLWDKETLEKMDKDRFRQSLGGLIEAYEAVARRLGVQLD

SEQ ID No.150

MELVLKDAQSALTVSETTFGRDFNEALVHQVVVAYAAGARQGTRAQKTRAEVTGSGKKPWRQKGTGRARSGSIKSPIWRSGGVTFAARPQDHSQKVNKKMYRGALKSILSELVRQDRLIVVEKFSVEAPKTKLLAQKLKDMALEDVLIITGELDENLFLAARNLHKVDVRDATGIDPVSLIAFDKVVMTADAVKQVEEMLA

SEQ ID No.151

MTESFAQLFEESLKEIETRPGSIVRGVVVAIDKDVVLVDAGLKSESAIPAEQFKNAQGELEIQVGDEVDVALDAVEDGFGETLLSREKAKRHEAWITLEKAYEDAETVTGVINGKVKGGFTVELNGIRAFLPGSLVDVRPVRDTLHLEGKELEFKVIKLDQKRNNVVVSRRAVIESENSAERDQLLENLQEGMEVKGIVKNLTDYGAFVDLGGVDGLLHITDMAWKRVKHPSEIVNVGDEITVKVLKFDRERTRVSLGLKQLGEDPWVAIAKRYPEGTKLTGRVTNLTDYGCFVEIEEGVEGLVHVSEMDWTNKNIHPSKVVNVGDVVEVMVLDIDEERRRISLGLKQCKANPWQQFAETHNKGDRVEGKIKSITDFGIFIGLDGGIDGLVHLSDISWNVAGEEAVREYKKGDEIAAVVLQVDAERERISLGVKQLAEDPFNNWVALNKKGAIVTGKVTAVDAKGATVELADGVEGYLRASEASRDRVEDATLVLSVGDEVEAKFTGVDRKNRAISLSVRAKDEADEKDAIATVNKQEDANFSNNAMAEAFKAAKGE

SEQ ID No.152

MSKTIATENAPAAIGPYVQGVDLGNMIITSGQIPVNPKTGEVPADVAAQARQSLDNVKAIVEAAGLKVGDIVKTTVFVKDLNDFATVNATYEAFFTEHNATFPARSCVEVARLPKDVKIEIEAIAVRR

所述肽优选选自具有如后文定义的具有SEQ ID No.67-84所示序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.138中的位置
			67	ISDIPEFVR	41-49
68	IEEDLLGTR	7-15
			69	LVDAINQLR	163-171
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.139中的位置
			70	TALAIDAIINQR	176-187
71	VVNTLGAPIDGK	107-118
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.140中的位置
72	SAGGIVLTGSAAAK	21-34
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.141中的位置
73	AVTAAVEELK	123-132
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.142中的位置
74	ALDAIIASVTESLK	24-37
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.143中的位置
75	YWDVELR	172-178
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.144中的位置
76	LPGILELSR	327-335

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.145中的位置
			77	SKATNLLYTR	9-18
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.146中的位置
			78	SEALKILNNIR	2-12
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.147中的位置
			79	LFGVTTLDIIR	145-155
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.148中的位置
			80	ASLPTIELALK	39-49
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.149中的位置
			81	LLSDTECLVK	73-82
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.150中的位置
			82	SILSELVR	107-114
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.151中的位置
			83	GGFTVELNGIR	118-128
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.152中的位置
			84	TGEVPADVAAQAR	39-51

2.对于至少一种抗生素的潜在抗性

属于TEM-2β-内酰胺酶蛋白(TEM-2)的至少一种肽，其具有如下SEQID No.126所示序列：

HPETLVKVKDAEDKLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGVGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.62-66所示序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.126中的位置
			62	LLTGELLTLASR	168-179
63	SALPAGWFIADK	198-209
			64	VAGPLLR	191-197
65	VGYIELDLNSGK	19-30
			66	VLLCGAVLSR	49-58

3.毒力:

属于志贺毒素1亚基A蛋白(STX1A)、志贺毒素2亚基A蛋白(STX2A)或者这二者的至少一种肽，其分别具有SEQ ID No.153和154所示序列：

SEQ ID No.153

MKIIIFRVLTFFFVIFSVNVVAKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS

SEQ ID No.154

MKCILFKWVLCLLLGFSSVSHSREFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVS SYLALVEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVRAVNEDSQPECQITGDRPVIKINNTLWESNTAAAFLNRKSQFLYTTGK

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.85、86和87所示序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.153中的位置
			85	TYVDSLNVIR	34-43
86	FVTVTAEALR	183-192
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.154中的位置
86	FVTVTAEALR	183-192
			87	ISNVLPEYR	227-235

4.鉴别：

属于如下的至少一种肽：乌头酸水合酶2(ACON2)，L-天冬酰胺酶2(ASPG2)，3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合成酶1(FABB)，谷氨酰胺结合的周质蛋白(GLNH)，钼酸盐结合的周质蛋白(MODA)，丙酮酸脱氢酶复合物的二氢脂赖氨酸-残基乙酰转移酶成分(ODP2)，外膜蛋白C(OMPC)，甲酸乙酰转移酶1(PFLB)，琥珀酰-CoA连接酶[形成ADP]亚基α(SUCD)，转酮醇酶1(TKT1)，UPF0381蛋白yfcZ(YFCZ)，未鉴定的蛋白质ygaU(YGAU)，其分别具有SEQ ID No.127-135、176、136和137所示如下序列：

SEQ ID No.127

MLEEYRKHVAERAAEGIAPKPLDANQMAALVELLKNPPAGEEEFLLDLLTNRVPPGVDEAAYVKAGFLAAIAKGEAKSPLLTPEKAIELLGTMQGGYNIHPLIDALDDAKLAPIAAKALSHTLLMFDNFYDVEEKAKAGNEYAKQVMQSWADAEWFLNRPALAEKLTVTVFKVTGETNTDDLSPAPDAWSRPDIPLHALAMLKNAREGIEPDQPGVVGPIKQIEALQQKGFPLAYVGDVVGTGSSRKSATNSVLWFMGDDIPHVPNKRGGGLCLGGKIAPIFFNTMEDAGALPIEVDVSNLNMGDVIDVYPYKGEVRNHETGELLATFELKTDVLIDEVRAGGRIPLIIGRGLTTKAREALGLPHSDVFRQAKDVAESDRGFSLAQKMVGRACGVKGIRPGAYCEPKMTSVGSQDTTGPMTRDELKDLACLGFSADLVMQSFCHTAAYPKPVDVNTHHTLPDFIMNRGGVSLRPGDGVIHSWLNRMLLPDTVGTGGDSHTRFPIGISFPAGSGLVAFAAATGVMPLDMPESVLVRFKGKMQPGITLRDLVHAIPLYAIKQGLLTVEKKGKKNIFSGRILEIEGLPDLKVEQAFELTDASAERSAAGCTIKLNKEPIIEYLNSNIVLLKWMIAEGYGDRRTLERRIQGMEKWLANPELLEADADAEYAAVIDIDLADIKEPILCAPNDPDDARPLSAVQGEKIDEVFIGSCMTNIGHFRAAGKLLDAHKGQLPTRLWVAPPTRMDAAQLTEEGYYSVFGKSGARIEIPGCSLCMGNQARVADGATVVSTSTRNFPNRLGTGANVFLASAELAAVAALIGKLPTPEEYQTYVAQVDKTAVDTYRYLNFNQLSQYTEKADGVIFQTAV

SEQ ID No.128

MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIVSAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQQIFNQY

SEQ ID No.129

MKRAVITGLGIVSSIGNNQQEVLASLREGRSGITFSQELKDSGMRSHVWGNVKLDTTGLIDRKVVRFMSDASIYAFLSMEQAIADAGLSPEAYQNNPRVGLIAGSGGGSPRFQVFGADAMRGPRGLKAVGPYVVTKAMASGVSACLATPFKIHGVNYSISSACATSAHCIGNAVEQIQLGKQDIVFAGGGEELCWEMACEFDAMGALSTKYNDTPEKASRTYDAHRDGFVIAGGGGMVVVEELEHALARGAHIYAEIVGYGATSDGADMVAPSGEGAVRCMKMAMHGVDTPIDYLNSHGTSTPVGDVKELAAIREVFGDKSPAISATKAMTGHSLGAAGVQEAIYSLLMLEHGFIAPSINIEELDEQAAGLNIVTETTDRELTTVMSNSFGFGGTNATLVMRKLKD

SEQ ID No.130

MKSVLKVSLAALTLAFAVSSHAADKKLVVATDTAFVPFEFKQGDKYVGFDVDLWAAIAKELKLDYELKPMDFSGIIPALQTKNVDLALAGITITDERKKAIDFSDGYYKSGLLVMVKANNNDVKSVKDLDGKVVAVKSGTGSVDYAKANIKTKDLRQFPNIDNAYMELGTNRADAVLHDTPNILYFIKTAGNGQFKAVGDSLEAQQYGIAFPKGSDELRDKVNGALKTLRENGTYNEIYKKWFGTEPK

