KR101833419B1 - 질량분석에 의해 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플로부터 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 미생물을 동정하는 단계와 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 잠재적 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 미생물에 대해 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계는 상기 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성의 마커로서 단백질, 펩티드 및/또는 대사물질을 사용하여 질량분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 미생물학적 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 질량분석을 사용하여 샘플의 미생물을 특징화하는 것에 관한 것이다.
파스퇴르에 의해 미생물이 발견된 이후, 미생물들은 현미경관찰 및 생화학 분석에 의해 연구되어 왔다. 이러한 통상의 방법들은 종종 기간이 길고 힘들며, 대안적인 분석법들을 찾으려는 시도가 있었다. 이에 따라, 질량분석에 의한 박테리아 분석이 문헌 'J. Anhalt and C. Fenselau[1]'에 의해 1975년에 이미 개시되었다.
상기 예비적 연구들 이후에, 질량분석(GC-MS)과 결합된 가스 크로마토그래피에 의한 미생물 벽 지방산의 연구가 행해졌다[2]. 이러한 방법은 FAME(Fatty Acid Methyl Ester)라는 이름으로 대중화되었다. 이는 현재 분류학적 연구의 참조 방법을 구성한다. 그러나, 이를 사용하는 것은 비누화, 가수분해 및 유도에 의한 샘플의 처리를 마스터한 특정 전문 연구원들에게만 한정된다.
1996년에, M. Claydon 등[3]의 연구와 T. Krishnamurthy 및 P. Ross[4]의 연구는 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight) 유형의 질량분석기를 사용하여 다양한 박테리아 종들을 동정하는 가능성을 보여주었다. 상기 분석은 질량 스펙트럼의 획득과 전문 소프트웨어에 의한 판독을 조합한다. 이는 매우 단순하며, 몇 분 내에 수행될 수 있다. 그러나, 이는 매우 최근에서야 의료 테스트 실험실에 널리 퍼지게 되었다[5]. 이의 임상적인 사용은 현재 박테리아와 효모 종을 동정하는 것에 제한된다. 이는 항미생물제(antimicrobials)에 대한 내성을 유형화하거나 동정화하는데 사용되지 않으며, 병원성(virulence)을 분석하는데 사용되지 않는다.
그러나, 미생물들을 특징화하는 것은 임상 분야와 산업 분야 모두에서 본질적이다. 따라서, 예를 들어 항생물질(antibiotics)과 같은 항미생물제에 대한 내성의 동정과 병원성 인자의 검출은 환자의 가장 적합한 치료를 보장하기 위해 필수적인 요소이다. 이와 유사하게, 유형화는 전염병학적 연구와 병원감염 질환의 방지에 중요하다.
질량분석의 다른 방법들, 특히 탠덤 질량분석이 상기 요구를 충족시키기 위하여 제안되었다. 일례로서, 4극자-TOF(Q-TOF)에 의해 β-락타마제를 동정하기 위한 C. Fenselau 등의 연구[6], 3중 4극자에 의해 스타필로코쿠스 장내독소 C2(병원성 인자 SEC2)를 검출하기 위한 D. Ding 등의 연구[7], 또는 Q-TOF에 의해 클로스트리듐을 유형화하기 위한 R. Everley 등의 연구가 언급될 수 있다[8].
그러나, 이러한 연구 결과들은 일상적인 임상 용도로 적용될 수 없다. 이는 고도로 전문화된 자를 필요로 하는 연구 기기에 의해 수득되었다. 분석 시간은 샘플 당 1시간을 초과하는 경우가 자주 있으며, 미생물학적 테스트 시험의 작업량에 부적합하다. 마지막으로, 다양한 팀들에 의해 획득된 데이터는 특정 질문에 대해 답을 줄 수 있지만, 모든 임상적 요구에 대해 동시에 답을 주지 못한다.
보다 최근에, S. Hofstadler 등은 모든 임상적 요구를 충족시키는 방법을 제안하였다[9]. 그들은 PCR에 의한 미생물 게놈의 증폭을 ESI-TOF(electrospray-TOF)에 의한 PCR 산물의 검출과 조합하였다. 이러한 방법은 이제 완전히 자동화된다[10]. 그러나, 이는 분자생물학적으로 고유한 결함, 즉 프로브의 비용, 추출 수율 등을 갖는 PCR 증폭을 필요로 한다.
본 명세서에서, 본 발명의 목적은 미생물을 특징화하는 방법, 즉 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성을 동정하고 결정하는 방법을 제공하는 것으로서, 이는 선행기술의 방법들의 단점을 극복할 수 있으며, 특히 분자생물학적 방법들에 비해 비싸지 않고 각각의 종에 대해 특이적인 시약이 필요하지 않으며, 1시간 미만의 짧은 시간안에 결과를 제공하며, 고도로 전문화된 인력을 요구하지 않으면서 임상에서 일상적으로 사용될 수 있다. 또한, 미생물을 특징화하는 전체 방법은 유리하게 동일한 질량분석기에 의해 수행될 수 있으며, 이에 따라 미생물학적 테스트 실험의 기기를 단순화시킬 수 있다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 샘플로부터 하나 이상의 미생물을 특징화하는 신규한 방법을 제안하며, 이는 상기 하나 이상의 미생물을 동정하는 단계와 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 잠재적 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 미생물에 대해 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계는 상기 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성의 마커로서 단백질, 펩티드 및/또는 대사물질을 사용하여 질량분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 방법에 의해 미생물을 특징화하기 위한 3개 이상의 특성들이 특징화하려는 미생물을 대표하는 단백질, 펩티드 또는 대사물질을 마커로서 사용하여 질량분석 기법에 의해 이용된다.
본 발명의 방법에 의해 특징화될 수 있는 미생물은 산업적 및 임상적으로 모두 접하게 되는 모든 병원성 또는 비병원성 미생물들이다. 이들은 박테리아, 바이러스, 원생동물 또는 효모일 수 있다.
"유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성의 마커"라는 표현은 상기 특성을 특징화하는 분자로서 단백질 또는 대사에서 기원한 것을 의미한다.
"미생물의 유형화(typing)"라는 표현은 동일한 종 내에서 수개의 균주들을 구별하는 것을 의미한다. 유형화는 전염병학적 값을 가지며; 임상의는 환자로부터 분리된 균주가 다른 환자 또는 주변환경으로부터 분리되고 명백하게 동일한 다른 균주들과 동일한 원에서 유래된 것인지 여부를 안다. 따라서, 이는 식중독 시기에 또는 병원에서 감염의 중심지를 밝히는 것을 가능하게 한다. 박테리아에서 유형화 특징의 마커의 비제한적인 예로서, 특징적인 돌연변이를 갖는 펩티드, 예컨대 대장균의 adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA 및 recA 유전자의 전사 산물, 및 스타필로코쿠스 아우레우스의 arc, aroE, glpF, gmk, pta, tpi 및 yqiL 유전자의 전사 산물이 언급될 수 있다. 원생동물에서 유형화 특징의 마커의 비제한적인 예로서, E. 디스파르 및 엔타모에바 히스톨리티카의 키티나제 유전자의 산물이 언급될 수 있다. 바이러스에서 유형화 특징의 마커의 비제한적인 예로서, 인간 면역결핍 바이러스의 폴리머라제 유전자의 산물이 언급될 수 있다. 마지막으로, 효모에서 유형화 특징의 마커의 비제한적인 예로서, 칸디다 알비칸스의 aat1a, acc1, adp1, mpib, sya1, vps13 및 zwf1b의 유전자 단편들의 전사 산물이 언급될 수 있다.
"하나 이상의 항미생물제에 대한 내성의 결정"이라는 표현은 항미생물제에 의한 파괴에 대한 미생물의 민감성을 결정하는 것을 의미한다. 따라서, 미생물이 박테리아라면 내성이 생길 수 있는 항미생물제는 항생물질이고, 미생물이 원생동물이라면 항미생물제는 항기생충제이고, 미생물이 바이러스라면 항미생물제는 항바이러스제이고, 미생물이 효모라면 항미생물제는 항균제이다. 내성 메카니즘에 관여하는 단백질은 과 및 종에 따라 다를 것이다. 박테리아에서 유용한 하나 이상의 항생물질에 대한 내성의 마커의 비제한적인 예로서, 메티실린에 대한 내성을 부여하는 스타필로코쿠스 아우레우스의 mecA 유전자의 전사 산물이 언급될 수 있으며, 이는 균주가 메티실린-내성(MRSA 균주)인지 아니면 메티실린-민감성(MSSA 균주)인지 여부를 나타낼 수 있게 해준다. 또한, TEM-2 단백질이 언급될 수 있으며, 이는 대장균 균주가 페니실린에 내성이지만 세팔로스포린 또는 카르바페넴과 같은 다른 군의 항생물질에 대해 민감성인지 여부를 나타낼 수 있게 해준다. 또다른 마커는 KPC(클렙시엘라 뉴모니애 카르바페네마제)라고 불리우는 효소이며, 이는 카르바페넴에 대한 내성을 부여한다. 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 내성 마커의 또다른 예는 2009년 ASMS 컨퍼런스에 제출된 포스터 "Metabolomics-based approach to antibiotic resistance in Staphylococcus aureus"에서 E. Alexander 등에 의해 기재된 바와 같이 반코마이신에 대한 내성을 나타내는 대사 프로파일이다. 원생동물에서 유용한 하나 이상의 항기생충제에 대한 내성의 마커의 비제한적인 예로서, 철-함유 슈퍼옥시드 디스무타제(Fe-SOD) 및 페록시레독신이 언급될 수 있으며, 이의 증가된 발현은 메트로니다졸에 대한 내성을 부여한다. 바이러스에서 유용한 하나 이상의 항바이러스제에 대한 내성의 마커의 비제한적인 예로서, 인간 면역결핍 바이러스 역전사효소의 돌연변이가 언급될 수 있으며, 이는 역전사효소 뉴클레오시드 억제제에 대해 감소된 민감성을 부여한다. 마지막으로, 효모에서 유용한 하나 이상의 항균제에 대한 내성의 마커의 비제한적인 예로서, 칸디다 알비칸스 1,3-b-D-글루칸 신타제 효소의 돌연변이가 언급될 수 있으며, 이는 에키노칸딘에 대해 감소된 민감성을 부여한다. 또다른 예로서, 칸디다 알비칸스에서 아졸 항균제에 대한 내성, 특히 플루코나졸에 대한 내성이 언급될 수 있다. 플루코나졸의 표적은 균류 벽의 주 성분인 에르고스테롤의 합성에 관여하는 효소인 라노스테롤 탈메틸효소이다. 플루코나졸에 대한 내성은 라노스테롤 탈메틸효소를 인코딩하는 erg11 유전자에서 점 돌연변이의 출현과 연관될 수 있다.
내성-특이적 마커는 본 출원인에 의해 입증된 바와 같이 유형화 마커로서 사용될 수도 있다는 점에 주목하여야 한다.
"미생물의 병원성의 결정"이라는 표현은 미생물의 발병적이고 유해하고 격렬한 성질을 평가하는 것을 의미한다. 박테리아에서 병원성 마커의 비제한적인 예로서, 스타필로코쿠스 아우레우스에 존재하는 2개의 상승 성분(LukFet LukS)을 갖는 세포용해 독소인 PVL(Panton-Valentine Leukocidin)이 언급될 수 있으며, 이는 피부상태, 광범위한 봉와직염, 골수염 및 괴사성폐렴을 야기하는 가장 치명적인 독소 중 하나로서 바이러스 중복감염에 관여한다. 또다른 예로서, 기도 감염, 수막염 및 세균혈증의 원인이 되는 종인 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 존재하는 오토리신 및 뉴몰리신이 언급되며, 또한 장의 공생 박테리아인 클로스트리듐 디피실리의 독소 A 및 B가 언급되며, 상기 독소는 장관상피의 투과성의 변형을 야기하거나(독소 A), 장관상피의 세포들을 직접적으로 공격하거나(독소 B), 또는 시간에 따른 장내 이동 및 장내 흡수를 감소시켜 설사를 야기한다(독소 A 및 B의 조합 작용). 또한, 일례로서 대장균에 존재하는 Shiga 독소 Stx1 및 Stx2가 언급될 수 있다. 이러한 2개의 세포독소는 장출혈성 대장균의 중요한 병원성 인자로 고려된다. 이들은 궤양성 대장염 또는 용혈성 요독 증후군과 같은 합병증의 원인이 된다. 원생동물에서 병원성 마커의 비제한적인 예로서, 이질 및 간농양의 원인이 되는 종인 엔타모에바 히스톨리티카에 존재하는 항산화제(Fe-히드로게나제 2, 페록시레독신, 슈퍼옥시드 디스무타제)가 언급될 수 있다. 바이러스에서 병원성 마커의 비제한적인 예로서, 인간에 있어서 더 병원성인 유형인 인간 면역결핍 바이러스 유형 1에서 Nef 단백질 변이체가 언급될 수 있다. 마지막으로, 효모에서 병원성 마커의 비제한적인 예로서, 표재성 칸디다증 뿐만 아니라 패혈증 및 파종성 칸디다증의 원인이 되는 종인 칸디다 알비칸스의 리파제 8이 언급될 수 있다.
병원성-특이적 마커는 본 출원인에 의해 입증된 바와 같이 유형화 마커로서 사용될 수도 있다는 점에 주목하여야 한다.
본 발명의 방법은 박테리아를 특징화하기 위해 수행될 수 있으며, 상기 항미생물제가 항생물질인 것은 본 발명의 일구현예를 구성한다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에 따라 특징화될 수 있는 박테리아로서 하기가 언급될 수 있다:
- 내성 및 유형화 마커로서 TEM-2를 사용하고 병원성 및 유형화 마커로서 Shiga 독소, OmpA를 사용하는 대장균,
- 내성 및 유형화를 위해 VanA 및 VanB를 사용하고 병원성 및 유형화를 위해 ESP(Enterococcal Surface Protein)를 사용하는 엔테로코쿠스 패칼리스 및 패시움, 또는
- 유형화를 위해 면역글로불린 G-결합 단백질 A(이는 단백질 A라고도 알려짐)로서 알려진 단백질을 사용하고, 내성을 위해 또는 심지어 유형화를 위해 PBP2a 단백질을 사용하고, 병원성을 위해 또는 심지어 유형화를 위해 PVL 단백질을 사용하는, 스타필로코쿠스 아우레우스.
본 발명의 방법에 따라 특징화될 수 있는 또다른 미생물로서 하기가 언급될 수 있다:
- 내성 및 유형화 마커로서 1,3-b-D-글루칸 신타제 효소 또는 라노스테롤 탈메틸효소를 사용하고, 병원성 및 유형화 마커로서 리파제 8을 사용하는, 칸디다 알비칸스.
본 발명의 방법이 수행될 수 있는 샘플은 표적 미생물을 함유할 수 있는 임의의 샘플이다. 상기 샘플은 생물학적 기원, 즉 동물, 식물 또는 인간 기원일 수 있다. 이는 생물학적 유체(예를 들어, 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 유기분비물) 시료, 조직 시료 또는 분리된 세포에 대응할 수 있다. 상기 시료는 미생물을 특징화하기 위한 마커가 테스트되는 시료에서 이용가능한 한 사용될 수 있거나, 또는 상기 시료는 분석에 앞서 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 방법들에 따라 증식, 추출, 농축, 정제 및/또는 배양 유형의 준비를 수행할 수 있는 한 사용될 수 있다.