SEQ ID No.131

MARKWLNLFAGAALSFAVAGNALADEGKITVFAAASLTNAMQDIATQFKKEKGVDVVSSFASSSTLARQIEAGAPADLFISADQKWMDYAVDKKAIDTATRQTLLGNSLVVVAPKASVQKDFTIDSKTNWTSLLNGGRLAVGDPEHVPAGIYAKEALQKLGAWDTLSPKLAPAEDVRGALALVERNEAPLGIVYGSDAVASKGVKVVATFPEDSHKKVEYPVAVVEGHNNATVKAFYDYLKGPQAAEIFKRYGFTIK

SEQ ID No.132

MAIEIKVPDIGADEVEITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIKVSVGDKTQTGALIMIFDSADGAADAAPAQAEEKKEAAPAAAPAAAAAKDVNVPDIGSDEVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIKVNVGDKVSTGSLIMVFEVAGEAGAAAPAAKQEAAPAAAPAPAAGVKEVNVPDIGGDEVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVGDKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAEGKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAAPAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDITELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYINIGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGGLGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKEFVPRLMLPISLSFDHRVIDGADGARFITIINNTLSDIRRLVM

SEQ ID No.133

MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTGYGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDVGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGKNGSVSGEGMTNNGREALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGAAVSSSKRTDDQNSPLYIGNGDRAETYTGGLKYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQNFEAVAQYQFDFGLRPSLAYLQSKGKNLGVINGRNYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF

SEQ ID No.134

MSELNEKLATAWEGFTKGDWQNEVNVRDFIQKNYTPYEGDESFLAGATEATTTLWDKVMEGVKLENRTHAPVDFDTAVASTITSHDAGYINKQLEKIVGLQTEAPLKRALIPFGGIKMIEGSCKAYNRELDPMIKKIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRVALYGIDYLMKDKLAQFTSLQADLENGVNLEQTIRLREEIAEQHRALGQMKEMAAKYGYDISGPATNAQEAIQWTYFGYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDVYIERDLKAGKITEQEAQEMVDHLVMKLRMVRFLRTPEYDELFSGDPIWATESIGGMGLDGRTLVTKNSFRFLNTLYTMGPSPEPNMTILWSEKLPLNFKKFAAKVSIDTSSLQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMIVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGVDEKLKMQVGPKSEPIKGDVLNYDEVMERMDHFMDWLAKQYITALNIIHYMHDKYSYEASLMALHDRDVIRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRDEDGLAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKIQKLHTYRDAIPTQSVLTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEVRKTNLAGLMDGYFHHEASIEGGQHLNVNVMNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM

SEQ ID No.135

MSILIDKNTKVICQGFTGSQGTFHSEQAIAYGTKMVGGVTPGKGGTTHLGLPVFNTVREAVAATGATASVIYVPAPFCKDSILEAIDAGIKLIITITEGIPTLDMLTVKVKLDEAGVRMIGPNCPGVITPGECKIGIQPGHIHKPGKVGIVSRSGTLTYEAVKQTTDYGFGQSTCVGIGGDPIPGSNFIDILEMFEKDPQTEAIVMIGEIGGSAEEEAAAYIKEHVTKPVVGYIAGVTAPKGKRMGHAGAIIAGGKGTADEKFAALEAAGVKTVRSLADIGEALKTVLK

SEQ ID No.176

MSSRKELANAIRALSMDAVQKAKSGHPGAPMGMADIAEVLWRDFLKHNPQNPSWADRDRFVLSNGHGSMLIYSLLHLTGYDLPMEELKNFRQLHSKTPGHPEVGYTAGVETTTGPLGQGIANAVGMAIAEKTLAAQFNRPGHDIVDHYTYAFMGDGCMMEGISHEVCSLAGTLKLGKLIAFYDDNGISIDGHVEGWFTDDTAMRFEAYGWHVIRDIDGHDAASIKRAVEEARAVTDKPSLLMCKTIIGFGSPNKAGTHDSHGAPLGDAEIALTREQLGWKYAPFEIPSEIYAQWDAKEAGQAKESAWNEKFAAYAKAYPQEAAEFTRRMKGEMPSDFDAKAKEFIAKLQANPAKIASRKASQNAIEAFGPLLPEFLGGSADLAPSNLTLWSGSKAINEDAAGNYIHYGVREFGMTAIANGISLHGGFLPYTSTFLMFVEYARNAVRMAALMKQRQVMVYTHDSIGLGEDGPTHQPVEQVASLRVTPNMSTWRPCDQVESAVAWKYGVERQDGPTALILSRQNLAQQERTEEQLANIARGGYVLKDCAGQPELIFIATGSEVELAVAAYEKLTAEGVKARVVSMPSTDAFDKQDAAYRESVLPKAVTARVAVEAGIADYWYKYVGLNGAIVGMTTFGESAPAELLFEEFGFTVDNVVAKAKELL

SEQ ID No.136

MSKCSADETPVCCCMDVGTIMDNSDCTASYSRVFANRAEAEQTLAALTEKARSVESEPCKITPTFTEESDGVRLDIDFTFACEAEMLIFQLGLR

SEQ ID No.137

MGLFNFVKDAGEKLWDAVTGQHDKDDQAKKVQEHLNKTGIPDADKVNIQIADGKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGNISGIASVDDQVKTATPATASQFYTVKSGDTLSAISKQVYGNANLYNKIFEANKPMLKSPDKIYPGQVLRIPEE

所述肽优选选自具有如下文定义的SEQ ID No.46-61所示序列的肽：

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.127中的位置
			46	ILEIEGLPDLK	578-588
47	VADGATVVSTSTR	779-791
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.128中的位置
48	TNTTDVATFK	185-194
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.129中的位置
49	LDTTGLIDR	54-62
			50	VGLIAGSGGGSPR	99-111
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.130中的位置
			51	AIDFSDGYYK	100-109
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.131中的位置
			52	LGAWDTLSPK	160-169
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.132中的位置
			53	FGEIEEVELGR	397-407
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.133中的位置
			54	INLLDDNQFTR	339-349
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.134中的位置
			55	LATAWEGFTK	8-17
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.135中的位置
			56	DSILEAIDAGIK	80-91
57	FAALEAAGVK	263-272
			58	SLADIGEALK	276-285
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.176中的位置

59	TEEQLANIAR	529-538
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.136中的位置
60	AEAEQTLAALTEK	38-50
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.137中的位置
61	SGDTLSAISK	103-112

应注意，如先前所述，对于分型而言，本发明的方法也可使用具有SEQID No:46-66及85-87所示序列的至少一种肽，其用于确定对于至少一种抗生素的潜在抗性、鉴别或者毒力，如前文所述。

根据另一优选的实施方案，本发明的方法可以鉴别白色念珠菌。

特别地，白色念珠菌的鉴别使用如下至少一种肽：

1.分型

属于如下的至少一种肽：醇脱氢酶1蛋白(ADH1)，果糖-二磷酸醛缩酶蛋白(ALF)，羊毛甾醇14-α脱甲基酶蛋白(CP51)，F-box蛋白COS111(CS111)，延长因子1-β(EF1B)，烯醇酶1(ENO1)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3P)，热激蛋白SSA1(HSP71)，热激蛋白SSB1(HSP75)，丙酮酸激酶(KPYK)，脂肪酶8(LIP8)，多蛋白质-桥连因子1(MBF1)，核转运因子2(NTF2),磷酸甘油酸激酶(PGK)，肽基-脯氨酸顺-反异构酶(PPIA)，60S核糖体蛋白L13(RL13)，60S核糖体蛋白L28(RL28)，60S核糖体蛋白L36(RL36)，40S核糖体蛋白S22(RS22)，磷酸丙糖异构酶(TPIS)，其分别具有SEQ ID No.155-175所示如下序列：

SEQ ID No.155

MSEQIPKTQKAVVFDTNGGQLVYKDYPVPTPKPNELLIHVKYSGVCHTDLHARKGDWPLATKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKIGDFAGIKWLNGSCMSCEFCQQGAEPNCGEADLSGYTHDGSFEQYATADAVQAAKIPAGTDLANVAPILCAGVTVYKALKTADLAAGQWVAISGAGGGLGSLAVQYARAMGLRVVAIDGGDEKGEFVKSLGAEAYVDFTKDKDIVEAVKKATDGGPHGAINVSVSEKAIDQSVEYVRPLGKVVLVGLPAHAKVTAPVFDAVVKSIEIKGSYVGNRKDTAEAIDFFSRGLIKCPIKIVGLSDLPEVFKLMEEGKILGRYVLDTSK

SEQ ID No.156

MAPPAVLSKSGVIYGKDVKDLFDYAQEKGFAIPAINVTSSSTVVAALEAARDNKAPIILQTSQGGAAYFAGKGVDNKDQAASIAGSIAAAHYIRAIAPTYGIPVVLHTDHCAKKLLPWFDGMLKADEEFFAKTGTPLFSSHMLDLSEETDDENIATCAKYFERMAKMGQWLEMEIGITGGEEDGVNNEHVEKDALYTSPETVFAVYESLHKISPNFSIAAAFGNVHGVYKPGNVQLRPEILGDHQVYAKKQIGTDAKHPLYLVFHGGSGSTQEEFNTAIKNGVVKVNLDTDCQYAYLTGIRDYVTNKIEYLKAPVGNPEGADKPNKKYFDPRVWVREGEKTMSKRIAEALDIFHTKGQL

SEQ ID No.157

MAIVETVIDGINYFLSLSVTQQISILLGVPFVYNLVWQYLYSLRKDRAPLVFYWIPWFGSAASYGQQPYEFFESCRQKYGDVFSFMLLGKIMTVYLGPKGHEFVFNAKLSDVSAEDAYKHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKRYVPKIREEILNYFVTDESFKLKEKTHGVANVMKTQPEITIFTASRSLFGDEMRRIFDRSFAQLYSDLDKGFTPINFVFPNLPLPHYWRRDAAQKKISATYMKEIKSRRERGDIDPNRDLIDSLLIHSTYKDGVKMTDQEIANLLIGILMGGQHTSASTSAWFLLHLGEKPHLQDVIYQEVVELLKEKGGDLNDLTYEDLQKLPSVNNTIKETLRMHMPLHSIFRKVTNPLRIPETNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDPTRWDTAAAKANSVSFNSSDEVDYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTFVYNLRWTIDGYKVPDPDYSSMVVLPTEPAEIIWEKRETCMF

SEQ ID No.158

MLKTDSLDFHSYLPPYRSLINPNARYDYRTHSLIPLTQNDLNLLRIAFQKKKEAPPSAFKMKYKSLLSDVSRTISMRLSNSNLLSSSSANNNNVLLSPPPSSSSTLSTPCGNILNRAGTTSSNISKINNLSQNQTQNQLPLFPAELHIKNLPVEILDYIFYLVDDNLDYKSCMYTCKLFYFLAKPYYYENLVFTSTYRFAQFVTYLRVNSEVGQYVQSIDLSGIKPGYDEDEQEEGQEENAENGEEENGGGARDPQYLLGEIADNPHHERVDQFPRGKILAGWRDWKFKNNPLYTIHPSPSLTKIASNSQFSNVSSKSSRSTSSKSSSSTTKKFVKPFRYFKSRKRKMSYSGTTKLERKSPRLEQLQLDQYSSNWNKRVNSHPLINKFLLHYSTSKDLPIGYILHMINLCPNIVSLNLGNLSLSTDYEISRSTIHKYQNFDLINNYPKDLIYKVDNIMRLNDVDDVYSIDGSILRFGNINSGSSGSNWERNGSSSNNRILFKSNQSIASTASSVYSVTTFSKPIRKYNSLLPPLPQTVADISYLNKGDGKVYLSDLNLKEINSAYLKKINEDEILSAIINVHGKRLIEYDTSLYQIPKPLNVDIAGTLKYINLSSMIWLNRKLIEKFLTRLLTKKSPELDMYGICYTDEFFDSDEQESDDDYEDSDDEEQRQCPIIYKQNLVIDFTDSGMYKSLPWAKRIDLNSFEGCQLANKIINNDLMTPQEQALRRERRRRGAIAANYLA

SEQ ID No.159

MSFSDFSKVESIKSLNEFLADKSYIDGTTATQADVTVYKAFQKEFPQFTRWFNHIASFTEEFEDLPAGKAPAASGSAAAAAEEEDDEDVDLFGSDDEVDEEAEKLKQQRLAEYAAKKAAKGPKPAAKSIVTLDVKPWDDETDLDELLTNVKAIEMEGLTWGAHQWIPVGFGIKKLQINLVVEDALVSLDDLQAAVEEDEDHVQSTDIAAMQKL

SEQ ID No.160

MSYATKIHARYVYDSRGNPTVEVDFTTDKGLFRSIVPSGASTGVHEALELRDGDKSKWLGKGVLKAVANVNDIIAPALIKAKIDVVDQAKIDEFLLSLDGTPNKSKLGANAILGVSLAAANAAAAAQGIPLYKHIANISNAKKGKFVLPVPFQNVLNGGSHAGGALAFQEFMIAPTGVSTFSEALRIGSEVYHNLKSLTKKKYGQSAGNVGDEGGVAPDIKTPKEALDLIMDAIDKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVSIEDPFAEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALLLKVNQIGTLTESIQAANDSYAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLSVGLRSGQIKTGAPARSERLAKLNQILRIEEELGSEAIYAGKDFQKASQL

SEQ ID No.161

MAIKIGINGFGRIGRLVLRVALGRKDIEVVAVNDPFIAPDYAAYMFKYDSTHGRYKGEVTASGDDLVIDGHKIKVFQERDPANIPWGKSGVDYVIESTGVFTKVEGAQKHIDAGAKKVIITAPSADAPMFVVGVNEDKYTPDLKIISNASCTTNCLAPLAKVVNDTFGIEEGLMTTVHSITATQKTVDGPSHKDWRGGRTASGNIIPSSTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMSLRLPTTDVSVVDLTVRLKKAASYEEIAPAIKKASEGPLKGVLGYTEDAVVSTDFLGSSYSSIFDEKAGILLSPTFVKLISWYDNEYGYSTKVVDLLEHVA

SEQ ID No.162

MSKAVGIDLGTTYSCVAHFANDRVEIIANDQGNRTTPSFVAFTDTERLIGDAAKNQAAMNPANTVFDAKRLIGRKFDDPEVINDAKHFPFKVIDKAGKPVIQVEYKGETKTFSPEEISSMVLTKMKEIAEGYLGSTVKDAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKGSRGEHNVLIFDLGGGTFDVSLLAIDEGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNFFIQEFKRKNKKDISTNQRALRRLRTACERAKRTLSSSAQTSIEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELCADLFRSTLDPVGKVLADAKIDKSQVEEIVLVGGSTRIPKIQKLVSDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILTGDTSSKTQDILLLDVAPLSLGIETAGGIMTKLIPRNSTIPTKKSETFSTYADNQPGVLIQVFEGERAKTKDNNLLGKFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSALEKGTGKTQKITITNDKGRLSKEEIDKMVSEAEKFKEEDEKEAARVQAKNQLESYAYSLKNTINDGEMKDKIGADDKEKLTKAIDETISWLDASQAASTEEYEDKRKELESVANPIISGAYGAAGGAPGGAGGFPGAGGFPGGAPGAGGPGGATGGESSGPTVEEVD

SEQ ID No.163

MADGVFQGAIGIDLGTTYSCVATYDSAVEIIANEQGNRVTPSFVAFTSEERLIGDAAKNQAALNPKNTVFDAKRLIGRAFDDESVQKDIKSWPFKVVESNGQPLIEVEYLDETKTFSPQEISSMVLTKMKEIAEAKIGKKVEKAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGAIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLGAGKSEKERHVLIFDLGGGTFDVSLLNITGGVFTVKATAGDTHLGGQDFDTNLLEHFKKEFQKKTGNDISSDARALRRLRTACERAKRSLSSGTQTTVEIDSLFDGEDFSANITRARFEDINSALFKSTLEPVEQVLEDAKISKSQVDEVVLVGGSTRIPKVQKLLSDFFDGKQLEKSINPDEAVAYGAAVQGAILTGQSTNDDTKDLLLLDVIPLSLGVAMQGNVLAPVVPRNTTVPTIKRRTFTTVADHQTTVQFPVYQGERVNCSENTLLGEFDLKNIPPMQAGEPVLEAIFEVDANGILKVTAVEKSTGRSANITISNSIGRLSTEEIEKMISDAEKFKSSDDAFAKRHEQKQKLEAYVASVESTVTDPVLSAKLKKSAKDKIEAALSDALQTLEIEESSADDYRKAELALKRAVTKGMATR

SEQ ID No.164

FTIPPNHEMIFTTDDAYKTKCDDKVMIIDYKNITKVIAPGKIIYVDDGVLSFEVISVDDQQTLKVRSLNAGMISSHKTANDVLELRVLSTSG

SEQ ID No.165

MLFLLFLLITPIYAGLIFPTKPSSDPFYNPPKGFEKAAVGDILQSRETPKSITGRFAPLKIQNSWQLLVRSEDSFGNPNAIVTTVIEPVNADPSKIASYQVFEDAAKADCAPSYALQFGSDLTTFVTQAEMYLMAPLLDQGYYVVSPDYEGPKSTFTIGKQSGQAVLNSIRATLKSSKITNIKEDAKVVMWGYSGGSLASGWAAALQPSYAPELSSSLLGAALGGFVTNITATAQAADGTVFAGIVANALGGVANEYPEFKSILQSDTDKKSVFDEFDSHCLADGVIDYINTSFLTGDNKIFKTGWDILKSPTIAKIVEDNGLVYQKQLVPKIPIFVYHGSIDQIVPIVNVKKTYQNWCEGGISSLEFAEDGTNGHLTETVVGAPAALTWIIDRFNGKQTVSGCQHDKRLSNFQYPNISSSILKYFKVALDTMMSNGLGSDIQKDKITPDDLRKFLLGGW