상기 샘플은 산업적 기원일 수 있으며, 이는 즉 비제한적인 예에 따르면 공기의 시료, 물의 시료, 표면으로부터 획득된 시료, 물품 또는 생산품 또는 식품 기원의 산물일 수 있다. 식품 기원의 샘플 중에서, 비제한적으로는 유제품(요구르트, 치즈), 육류, 생선류, 달걀, 과일, 채소, 물 또는 음료(우유, 과일 쥬스, 소다 등) 샘플이 언급될 수 있다. 이러한 식품 기원의 샘플은 또한 원료 또는 요리된 음식으로부터 유래할 수 있다. 마지막으로, 식품 샘플은 특히 동물 식품과 같은 동물 사료로부터 유래될 수 있다.
미생물을 특징화하기 위한 마커가 단백질 기원일 경우, 질량분석에 의한 검출의 업스트림에서 분석대상인 샘플은 바람직하게는 샘플에 존재하는 모든 단백질들을 펩티드로 단편화시켜 펩티드를 생성하기 위해 사전처리되며, 이는 예를 들어 단백질분해 효소(프로테아제)에 의한 소화를 통해, 또는 화학 시약의 작용을 통해 이루어진다. 실제로, 단백질은 물리화학적 처리에 의해, 생물학적 처리에 의해, 또는 상기 2개의 처리의 조합에 의해 분열될 수 있다. 이용될 수 있는 처리법 중에서, 히드록실 라디칼, 특히 H2O2에 의한 처리가 언급될 수 있다. 히드록실 라디칼에 의한 처리는 펩티드 결합의 분해를 야기하며, 이는 단백질의 임의의 펩티드 결합상에서 임의적으로 발생한다. 히드록실 라디칼의 농도는 분해의 개수와 이에 따라 획득되는 펩티드 단편의 길이에 영향을 미친다. 다른 화학 처리법이 또한 사용될 수 있으며, 예를 들어 메티오닐 잔기의 카복실기의 수준에서 펩티드 결합을 특이적으로 깨뜨리는 브롬화시안(CNBr)에 의한 처리법이 있다. 트리플루오로아세트산 중 단백질의 용액을 1000℃에서 가열함으로써 아스파르틸 잔기에서 부분적 산 분해를 수행하는 것도 또한 가능하다.
효소적 소화에 의한 단백질의 처리는 물리화학적 처리에 비해서도 바람직하며, 그 이유는 단백질의 구조를 더 광범위하게 보존하고 또한 조절이 더 쉽기 때문이다. "효소적 소화(enzymatic digestion)"라는 용어는 적절한 반응조건하에서 하나 이상의 효소의 단일 작용 또는 조합 작용을 의미한다. 프로테아제로 불리우는 단백질분해 효소는 특이적 부위에서 단백질을 분해한다. 각각의 프로테아제는 일반적으로 동일한 분해를 항상 수행하는 아미노산의 서열을 인식한다. 특정 프로테아제들은 분해가 이루어지는 2개의 아미노산 서열 또는 단일 아미노산을 인식하고, 다른 프로테아제들은 더 긴 서열만 인식한다. 이러한 프로테아제들은 엔도프로테아제 또는 엑소프로테아제일 수 있다. 알려진 프로테아제들 중에서, WO2005/098071에 기재된 바와 같이 하기가 언급될 수 있다:
- 특이적 효소, 예컨대 Arg 및 Lys 잔기의 카복실기 수준에서 펩티드 결합을 분열시키는 트립신, 리신의 -CO 기의 펩티드 결합을 분열시키는 엔도리신, 방향족 잔기(Phe, Tyr 및 Trp)의 카복실기 수준에서 펩티드 결합을 가수분해시키는 키모트립신, 방향족 잔기(Phe, Tyr 및 Trp)의 NH2 기 수준에서 분해시키는 펩신, Glu 잔기의 카복실기 수준에서 펩티드 결합을 분해시키는 스타필로코쿠스 아우레우스의 V8 균주의 V8 프로테아제;
- 비특이적 효소, 예컨대 소수성 아미노산(Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe)의 NH2 기의 펩티드 결합을 가수분해시키는 바실러스 써모프로테오리티쿠스 박테리아 유래 써모리신, 제어된 반응조건(효소 농도 및 반응 시간) 하에서 모든 결합들을 거의 가수분해하여 단백질을 올리고펩티드로 전환할 수 있는 박테리아 프로테아제인 서브틸리신 및 프로나제.
작용 방법이 양립가능하거나 연속적으로 사용될 수 있다면, 수개의 프로테아제들은 동시에 사용될 수 있다. 본 발명에서, 샘플의 소화는 바람직하게는 프로테아제 효소, 예를 들어 트립신의 작용을 통해 수행된다.
화학 시약 또는 프로테아제를 사용한 펩티드의 생성은 용액 내에서 단순한 반응에 의해 획득될 수 있다. 이는 마이크로웨이브 오븐에 의해 수행될 수 있거나[11], 가압하에서 수행될 수 있거나[12], 또는 선택적으로는 초음파 기기에 의해 수행될 수 있다[13]. 후자의 3가지 경우에서, 프로토콜은 훨씬 더 빠를 것이다.
이에 따라 획득되는 펩티드 중에서, 단백질에 특이적인 펩티드는 프로테오타입(proteotypic) 펩티드로 불리워진다. 이는 질량분석에 의해 분석될 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 특징화 마커는 특징화하려는 미생물의 단백질이다. 특히, 상기 단백질은 바람직하게는 효소에 의해, 더 바람직하게는 트립신에 의해 펩티드로 소화된다.
이와 유사하게, 단백질 기원의 특징화 마커를 함유하는 샘플은 정제 목적을 위해 사전처리될 수도 있다. 상기 마커가 단백질 기원일 경우, 이러한 정제 사전처리는 전술한 바와 같은 펩티드를 생성하는 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.
샘플 정제 사전처리는 당업계의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있으며, 이는 특히 원심분리, 여과, 전기영동 또는 크로마토그래피 기법들을 수행한다. 이러한 분리 기법들은 단독으로 사용되거나, 또는 다차원적 분리를 얻기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 다차원적 크로마토그래피는 T. Fortin 등[14] 또는 H. Keshishian 등[15]에 의해 기재된 바와 같이 역상 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피 분리를 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 문헌들에서, 크로마토그래피 매질은 컬럼 또는 카트리지(고체상 추출)일 수 있다.
프로테오타입 펩티드의 전기영동 또는 크로마토그래피 분획(또는 단차원적 또는 다차원적 크로마토그래피에서 보유시간)은 각각의 펩티드를 특징지워주며, 따라서 이러한 기법들의 수행은 분석되어지는 프로테오타입 펩티드(들)를 선택할 수 있게 해준다. 생성된 펩티드의 상기 분획법은 질량분석에 의한 차후 분석의 특이성을 증가시킬 수 있게 해준다.
펩티드 분획에 대해 전기영동 또는 크로마토그래피 기법의 대안은 N-글리코펩티드를 특이적으로 정제하는 것으로 구성된다([16] 및 특허출원 WO 2008/066629). 그럼에도 불구하고, 상기 정제는 오직 N-글리코실화 유형의 후번역 변형을 수행한 펩티드의 정량화만을 허용한다. 그러나, 모든 단백질이 글리코실화되지 않으며, 이에 따라 그의 사용을 제한한다.
본 발명의 방법에서 수행되는 질량분석은 다양한 유형의 분자들을 분석하고 검출하기 위한 강력한 툴로써 당업계의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 일반적으로, 이온화될 수 있는 임의 유형의 분자는 질량분석기를 사용하여 그의 분자량의 함수로서 검출될 수 있다. 검출하려는 분자, 단백질 또는 대사 기원의 성질에 따라, 특정 질량분석 기법이 더 적합할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 검출을 위해 사용되는 질량분석 방법이 무엇이든지간에, 표적 분자를 분자 이온으로 지칭되는 이온으로 이온화하는 단계를 포함하며, 본 케이스의 경우 특징화 마커를 이온화하는 단계 및 중량의 함수로서 획득된 분자 이온을 분리하는 단계를 포함한다.
따라서, 모든 질량분석기들은 하기를 포함한다:
i) 분석하려는 샘플에 존재하는 마커를 이온화하기 위한 이온화 원, 즉 상기 마커에게 양전하 또는 음전하를 제공하기 위한 이온화 원;
ii) 이온화된 마커 또는 분자 이온을 그의 질량 대 전하 비(m /z)에 따라 분리하기 위한 질량 분석 장치;
iii) 하기에서 상술한 바와 같은, 분자 이온에 의해 직접적으로 생성되거나 또는 분자 이온으로부터 생성된 이온에 의해 생성되는 신호를 측정하기 위한 검출기.
질량분석을 수행하기 위해 필요한 이온화 단계는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이온화 원은 분석하려는 분자를 이온화된 기체 상태가 될 수 있게 한다. 이온화 원은 양이온을 시험하기 위해 포지티브 모드에서 사용될 수 있거나, 또는 음이온을 시험하기 위해 네거티브 모드에서 사용될 수도 있다. 여러 유형의 원이 존재하며, 분석하려는 분자와 원하는 결과에 따라 사용될 것이다. 특히, 하기의 것이 언급될 수 있다:
- EI(electron ionization), CI(chemical ionization) 및 DCI(desorption-chemical ionization),
- FAB(fast atom bombardment), MAB(metastable atom bombardment) 또는 이온충격(SIMS, LSIMS),
- ICP(inductively coupled plasma),
- APCI(atmospheric pressure chemical ionization) 및 APPI(atmospheric pressure photoionization),
- ESI(electrospray ionization),
- MALDI(matrix assisted laser desorption ionization), SELDI(surface enhanced laser desorption ionization) 또는 DIOS(desorption/ionization on silicon),
- 준안정 종과의 상호작용에 의한 이온화-탈착(DART).
특히, 이온화는 하기에 따라 수행될 수 있다: 표적 분자를 함유하는 샘플이 이온화 원으로 도입되고, 여기서 상기 분자는 기체 상태에서 이온화되고, 이에 따라 초기 분자에 대응하는 분자 이온으로 전환된다. 전기부문 유형의 이온화 원(ESI(ElectroSpray Ionisation))은 분자를 이온화하는 동시에 액체 상태에서 기체 상태로 진행되도록 한다. 그 후 획득된 분자 이온은 액체 상태로 존재하는 분자에 대응하며, 이는 포지티브 모드에서 1개, 2개 또는 3개의 추가 양성자 또는 그 이상을 가지며 이에 따라 1개, 2개 또는 3개의 전하 또는 그 이상을 운반한다. 예를 들어 표적 분자가 단백질인 경우, 포지티브 모드에서 작동하는 전기분무 유형의 원에 의해 표적 단백질의 단편화 이후에 획득된 프로테오타입 펩티드의 이온화는, 1개, 2개 또는 3개의 추가 양성자 또는 그 이상을 갖고 이에 따라 1개, 2개 또는 3개의 전하 또는 그 이상을 운반하는 기체 상태의 폴리펩티드 이온을 생성하며, 이는 액체 상태에서 기체 상태로의 변화를 가져온다[17]. 이러한 유형의 원은 특히 표적 분자 또는 획득된 프로테오타입 펩티드가 역상 액체 크로마토그래피에 의해 미리 분리된 경우에 적합하다. 그럼에도 불구하고, 샘플에 존재하는 분자의 이온화로부터의 수율은 존재하는 다양한 종들의 농도와 성질에 따라 달라질 수 있다. 이러한 현상은 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 매트릭스 효과를 야기한다.
MALDI 이온화 원은 고체 상태의 샘플로부터 분자를 이온화하는 것을 가능하게 할 것이다.
이온화된 마커를 그의 질량/전하 비(m/z)의 함수로서 분리하는 단계가 수행되는 질량 분석 장치는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 질량 분석장치이다. 4극자(Q), 이온 트랩이라고도 불리우는 3D 이온 트랩(IT) 또는 선형 이온 트랩(LIT) 유형의 저해상도 분석장치, 및 분석물의 정확한 질량을 측정하기 위해 특히 전기 섹터에 결합된 자기 섹터, TOF(time of flight)를 사용하는 고해상도 분석장치가 언급될 수 있다.
m/z 비에 따른 분자 이온의 분리는 단일 시간이 수행될 수 있거나(단일 질량분석 또는 MS), 또는 여러 개의 연속적인 MS 분리가 수행될 수도 있다. 2개의 연속적인 MS 분리가 수행되는 경우, 분석은 MS/MS 또는 MS2으로 불리워진다. 3개의 연속적인 MS 분리가 수행되는 경우, 분석은 MS/MS/MS 또는 MS3으로 불리워지며, 더 일반적으로는 n개의 연속적인 MS 분리가 수행될 때 분석은 MSn으로 불리워진다.
여러 개의 연속적인 분리를 수행하는 기법들 중에서, 단일 표적 분자를 검출하거나 분석할 경우에 SRM(Selected Reaction Monitoring) 모드, 또는 여러 개의 표적 분자들을 검출하거나 분석할 경우에 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 모드는 특히 MS2 분리를 사용한다. 이와 유사하게, MRM3 모드는 MS/MS/MS에 의한 분리를 특히 사용한다. 이어서, 표적화 질량분석이라는 기법이 사용된다.
단일 MS 모드에서 검출의 경우, 획득되는 분자 이온의 질량/전하 비는 검출하려는 표적 분자와 연관된다.
MS/MS 모드에서 검출의 경우, MS 분석에 비해 2개의 단계가 본질적으로 추가되며, 이는 하기와 같다:
i) 1세대 단편 이온이라고 불리우는 이온을 제공하기 위하여, 전구 이온이라고 지칭되는 분자 이온의 단편화, 및
ii) 전구 이온의 비(m/z)에 대응하는 비(m/z)1, 질량(m/z)2에 따라 1세대 단편 이온이라고 불리우는 이온의 분리.
이에 따라 획득된 1세대 단편 이온의 질량/전하 비는 검출하려는 표적 분자와 연관된다. "1세대 단편 이온(first-generation fragment ion)"이라는 용어는 단편화 단계 이후에 전구 이온으로부터 생성된 이온을 의미하는 것으로서, 이의 질량 대 전하 비 m/z는 전구 이온과 다르다.
(m/z)1 및 (m/z)2의 쌍은 전이체(transition)라고 지칭되며, 이는 검출하려는 특징적 이온을 나타낸다.