SEQ ID No.166

MSSDWDSVTIIGQKARVGGGGPRENVAKTSSQLNAARRAGLVVGTEKKYGTANTKSNPEGQRLTKLDATDDVVAVKKVDVSVGKAIQQARQEKKLTQKELATKVNEKPNVINDYEAGRAIPNQQLLAKLERALGVKLRGKNIGEPLFAKKK

SEQ ID No.167

MSVDFNAVATEFCNFYYNQFDSDRSQLGNLYRNESMLTFETSQLQGARDIVEKLASLPFQKVAHRISTLDAQPASANGDILVMVTGELLIDEEQNAQRYSQVFHLIPDNGSYYVFNDIFRLNYS

SEQ ID No.168

MSLSNKLSVKDLDVAGKRVFIRVDFNVPLDGKTITNNQRIVAALPTIKYVEEHKPKYIVLASHLGRPNGERNDKYSLAPVATELEKLLGQKVTFLNDCVGPEVTKAVENAKDGEIFLLENLRYHIEEEGSSKDKDGKKVKADPEAVKKFRQELTSLADVYINDAFGTAHRAHSSMVGLEVPQRAAGFLMSKELEYFAKALENPERPFLAILGGAKVSDKIQLIDNLLDKVDMLIVGGGMAFTFKKILNKMPIGDSLFDEAGAKNVEHLVEKAKKNNVELILPVDFVTADKFDKDAKTSSATDAEGIPDNWMGLDCGPKSVELFQQAVAKAKTIVWNGPPGVFEFEKFANGTKSLLDAAVKSAENGNIVIIGGGDTATVAKKYGVVEKLSHVSTGGGASLELLEGKDLPGVVALSNKN

SEQ ID No.169

MSTVYFDVSADGQKLGKITFKLYDDVVPKTAENFRALCTGEKGFGYKGSIFHRVIPQFMLQGGDFTNFNGTGGKSIYGTKFADENFVKRHDRPGLLSMANAGPNTNGSQFFITTVPCPWLDGKHVVFGEVTDGLDIVKKIESFGSGSGATSKKIVIEESGQL

SEQ ID No.170

MAISKNLPLLNNHFRKHWQERVRVHFDQAGKKASRRQSRLRKAAKIAPRPIDALRPVVRAPTVKYNRKVRAGRGFTLAELKAVGIAPKYARTIGISVDHRRQNKSQETFDANVARLQEYKSKLVIFDKKTKASEVASFEQVDVSATFPVEQPAPESGLRAVEVPEQTAYRTLRLARNEKKYKGIREKRAKEKAEAEAEKAKK

SEQ ID No.171

EKKDEYLSKSSASAAPVIDTLAHGYGKVLGKGRLPEVPVIVKARFVSKLAEEKSESLVVLSN

SEQ ID No.172

MAKSGIAAGVNKGRKTTAKEVAPKISYRKGASSQRTVFVRSIVKEVAGLAPYERRLIELIRNAGEKRAKKLAKKRLGTHKRALRKVEEMTQVIAESRRH

SEQ ID No.173

MKYLAAYLLLVQGGNTSPSASDITALLESVGVEAEESRLQALLKDLEGKDLQELIAEGNTKLASVPSGGAAAGGASASTGAAAGGAAEAEEEKEEEAKEESDDDMGFGLFD

SEQ ID No.174

MTRTSVLADALNAINNAEKTGKRQVLIRPSSKVIIKFLTVMQKHGYIGEFEYIDDHRSGKIVVQLNGRLNKCGVIQPRFNVKINDIERWTDNLLPARQFGYVILTTSAGIMDHEEARRKHVSGKILGFVY

SEQ ID No.175

MARQFFVGGNFKANGTKQQITSIIDNLNKADLPKDVEVVICPPALYLGLAVEQNKQPTVAIGAQNVFDKSCGAFTGETCASQILDVGASWTLTGHSERRTIIKESDEFIAEKTKFALDTGVKVILCIGETLEERKGGVTLDVCARQLDAVSKIVSDWSNIVVAYEPVWAIGTGLAATPEDAEETHKGIRAHLAKSIGAEQAEKTRILYGGSVNGKNAKDFKDKANVDGFLVGGASLKPEFVDIIKSRL

所述肽选自具有如下文定义的SEQ ID No.88-125所示序列的肽。

肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.156中的位置
			88	ADEEFFAK	125-132
97	IAEALDIFHTK	346-356
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.163中的位置
89	AFDDESVQK	79-87
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.160中的位置
90	AKIDVVDQAK	81-90
			98	IDVVDQAK	83-90
99	IEEELGSEAIYAGKDFQK	419-436
			112	VGDKIQIVGDDLTVTNPTR	315-333
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.170中的位置
			91	AVEVPEQTAYR	160-170
107	SQETFDANVAR	105-115
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.174中的位置

92	CGVIQPR	72-78
			114	WTDNLLPAR	89-97
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.173中的位置
			93	DLQELIAEGNTK	50-61
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.169中的位置
			94	FADENFVKR	81-89
100	IESFGSGSGATSK	140-152
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.175中的位置
95	FALDTGVK	115-122
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.171中的位置
96	GRLPEVPVIVK	32-42
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.167中的位置
101	LASLPFQK	54-61
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.166中的位置
102	LDATDDVVAVK	66-76
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.168中的位置
103	NVEHLVEK	264-271
			110	SVELFQQAVAK	319-329
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.172中的位置
			104	SGIAAGVNK	4-12
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.161中的位置
			105	SGVDYVIESTGVFTK	89-103
115	YKGEVTASGDDLVIDGHK	55-72
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.158中的位置
108	SSSSTTKK	326-333
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.159中的位置
106	SLNEFLADK	14-22
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.162中的位置
109	STLDPVGK	311-318
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.164中的位置
111	TANDVLELR	78-86
			肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.155中的位置
113	VVAIDGGDEK	200-209
			116	YVLDTSK	344-350
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.157中的位置
			117	AVIYDCPNSR	399-414
177	GHYVLVFPGYAHTSER	399-414
			118	GHYVLVSPGYAHTSER	399-414
119	GVIYDCPNSR	129-138
			120	GVSSPYLPFGGGR	455-467
121	GVSSPYLPFSGGK	455-467
			122	GVSSPYLPFSGGR	455-467
肽SEQ ID No.	氨基酸序列	在SEQ ID No.165中的位置
			123	AAVGDILQSR	37-46

124	ITPDDLR	447-453
			125	TGWDILK	304-310

2.对于至少一种抗生素的潜在抗性

属于羊毛甾醇14-α脱甲基酶蛋白(CP51)的至少一种肽，具有SEQ IDNo.157所示序列，所述肽优选选自如上文定义的具有SEQ ID No.117-122及177所示序列的肽。

3.毒力:

属于脂肪酶8蛋白(LIP8)的具有SEQ ID No.163所示序列的至少一种肽，所述肽优选选自如上述具有SEQ ID No.123-125所示序列的肽。

4.鉴别:

属于如下的至少一种肽：醇脱氢酶1蛋白(ADH1)，果糖-二磷酸醛缩酶蛋白(ALF)，F-box蛋白COS111(CS111)，延长因子1-β(EF1B)，烯醇酶1(ENO1)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3P)，热激蛋白SSA1(HSP71)，热激蛋白SSB1(HSP75)，丙酮酸激酶(KPYK)，多蛋白质-桥连因子1(MBF1)，核转运因子2(NTF2)，磷酸甘油酸激酶(PGK)，肽基-脯氨酸顺-反异构酶(PPIA)，60S核糖体蛋白L13(RL13)，60S核糖体蛋白L28(RL28)，60S核糖体蛋白L36(RL36)，40S核糖体蛋白S22(RS22)，磷酸丙糖异构酶(TPIS),其具有SEQ ID No.155、156、158-164及166-175所示序列，所述肽优选选自具有如上述SEQ ID No.88-116所示序列的肽。

用于本发明的具有SEQ ID No.2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44-125及177所示序列的肽是新的肽，其构成本发明的另一方面。

本发明的方法及其优势通过如下非限制性的本发明方法的实施例而更显而易见。

实施例1：通过生物化学谱从样品中鉴别微生物

1.在培养基上培养样品

根据微生物物种，最佳培养基和最佳培养条件是不同的。默认的是，将样品接种在不同培养基上：

·具有羊血的Columbia琼脂(bioMérieux ref 43041)，在厌氧或无厌氧条件下在35°C培养18-24小时；

·TSA琼脂(bioMérieux reference 43011)，在37°C培养18-24小时。

2.微生物的鉴别

所述鉴别如下所述实施：

1.选择分离的菌落。

2.在观测无菌条件时，将3.0ml水相无菌盐水溶液(含有0.45-0.50%的NaCl，pH 4.5-7.0)移至透明的塑料(聚苯乙烯)试管中。

3.使用无菌棉签或者无菌拭子，将足够数目的相同菌落移至在步骤2中制备的盐水溶液试管中，用校准的VITEK 2DENSICHEK将细菌悬浮液调节至0.50-0.63 McFarland。

4.将细菌悬浮液试管和VITEK 2鉴别卡置于VITEK 2盒上。

5.将所述盒加样于VITEK 2仪器上。

6.自动进行充填、密封、保温和读数操作。

7.获得生物化学谱。

8.用VITEK 2系统鉴别，通过与已知菌株的生物化学谱对比进行。

实施例2：通过MALDI-TOF从样品中鉴别微生物

所述鉴别如下所述进行：

1.使用1μl环将根据实施例1获得的一部分微生物菌落及均匀沉积物移至平板上，通过MALDI-TOF进行质谱分析。

2.使用1μl基质覆盖所述沉积物。所用基质是在有机溶剂(50%乙腈和2.5%三氟乙酸)中的HCCA(α-氰-4-羟基肉桂酸)的饱和溶液。

3.在室温干燥。

4.将平板导入质谱分析仪中。

5.获得质谱。

6.将获得的质谱与知识库(knowledge base)中包含的质谱进行对比。

7.通过对比获得的峰与知识库的那些峰鉴别微生物。

实施例3：通过ESI-MS从样品中鉴别微生物

如下所述进行鉴别：

1.取样根据实施例1获得的微生物菌落，在100μl去矿物质水中悬浮。

2.在3000g离心5分钟。

3.除去上清。

4.在100μl去矿物质水中重悬浮。

5.在3000g离心5分钟。

6.除去上清。

7.在100μl的乙腈、去矿物质水和甲酸的混合物(50/50/0.1%)中重悬浮。

8.用孔径为0.45μm的滤膜过滤。

9.以单一MS模式注射进质谱分析仪中。

10.获得质谱。

11.将获得的质谱与知识库中包含的质谱相对比。

12.通过与参考质谱相对照鉴别所述微生物。

实施例4：从微生物中获得消化的蛋白质

常规地，在11个步骤中实施如下方案：

1.取样根据实施例1获得的微生物，在10-100μl的6M盐酸胍、50mMTris-HCl溶液pH=8.0中悬浮。

2.加入二硫苏糖醇(DTT)，以获得终浓度为5mM。

3.在95°C水浴中还原(Reduction)20分钟。

4.将试管冷却至室温。

5.加入碘乙酰胺以获得终浓度为12.5mM。

6.在室温避光烷化40分钟。

7.用50mM,NH₄HCO₃溶液pH=8.0稀释6倍，以获得最终1M浓度的盐酸胍。

8.加入1μg胰蛋白酶。

9.在37°C消化6小时过夜。

10.加入甲酸至pH低于4，以终止反应。

11.在100000g超速离心30分钟。

实施例5：鉴定金黄色葡萄球菌样品:

在根据实施例1-3任一方法确定一或多个物种样品之后，分析下文列出的物种。

分析13个金黄色葡萄球菌菌株，以证实其鉴别及确定其特征：

对不属于金黄色葡萄球菌的物种应用相同方法，以作为阴性对照：

·大肠杆菌

ID7 AST2

·肺炎链球菌

VIR21

·艰难梭状芽孢杆菌

VIR26

根据实施例4处理每个样品，然后根据如下条件注射体积为5μl的消化的蛋白质并进行分析：

·得自Agilent Technologies(Massy，France)公司的Agilent 1100系列色谱系统。

·Waters Symmetry C18柱，2.1mm内径，长度为100mm，颗粒大小3.5μm。

·溶剂A:H₂O+0.1%甲酸。

·溶剂B:ACN+0.1%甲酸。

·HPLC梯度在后文表1中限定。

表1

时间	流速(μl)	溶剂A(%)	溶剂B(%)
				0	300	95	5
25	300	60	40

27	300	0	100
				35	300	0	100
35.1	300	95	5
				45	300	95	5

·将所述色谱柱输出的洗脱物直接注射进得自Applied Biosystems(Foster City，United States of America)公司的

5500质谱分析仪的电离源中。

·以MRM模式通过质谱分析对得自微生物的蛋白质消化的肽进行分析。仅检测在表2中示出的肽。为此，检测在表2中示出的第一代碎片。每个跃迁(即与其第一代碎片相关的每个肽)使得可以对其应答的应用，在表2中临床感兴趣一列中用字母I、T、R和V列出。I表示证实微生物的鉴别，T表示分型，R表示对于至少一种抗生素的抗性，V表达毒力因子的检测。

表2

前体肽的电荷状态、其保留时间及跃迁，即Q1中(m/z)₁与Q3中(m/z)₂的比率，在表3中示出。用于碎裂先驱离子的碰撞能量也在表3中示出。

表3

·使用的其它机械参数如下所述：

扫描类型： MRM

极性: 正

电离源: Turbo V^TM(Applied BioSystems)

Q1设置: 用单位解析度过滤

Q3设置: 用单位解析度过滤

扫描间暂停: 5.00msec

扫描速度: 10Da/s

气幕: 50.00psi

锥孔电压: 5500.00V

源温度: 500.00°C

气雾(Nebulizing gas): 50.00psi

加热气体(Heating gas): 40.00psi

动态添加: 激活

去簇电压(Declustering potential,DP):100.00V

Q0前的进入电压(Entry potential EP): 6.00V

碰撞室脱离电压(CXP): 11V

总循环时间： 1.6秒。

测量针对每个跃迁及每个研究的微生物获得的面积。面积大于或等于1000(任意单位)的所有跃迁均被认为是阳性的，在表4A和4B中以“1”表达，。面积低于1000的所有跃迁均被认为是阴性的，在表4A和4B中以0表达。当观测到无信号峰时，所述跃迁标示为阴性。

然后针对I、R和V应用计算阳性跃迁数的总和，在表5中示出。

表4A

表4B

表5

所有金黄色葡萄球菌样品均呈现出在I类别中12个以上的阳性跃迁。所有这些样品均因此被证实确实属于金黄色葡萄球菌种。

另一方面，样品ID7、AST2、VIR21和VIR26呈现出在I类别中低于2个的阳性跃迁，这些样品因此被证实不属于金黄色葡萄球菌种。

金黄色葡萄球菌的ID2、ID4、ID2a、ID4a、AST13和AST14菌株呈现出R类别的8个以上的阳性跃迁，其因此表达青霉素结合蛋白(PBP2a),，这与对于M青霉素(如甲氧西林)抗性机制是同义的。

另一方面，金黄色葡萄球菌的ID3、ID3a、AST7、AST8、VIR5、VIR6和VIR7菌株呈现出V类别的少于3个阳性跃迁，因此其不表达PBP2a。这些菌株因此对抗生素如M青霉素敏感。

不属于金黄色葡萄球菌种的ID7、AST2、VIR21和VIR26菌株也呈现出R类别少于3个的跃迁，其因此不表达PBP2a，从而证实该方法的特异性。

金黄色葡萄球菌的VIR5和VIR7样品呈现出V类别的9个以上的阳性跃迁，因此其表达Panton-Valentine-Leukocidin (PVL)蛋白。

另一方面，金黄色葡萄球菌的ID2、ID3、ID4、ID2a、ID3a、ID4a、AST7、AST8、AST13、AST14和VIR6菌株呈现出少于3个的阳性跃迁，因此其不表达PVL。这些菌株因此不具有对于PVL的毒力性质。

不属于金黄色葡萄球菌种的ID7、AST2、VIR21和VIR26菌株也呈现出V类别少于3个的跃迁，因此其不表达PVL，从而证实该方法的特异性。

对于分型而言，将每个菌株的T类别跃迁与作为参考菌株的其它菌株的跃迁进行对比。在实践中，当两个菌株之间的跃迁归为相同类别(阳性或阴性)时，赋值为0；当两个菌株之间的跃迁归为不同类别时(阳性跃迁和阴性跃迁)，赋值为1。计算每个菌株对的所有T-类别跃迁的总数数值以确定得分。得分示于表6。

表6

分值低于或等于4的菌株是相同类型，分值完全高于4的菌株是不同类型。

因此，ID2与ID2a、ID3与ID3a、ID4与ID4a及AST7与AST8菌株是相同类型。成对的其它菌株均是不同类型。应注意在不是金黄色葡萄球菌的ID7、AST2、VIR21和VIR26菌株及是金黄色葡萄球菌的所有其它菌株之间获得的较高总和。这些结果证实该方法的特异性。

ID7、AST2、VIR21和VIR26菌株当然不是相同类型，这是无意义的，其是不同物种。这些菌株因此可彼此互相对比，在表6中无数值示出。

非常有利地，高于25的得分，如在ID2与VR7之间，反映出菌株之间的显著分歧。得分在15-25之间，如在ID2与AST14之间，反映出中等分歧；得分在5-15之间，如在ID2与ID4a之间，反映出较弱分歧。