표적 분자와 연관되기 위해 검출하려는 특징적 이온의 선택은 당업계의 통상의 기술자에 의해 표준 방법에 따라 이루어진다. 그 선택은 유리하게는 재현성 및 신뢰성의 측면에서 가능한한 민감하고 가능한한 특이적이고 가능한한 강건한 분석을 유발할 것이다. 프로테오타입 펩티드(m/z)1 및 1세대 단편(m/z)2의 선택을 위해 개발된 방법에서, 상기 선택은 본질적으로 반응의 강도에 기초한다. 보다 상세하게는, 문헌 'V. Fusaro 등[18]'이 참조될 수 있다. 상용 소프트웨어, 예컨대 Applied Biosystems사의 MIDAS 소프트웨어 및 MRM Pilot 소프트웨어 또는 MRMaid[19]는 당업계의 통상의 기술자에 의해 사용되어 가능한 모든 전이체 쌍들을 예측하도록 할 수 있다. 또한, PeptideAtlas라고 불리우는 데이터베이스가 사용될 수 있으며, 이는 과학계에 의해 개시된 모든 펩티드 MRM 전이체들을 편집하기 위해 F. Desiere 등[20]이 구축한 것이다. 이러한 PeptideAtlas 데이터베이스는 인터넷상에서 자유롭게 이용가능하다. 비단백질성 분자에 대해, 예를 들어 Applied Biosystems(미국)사의 Cliquid 소프트웨어를 통해 접근 가능한 것과 같은 데이터베이스를 사용하는 것도 가능하다.
프로테오타입 펩티드, (m/z)1 및 (m/z)2를 선택하기 위한 대안 접근법은 다은 연구시에 획득된 MS/MS 분획 스펙트럼을 사용하는 것으로 구성된다. 이러한 연구는 예를 들어 프로테옴 분석에 의한 바이오마커의 발견 및 동정의 단계일 수 있다. 이러한 접근법은 사용자들과 미팅하는 동안 Thermo Scientific에 의해 제안되었다[19]. 이는 SIEVE 소프트웨어(Thermo Scientific)에 의해 실험적으로 동정된 펩티드로부터 후보 전이체 목록을 만들 수 있도록 한다. (m/z)1 및 (m/z)2 이온의 선택을 위해 특정 기준이 J. Mead 등[19]에 의해 개시되었으며, 이는 하기에서 상술된다:
- 내부의 분열 부위, 즉 내부의 리신 또는 아르기닌을 갖는 펩티드는 리신 또는 아르기닌 이후에 프롤린이 없다면 피해야 함.
- 아스파라긴 또는 글루타민을 갖는 펩티드는 탈아미노화할 수 있기 때문에 피해야 함.
- N-말단 글루타민 또는 글루탐산을 갖는 펩티드는 자발적으로 고리화할 수 있기 때문에 피해야 함.
- 메티오닌을 갖는 펩티드는 산화될 수 있기 때문에 피해야 함.
- 시스테인을 갖는 펩티드는 티올 관능기의 변성, 환원 및 차단의 가능한 단계 동안 재현불가능하게 변형될 수 있기 때문에 피해야 함.
- 프롤린을 갖는 펩티드는 일반적으로 단일의 매우 우세한 피크를 갖는 MS/MS의 강한 단편을 생성하기 때문에 유리한 것으로 고려될 수 있음. 그러나, 단일의 매우 우세한 단편은 복잡한 혼합물에서 전이체의 정체를 입증할 수 있게 하지 못 한다. 실제로, 여러 개의 특징적 단편들이 동시에 존재할 때에만, 원하는 전구 이온이 실제로 검출되는지를 입증할 수 있도록 한다.
- C-말단에 인접한 위치(n-1 위치)에 또는 C-말단에 대해 두번째 위치에(n-2 위치) 프롤린을 갖는 펩티드는 1세대 단편 펩티드의 크기가 일반적으로 너무 작아 충분히 특이적이 될 수 없다고 여겨지기 때문에 피해야 함.
- 전구체보다 더 큰 질량을 갖는 단편의 선택은 특이성을 촉진하기 위해 바람직함. 이를 위해, 이중-하전된 전구 이온을 선택하고, 전구체보다 더 큰 질량을 갖는 가장 강한 1세대 단편 이온, 즉 단일-하전된 1세대 단편 이온을 선택하는 것이 필요하다.
선택된 전구 이온의 단편화는 3중 4극자 유형[21], 또는 이온 트랩 유형[22], 또는 TOF(time of flight) 유형[23]의 모델과 같은 분획 셀에서 수행되며, 이는 이온을 분리할 수 있게 한다. 통상적으로, 단편화(들)는 강한 광원, 전자 또는 라디칼 종과의 충돌을 이용한 광여기 또는 광해리에 의해, 또는 예를 들어 TOF 튜브에서 전위차의 적용에 의해, 또는 임의의 다른 활성화 모드에 의해, 전기장에서 아르곤 또는 질소와 같은 불활성기체와의 충돌을 통해 수행될 것이다. 전기장의 특징은 단편화의 강도 및 성질에 영향을 미친다. 따라서, 예를 들어 4극자에서 불활성기체의 존재하에 적용되는 전기장은 이온에 제공되는 충돌 에너지에 영향을 미친다. 분석하려는 전이체의 민감성을 증가시키기 위하여, 당업계의 통상의 기술자에 의해 상기 충돌 에너지가 최적화될 것이다. 일례로서, Applied Biosystems(Foster City, 미국)사의 AB SCIEX QTRAP® 5500 질량분석기에서 q2에서 충돌 에너지를 5 내지 180 e-V 사이에서 변화시키는 것이 가능하다. 이와 유사하게, 충돌 단계의 기간 및 예를 들어 이온 트랩 내의 여기 에너지는 당업계의 통상의 기술자에 의해 가장 민감한 분석을 만들기 위해 최적화될 것이다. 일례로서, Applied Biosystems사의 AB SCIEX QTRAP® 5500 질량분석기에서 Q3에서 여기 에너지를 0 내지 1(임의 단위) 사이에서 변화시키고, 여기 시간이라고 불리워지는 상기 기간을 0.010 내지 50 ms 사이에서 변화시키는 것이 가능하다.
마지막으로, 선택된 특징적 이온의 검출은 특히 검출기 및 처리 시스템에 의해 수행되는 것이 통상적이다. 상기 검출기는 이온들을 수집하고 전기적 신호를 생성하며, 이의 강도는 수집된 이온의 양에 의존한다. 그 후, 획득된 신호는 증폭되어, 컴퓨터에 의해 처리될 수 있다. 데이터 처리 컴퓨터 조립체는 검출기에 의해 수령된 정보를 질량 스펙트럼으로 전환할 수 있도록 한다.
SRM 모드 또는 MRM 모드의 원리는, 전구 이온을 특이적으로 선택하고, 이를 단편화하고, 그 후 이의 단편 이온들 중 하나를 특이적으로 선택하는 것이다. 상기 적용을 위해, 3중 4극자 유형 또는 3중 4극자-이온 트랩 혼성의 장치들이 일발적으로 사용된다.
표적 단백질을 분석하거나 검출하기 위한 목적으로 MS2 모드에서 사용되는 3중 4극자 장치(Q1q2Q3)의 경우, 첫번째 4극자(Q1)는 분자 이온들을 그의 질량 대 전하 비(m/z)에 따라 필터링될 수 있으며, 여기서 상기 분자 이온은 사전 소화 단계 동안 획득되고 분석되어지는 단백질에 특이적인 프로테오타입 펩티드에 대응하는 것이다. (m/z)1이라고 불리우는 원하는 프로테오타입 펩티드의 질량/전하 비를 갖는 펩티드만 두번째 4극자(q2)로 전달되고, 차후의 단편화를 위한 전구 이온의 역할을 한다. q2 분석장치는 질량/전하 비(m/z)1의 펩티드를 1세대 단편 이온으로 단편화시킬 수 있다. 상기 단편화는 일반적으로 q2에서 전구 펩티드와 불활성기체, 예컨대 질소 또는 아르곤의 충돌에 의해 획득된다. 1세대 단편 이온은 (m/z)2라고 불리우는 특이적 질량 대 전하 비에 따라 1세대 단편 이온을 필터링하는 세번째 4극자(Q3)로 전달된다. 원하는 프로테오타입 펩티드의 특징적 단편의 질량/전하 비(m/z)2를 갖는 1세대 단편 이온만 검출기로 전달되어, 검출되거나 정량화된다.
이러한 작동 모드는 이중 선택성을 가지며, 이는 한편으로는 전구 이온의 선택과 관련되며, 다른 한편으로는 1세대 단편 이온의 선택과 관련된다. 따라서, SRM 또는 MRM 모드에서의 질량분석이 정량화를 위해 유리하다.
본 발명의 방법에서 수행되는 질량분석이 탠덤 질량분석(MS2, MS3, MS4 또는 MS5)인 경우, 여러 개의 질량 분석장치들이 함께 결합될 수 있다. 예를 들어, 첫번째 분석장치는 이온을 분리하고, 충돌 셀은 상기 이온을 단편화시킬 수 있고, 두번째 분석장치는 단편 이온을 분리한다. 이온 트랩 또는 FT-ICR과 같은 몇몇 분석장치들은 여러 개의 분석장치들을 하나로 구성하며, 이는 이온을 단편화시키고 상기 단편을 직접적으로 분석할 수 있게 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 하기의 하나 이상의 특징들을 포함한다:
- 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 잠재적 내성, 및 병원성 인자의 특징을 위해 수행되는 질량분석은 MS/MS 유형의 분광분석법이며, 이는 검출하거나 정량화하려는 분자에 특이적인 단편을 생성시키고, 이에 따라 특이성이 높은 분석방법을 제공하는 이점을 갖는다;
- MS/MS 분광분석법은 MRM이며, 이는 수십밀리초의 질량분석기 내 분석 주기 시간을 사용하는 이점을 가지며, 다중화 방식, 다수의 다양한 분자들에서 높은 민감성으로 검출하거나 정량화할 수 있게 한다;
- 유형화, 항미생물제에 대한 내성, 및 병원성 인자의 특징을 결정하는 것은 동일한 질량분석 기기에서, 바람직하게는 동시에 수행되며, 이는 분석시간과 기기비용을 감소시키는 이점을 갖는다; 이는 또한 결과의 처리 및 보고를 용이하게 한다.
유형화, 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특징을 결정하는 것 외에, 테스트되는 샘플에 존재하는 미생물(들)을 동정하는 것이 바람직할 수 있다.
미생물을 동정하는 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있으며, 이는 예를 들어 P. R. Murray 등의 문헌 [Manual of Clinical Microbiology, 2007, 제9판], 특히 박테리아 및 효모에 대해 문헌 [Vol. I, Section III, chapters 15 and 16], 바이러스에 대해 문헌 [Vol. II, Section VI, chapter 82], 원생동물에 대해 문헌 [Vol. II, Section X, chapter 135]에 개시되어 있다. 통상적인 동정 방법의 일례로서, 예를 들어 Vitek 2 동정 카드(bioMerieux)를 사용하거나, 선택적으로는 특정 유전자들의 존재의 연구 및 그의 서열의 연구에 기초하여 동정 기준을 갖는 분자생물학 기법을 사용하는, 생물학적 프로파일의 결정이 언급될 수 있다.
동정이 수행되는 샘플로부터 직접적으로 동정이 수행되거나, 또는 P. R. Murray 등의 문헌 [Manual of Clinical Microbiology, 2007, 제9판], 문헌 [Vol. I, Section III, chapter 14], 특히 박테리아에 대해 문헌 [Vol. I, Section IV, chapter 21], 바이러스에 대해 문헌 [Vol. II, Section VI, chapter 81], 효모에 대해 문헌 [Vol. II, Section VIII, chapter 117], 원생동물에 대해 문헌 [Vol. II, Section X, chapter 134]에 개시된 바와 같이 찾으려는 미생물들의 종에 따라 조절된 배양배지 및 최적의 배양조건과 함께 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 샘플에 함유된 미생물이 배양될 수 있다.
따라서, 일반적으로 생화학적 방법에 의해 시료 내 박테리아를 동정하는 경우, 예를 들어 한천에서 접종한 후에 순 배양에서 먼저 획득하는 것이 필요하다. 일부 경우에는 분자생물학(PCR)이 분석하려는 샘플에 직접적으로 적용될 수 있다.
미생물을 배양하는 대신, 활성 표면에 의해 샘플에서 직접적으로 포획함으로서 미생물이 농축될 수 있다. 상기 방법은 W.-J. Chen 등[11]에 개시되어 있으며, 여기서 Fe3O4/TiO2-활성화된 표면을 갖는 자기 비드에 의해 다양한 박테리아 종들이 포획된다. 다른 수단에 의한 포획이 또한 가능하며, 예를 들어 렉틴에 의한 포획[24], 또는 항체에 의한 포획[25], 또는 반코마이신에 의한 포획[26]이 있다. 상기 포획은 미생물을 농축시키고, 이에 따라 배양 단계를 축소시키거나 심지어 제거할 수 있도록 한다. 이는 상당한 시간 단축을 가져온다.
상기 동정은 또한 전술한 기법들에 따른 질량분석, 바람직하게는 MS, MS/MS, 또는 MS 이후 MS/MS 유형의 분광분석법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 본 발명의 구현예를 구성한다. 이 경우에도 또한 샘플은 한천상에서 접종과 같은 배양 단계를 미리 받을 수 있다.
MS에 의한 동정 방법의 사용은 수분내에 수행될 수 있고 단일 분석장치, 즉 MS/MS에서 사용되는 탠덤 질량분석기보다 덜 복잡한 기기가 장착된 질량분석기를 필요로 하기 때문에 유리하다.
MS 이후 MS/MS 유형의 분광분석법에 의한 동정 방법의 사용도 역시 유리하다. 이는 물론 MS에서 관찰되는 이온을 동정할 수 있으며, 이에 따라 분석의 특이성이 증가된다.
MRM 유형의 MS/MS에 의한 동정 방법의 사용은 MS 이후 MS/MS의 통상적인 접근법에 비해 더 민감하고 더 단순한 점에서 이점을 갖는다. 상기 방법은 MS 스펙트럼의 획득과 MS/MS 스펙트럼의 획득 사이에 정보를 처리하기 위한 효과적인 소프트웨어를 필요로 하지 않으며, 또한 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 연결하기 위한 장치 파라미터 조절의 임의의 변화를 필요로 하지 않는다.
MS에 의한 동정 방법은 크로마토그래피 분리 이후에 S. Vaidyanathan 등[27] 또는 R. Everley 등[8]에 개시된 바와 같이 조 샘플상에서 전기분무 원에 의해 수행될 수 있다. 그 후, 다양한 범위의 m/z에 의해 미생물이 동정될 수 있다. S. Vaidyanathan 등은 200 내지 2000 Th 사이의 창을 사용하였으며, R. Everley 등은 620 내지 2450 Th 사이의 창을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 또한 단백질의 전하 상태와 독립적으로 단백질의 질량에 접근하기 위해 해석될 수 있다. R. Everley 등은 이에 따라 약 5000 내지 50000 Da 사이의 질량들을 이용하였다. 선택적으로, MS에 의한 동정 방법은 또한 Claydon 등[3]과 T. Krishnamurthy 및 P. Ross[4]에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF에 의해 수행될 수도 있다. 분석은 질량 스펙트럼의 획득과 전문 소프트웨어에 의한 판독을 조합한다. 이는 매우 단순하며, 수분 내에 수행될 수 있다. 이러한 동정 방법은 현재 의료 테스트 실험실[28]을 통해 널리 퍼져 있다.
샘플에 존재하는 박테리아의 단백질을 통해 MS 이후 MS/MS에 의한 박테리아의 동정은 다수의 팀에 의해 널리 적용되었다. 일례로서, 살모넬라 엔테리카의 펩티돔에 대한 N. Manes 등[29]의 최근 연구가 언급될 수 있거나, 또는 트립신에 의한 단백질의 소화 이후에 박테리아의 프로테옴을 연구한 R. Nandakumar 등[30] 또는 L. Hernychova 등[31]의 연구가 언급될 수 있다. 통상의 접근법은 i) MS 스펙트럼을 획득하는 단계, ii) 강한 신호를 갖는 MS 스펙트럼상에서 관찰되는 각각의 전구 이온을 연속적으로 선택하는 단계, iii) 각각의 전구 이온을 연속적으로 단편화하고 그의 MS/MS 스펙트럼을 획득하는 단계, iv) 관찰된 MS/MS 스펙트럼에 대응하는 확률이 높은 펩티드를 동정하기 위하여, Mascot(Matrix Science, London, 영국) 또는 SEQUEST(Thermo Scientific, Waltham, 미국)와 같은 소프트웨어를 통해, SWISS-PROT 또는 NCBI와 같은 단백질 데이터베이스를 검색하는 단계로 구성된다. 상기 방법은 종에 특징적인 단백질 또는 펩티드가 동정된다면 미생물을 동정할 수 있다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 미생물의 동정은 통상의 동정 방법에 의해 수행되며, 본 발명의 방법은 상기 하나 이상의 미생물의 동정을 확인하는 추가 단계를 포함하며, 여기서 확인 단계는 미생물의 동정에 대해 전술된 기법들에 따라 질량분석에 의해 수행된다.
특정 일구현예에 따르면, 확인 단계의 질량분석은 MS/MS 유형, 바람직하게는 MRM의 질량분석이다.
질량분석을 사용하는 이점들 중 하나는 분자, 본 발명의 경우 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 유형화의 특징의 마커를 정량화하는데 특히 유용하다는 사실에 있다. 이를 위해, 검출되는 전류의 세기가 사용되며, 이는 표적 분자의 양에 비례한다. 이에 따라 측정된 전류의 세기는 존재하는 표적 분자의 양을 결정하기 위한 정량적 측정으로서 제공될 수 있으며, 이는 mol/m3 또는 kg/m3 유형의 국제단위계(SI)의 표현, 또는 상기 단위의 배수 또는 약수, 또는 SI 단위의 일반적인 유도체 및 이의 배수 또는 약수를 특징으로 한다. 비제한적인 예로서, ng/ml 또는 fmol/l와 같은 단위들이 정량적 측정을 특징화하는 단위이다.
그럼에도 불구하고, 측정된 피크의 면적(이는 검출되는 이온에 의해 유도된 전류의 세기에 대응함)을 분석하려는 표적 분자의 양과 연관시킬 수 있기 위하여, 칼리브레이션이 필요하다. 이를 위해, 질량분석에서 통상적으로 사용되는 칼리브레이션이 본 발명에서 수행될 수 있다. MRM 분석은 외부 표준을 사용하거나, 또는 바람직하게는 T. Fortin 등[14]에 개시된 바와 같이 내부 표준을 사용하여 통상적으로 칼리브레이트될 수 있다. 표적 분자가 관심대상인 단백질을 분석하도록 할 수 있는 프로테오타입 펩티드일 경우, 정량적 측정과 표적 프로테오타입 펩티드의 양 및 이에 따른 관심대상인 단백질의 양 사이의 연관성은, 분석되어지는 양이 알려진 표준 신호에 대해 상대적으로 측정된 신호를 칼리브레이트함으로서 획득된다. 칼리브레이션은 예를 들어 표준 프로테오타입 펩티드를 다양한 농도로 연속적으로 주입함으로써 획득된(외부 칼리브레이션) 칼리브레이션 커브에 의해 수행될 수 있거나, 또는 바람직하게는 예를 들어 후술하는 AQUA, QconCAT 또는 PSAQ 방법들에 따라 내부 표준으로서 중 펩티드를 사용하는 내부 칼리브레이션에 의해 수행될 수 있다. "중(heavy) 펩티드"라는 용어는 프로테오타입 펩티드에 대응하는 펩티드를 의미하지만, 여기서 하나 이상의 탄소 12(12C) 원자들이 탄소 13(13C)으로 치환되거나, 및/또는 하나 이상의 질소 14(14N) 원자들이 질소 15(15N)로 치환된다.
내부 표준(AQUA)으로서 중 펩티드의 사용은 또한 특허출원 US 2004/0229283에서 제안되었다. 원리는 일반적인 천연의 동위원소보다 더 무거운 동위원소를 포함하는 아미노산으로 프로테오타입 펩티드를 인공적으로 합성하는 것이다. 상기 아미노산은 예를 들어 탄소 12(12C) 원자의 일부를 탄소 13(13C)로 치환시키거나, 또는 질소 14(14N) 원자의 일부를 질소 15(15N)로 치환시킴으로써 획득된다. 이에 따라 합성된 인공 펩티드(AQUA)는 천연 펩티드와 동일한 물리화학적 특징들(질량이 더 높다는 것은 제외함)을 엄격하게 갖는다. 이는, 예를 들어 관심대상인 샘플의 단백질의 분해를 야기하는 처리 단계와 상기 처리 단계 이후에 획득된 펩티드의 단편화 단계 사이에, 질량분석에 의한 분석의 업스트림에서, 일반적으로 특정 농도로 샘플에 첨가된다. 그 결과, AQUA 펩티드는 펩티드를 단편화하는 동안 분석하려는 천연 펩티드와 동시정제된다. 이에 따라, 2개의 펩티드들은 분석을 위해 질량분석기에 동시에 주입된다. 그 후, 이들은 원(source)에서 동일한 이온화 수율을 받는다. 천연 펩티드 및 AQUA 펩티드(이의 농도는 알려짐)에 대한 피크 면적의 비교는 천연 펩티드의 농도를 산출할 수 있도록 하며, 이에 따라 분석하려는 단백질의 농도로 돌아가 작업할 수 있도록 한다. AQUA 기법의 변이형이 QconCat라는 이름으로 J.-M. Pratt 등[32]에 의해 제안되었다. 이 변이형은 또한 특허출원 WO 2006/128492에도 개시되어 있다. 이는 다양한 AQUA 펩티드들을 연결하는 단계, 및 무거운 재조합 단백질의 형태로 인공 폴리펩티드를 생성하는 단계로 구성된다. 재조합 단백질은 무거운 동위원소를 포함하는 아미노산에 의해 합성된다. 이러한 방식에 의해, 더 낮은 비용으로 여러 개의 단백질들의 동시 분석을 칼리브레이트하기 위한 표준을 획득할 수 있다. QconCAT 표준은 처음부터, 단백질의 분해를 야기하는 처리의 업스트림에서, 그리고 단백질의 단편화, 단백질의 티올 관능기의 변성, 환원 및 그 후 차단의 단계가 존재한다면 상기 단계 이전에, 첨가된다. 따라서, QconCAT 표준은 천연 단백질로서 단백질의 분해를 야기하는 처리의 동일한 주기를 받게 되며, 이에 따라 단백질의 분해를 야기하는 처리 단계로부터 수율을 고려하는 것을 가능하게 한다. 이는 천연 단백질의 처리, 특히 소화에 의한 처리가 완전하지 않을 수 있기 때문이다. 이 경우, AQUA 표준의 사용은 천연 단백질의 양이 과소평가되는 것을 유발하게 된다. 따라서, 완전한 분석을 위해, 단백질의 분해를 야기하는 처리로부터 수율을 고려하는 것이 중요할 수 있다. 그러나, V. Brun 등[33]은 QconCAT 표준이 가끔씩 천연 단백질의 처리, 특히 소화에 의한 처리로부터 수율을 정확하게 재현하지 못하며, 이는 거의 틀림없이 QconCAT 단백질의 다른 삼차원 형태 때문이라는 점을 보여주었다.
따라서, V. Brun 등[33]은 특허출원 WO 2008/145763에 개시되어 있는 PSAQ 방법을 사용하는 것을 제안하였다. 이 경우, 내부 표준은 재조합 단백질이며, 이는 천연 단백질과 서열이 동일하지만 무거운 아미노산에 의해 합성되었다. 합성은 무거운 아미노산에 의해 생체외에서 수행된다. 이러한 표준은 천연 단백질과 동일한 물리화학적 특징들(질량이 더 높다는 것은 제외함)을 엄격하게 갖는다. 이는 처음부터, 단백질 단편화 단계가 존재한다면 상기 단계 이전에, 추가된다. 따라서, 이는 단백질의 단편화 단계 동안 천연 펩티드와 동시정제된다. 이는 천연 단백질과 동일한 처리(특히, 소화에 의한 처리) 수율을 나타낸다. 또한, 분해 후에 획득되는 중 펩티드는 펩티드 단편화 단계가 수행된다면 천연 펩티드와 동시정제된다. 이에 따라, 2개의 펩티드들은 정량적으로 분석하기 위해 질량분석기에 동시에 주입된다. 따라서, 이들은 원(source)에서 동일한 이온화 수율을 받는다. PSAQ 방법에서 표준 펩티드와 천연 펩티드의 피크 면적의 비교는 분석하려는 단백질의 농도를 산출할 수 있도록 하면서, 분석 방법의 모든 단계들을 고려할 수 있도록 한다.
질량분석에 의한 분석, 특히 MRM 또는 MS 분석에서 사용되는 상기 모든 기법들, 즉 AQUA, QconCAT, PSAQ 또는 임의의 다른 칼리브레이션 기법은 본 발명에서 칼리브레이션을 수행하기 위해 이용될 수 있다.
바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징화를 할 수 있다.
특히, 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징화는 하기와 같이 하나 이상의 펩티드를 사용한다:
1. 유형화에 대해:
하기의 서열번호 1을 갖는 단백질 A에 속하는 하나 이상의 펩티드:
MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8을 갖는 펩티드로부터 선택됨:
2. 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성에 대해:
하기의 서열번호 9를 갖는 PBP2a 단백질에 속하는 하나 이상의 펩티드:
MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKDSSYISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGVKDINIQDRKIKKVSKNKKRVDAQYKIKTNYGNIDRNVQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENLKSERGKILDRNNVELANTGTAYEIGIVPKNVSKKDYKAIAKELSISEDYIKQQMDQNWVQDDTFVPLKTVKKMDEYLSDFAKKFHLTTNETESRNYPLEKATSHLLGYVGPINSEELKQKEYKGYKDDAVIGKKGLEKLYDKKLQHEDGYRVTIVDDNSNTIAHTLIEKKKKDGKDIQLTIDAKVQKSIYNNMKNDYGSGTAIHPQTGELLALVSTPSYDVYPFMYGMSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTAMIGLNNKTLDDKTSYKIDGKGWQKDKSWGGYNVTRYEVVNGNIDLKQAIESSDNIFFARVALELGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPFYNAQISNKNLDNEILLADSGYGQGEILINPVQILSIYSALENNGNINAPHLLKDTKNKVWKKNIISKENINLLTDGMQQVVNKTHKEDIYRSYANLIGKSGTAELKMKQGETGRQIGWFISYDKDNPNMMMAINVKDVQDKGMASYNAKISGKVYDELYENGNKKYDIDE
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 10 내지 17을 갖는 펩티드로부터 선택됨:
3. 병원성에 대해:
하기의 서열번호 18 및 22를 각각 갖는, PVL 단백질에 속하는 하나 이상의 펩티드, 아단위 LukS 및 LukF:
서열번호 18:
MIFMVKKRLLAATLSLGIITPIATSFHESKADNNIENIGDGAEVVKRTEDTSSDKWGVTQNIQVDFVKDKKYNKDALILKMQGFINSKTTYYNYKNTDHIKAMRWPFQYNIGLKTNDPNVDLINYLPKNKIDSVNVSQTLGYNIGGNFNSGPSTGGNGSFNYSKTISYNQQNYISEVERQNSKSVQWGIKANSFITSLGKMSGHDPNLFVGYKPYSQNPRDYFVPDNELPPLVHSGFNPSFIATVSHEKGSGDTSEFEITYGRNMDVTHATRRTTHYGNSYLEGSRIHNAFVNRNYTVKYEVNWKTHEIKVKGHN
서열번호 22:
MKKIVKSSVVTSIALLLLSNTVDAAQHITPVSEKKVDDKITLYKTTATSDSDKLKISQILTFNFIKDKSYDKDTLILKAAGNIYSGYTKPNPKDTISSQFYWGSKYNISINSDSNDSVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTVGYSYGGDINISNGLSGGGNGSKSFSETINYKQESYRTSLDKRTNFKKIGWDVEAHKIMNNGWGPYGRDSYHSTYGNEMFLGSRQSNLNAGQNFLEYHKMPVLSRGNFNPEFIGVLSRKQNAAKKSKITVTYQREMDRYTNFWNQLHWIGNNYKDENRATHTSIYEVDWENHTVKLIDTQSKEKNPMS
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 19, 20, 21, 23 및 24를 갖는 펩티드로부터 선택됨:
4. 동정에 대해:
하기의 서열번호 25, 28, 31, 33, 36, 39, 41 및 43을 각각 갖는, 50S 리보솜 단백질 L30(RL30), 50S 리보솜 단백질 L331(RL331), 스타필로코쿠스 분비 항원 ssaA2(SSAA2), UPF0337 단백질 SA0772(Y772), 이관능성 오토리신(ATL), 신장 인자 Tu(EFTU), 가능한 트랜스글리콜라제 isaA(ISAA) 및 UPF0457 단백질 SA1975.1(Y197A)에 속하는 하나 이상의 펩티드:
서열번호 25:
MAKLQITLTRSVIGRPETQRKTVEALGLKKTNSSVVVEDNPAIRGQINKVKHLVTVEEK
서열번호 28:
MRVNVTLACTECGDRNYITTKNKRNNPERVEMKKFCSRENKQTLHRETK
서열번호 31:
MKKIATATIATAGFATIAIASGNQAHASEQDNYGYNPNDPTSYSYTYTIDAQGNYHYTWKGNWHPSQLNQDNGYYSYYYYNGYNNYNNYNNGYSYNNYSRYNNYSNNNQSYNYNNYNSYNTNSYRTGGLGASYSTSSNNVQVTTTMAPSSNGRSISSGYTSGRNLYTSGQCTYYVFDRVGGKIGSTWGNASNWANAAARAGYTVNNTPKAGAIMQTTQGAYGHVAYVESVNSNGSVRVSEMNYGYGPGVVTSRTISASQAAGYNFIH
서열번호 33:
MADESKFEQAKGNVKETVGNVTDNKNLENEGKEDKASGKAKEFVENAKEKATDFIDKVKGNKGE
서열번호 36:
AGLQYKPQVQRVPGKWTDANFNDVKHAMDTKRLAQDPALKYQFLRLDQPQNISIDKINQFLKGKGVLENQGAAFNKAAQMYGINEVYLISHALLETGNGTSQLAKGADVVNNKVVTNSNTKYHNVFGIAAYDNDPLREGIKYAKQAGWDTVSKAIVGGAKFIGNSYVKAGQNTLYKMRWNPAHPGTHQYATDVDWANINAKIIKGYYDKIGEVGKYFDIPQYK
서열번호 39:
MAKEKFDRSKEHANIGTIGHVDHGKTTLTAAIATVLAKNGDSVAQSYDMIDNAPEEKERGITINTSHIEYQTDKRHYAHVDCPGHADYVKNMITGAAQMDGGILVVSAADGPMPQTREHILLSRNVGVPALVVFLNKVDMVDDEELLELVEMEVRDLLSEYDFPGDDVPVIAGSALKALEGDAQYEEKILELMEAVDTYIPTPERDSDKPFMMPVEDVFSITGRGTVATGRVERGQIKVGEEVEIIGLHDTSKTTVTGVEMFRKLLDYAEAGDNIGALLRGVAREDVQRGQVLAAPGSITPHTEFKAEVYVLSKDEGGRHTPFFSNYRPQFYFRTTDVTGVVHLPEGTEMVMPGDNVEMTVELIAPIAIEDGTRFSIREGGRTVGSGVVTEIIK
서열번호 41:
MKKTIMASSLAVALGVTGYAAGTGHQAHAAEVNVDQAHLVDLAHNHQDQLNAAPIKDGAYDIHFVKDGFQYNFTSNGTTWSWSYEAANGQTAGFSNVAGADYTTSYNQGSNVQSVSYNAQSSNSNVEAVSAPTYHNYSTSTTSSSVRLSNGNTAGATGSSAAQIMAQRTGVSASTWAAIIARESNGQVNAYNPSGASGLFQTMPGWGPTNTVDQQINAAVKAYKAQGLGAWGF
서열번호 43:
MAMTVKKDNNEVRIQWRVADIKIPTSEIKNITQDQDIHAVPKLDSKDVSRIGSTFGKTNRVIIDTEDHEYIIYTQNDQKVYNELTK
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 26, 27, 29, 30, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44 및 45를 갖는 펩티드로부터 선택됨:
또한, 전술한 바와 같이 유형화를 위해 본 발명의 방법은 전술한 바와 같이 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성 또는 병원성을 결정하는데 유용한 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44 및 45를 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용할 수 있다는 점에 주목하여야 한다.