因此所述方法不仅可以确定两个菌株是否是相同类型的，这对于鉴别感染的共同位置(common seat)是重要的，也可以估计两个菌株的相近性，这对于流行病学研究非常重要。

这个实施例示出本发明可以非常有利地在非常短的少于1小时的时间内证实物种如金黄色葡萄球菌的身份，及在同一分析内同时确定分型及对于至少一种抗生素抗性的性质，及确定毒力因子的存在。最后，细菌的特征是使用细菌蛋白质确定的，其反映出活的及可存活的微生物的存在，与使用细菌DNA的鉴定不同，使用细菌DNA的鉴定方法由于存在死亡的细菌可导致结果有误差。

实施例6：用去成盐(desalifying)步骤消化微生物的方案

常规地，在17个步骤中实施如下方案：

步骤1-10：与实施例4相同。

11.将样品体积用水/0.1%(v/v)甲酸调节为1ml。

12.用1ml甲醇及随后1ml的H₂O/0.1%(v/v)甲酸平衡Waters OasisHLB柱。

13加样通过重力流动的样品。

14.用1ml的H₂O/0.1%(v/v)甲酸洗涤。

15.用1ml的80%甲醇与20%水/0.1%(v/v)甲酸的混合物洗脱。

16.将洗脱物用

SPD2010蒸发器(Thermo ElectronCorporation,Waltham,Massachusetts,United States of America)蒸发2小时，以获得大约100μl体积。

17.然后将洗脱物置于水/0.5%(v/v)甲酸溶液中，数量为足以进行(QS)的250μl。

实施例7：鉴定大肠杆菌样品

在根据实施例1-3所述任一方法确定一或多个物种样品之后，分析下文列出的物种。

分析15个大肠杆菌菌株，以证实其鉴别及确定其特征：

对不属于大肠杆菌的物种实施相同分析方法，作为阴性对照：

·金黄色葡萄球菌 VIR10

·肺炎链球菌 VIR19

·艰难梭状芽孢杆菌 VIR28

根据实施例6所述处理每个样品，然后注射体积为5μl的消化的蛋白质，根据如下条件分析：

·Waters Symmetry C18柱，内径2.1mm，长度100mm，颗粒大小3.5μm。

·溶剂A：H₂O+0.1%甲酸。

·溶剂B：ACN+0.1%甲酸。

·HPLC梯度在下文表7中限定。

表7

时间(分钟)	流速(μl)	溶剂A(%)	溶剂B(%)
				0	300	95	5
3	300	95	5
				28	300	60	40
30	300	0	100
				38	300	0	100
38.1	300	95	5
				45	300	95	5

·将所述色谱柱输出的洗脱物直接注射进得自Applied Biosystems(Foster City，United States ofAmerica)公司的

5500质谱分析仪的电离源中。

·以MRM模式使用质谱分析仪分析得自微生物的蛋白质消化的肽。仅检测在表8中示出的肽。为此，检测在表8中示出的第一代碎片。每个跃迁(即与其第一代碎片相关的每个肽)使得可以对其应答的应用，在表8中临床感兴趣一列中用字母I、T、R和V列出。I表示证实微生物的鉴别，T表示分型，R表示对于至少一种抗生素的抗性，V表达毒力因子的检测。

表8

前体肽的电荷状态、其保留时间及跃迁，即Q1(m/z)₁中与Q3中(m/z)₂的比率，在表9中示出。用于碎裂先驱离子的碰撞能量也在表9中示出。

表9

·使用的其它机械参数如下所述：

扫描类型: MRM

预定的MRM: 有

极性: 正

电离源: Turbo V^TM(Applied BioSystems)

Q1设置: 用单位解析度过滤

Q3设置: 用单位解析度过滤

扫描间暂停: 5.00msec

扫描速度: 10Da/s

气幕: 50.00psi

锥孔电压: 5500.00V

源温度: 550.00°C

气雾: 50.00psi

加热气体: 40.00psi

动态添加: 激活

去簇电压(DP): 100.00V

Q0前的进入电压(EP): 9.00V

碰撞室脱离电压(CXP): 35V

总循环时间: 1.2sec

检测窗 80sec

测量每个跃迁及每个研究的微生物获得的面积。面积大于或等于2500(任意单位)的所有跃迁均被认为是阳性的，在表10A和10B中以“1”表达，。面积低于2500的所有跃迁均被认为是阴性的，在表10A和10B中以0表达。当观测到无信号峰时，所述跃迁标示为阴性。

然后针对I、R和V应用计算阳性跃迁数的总和，在表11中示出。

表10A

表10B

表11

所有大肠杆菌样品均呈现出在I类别中44个以上的阳性跃迁。所有这些样品均因此被证实确实属于大肠杆菌种。

另一方面，样品VIR10、VIR19和VIR28呈现出在I类别中低于2个的阳性跃迁，这些样品因此被证实不属于大肠杆菌种。

大肠杆菌的AST2、AST3、AST4和AST5菌株呈现出R类别的14个以上的阳性跃迁，其因此表达质粒介导的青霉素酶TEM-2，这与对于青霉素抗性机制是同义的。

另一方面，大肠杆菌的AST1、VIR41、VIR42、VIR43、VIR44、VIR45、ID6、ID7、ID8、ID9和ID10菌株呈现出R类别的少于7个阳性跃迁，因此其不表达质粒介导的青霉素酶TEM-2。这些菌株因此对青霉素、特别是氨基青霉素或A青霉素(氨苄青霉素)、羧基青霉素或C青霉素(替卡西林)及脲基类青霉素(ureidopenicillin)或青霉素U(哌拉西林)敏感。

不属于大肠杆菌种的VIR10、VIR19和VIR28菌株呈现出R类别少于2个的跃迁，其因此不表达TEM-2，从而证实该方法的特异性。

大肠杆菌的VIR41、VIR42、VIR43和VIR44样品呈现出V类别4个以上的阳性跃迁，其因此表达志贺1或2(STX1或STX2)毒素。更特别地，对于VIR41，118至125的跃迁是阳性的，VIR41因此同时表达志贺毒素1和志贺毒素2。VIR42和VIR44对于跃迁121至125是阳性的，其因此表达志贺毒素2。对于VIR45是同样的，其呈现出跃迁123和124。VIR43，其呈现出跃迁118至122，表达志贺毒素2。另一方面，大肠杆菌的AST1、AST2、AST3、AST4、AST5、VIR45、ID6、ID7、ID8、ID9和ID10菌株呈现出少于3个的阳性跃迁，因此其不表达志贺毒素。这些菌株因此不具有志贺毒素相关毒力的性质。

不属于大肠杆菌种的VIR10、VIR19和VIR28菌株也呈现出V类别少于3个的跃迁，因此其不表达stx1或stx2，从而证实该方法的特异性。

对于分型而言，将每个菌株的T类别跃迁与作为参考菌株的其它菌株的跃迁进行对比。在实践中，当两个菌株之间的跃迁归为相同类别(阳性或阴性)时，赋值为0；当两个菌株之间的跃迁归为不同类别时(阳性跃迁和阴性跃迁)。赋值为1。计算每个菌株对的所有T-类别跃迁的总数数值以确定得分。得分示于表12。

表12

	AST1	AST2	AST3	AST4	AST5	VIR41	VIR42	VIR43	VIR44	VIR45	ID6	ID7	ID8	ID9	ID10	VIR10	VIR19	VIR28
																			AST1	0	19	18	18	19	17	12	15	17	16	3	11	12	11	9	92	92	95
AST2	19	0	3	3	2	24	21	18	22	19	22	22	23	22	22	109	109	112
																			AST3	18	3	0	0	1	25	22	21	23	20	19	19	20	19	19	106	106	109
AST4	18	3	0	0	1	25	22	21	23	20	19	19	20	19	19	106	106	109
																			AST5	19	2	1	1	0	24	23	20	24	21	20	20	21	20	20	107	107	110
VIR41	17	24	25	25	24	0	5	6	12	13	16	22	23	20	20	105	105	108
																			VIR42	12	21	22	22	23	5	0	7	7	8	13	19	20	17	17	102	102	105
VIR43	15	18	21	21	20	6	7	0	10	9	16	20	21	18	20	105	105	108
																			VIR44	17	22	23	23	24	12	7	10	0	5	18	22	23	22	22	103	103	106
VIR45	16	19	20	20	21	13	8	9	5	0	17	19	20	19	19	102	102	105
																			ID6	3	22	19	19	20	16	13	16	18	17	0	10	11	10	8	91	91	94
ID7	11	22	19	19	20	22	19	20	22	19	10	0	1	4	4	89	89	92
																			ID8	12	23	20	20	21	23	20	21	23	20	11	1	0	2	3	90	92	92
ID9	11	22	19	19	20	20	17	18	22	19	10	4	2	0	3	90	94	94
																			ID10	9	22	19	19	20	20	17	20	22	19	8	4	3	3	0	87	91	91
VIR10	92	109	106	106	107	105	102	105	103	102	91	89	90	90	87	～	～	～
																			VIR19	92	109	106	106	107	105	102	105	103	102	91	89	92	94	91	～	～	～
VIR28	95	112	109	109	110	108	105	108	106	105	94	92	92	94	91	～	～	～