물론, "하나 이상의 펩티드"라는 용어는 검출하기를 원하는 마커를 나타내는 펩티드의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상, 여섯 이상 또는 그 이상을 나타낸다. 바람직하게는, 특징 당 둘 이상의 펩티드, 또는 셋 이상의 펩티드, 또는 넷 이상의 펩티드가 사용될 것이다.
바람직한 또다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 대장균의 특징화가 가능하다.
특히, 대장균의 특징화는 하기와 같이 하나 이상의 펩티드를 사용한다:
1. 유형화에 대해:
하기의 서열번호 138 내지 152를 각각 갖는, 아스파르테이트 암모니아-리아제 단백질(ASPA), ATP 신타제 알파 아단위(ATPA), 10 kDa 샤페로닌(CH10), 60 kDa 샤페로닌(CH60), DNA-결합 단백질 HU-베타(DBHB), 글루타메이트 데카복실라제(DCEB), 숙시네이트 데히드로게나제 플라보단백질 아단위(DHSA), 기아 동안 DNA 보호 단백질(DNA protection during starvation protein: DPS), DNA-결합 단백질 H-NS(HNS), 말레이트 데히드로게나제(MDH), 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 포스포리보실아미노이미다졸-숙시노카복사미드 신타제(PUR7), 50S 리보솜 단백질 L4(RL4), 30S 리보솜 단백질 S1(RS1), UPF0076 단백질 yjgF(YJGF)에 속하는 하나 이상의 펩티드:
서열번호 138
MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ
서열번호 139
MQLNSTEISELIKQRIAQFNVVSEAHNEGTIVSVSDGVIRIHGLADCMQGEMISLPGNRYAIALNLERDSVGAVVMGPYADLAEGMKVKCTGRILEVPVGRGLLGRVVNTLGAPIDGKGPLDHDGFSAVEAIAPGVIERQSVDQPVQTGYKAVDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTALAIDAIINQRDSGIKCIYVAIGQKASTISNVVRKLEEHGALANTIVVVATASESAALQYLAPYAGCAMGEYFRDRGEDALIIYDDLSKQAVAYRQISLLLRRPPGREAFPGDVFYLHSRLLERAARVNAEYVEAFTKGEVKGKTGSLTALPIIETQAGDVSAFVPTNVISITDGQIFLETNLFNAGIRPAVNPGISVSRVGGAAQTKIMKKLSGGIRTALAQYRELAAFSQFASDLDDATRKQLDHGQKVTELLKQKQYAPMSVAQQSLVLFAAERGYLADVELSKIGSFEAALLAYVDRDHAPLMQEINQTGGYNDEIEGKLKGILDSFKATQSW
서열번호 140
MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
서열번호 141
MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMGGMGGMGGMM
서열번호 142
MNKSQLIDKIAAGADISKAAAGRALDAIIASVTESLKEGDDVALVGFGTFAVKERAARTGRNPQTGKEITIAAAKVPSFRAGKALKDAVN
서열번호 143
MDKKQVTDLRSELLDSRFGAKSISTIAESKRFPLHEMRDDVAFQIINDELYLDGNARQNLATFCQTWDDENVHKLMDLSINKNWIDKEEYPQSAAIDLRCVNMVADLWHAPAPKNGQAVGTNTIGSSEACMLGGMAMKWRWRKRMEAAGKPTDKPNLVCGPVQICWHKFARYWDVELREIPMRPGQLFMDPKRMIEACDENTIGVVPTFGVTYTGNYEFPQPLHDALDKFQADTGIDIDMHIDAASGGFLAPFVAPDIVWDFRLPRVKSISASGHKFGLAPLGCGWVIWRDEEALPQELVFNVDYLGGQIGTFAINFSRPAGQVIAQYYEFLRLGREGYTKVQNASYQVAAYLADEIAKLGPYEFICTGRPDEGIPAVCFKLKDGEDPGYTLYDLSERLRLRGWQVPAFTLGGEATDIVVMRIMCRRGFEMDFAELLLEDYKASLKYLSDHPKLQGIAQQNSFKHT
서열번호 144
MKLPVREFDAVVIGAGGAGMRAALQISQSGQTCALLSKVFPTRSHTVSAQGGITVALGNTHEDNWEWHMYDTVKGSDYIGDQDAIEYMCKTGPEAILELEHMGLPFSRLDDGRIYQRPFGGQSKNFGGEQAARTAAAADRTGHALLHTLYQQNLKNHTTIFSEWYALDLVKNQDGAVVGCTALCIETGEVVYFKARATVLATGGAGRIYQSTTNAHINTGDGVGMAIRAGVPVQDMEMWQFHPTGIAGAGVLVTEGCRGEGGYLLNKHGERFMERYAPNAKDLAGRDVVARSIMIEIREGRGCDGPWGPHAKLKLDHLGKEVLESRLPGILELSRTFAHVDPVKEPIPVIPTCHYMMGGIPTKVTGQALTVNEKGEDVVVPGLFAVGEIACVSVHGANRLGGNSLLDLVVFGRAAGLHLQESIAEQGALRDASESDVEASLDRLNRWNNNRNGEDPVAIRKALQECMQHNFSVFREGDAMAKGLEQLKVIRERLKNARLDDTSSEFNTQRVECLELDNLMETAYATAVSANFRTESRGAHSRFDFPDRDDENWLCHSLYLPESESMTRRSVNMEPKLRPAFPPKIRTY
서열번호 145
MSTAKLVKSKATNLLYTRNDVSDSEKKATVELLNRQVIQFIDLSLITKQAHWNMRGANFIAVHEMLDGFRTALIDHLDTMAERAVQLGGVALGTTQVINSKTPLKSYPLDIHNVQDHLKELADRYAIVANDVRKAIGEAKDDDTADILTAASRDLDKFLWFIESNIE
서열번호 146
MSEALKILNNIRTLRAQARECTLETLEEMLEKLEVVVNERREEESAAAAEVEERTRKLQQYREMLIADGIDPNELLNSLAAVKSGTKAKRAQRPAKYSYVDENGETKTWTGQGRTPAVIKKAMDEQGKSLDDFLIKQ
서열번호 147
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDATPALEGANVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAAEVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGVSFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAYVEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEKNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
서열번호 148
MSVIKMTDLDLAGKRVFIRADLNVPVKDGKVTSDARIRASLPTIELALKQGAKVMVTSHLGRPTEGEYNEEFSLLPVVNYLKDKLSNPVRLVKDYLDGVDVAEGELVVLENVRFNKGEKKDDETLSKKYAALCDVFVMDAFGTAHRAQASTHGIGKFADVACAGPLLAAELDALGKALKEPARPMVAIVGGSKVSTKLTVLDSLSKIADQLIVGGGIANTFIAAQGHDVGKSLYEADLVDEAKRLLSTCNIPVPSDVRVATEFSETAPATLKSVNDVKADEQILDIGDASAQELAEILKNAKTILWNGPVGVFEFPNFRKGTEIVANAIADSEAFSIAGGGDTLAAIDLFGIADKISYISTGGGAFLEFVEGKVLPAVAMLEERAKK
서열번호 149
MQKQAELYRGKAKTVYSTENPDLLVLEFRNDTSAGDGARIEQFDRKGMVNNKFNYFIMSKLAEAGIPTQMERLLSDTECLVKKLDMVPVECVVRNRAAGSLVKRLGIEEGIELNPPLFDLFLKNDAMHDPMVNESYCETFGWVSKENLARMKELTYKANDVLKKLFDDAGLILVDFKLEFGLYKGEVVLGDEFSPDGSRLWDKETLEKMDKDRFRQSLGGLIEAYEAVARRLGVQLD
서열번호 150
MELVLKDAQSALTVSETTFGRDFNEALVHQVVVAYAAGARQGTRAQKTRAEVTGSGKKPWRQKGTGRARSGSIKSPIWRSGGVTFAARPQDHSQKVNKKMYRGALKSILSELVRQDRLIVVEKFSVEAPKTKLLAQKLKDMALEDVLIITGELDENLFLAARNLHKVDVRDATGIDPVSLIAFDKVVMTADAVKQVEEMLA
서열번호 151
MTESFAQLFEESLKEIETRPGSIVRGVVVAIDKDVVLVDAGLKSESAIPAEQFKNAQGELEIQVGDEVDVALDAVEDGFGETLLSREKAKRHEAWITLEKAYEDAETVTGVINGKVKGGFTVELNGIRAFLPGSLVDVRPVRDTLHLEGKELEFKVIKLDQKRNNVVVSRRAVIESENSAERDQLLENLQEGMEVKGIVKNLTDYGAFVDLGGVDGLLHITDMAWKRVKHPSEIVNVGDEITVKVLKFDRERTRVSLGLKQLGEDPWVAIAKRYPEGTKLTGRVTNLTDYGCFVEIEEGVEGLVHVSEMDWTNKNIHPSKVVNVGDVVEVMVLDIDEERRRISLGLKQCKANPWQQFAETHNKGDRVEGKIKSITDFGIFIGLDGGIDGLVHLSDISWNVAGEEAVREYKKGDEIAAVVLQVDAERERISLGVKQLAEDPFNNWVALNKKGAIVTGKVTAVDAKGATVELADGVEGYLRASEASRDRVEDATLVLSVGDEVEAKFTGVDRKNRAISLSVRAKDEADEKDAIATVNKQEDANFSNNAMAEAFKAAKGE
서열번호 152
MSKTIATENAPAAIGPYVQGVDLGNMIITSGQIPVNPKTGEVPADVAAQARQSLDNVKAIVEAAGLKVGDIVKTTVFVKDLNDFATVNATYEAFFTEHNATFPARSCVEVARLPKDVKIEIEAIAVRR
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 67 내지 84를 갖는 펩티드로부터 선택됨:
2. 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성에 대해:
하기의 서열번호 126을 갖는 TEM-2 베타-락타마제 단백질(TEM-2)에 속하는 하나 이상의 펩티드:
HPETLVKVKDAEDKLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGVGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 62 내지 66을 갖는 펩티드로부터 선택됨:
3. 병원성에 대해:
서열번호 153 및 154를 각각 갖는, Shiga 독소 1 아단위 A 단백질(STX1A), Shiga 독소 2 아단위 A 단백질(STX2A) 또는 상기 둘 모두에 속하는 하나 이상의 펩티드:
서열번호 153
MKIIIFRVLTFFFVIFSVNVVAKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
서열번호 154
MKCILFKWVLCLLLGFSSVSHSREFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALVEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVRAVNEDSQPECQITGDRPVIKINNTLWESNTAAAFLNRKSQFLYTTGK
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 85, 86 및 87을 갖는 펩티드로부터 선택됨:
4. 동정에 대해:
하기의 서열번호 127 내지 135, 176, 136 및 137을 각각 갖는, 아코니테이트 히드라타제 2(ACON2), L-아스파라기나제 2(ASPG2), 3-옥소아실-[아실-캐리어-단백질] 신타제 1(FABB), 글루타민-결합 페리플라즈마 단백질(GLNH), 몰리브데이트-결합 페리플라즈마 단백질(MODA), 피루베이트 데히드로게나제 복합체의 디히드로리포일리신-잔기 아세틸트랜스퍼라제 성분(ODP2), 외막 단백질 C(OMPC), 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제 1(PFLB), 숙시닐-CoA 리가제 [ADP-형성] 아단위 알파(SUCD), 트랜스케톨라제 1(TKT1), UPF0381 단백질 yfcZ(YFCZ), 비특징화된 단백질 ygaU (YGAU)에 속하는 하나 이상의 펩티드:
서열번호 127
MLEEYRKHVAERAAEGIAPKPLDANQMAALVELLKNPPAGEEEFLLDLLTNRVPPGVDEAAYVKAGFLAAIAKGEAKSPLLTPEKAIELLGTMQGGYNIHPLIDALDDAKLAPIAAKALSHTLLMFDNFYDVEEKAKAGNEYAKQVMQSWADAEWFLNRPALAEKLTVTVFKVTGETNTDDLSPAPDAWSRPDIPLHALAMLKNAREGIEPDQPGVVGPIKQIEALQQKGFPLAYVGDVVGTGSSRKSATNSVLWFMGDDIPHVPNKRGGGLCLGGKIAPIFFNTMEDAGALPIEVDVSNLNMGDVIDVYPYKGEVRNHETGELLATFELKTDVLIDEVRAGGRIPLIIGRGLTTKAREALGLPHSDVFRQAKDVAESDRGFSLAQKMVGRACGVKGIRPGAYCEPKMTSVGSQDTTGPMTRDELKDLACLGFSADLVMQSFCHTAAYPKPVDVNTHHTLPDFIMNRGGVSLRPGDGVIHSWLNRMLLPDTVGTGGDSHTRFPIGISFPAGSGLVAFAAATGVMPLDMPESVLVRFKGKMQPGITLRDLVHAIPLYAIKQGLLTVEKKGKKNIFSGRILEIEGLPDLKVEQAFELTDASAERSAAGCTIKLNKEPIIEYLNSNIVLLKWMIAEGYGDRRTLERRIQGMEKWLANPELLEADADAEYAAVIDIDLADIKEPILCAPNDPDDARPLSAVQGEKIDEVFIGSCMTNIGHFRAAGKLLDAHKGQLPTRLWVAPPTRMDAAQLTEEGYYSVFGKSGARIEIPGCSLCMGNQARVADGATVVSTSTRNFPNRLGTGANVFLASAELAAVAALIGKLPTPEEYQTYVAQVDKTAVDTYRYLNFNQLSQYTEKADGVIFQTAV
서열번호 128
MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIVSAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQQIFNQY
서열번호 129
MKRAVITGLGIVSSIGNNQQEVLASLREGRSGITFSQELKDSGMRSHVWGNVKLDTTGLIDRKVVRFMSDASIYAFLSMEQAIADAGLSPEAYQNNPRVGLIAGSGGGSPRFQVFGADAMRGPRGLKAVGPYVVTKAMASGVSACLATPFKIHGVNYSISSACATSAHCIGNAVEQIQLGKQDIVFAGGGEELCWEMACEFDAMGALSTKYNDTPEKASRTYDAHRDGFVIAGGGGMVVVEELEHALARGAHIYAEIVGYGATSDGADMVAPSGEGAVRCMKMAMHGVDTPIDYLNSHGTSTPVGDVKELAAIREVFGDKSPAISATKAMTGHSLGAAGVQEAIYSLLMLEHGFIAPSINIEELDEQAAGLNIVTETTDRELTTVMSNSFGFGGTNATLVMRKLKD
서열번호 130
MKSVLKVSLAALTLAFAVSSHAADKKLVVATDTAFVPFEFKQGDKYVGFDVDLWAAIAKELKLDYELKPMDFSGIIPALQTKNVDLALAGITITDERKKAIDFSDGYYKSGLLVMVKANNNDVKSVKDLDGKVVAVKSGTGSVDYAKANIKTKDLRQFPNIDNAYMELGTNRADAVLHDTPNILYFIKTAGNGQFKAVGDSLEAQQYGIAFPKGSDELRDKVNGALKTLRENGTYNEIYKKWFGTEPK
서열번호 131
MARKWLNLFAGAALSFAVAGNALADEGKITVFAAASLTNAMQDIATQFKKEKGVDVVSSFASSSTLARQIEAGAPADLFISADQKWMDYAVDKKAIDTATRQTLLGNSLVVVAPKASVQKDFTIDSKTNWTSLLNGGRLAVGDPEHVPAGIYAKEALQKLGAWDTLSPKLAPAEDVRGALALVERNEAPLGIVYGSDAVASKGVKVVATFPEDSHKKVEYPVAVVEGHNNATVKAFYDYLKGPQAAEIFKRYGFTIK
서열번호 132
MAIEIKVPDIGADEVEITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIKVSVGDKTQTGALIMIFDSADGAADAAPAQAEEKKEAAPAAAPAAAAAKDVNVPDIGSDEVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIKVNVGDKVSTGSLIMVFEVAGEAGAAAPAAKQEAAPAAAPAPAAGVKEVNVPDIGGDEVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVGDKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAEGKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAAPAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDITELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYINIGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGGLGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKEFVPRLMLPISLSFDHRVIDGADGARFITIINNTLSDIRRLVM
서열번호 133
MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTGYGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDVGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGKNGSVSGEGMTNNGREALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGAAVSSSKRTDDQNSPLYIGNGDRAETYTGGLKYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQNFEAVAQYQFDFGLRPSLAYLQSKGKNLGVINGRNYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF
서열번호 134
MSELNEKLATAWEGFTKGDWQNEVNVRDFIQKNYTPYEGDESFLAGATEATTTLWDKVMEGVKLENRTHAPVDFDTAVASTITSHDAGYINKQLEKIVGLQTEAPLKRALIPFGGIKMIEGSCKAYNRELDPMIKKIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRVALYGIDYLMKDKLAQFTSLQADLENGVNLEQTIRLREEIAEQHRALGQMKEMAAKYGYDISGPATNAQEAIQWTYFGYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDVYIERDLKAGKITEQEAQEMVDHLVMKLRMVRFLRTPEYDELFSGDPIWATESIGGMGLDGRTLVTKNSFRFLNTLYTMGPSPEPNMTILWSEKLPLNFKKFAAKVSIDTSSLQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMIVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGVDEKLKMQVGPKSEPIKGDVLNYDEVMERMDHFMDWLAKQYITALNIIHYMHDKYSYEASLMALHDRDVIRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRDEDGLAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKIQKLHTYRDAIPTQSVLTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEVRKTNLAGLMDGYFHHEASIEGGQHLNVNVMNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
서열번호 135
MSILIDKNTKVICQGFTGSQGTFHSEQAIAYGTKMVGGVTPGKGGTTHLGLPVFNTVREAVAATGATASVIYVPAPFCKDSILEAIDAGIKLIITITEGIPTLDMLTVKVKLDEAGVRMIGPNCPGVITPGECKIGIQPGHIHKPGKVGIVSRSGTLTYEAVKQTTDYGFGQSTCVGIGGDPIPGSNFIDILEMFEKDPQTEAIVMIGEIGGSAEEEAAAYIKEHVTKPVVGYIAGVTAPKGKRMGHAGAIIAGGKGTADEKFAALEAAGVKTVRSLADIGEALKTVLK
서열번호 176
MSSRKELANAIRALSMDAVQKAKSGHPGAPMGMADIAEVLWRDFLKHNPQNPSWADRDRFVLSNGHGSMLIYSLLHLTGYDLPMEELKNFRQLHSKTPGHPEVGYTAGVETTTGPLGQGIANAVGMAIAEKTLAAQFNRPGHDIVDHYTYAFMGDGCMMEGISHEVCSLAGTLKLGKLIAFYDDNGISIDGHVEGWFTDDTAMRFEAYGWHVIRDIDGHDAASIKRAVEEARAVTDKPSLLMCKTIIGFGSPNKAGTHDSHGAPLGDAEIALTREQLGWKYAPFEIPSEIYAQWDAKEAGQAKESAWNEKFAAYAKAYPQEAAEFTRRMKGEMPSDFDAKAKEFIAKLQANPAKIASRKASQNAIEAFGPLLPEFLGGSADLAPSNLTLWSGSKAINEDAAGNYIHYGVREFGMTAIANGISLHGGFLPYTSTFLMFVEYARNAVRMAALMKQRQVMVYTHDSIGLGEDGPTHQPVEQVASLRVTPNMSTWRPCDQVESAVAWKYGVERQDGPTALILSRQNLAQQERTEEQLANIARGGYVLKDCAGQPELIFIATGSEVELAVAAYEKLTAEGVKARVVSMPSTDAFDKQDAAYRESVLPKAVTARVAVEAGIADYWYKYVGLNGAIVGMTTFGESAPAELLFEEFGFTVDNVVAKAKELL
서열번호 136
MSKCSADETPVCCCMDVGTIMDNSDCTASYSRVFANRAEAEQTLAALTEKARSVESEPCKITPTFTEESDGVRLDIDFTFACEAEMLIFQLGLR
서열번호 137
MGLFNFVKDAGEKLWDAVTGQHDKDDQAKKVQEHLNKTGIPDADKVNIQIADGKATVTGDGLSQEAKEKILVAVGNISGIASVDDQVKTATPATASQFYTVKSGDTLSAISKQVYGNANLYNKIFEANKPMLKSPDKIYPGQVLRIPEE
상기 펩티드는 바람직하게는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 46 내지 61을 갖는 펩티드로부터 선택됨:
또한, 전술한 바와 같이 유형화를 위해 본 발명의 방법은 전술한 바와 같이 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성, 동정 또는 병원성을 결정하는데 유용한 서열번호 46 내지 66 및 85 내지 87을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용할 수 있다는 점에 주목하여야 한다.
바람직한 또다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 칸디다 알비칸스의 특징화가 가능하다.
특히, 칸디다 알비칸스의 특징화는 하기와 같이 하나 이상의 펩티드를 사용한다:
1. 유형화에 대해:
하기의 서열번호 155 내지 175를 각각 갖는, 알코올 데히드로게나제 1 단백질(ADH1), 프룩토스-비포스페이트 알돌라제 단백질(ALF), 라노스테롤 14-알파 탈메틸효소 단백질(CP51), F-box 단백질 COS111(CS111), 신장 인자 1-베타(EF1B), 에놀라제 1(ENO1), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(G3P), 열충격 단백질 SSA1(HSP71), 열충격 단백질 SSB1(HSP75), 피루베이트 키나제(KPYK), 리파제 8(LIP8), 멀티단백질-가교 인자 1(MBF1), 핵 수송 인자 2(NTF2), 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제(PPIA), 60S 리보솜 단백질 L13(RL13), 60S 리보솜 단백질 L28(RL28), 60S 리보솜 단백질 L36(RL36), 40S 리보솜 단백질 S22(RS22), 트리오스포스페이트 이소머라제(TPIS)에 속하는 하나 이상의 펩티드:
서열번호 155
MSEQIPKTQKAVVFDTNGGQLVYKDYPVPTPKPNELLIHVKYSGVCHTDLHARKGDWPLATKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKIGDFAGIKWLNGSCMSCEFCQQGAEPNCGEADLSGYTHDGSFEQYATADAVQAAKIPAGTDLANVAPILCAGVTVYKALKTADLAAGQWVAISGAGGGLGSLAVQYARAMGLRVVAIDGGDEKGEFVKSLGAEAYVDFTKDKDIVEAVKKATDGGPHGAINVSVSEKAIDQSVEYVRPLGKVVLVGLPAHAKVTAPVFDAVVKSIEIKGSYVGNRKDTAEAIDFFSRGLIKCPIKIVGLSDLPEVFKLMEEGKILGRYVLDTSK
서열번호 156
MAPPAVLSKSGVIYGKDVKDLFDYAQEKGFAIPAINVTSSSTVVAALEAARDNKAPIILQTSQGGAAYFAGKGVDNKDQAASIAGSIAAAHYIRAIAPTYGIPVVLHTDHCAKKLLPWFDGMLKADEEFFAKTGTPLFSSHMLDLSEETDDENIATCAKYFERMAKMGQWLEMEIGITGGEEDGVNNEHVEKDALYTSPETVFAVYESLHKISPNFSIAAAFGNVHGVYKPGNVQLRPEILGDHQVYAKKQIGTDAKHPLYLVFHGGSGSTQEEFNTAIKNGVVKVNLDTDCQYAYLTGIRDYVTNKIEYLKAPVGNPEGADKPNKKYFDPRVWVREGEKTMSKRIAEALDIFHTKGQL
서열번호 157
MAIVETVIDGINYFLSLSVTQQISILLGVPFVYNLVWQYLYSLRKDRAPLVFYWIPWFGSAASYGQQPYEFFESCRQKYGDVFSFMLLGKIMTVYLGPKGHEFVFNAKLSDVSAEDAYKHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKRYVPKIREEILNYFVTDESFKLKEKTHGVANVMKTQPEITIFTASRSLFGDEMRRIFDRSFAQLYSDLDKGFTPINFVFPNLPLPHYWRRDAAQKKISATYMKEIKSRRERGDIDPNRDLIDSLLIHSTYKDGVKMTDQEIANLLIGILMGGQHTSASTSAWFLLHLGEKPHLQDVIYQEVVELLKEKGGDLNDLTYEDLQKLPSVNNTIKETLRMHMPLHSIFRKVTNPLRIPETNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDPTRWDTAAAKANSVSFNSSDEVDYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTFVYNLRWTIDGYKVPDPDYSSMVVLPTEPAEIIWEKRETCMF
서열번호 158
MLKTDSLDFHSYLPPYRSLINPNARYDYRTHSLIPLTQNDLNLLRIAFQKKKEAPPSAFKMKYKSLLSDVSRTISMRLSNSNLLSSSSANNNNVLLSPPPSSSSTLSTPCGNILNRAGTTSSNISKINNLSQNQTQNQLPLFPAELHIKNLPVEILDYIFYLVDDNLDYKSCMYTCKLFYFLAKPYYYENLVFTSTYRFAQFVTYLRVNSEVGQYVQSIDLSGIKPGYDEDEQEEGQEENAENGEEENGGGARDPQYLLGEIADNPHHERVDQFPRGKILAGWRDWKFKNNPLYTIHPSPSLTKIASNSQFSNVSSKSSRSTSSKSSSSTTKKFVKPFRYFKSRKRKMSYSGTTKLERKSPRLEQLQLDQYSSNWNKRVNSHPLINKFLLHYSTSKDLPIGYILHMINLCPNIVSLNLGNLSLSTDYEISRSTIHKYQNFDLINNYPKDLIYKVDNIMRLNDVDDVYSIDGSILRFGNINSGSSGSNWERNGSSSNNRILFKSNQSIASTASSVYSVTTFSKPIRKYNSLLPPLPQTVADISYLNKGDGKVYLSDLNLKEINSAYLKKINEDEILSAIINVHGKRLIEYDTSLYQIPKPLNVDIAGTLKYINLSSMIWLNRKLIEKFLTRLLTKKSPELDMYGICYTDEFFDSDEQESDDDYEDSDDEEQRQCPIIYKQNLVIDFTDSGMYKSLPWAKRIDLNSFEGCQLANKIINNDLMTPQEQALRRERRRRGAIAANYLA
서열번호 159
MSFSDFSKVESIKSLNEFLADKSYIDGTTATQADVTVYKAFQKEFPQFTRWFNHIASFTEEFEDLPAGKAPAASGSAAAAAEEEDDEDVDLFGSDDEVDEEAEKLKQQRLAEYAAKKAAKGPKPAAKSIVTLDVKPWDDETDLDELLTNVKAIEMEGLTWGAHQWIPVGFGIKKLQINLVVEDALVSLDDLQAAVEEDEDHVQSTDIAAMQKL
서열번호 160
MSYATKIHARYVYDSRGNPTVEVDFTTDKGLFRSIVPSGASTGVHEALELRDGDKSKWLGKGVLKAVANVNDIIAPALIKAKIDVVDQAKIDEFLLSLDGTPNKSKLGANAILGVSLAAANAAAAAQGIPLYKHIANISNAKKGKFVLPVPFQNVLNGGSHAGGALAFQEFMIAPTGVSTFSEALRIGSEVYHNLKSLTKKKYGQSAGNVGDEGGVAPDIKTPKEALDLIMDAIDKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVSIEDPFAEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALLLKVNQIGTLTESIQAANDSYAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLSVGLRSGQIKTGAPARSERLAKLNQILRIEEELGSEAIYAGKDFQKASQL
서열번호 161