因此，AST2、AST3、AST4和AST5菌株是相同类型。对于AS T1和ID6菌株及对于ID7、ID8、ID9和ID10菌株是同样的。所有成对的气压菌株是不同类型的。应注意在不是金黄色葡萄球菌的VIR10、VIR19和VIR28菌株及所有其它金黄色葡萄球菌菌株之间获得的较高的总和。这些结果证实该方法的特异性。

VIR10、VIR19和VIR28菌株是不同物种。这些菌株因此不能互相对比，在表12中未报告数值。

非常有利地，高于20的得分，如在AST4与VIR41之间，反映出菌株之间的显著分歧。得分在12-20之间，如在ID7与VIR42之间，反映出中等分歧；得分在4-12之间，如在ID10与AST1之间，反映出较弱分歧。

因此所述方法不仅可以确定两个菌株是否是相同类型的，这对于鉴别感染的共同位置是重要的，但是也可以估计两个菌株的相近性，这对于流行病学研究非常重要。

这个实施例示出本发明可以非常有利地在非常短的少于1小时的时间内证实物种如大肠杆菌的身份，及在同一分析内同时确定分型性质及对于至少一种抗生素的潜在抗性，及确定毒力因子的存在。这些性质使用相同仪器确定，这极大地便于分析和报告结果。最后，细菌的特征是使用细菌蛋白质确定的，其反映出活的及可存活的微生物的存在，与使用细菌DNA的鉴定不同，使用细菌DNA的鉴定方法由于存在死亡的细菌可导致结果有误差。

实施例8：在存在甲醇条件下消化微生物的方案

常规地，在17个步骤中实施如下方案：

1.取样根据实施例1获得的微生物菌落，悬浮于400μl的50mM碳酸氢铵溶液pH=8.0中。

2.加入600μl甲醇。

步骤3-7：与实施例4的步骤2-6相同。

步骤8-17：与实施例6的步骤8-17相同。

实施例9：鉴定白色念珠菌样品

分析17个白色念珠菌居住，以证实其鉴别及确定其特征：

对不属于白色念珠菌的物种应用相同方法，以作为阴性对照：

·大肠杆菌 VIR43

·金黄色葡萄球菌 VIR5

·粪肠球菌 AST-VAN8

根据实施例8所述处理每个样品，然后注射体积为5μl的消化的蛋白质，及根据实施例7所述相同条件进行分析。

·以MRM模式使用质谱分析仪分析得自微生物蛋白质消化的肽。仅检测表13中所示肽。为此，检测表13中所示第一代碎片。每个跃迁(即与其第一代碎片相关的每个肽)使得可以对其应答的应用，在表14中临床感兴趣一列中用字母I、T、R和V列出。I表示证实微生物的鉴别，T表示分型，R表示对于至少一种抗生素的抗性，V表达毒力因子的检测。

表13

前体肽的电荷状态、其保留时间和跃迁，即Q1中(m/z)₁与Q3中(m/z)₂的比率，在表14中示出。用于碎裂先驱离子的碰撞能量也在表14中示出。

表14

使用的其它机械参数与实施例7中所述相同。测量针对每个跃迁及每个研究的微生物获得的面积。面积大于或等于2000(任意单位)的所有跃迁均被认为是阳性的，在表15A和15B中以“1”表达。面积低于2000的所有跃迁均被认为是阴性的，在表15A和15B中以0表达。当观测到无信号峰时，所述跃迁标示为阴性。

表15A

表15B

然后计算I、R和V应用的阳性跃迁数的总和，在表16中报告。

表16

所有白色念珠菌样品均呈现出在I类别60个以上的跃迁。所有这些样品因此均证实确实属于白色念珠菌物种。

另一方面，VIR43、VIR5和AST-VAN8样品呈现出在I类别少于13个的阳性跃迁，这些样品因此被证实不属于白色念珠菌物种。

观测到跃迁84和85表示存在突变的肽及反映出ATF6和ATF7菌株抗性。

观测到跃迁86和87表示存在突变的肽及反映出ATF2和ATF3菌株抗性。

观测到跃迁96表示存在突变的肽及反映出ATF5菌株抗性。

观测到跃迁99和100表示存在突变的肽及反映出ATF7菌株抗性。

观测到跃迁88和89表示存在天然的肽及反映出ATF4菌株敏感性。

观测到跃迁93和94表示存在天然的肽及反映出ATF1和ATF4菌株敏感性。

计算I跃迁的所有面积的总和以提供SI总和。计算V跃迁的所有面积以提供SV总和。然后计算SV/SI比率，乘以乘法因子MF。获得的结果在表17中示出。

表17

VIR31和VIR32菌株的(SV/SI)比率×MF大于9×10⁴，其过表达脂肪酶8，这些菌株因此是毒性的。所有其它菌株比率低于9×10⁴，其不过表达脂肪酶8，及因此不是毒性的。令人感兴趣地，由于(SV/SI)比率×MF对于VIR31菌株高于对于VIR32菌株，因此鉴定VIR31菌株比VIR32菌株更具毒性。

对于分型而言，将每个菌株的T类别跃迁与被认为是参考菌株的其它菌株的跃迁相对比。实际上，当两个菌株之间的跃迁归于相同类别(阳性或阴性)时，赋值为0,；当两个菌株之间的跃迁归为不同类别(阳性跃迁及阴性跃迁)时，赋值为1。计算每个菌株的所有T类别跃迁的数值总和，以确定得分。得分在表18中示出。

表18

得分低于或等于2的菌株是相同类型，得分完全大于2的菌株是不同类型。

因此，ATF1与ATF2、VIR35与VIR36，及VIR37与VIR38菌株分别是相同类型。所有其它成对菌株是不同类型。应注意在不是金黄色葡萄球菌的VIR43、VIR5和AST-VAN8菌株及是金黄色葡萄球菌的所有其它菌株之间获得的较高总和。这些结果证实该方法的特异性。

VIR43、VIR5和AST-VAN8菌株是不同物种。这些菌株因此不能互相对比，在表18中未报告数值。

非常有利地，如在ATF1与VIR39之间的得分高于20，反映出菌株之间的巨大差异。如在CA16与ATF1之间的得分在14-20之间，反映出中等差异，及如在ATF1与ATF7之间的得分在4-14之间，反映出微弱差异。

如此实施的所述方法因此不仅可以确定两个菌株是否是相同类型，这对于鉴别感染的普通场所是重要的，而且可以估计两个菌株的相近性，这对于流行病学研究非常重要。

这个实施例示出本发明可以非常有利地在非常短的少于1小时的时间内证实物种如白色念珠菌的身份，及在同一分析内同时确定分型及对于至少一种抗生素抗性的性质，及确定毒力因子的存在。本发明还可以定量测定，当对于至少一种抗生素的抗性或毒力性质与蛋白质或代谢物的表达水平相关时，定量测定是特别有益的。这是为什么我们在此举例说明脂肪酶8的定量测定的原因。这些性质使用同一仪器确定，这样极大地便于分析及报告结果。最后，酵母的特征是使用真菌蛋白质确定的，其反映出活的及可存活的微生物的存在，与使用真菌DNA的鉴定不同，使用真菌DNA的鉴定方法由于存在死亡的酵母可导致结果有误差。

实施例10：适于测定至少一种微生物的在存在甲醇条件下消化微生物的方案

常规地，在19个步骤中实施如下方案。

1.取样根据实施例1获得的5个微生物菌落，悬浮于100μl的6M盐酸胍、50mM Tris-HCl溶液pH=8.0中

2.在15000g离心5分钟。

3.将沉淀置于400μl的50mM碳酸氢铵溶液pH=8.0中。

4.加入600μl甲醇。

步骤5-9：与实施例4的步骤2-6相同。

步骤10-19：与实施例6的步骤8-17相同。

实施例11：通过同时分析蛋白质和代谢物鉴定白色念珠菌样品

在根据实施例1-3所述任一方法确定一或多个物种样品之后，分析下文列出的样品。

分析5个白色念珠菌菌株，以证实其鉴别及确定其特征：

ATF1 ATF2

ATF3 ATF4

ATF6

根据实施例10所述处理每个样品，然后注射20μl体积的消化的蛋白质，根据与实施例7所述相同条件分析。

表13和14除了一处之外是相同的。在所述方法中加入跃迁数109。其相应于临床感兴趣的I和R的麦角固醇分子。

所述前体的电荷状态是1，保留时间是36.3分钟，在Q1中过滤的m/z是379.4，在Q3中过滤的m/z是69.2，碰撞能量是47。

质谱分析仪与实施例7的质谱分析仪除了下文所述参数之外是相同的。

气幕: 25.00psi

源温度: 450.00°C

加热气体: 50.00psi

Q0前的进入电压(EP): 4.00V

对于跃迁109，参数不同：

去簇电压(DP): 200.00V

Q0前的进入电压(EP): 10.00V

碰撞室脱离电压(CXP): 8V

以与实施例9相同方式分析所有跃迁1-108。计算I跃迁的所有面积的总和，提供SI总和。跃迁109的面积被称作A109。然后计算A109/SI 比率，乘以乘法因子MF。获得的结果在表19中示出。