MAIKIGINGFGRIGRLVLRVALGRKDIEVVAVNDPFIAPDYAAYMFKYDSTHGRYKGEVTASGDDLVIDGHKIKVFQERDPANIPWGKSGVDYVIESTGVFTKVEGAQKHIDAGAKKVIITAPSADAPMFVVGVNEDKYTPDLKIISNASCTTNCLAPLAKVVNDTFGIEEGLMTTVHSITATQKTVDGPSHKDWRGGRTASGNIIPSSTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMSLRLPTTDVSVVDLTVRLKKAASYEEIAPAIKKASEGPLKGVLGYTEDAVVSTDFLGSSYSSIFDEKAGILLSPTFVKLISWYDNEYGYSTKVVDLLEHVA
서열번호 162
MSKAVGIDLGTTYSCVAHFANDRVEIIANDQGNRTTPSFVAFTDTERLIGDAAKNQAAMNPANTVFDAKRLIGRKFDDPEVINDAKHFPFKVIDKAGKPVIQVEYKGETKTFSPEEISSMVLTKMKEIAEGYLGSTVKDAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKGSRGEHNVLIFDLGGGTFDVSLLAIDEGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNFFIQEFKRKNKKDISTNQRALRRLRTACERAKRTLSSSAQTSIEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELCADLFRSTLDPVGKVLADAKIDKSQVEEIVLVGGSTRIPKIQKLVSDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILTGDTSSKTQDILLLDVAPLSLGIETAGGIMTKLIPRNSTIPTKKSETFSTYADNQPGVLIQVFEGERAKTKDNNLLGKFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSALEKGTGKTQKITITNDKGRLSKEEIDKMVSEAEKFKEEDEKEAARVQAKNQLESYAYSLKNTINDGEMKDKIGADDKEKLTKAIDETISWLDASQAASTEEYEDKRKELESVANPIISGAYGAAGGAPGGAGGFPGAGGFPGGAPGAGGPGGATGGESSGPTVEEVD
서열번호 163
MADGVFQGAIGIDLGTTYSCVATYDSAVEIIANEQGNRVTPSFVAFTSEERLIGDAAKNQAALNPKNTVFDAKRLIGRAFDDESVQKDIKSWPFKVVESNGQPLIEVEYLDETKTFSPQEISSMVLTKMKEIAEAKIGKKVEKAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGAIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLGAGKSEKERHVLIFDLGGGTFDVSLLNITGGVFTVKATAGDTHLGGQDFDTNLLEHFKKEFQKKTGNDISSDARALRRLRTACERAKRSLSSGTQTTVEIDSLFDGEDFSANITRARFEDINSALFKSTLEPVEQVLEDAKISKSQVDEVVLVGGSTRIPKVQKLLSDFFDGKQLEKSINPDEAVAYGAAVQGAILTGQSTNDDTKDLLLLDVIPLSLGVAMQGNVLAPVVPRNTTVPTIKRRTFTTVADHQTTVQFPVYQGERVNCSENTLLGEFDLKNIPPMQAGEPVLEAIFEVDANGILKVTAVEKSTGRSANITISNSIGRLSTEEIEKMISDAEKFKSSDDAFAKRHEQKQKLEAYVASVESTVTDPVLSAKLKKSAKDKIEAALSDALQTLEIEESSADDYRKAELALKRAVTKGMATR
서열번호 164
FTIPPNHEMIFTTDDAYKTKCDDKVMIIDYKNITKVIAPGKIIYVDDGVLSFEVISVDDQQTLKVRSLNAGMISSHKTANDVLELRVLSTSG
서열번호 165
MLFLLFLLITPIYAGLIFPTKPSSDPFYNPPKGFEKAAVGDILQSRETPKSITGRFAPLKIQNSWQLLVRSEDSFGNPNAIVTTVIEPVNADPSKIASYQVFEDAAKADCAPSYALQFGSDLTTFVTQAEMYLMAPLLDQGYYVVSPDYEGPKSTFTIGKQSGQAVLNSIRATLKSSKITNIKEDAKVVMWGYSGGSLASGWAAALQPSYAPELSSSLLGAALGGFVTNITATAQAADGTVFAGIVANALGGVANEYPEFKSILQSDTDKKSVFDEFDSHCLADGVIDYINTSFLTGDNKIFKTGWDILKSPTIAKIVEDNGLVYQKQLVPKIPIFVYHGSIDQIVPIVNVKKTYQNWCEGGISSLEFAEDGTNGHLTETVVGAPAALTWIIDRFNGKQTVSGCQHDKRLSNFQYPNISSSILKYFKVALDTMMSNGLGSDIQKDKITPDDLRKFLLGGW
서열번호 166
MSSDWDSVTIIGQKARVGGGGPRENVAKTSSQLNAARRAGLVVGTEKKYGTANTKSNPEGQRLTKLDATDDVVAVKKVDVSVGKAIQQARQEKKLTQKELATKVNEKPNVINDYEAGRAIPNQQLLAKLERALGVKLRGKNIGEPLFAKKK
서열번호 167
MSVDFNAVATEFCNFYYNQFDSDRSQLGNLYRNESMLTFETSQLQGARDIVEKLASLPFQKVAHRISTLDAQPASANGDILVMVTGELLIDEEQNAQRYSQVFHLIPDNGSYYVFNDIFRLNYS
서열번호 168
MSLSNKLSVKDLDVAGKRVFIRVDFNVPLDGKTITNNQRIVAALPTIKYVEEHKPKYIVLASHLGRPNGERNDKYSLAPVATELEKLLGQKVTFLNDCVGPEVTKAVENAKDGEIFLLENLRYHIEEEGSSKDKDGKKVKADPEAVKKFRQELTSLADVYINDAFGTAHRAHSSMVGLEVPQRAAGFLMSKELEYFAKALENPERPFLAILGGAKVSDKIQLIDNLLDKVDMLIVGGGMAFTFKKILNKMPIGDSLFDEAGAKNVEHLVEKAKKNNVELILPVDFVTADKFDKDAKTSSATDAEGIPDNWMGLDCGPKSVELFQQAVAKAKTIVWNGPPGVFEFEKFANGTKSLLDAAVKSAENGNIVIIGGGDTATVAKKYGVVEKLSHVSTGGGASLELLEGKDLPGVVALSNKN
서열번호 169
MSTVYFDVSADGQKLGKITFKLYDDVVPKTAENFRALCTGEKGFGYKGSIFHRVIPQFMLQGGDFTNFNGTGGKSIYGTKFADENFVKRHDRPGLLSMANAGPNTNGSQFFITTVPCPWLDGKHVVFGEVTDGLDIVKKIESFGSGSGATSKKIVIEESGQL
서열번호 170
MAISKNLPLLNNHFRKHWQERVRVHFDQAGKKASRRQSRLRKAAKIAPRPIDALRPVVRAPTVKYNRKVRAGRGFTLAELKAVGIAPKYARTIGISVDHRRQNKSQETFDANVARLQEYKSKLVIFDKKTKASEVASFEQVDVSATFPVEQPAPESGLRAVEVPEQTAYRTLRLARNEKKYKGIREKRAKEKAEAEAEKAKK
서열번호 171
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서열번호 172
MAKSGIAAGVNKGRKTTAKEVAPKISYRKGASSQRTVFVRSIVKEVAGLAPYERRLIELIRNAGEKRAKKLAKKRLGTHKRALRKVEEMTQVIAESRRH
서열번호 173
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서열번호 174
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서열번호 175
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상기 펩티드는 하기에서 정의되는 바와 같이 서열번호 88 내지 125를 갖는 펩티드로부터 선택됨:
2. 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성에 대해:
서열번호 157을 갖는 라노스테롤 14-알파 탈메틸효소 단백질(CP51)에 속하는 하나 이상의 펩티드, 여기서 상기 펩티드는 바람직하게는 상기에서 정의되는 서열번호 117 내지 122 및 177을 갖는 펩티드로부터 선택됨.
3. 병원성에 대해:
서열번호 163을 갖는 리파제 8 단백질(LIP8)에 속하는 하나 이상의 펩티드, 여기서 상기 펩티드는 바람직하게는 상기에서 정의되는 서열번호 123 내지 125를 갖는 펩티드로부터 선택됨.
4. 동정에 대해:
서열번호 155, 156, 158 내지 164, 및 166 내지 175를 갖는, 알코올 데히드로게나제 1 단백질(ADH1), 프룩토스-비포스페이트 알돌라제 단백질(ALF), F-box 단백질 COS111(CS111), 신장 인자 1-베타(EF1B), 에놀라제 1(ENO1), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(G3P), 열충격 단백질 SSA1(HSP71), 열충격 단백질 SSB1(HSP75), 피루베이트 키나제(KPYK), 멀티단백질-가교 인자 1(MBF1), 핵 수송 인자 2(NTF2), 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제(PPIA), 60S 리보솜 단백질 L13(RL13), 60S 리보솜 단백질 L28(RL28), 60S 리보솜 단백질 L36(RL36), 40S 리보솜 단백질 S22(RS22), 트리오스포스페이트 이소머라제(TPIS)에 속하는 하나 이상의 펩티드, 여기서 상기 펩티드는 바람직하게는 상기에서 정의되는 서열번호 88 내지 116을 갖는 펩티드로부터 선택됨.
서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44 내지 125 및 177을 갖는, 본 발명의 목적을 위해 사용되는 펩티드들은 신규하며, 본 발명의 또다른 주제를 구성한다.
본 발명의 방법 및 이의 이점들은 본 발명의 방법을 수행하는 다양한 비제한적인 예들과 관련하여 본 명세서의 나머지 부분에 나타날 것이다.
실시예 1: 생화학적 프로파일에 의해 샘플로부터 미생물의 동정
1. 배양배지상에서 샘플의 배양
최적의 배양배지와 최적의 배양조건은 미생물의 종에 따라 다르다. 자동적으로, 샘플은 다양한 배지상에 접종된다:
o 혐기성 조건을 사용하거나 사용하지 않고, 35℃에서 18 내지 24 시간 동안 양 혈액을 갖는 콜롬비아 한천(bioMerieux 참조번호 43041);
o 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 TSA 한천(bioMerieux 참조번호 43011).
2. 미생물의 동정
동정은 하기에 따라 수행된다:
1. 분리된 콜로니를 선택함.
2. 무균 상태를 준수하면서, 3.0 ml의 수성 멸균 염류용액(pH 4.5 내지 7.0, 0.45-0.50%의 NaCl을 함유함)을 투명 플라스틱(폴리스티렌) 테스트 튜브로 이동시킴.
3. 멸균 면봉 또는 멸균 스왑을 사용하여, 충분한 수의 동일한 콜로니들을 제2단계에서 제조된 염류용액의 튜브로 이동시키고, 박테리아 현탁액을 칼리브레이트된 VITEK 2 DENSICHEK에 의해 0.50 내지 0.63 McFarland로 조절함.
4. VITEK 2 카세트상에 VITEK 2 동정 카드 및 박테리아 현탁액의 튜브를 위치시킴.
5. 상기 카세트를 VITEK 2 기기로 로딩함.
6. 충진, 밀봉, 배양 및 판독 작용은 자동적임.
7. 생화학적 프로파일을 획득함.
8. 알려진 균주의 생화학적 프로파일과 비교함으로써, VITEK 2 시스템에 의한 동정을 수행함.
실시예 2: MALDI-TOF에 의해 샘플로부터 미생물의 동정
동정은 하기에 따라 수행된다:
1. 실시예 1에 따라 획득된 미생물 콜로니의 일부를 1 μl 루프에 의해 이동시켜, MALDI-TOF에 의한 질량분석용 플레이트상에 균일하게 증착시킴.
2. 1 μl의 매트릭스로 상기 증착물을 도포함. 사용되는 상기 매트릭스는 유기용매(50% 아세토니트릴 및 2.5% 트리플루오로아세트산) 중 HCCA(알파-시아노-4-히드록시신남산)의 포화용액임.
3. 주위온도에서 건조시킴.
4. 상기 플레이트를 질량분석기에 도입함.
5. 질량 스펙트럼을 획득함.
6. 획득한 스펙트럼을 지식 베이스에 포함된 스펙트럼과 비교함.
7. 지식 베이스에 의해 획득한 피크의 비교를 통해, 미생물을 동정함.
실시예 3: ESI-MS에 의해 샘플로부터 미생물의 동정
동정은 하기에 따라 수행된다:
1. 실시예 1에 따라 획득한 미생물 콜로니를 샘플링하고, 100 μl의 탈염수에서 현탁시킴.
2. 5분 동안 3000g에서 원심분리함.
3. 상청액을 제거함.
4. 100 μl의 탈염수에서 재현탁시킴.
5. 5분 동안 3000g에서 원심분리함.
6. 상청액을 제거함.
7. 아세토니트릴, 탈염수 및 포름산(50/50/0.1%)의 혼합물 100 μl에서 재현탁시킴.
8. 공극 크기가 0.45 μm인 필터에 의해 여과함.
9. 단일 MS 모드에서 질량분석기로 주입함.
10. 질량 스펙트럼을 획득함.
11. 획득한 스펙트럼을 지식 베이스에 포함된 스펙트럼과 비교함.
12. 기준 스펙트럼을 참조하여 미생물을 동정함.
실시예 4: 미생물로부터 소화된 단백질의 획득
통상적으로, 하기의 프로토콜이 11개의 단계로 수행된다:
1. 실시예 1에 따라 획득한 미생물 콜로니를 샘플링하고, 6M 구아니딘 염산염, 50 mM Tris-HCl, pH=8.0의 용액 10 내지 100 μl에서 현탁시킴.
2. 최종 농도 5 mM을 얻기 위하여 디티오트레이톨(DTT)을 첨가함.
3. 수조에서 20분 동안 95℃에서 환원시킴.
4. 튜브를 주위 온도로 냉각시킴.
5. 최종 농도 12.5 mM을 얻기 위하여 요오드아세트아미드를 첨가함.
6. 주위 온도에서 40분 동안 암중에서 알킬화시킴.
7. 최종 구아니딘 염산염 농도 1M을 얻기 위하여 50 mM, NH4HCO3 용액, pH=8.0으로 6배 희석시킴.
8. 1 μg의 트립신을 첨가함.
9. 밤새 6시간 동안 37℃에서 소화시킴.
10. 반응을 중지시키기 위하여 4 미만의 pH까지 포름산을 첨가함.
11. 30분 동안 100000g에서 초원심분리함.
실시예 5:
S. 아우레우스
샘플의 특징화:
실시예 1 내지 3에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 샘플의 하나 이상의 종이 수립된 후에, 하기에 나열된 종들이 분석된다.
S. 아우레우스의 13개의 균주들이 분석되어, 그의 동정이 확인되고 그의 특징들이 수립된다:
ID2 ID3
ID4 ID2a
ID3a ID4a
AST7 AST8
AST13 AST14
VIR5 VIR6
VIR7
동일한 분석 방법이 S. 아우레우스 종에 속하지 않는 종에 적용되고, 이는 음성대조군으로서 제공된다:
- 대장균
ID7 AST2
- S. 뉴모니애
VIR21
- C. 디피실리
VIR26
각각의 샘플은 실시예 4에 따라 처리되고, 그 후 5 μl 부피의 소화된 단백질이 주입되고, 하기의 조건에 따라 분석된다:
- Agilent Technologies(Massy, 프랑스)사의 Agilent 1100 계열 크로마토그래피 시스템.
- Waters Symmetry C18 컬럼, 2.1 mm 내직경, 100 mm 길이, 입자크기 3.5 μm.
- 용매 A: H2O + 0.1% 포름산.
- 용매 B: ACN + 0.1% 포름산.