表19

(A109/SI)比率×MF大于2×10³的菌株ATF2、ATF3和ATF6菌株过表达麦角固醇；这些菌株因此是抗性的。所有其它菌株的比率小于2×10³，其不表达麦角固醇及因此不是抗性的。

这个实施例示出本发明可以非常有利地在同一分析内在非常短的少于1小时的时间内同时测定及定量各种化合物，如蛋白质、肽或者代谢物。甚至比测定蛋白质更有利地，定量测定得自这个蛋白质的作用的代谢物可以鉴定功能性蛋白质及更广泛的功能性合成途径的存在。因此，在这种情况中麦角固醇的量化可以确定对氟康唑抗性机制的存在，其与功能性及强活性羊毛甾醇去甲基酶的存在相关联。

实施例12：鉴定尿液样品中存在的微生物

在根据实施例1-3所述任一方法确定一或多个物种样品之后，分析5个污染大肠杆菌的尿液样品(尿液1-5)。也分析未污染的第6个尿液样品(尿液6)以作为阴性对照。

如下方案在29个步骤中实施(步骤5-12是任选的，可以省略而不明显改变结果)：

1.在2000g将5ml污染的尿液离心30秒。

2.回收上清。

3.在15000g离心5分钟。

4.除去上清。

5.用3ml蒸馏水通过重悬浮洗涤沉淀。

6.在15000g离心5分钟。

7.除去上清。

8.将沉淀与1/10稀释的溶剂接触。

9.在-20℃放置1小时。

10.在15000g离心5分钟。

11.除去上清。

12.将沉淀与1/10稀释的溶剂接触。

13.在-20℃放置1小时。

14.在15000g离心5分钟。

15.除去上清。

12.将沉淀悬浮于10-100μl的6M盐酸胍、50mM Tris-HCl溶液pH=8.0中。

13.步骤14-18：与实施例4的步骤2-6相同。

19.步骤19-28：与实施例6的步骤8-17相同。

29.将酸化的洗脱物注射进色谱系统和质谱分析仪中，根据实施例7所述方案进行。

测量每个跃迁及每个研究的微生物获得的面积。由于尿液样品具有彼此极不相同的细菌荷载，因此实施例7中断定阳性跃迁而使用的阈值在此不可使用。其必须加以调整以适应存在的细菌的量。在先前的实施例中，菌落取样获得相似的微生物量。在这个实施例中不在是这种情况。因此，通过所有I跃迁面积的总和估计细菌的量。I跃迁的面积总和在表20中报告。

表20

尿液1	尿液2	尿液3	尿液4	尿液5	尿液6
						1509251.3	828079.5	5349271.0	11918946.9	1054480.6	0.0

因此，样品4包含的细菌荷载高于样品3，其自身具有高于实施例1和5的荷载，实施例1和5自身具有高于样品2的荷载。样品1和5具有相当的细菌荷载。样品6不包含大肠杆菌，呈现出零荷载，从而证实该技术的特异性。

然后将每个跃迁面积通过将其除以所有I跃迁的面积而标准化。该比率高于或等于0.00015(无因次比率)的所有跃迁被认为是阳性，在表21中标示为1。该比率低于0.00015的所有跃迁被认为是阴性的，在表21中标示为0。当观测到无信号峰时，所述跃迁被标示为阴性。

表21

然后计算I、R和V应用的阳性跃迁总数，在表22中报告。

表22

	尿液1	尿液2	尿液3	尿液4	尿液5	尿液6
							I	36	36	40	44	41	0
R	6	6	6	0	5	0
							V	1	1	1	0	0	0

以与跃迁阳性相同方式，需要修饰阈值以顾及样品浓度，鉴定一个菌株必需的肽的数目必须适应细菌总浓度。如果细菌的量低于一个菌落，则在实施例7中某些微弱检测的肽可以在检测限度之下。

尿液1-5呈现出I类别的30个以上阳性跃迁。所有这些样品因此均被证实污染大肠杆菌物种。

另一方面，尿液6呈现出无I类别阳性跃迁。因此证实其未污染大肠杆菌物种。

尿液1、2、3和5呈现出R类别的至少5个阳性跃迁，其因此表达质粒介导的青霉素酶TEM-2，这与青霉素、特别是氨基青霉素或者A青霉素(氨苄青霉素)、羧基青霉素或C青霉素(替卡西林)及脲基类青霉素或青霉素U (哌拉西林)抗性机制同义。

另一方面，尿液4和6未呈现出R类别的阳性跃迁，其因此不表达质粒介导的青霉素酶TEM-2。这些菌株因此对青霉素敏感。

这些氨苄青霉素、替卡西林和哌拉西林抗性结果通过用由本申请人销售的2自动装置及AST-EXN和AST-N103卡证实。所述证实在

2自动装置上花费6-8小时，比本发明的方法慢。

尿液1-6不呈现出V类别的一个以上的阳性跃迁。这些尿液因此未污染志贺毒素类型毒素。

对于分型而言，将每个菌株的T类别跃迁与作为参考菌株的其它菌株的跃迁进行对比。在实践中，当两个菌株之间的跃迁归为相同类别(阳性或阴性)时，赋值为0；当两个菌株之间的跃迁归为不同类别时(阳性跃迁和阴性跃迁)。赋值为1。计算每个菌株对的所有T-类别跃迁的总数数值以确定得分。得分示于表23。

表23

	尿液1	尿液2	尿液3	尿液4	尿液5
						尿液1	0	11	13	19	15
尿液2	11	0	16	24	20
						尿液3	13	16	0	16	12
尿液4	19	24	16	0	8
						尿液5	15	20	12	8	0

无尿液样品得分低于或等于4。感染尿液样品1-5的菌株因此是不同类型。将这些尿液样品收集在感染通常在不同环境中发生的当地医学检验实验室中。在这些条件下，罕见地观测到与相同菌株相关的尿液感染。

这个实施例示出本发明非常有利地可以从原始样品中直接证实物种如大肠杆菌的身份，及在同一分析内同时确定分型性质及对于至少一种抗生素的潜在抗性。

参考文献

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Claims

1.从样品中鉴定至少一种微生物的方法，包括鉴别所述至少一种微生物以及确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于对所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。

2.权利要求1的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质所实施的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。

3.权利要求2的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述MS/MS质谱分析是MRM。

4.权利要求1-3任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是在相同的质谱分析装置中实施的。

5.权利要求4的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种微生物的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是同时实施的。

6.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物也是通过质谱分析实施的。

7.权利要求6的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物的质谱分析是MS型、MS/MS型、或者MS型及随后MS/MS型的质谱分析。

8.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于其包括证实所述至少一种微生物的鉴别的额外步骤，所述证实步骤是通过质谱分析实施的。

9.权利要求8的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。

10.权利要求9的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是MRM。

11.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记是所述至少一种微生物的蛋白质。

12.权利要求11的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述微生物的蛋白质被消化成肽。

13.权利要求12的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述消化是用酶来进行的。

14.权利要求13的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述酶是胰蛋白酶。

15.前述权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述至少一种微生物是细菌，并且所述抗微生物剂是抗生素。

16.权利要求15的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述细菌是金黄色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)。

17.权利要求16的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQ ID No.2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44或45所示序列的至少一种肽。

18.权利要求16或17的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对至少一种抗生素潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQ ID No.10-17所示序列的至少一种肽。

19.权利要求16-18任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQ ID No.19、20、21、23或24所示序列的至少一种肽。

20.权利要求16-19任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQ ID No.26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44和45所示序列的至少一种肽。

21.权利要求15的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述细菌是大肠杆菌(Escherichia.coli)。

22.权利要求21的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQ ID No.46-87所示序列的至少一种肽。

23.权利要求21或22的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于至少一种抗生素潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQ ID No.85、86和87所示序列的至少一种肽。

24.权利要求21-23任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQ ID No.62-66所示序列的至少一种肽。

25.权利要求21-24任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQ ID No.46-61所示序列的至少一种肽。

26.权利要求1-14的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述至少一种微生物是酵母，并且所述抗微生物剂是抗真菌剂。

27.权利要求26的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述酵母是白色念珠菌(Candida albicans)。

28.权利要求27的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有SEQ ID No.88-125和177所示序列的至少一种肽。

29.权利要求27或28的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于至少一种抗真菌剂的潜在抗性的性质的确定是使用具有SEQ ID No.117-122和177所示序列的至少一种肽。

30.权利要求27-29任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对毒力的确定是使用具有SEQ ID No.123-125所示序列的至少一种肽。

31.权利要求27-30任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述鉴别是使用具有SEQ ID No.88-116所示序列的至少一种肽。

32.前述任一项权利要求的鉴别至少一种微生物的方法，特征在于所述代谢物是麦角固醇。

33.具有SEQ ID No.2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44-125和177所示序列的肽。