- 하기의 표 1에서 정의된 HPLC 구배:
- 크로마토그래피 컬럼의 출구에서 용출액이 Applied Biosystems(Foster City, 미국)사의 QTRAP® 5500 질량분석기의 이온화 원에 직접적으로 주입된다.
- 미생물의 단백질의 소화로부터 생성된 펩티드는 MRM 모드에서 질량분석에 의해 분석된다. 표 2에 나타낸 펩티드만 검출된다. 이를 위해, 표 2에 나타낸 1세대 단편(들)이 검출된다. 각각의 전이체, 즉 1세대 단편과 연관되는 각각의 펩티드가 반응할 수 있게 되는 적용은 표 2의 임상적 관심 컬럼에서 문자 I, T, R 및 V에 의해 명시된다. I는 미생물의 동정의 확인을 나타내며, T는 유형화를 나타내며, R은 하나 이상의 항생물질에 대한 내성을 나타내며, V는 병원성 인자의 검출을 나타낸다.
전구 펩티드의 전하 상태, 그의 보유시간 및 전이체, 즉 Q1에서 비 (m/z)1 및 Q3에서 비 (m/z)2가 표 3에 나타나 있다. 전구 이온을 단편화하는데 사용되는 충돌 에너지가 또한 표 3에 나타난다.
- 사용된 다른 기기 파라미터들은 하기와 같다:
스캔 유형: MRM
극성: 포지티브
이온화 원: Turbo V™(Applied BioSystems)
Q1 세팅: 단위 해상도에 의한 필터링(filtering with unit resolution)
Q3 세팅: 단위 해상도에 의한 필터링
인터-스캔 정지: 5.00 msec
스캔 속도: 10 Da/s
커튼 가스: 50.00 psi
콘 전압: 5500.00 V
원(source) 온도: 500.00℃
분무 가스: 50.00 psi
열 가스: 40.00 psi
동적 충진(dynamic filling): 활성화됨
DP(declustering potential): 100.00 V
Q0 이전의 EP(entry potential): 6.00 V
CXP(collision cell exit potential): 11 V
전체 주기 시간: 1.6 sec
시험되는 각각의 전이체와 각각의 미생물에 대해 획득된 면적이 측정되었다. 면적이 1000(임의 단위)과 같거나 더 큰 전이체들 모두는 포지티브인 것으로 고려되며, 표 4a 및 4b에서 "1"로 표시된다. 면적이 1000보다 더 작은 전이체들 모두는 네거티브인 것으로 고려되며, 표 4a 및 4b에서 "0"으로 표시된다. 어떠한 신호 피크도 관찰되지 않았을 경우, 전이체는 네거티브로 표시되었다.
포지티브-전이체 수는 적용 I, R 및 V에 대해 합산되어, 표 5에 표시된다:
S. 아우레우스 샘플 모두는 I 카테고리에서 12개보다 많은 포지티브 전이체들을 나타낸다. 따라서, 상기 샘플 모두는 실제로 S. 아우레우스 종에 속하는 것으로 확인된다.
다른 한편, 샘플 ID7, AST2, VIR21 및 VIR26은 I 카테고리에서 2개보다 적은 포지티브 전이체들을 나타내며, 이에 따라 상기 샘플들은 S. 아우레우스 종에 속하지 않는 것으로 확인된다.
S. 아우레우스의 ID2, ID4, ID2a, ID4a, AST13 및 AST14 균주는 R 카테고리에 대해 8개보다 많은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 페니실린 결합 단백질(PBP2a)을 발현하고, 이는 그룹 M 페니실린(예컨대, 메티실린)에 대한 내성의 메카니즘과 아주 밀접하다.
다른 한편, S. 아우레우스의 ID3, ID3a, AST7, AST8, VIR5, VIR6 및 VIR7 균주는 V 카테고리에 대해 3개보다 적은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 PBP2a를 발현하지 않는다. 따라서, 이들 균주는 그룹 M 페니실린과 같은 항생물질에 대해 민감성이다.
S. 아우레우스 종에 속하지 않는 ID7, AST2, VIR21 및 VIR26 균주는 또한 R 카테고리에 대해 3개보다 적은 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 PBP2a를 발현하지 않으며, 따라서 본 방법의 특이성이 확인된다.
S. 아우레우스의 VIR5 및 VIR7 샘플은 V 카테고리에서 9개보다 많은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 PVL(Panton-Valentine-Leukocidin) 단백질을 발현한다.
다른 한편, S. 아우레우스의 ID2, ID3, ID4, ID2a, ID3a, ID4a, AST7, AST8, AST13, AST14 및 VIR6 균주는 3개보다 적은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 PVL을 발현하지 않는다. 따라서, 이들 균주는 PVL과 관련되는 병원성 특징을 갖지 않는다.
S. 아우레우스 종에 속하지 않는 ID7, AST2, VIR21 및 VIR26 균주는 또한 V 카테고리에 대해 3개보다 적은 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 PVL을 발현하지 않으며, 따라서 본 방법의 특이성이 확인된다.
유형화를 위해, 각 균주의 T-카테고리 전이체들이 참조 균주로서 고려되는 다른 균주의 전이체들과 비교된다. 실제로, 2개의 균주 사이의 전이체가 동일한 카테고리(포지티브 또는 네거티브)로 분류될 때 값 0이 부여되고, 2개의 균주 사이의 전이체가 다른 카테고리(포지티브 전이체 및 네거티브 전이체)로 분류될 때 값 1이 부여된다. 상기 값은 각각의 균주 쌍의 T-카테고리 전이체 모두에 대해 합산되어, 스코어가 수립된다. 표 6에 스코어가 기재되어 있다:
스코어가 4와 같거나 더 작은 균주는 동일한 유형이며, 스코어가 4보다 엄밀히 더 높은 균주는 상이한 유형이다.
따라서, ID2와 ID2a, ID3과 ID3a, ID4와 ID4a, 및 AST7과 AST8 균주는 동일한 유형이다. 쌍으로 묶여진 다른 모든 균주들은 유형이 상이하다. S. 아우레우스가 아닌 ID7, AST2, VIR21 및 VIR26 균주와 S. 아우레우스에 해당하는 다른 모든 균주들 사이에 획득되는 높은 합계가 주목되어야 한다. 이러한 결과들은 본 방법의 특이성을 확인시켜준다.
ID7, AST2, VIR21 및 VIR26 균주는 물론 동일한 유형이 아니며; 이들은 다른 종이다. 따라서, 이들 균주는 서로 비교될 수 없으며, 표 6에 어떠한 값도 기재되어 있지 않다.
매우 유리하게는, 25보다 높은 스코어, 예컨대 ID2와 VIR7 사이의 스코어는 균주 사이의 큰 분기(divergence)를 나타낸다. ID2와 AST14 사이에서와 같이 15 내지 25의 스코어는 중간 정도의 분기를 나타내며, ID2와 ID4a 사이에서와 같이 5 내지 15의 스코어는 약한 분기를 나타낸다.
이에 따라 수행되는 방법은 따라서 2개의 균주가 동일한 유형인지 여부를 수립할 수 있게 할 뿐만 아니라(이는 감염의 공통 진원을 식별하기 위해 중요함), 2개의 균주의 근접도를 측정할 수 있게 한다(이는 전염병학적 연구에서 매우 중요함).
본 실시예에 의해, 매우 유리하게도 본 발명은 S. 아우레우스와 같은 종의 정체를 1시간 미만의 시간(이는 매우 짧음) 내에 확인할 수 있게 해주며, 동일한 분석 내에서 동시에 유형화 및 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특징을 결정하고 병원성 인자의 존재를 수립할 수 있게 해준다는 점이 입증된다. 상기 특징들은 동일한 기기에 의해 수립되었으며, 이는 결과의 분석과 보고를 매우 촉진시켜주었다. 마지막으로, 박테리아 DNA(이는 죽어있는 박테리아의 존재에 의해 왜곡될 수 있음)를 이용한 특징화와는 달리, 박테리아의 특징은 박테리아 단백질(이는 거주하고 살아있는 미생물의 존재를 반영함)을 이용하여 수립된다.
실시예 6: 탈염화 단계를 갖는 미생물의 소화에 대한 프로토콜
통상적으로, 하기의 프로토콜이 17개의 단계로 수행된다:
1단계 내지 10단계: 실시예 4와 같음.
11. 샘플의 부피는 물/0.1%(v/v) 포름산에 의해 1 ml까지 만들어짐.
12. 1 ml의 메탄올 그 후 1 ml의 H2O/0.1%(v/v) 포름산에 의해, Waters Oasis HLB 컬럼을 평형화시킴.
13. 중력에 의해 흐르는 샘플을 로딩함.
14. 1 ml의 H2O/0.1%(v/v) 포름산으로 세척함.
15. 80% 메탄올 및 20% 물/0.1%(v/v) 포름산의 혼합물 1 ml로 용출시킴.
16. 용출액은 2시간 동안 SpeedVac® SPD2010 증발기(Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, 미국)에 의해 증발되어, 약 100 μl의 부피가 획득됨.
17. 상기 용출액은 그 후 물/0.5%(v/v) 포름산 용액에 함유됨, (QS)에 충분한 양 250 μl.
실시예 7:
대장균
샘플의 특징화:
실시예 1 내지 3에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 샘플의 하나 이상의 종이 수립된 후에, 하기에 나열된 종들이 분석된다.
15개의 대장균 균주들이 분석되어, 그의 동정이 확인되고 그의 특징들이 수립된다:
AST1 AST2
AST3 AST4
AST5 VIR41
VIR42 VIR43
VIR44 VIR45
ID6 ID7
ID8 ID9
ID10
동일한 분석 방법이 대장균 종에 속하지 않는 종에 적용되고, 이는 음성대조군으로서 제공된다:
- S. 아우레우스
VIR10
- S. 뉴모니애
VIR19
- C. 디피실리
VIR28
각각의 샘플은 실시예 6에 따라 처리되고, 그 후 5 μl 부피의 소화된 단백질이 주입되고, 하기의 조건에 따라 분석된다:
- Agilent Technologies(Massy, 프랑스)사의 Agilent 1100 계열 크로마토그래피 시스템.
- Waters Symmetry C18 컬럼, 2.1 mm 내직경, 100 mm 길이, 입자크기 3.5 μm.
- 용매 A: H2O + 0.1% 포름산.
- 용매 B: ACN + 0.1% 포름산.
- 하기의 표 7에서 정의된 HPLC 구배:
- 크로마토그래피 컬럼의 출구에서 용출액이 Applied Biosystems(Foster City, 미국)사의 QTRAP® 5500 질량분석기의 이온화 원에 직접적으로 주입된다.
- 미생물의 단백질의 소화로부터 생성된 펩티드는 MRM 모드에서 질량분석기를 이용하여 분석된다. 표 8에 나타낸 펩티드만 검출된다. 이를 위해, 표 8에 나타낸 1세대 단편(들)이 검출된다. 각각의 전이체, 즉 1세대 단편과 연관되는 각각의 펩티드가 반응할 수 있게 되는 적용은 표 8의 임상적 관심 컬럼에서 문자 I, T, R 및 V에 의해 명시된다. I는 미생물의 동정의 확인을 나타내며, T는 유형화를 나타내며, R은 하나 이상의 항생물질에 대한 내성을 나타내며, V는 병원성 인자의 검출을 나타낸다.
전구 펩티드의 전하 상태, 그의 보유시간 및 전이체, 즉 Q1에서 비 (m/z)1 및 Q3에서 비 (m/z)2가 표 9에 나타나 있다. 전구 이온을 단편화하는데 사용되는 충돌 에너지가 또한 표 9에 나타난다.
- 사용된 다른 기기 파라미터들은 하기와 같다:
스캔 유형: MRM
스케쥴된 MRM: 예스
극성: 포지티브
이온화 원: Turbo V™(Applied BioSystems)
Q1 세팅: 단위 해상도에 의한 필터링
Q3 세팅: 단위 해상도에 의한 필터링
인터-스캔 정지: 5.00 msec
스캔 속도: 10 Da/s
커튼 가스: 50.00 psi
콘 전압: 5500.00 V
원(source) 온도: 550.00℃
분무 가스: 50.00 psi
열 가스: 40.00 psi
동적 충진: 활성화됨
DP(declustering potential): 100.00 V
Q0 이전의 EP(entry potential): 9.00 V
CXP(collision cell exit potential): 35 V
전체 주기 시간: 1.2 sec
검출 창: 80 sec
시험되는 각각의 전이체와 각각의 미생물에 대해 획득된 면적이 측정되었다. 면적이 2500(임의 단위)과 같거나 더 큰 전이체들 모두는 포지티브인 것으로 고려되며, 표 10a 및 10b에서 "1"로 표시되었다. 면적이 2500보다 작은 전이체들 모두는 네거티브인 것으로 고려되며, 표 10a 및 10b에서 "0"으로 표시되었다. 어떠한 신호 피크도 관찰되지 않았을 경우, 전이체는 네거티브로 표시되었다.
포지티브-전이체 수는 I, R 및 V 적용에 대해 합산되어, 표 11에 표시된다:
대장균 샘플 모두는 I 카테고리에서 44개보다 많은 포지티브 전이체들을 나타낸다. 따라서, 상기 샘플 모두는 실제로 대장균 종에 속하는 것으로 확인된다.
다른 한편, VIR10, VIR19 및 VIR28 샘플은 I 카테고리에서 3개보다 적은 포지티브 전이체들을 나타내며, 이에 따라 상기 샘플들은 대장균 종에 속하지 않는 것으로 확인된다.
대장균의 AST2, AST3, AST4 및 AST5 균주는 R 카테고리에 대해 14개보다 많은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 플라스미드-매개 페니실리나제 TEM-2를 발현하고, 이는 페니실린에 대한 내성의 메카니즘과 아주 밀접하다.
다른 한편, 대장균의 AST1, VIR41, VIR42, VIR43, VIR44, VIR45, ID6, ID7, ID8, ID9 및 ID10 균주는 R 카테고리에 대해 7개보다 적은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 플라스미드-매개 페니실리나제 TEM-2를 발현하지 않는다. 따라서, 이들 균주는 페니실린, 특히 아미노페니실린 또는 A 페니실린(암피실린), 카복시페니실린 또는 C 페니실린(티카르실린) 및 우레이도페니실린 또는 페니실린 U(피페라실린)에 대해 민감성이다.
대장균 종에 속하지 않는 VIR10, VIR19 및 VIR28 균주는 R 카테고리에 대해 2개보다 적은 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 TEM-2를 발현하지 않으며, 따라서 본 방법의 특이성이 확인된다.
대장균의 VIR41, VIR42, VIR43 및 VIR44 샘플은 V 카테고리에서 4개보다 많은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 shiga독소 1 또는 shiga독소 2(STX1 또는 STX2) 독소를 발현한다. 보다 구체적으로, VIR41에 대해 전이체 118 내지 125가 포지티브이며, 이에 따라 VIR41은 동시에 shiga독소 1 및 shiga독소 2를 발현한다. VIR42 및 VIR44는 전이체 121 내지 125에 대해 포지티브이며, 이에 따라 shiga독소 2를 발현한다. 전이체 123 및 124를 나타내는 VIR45에서도 마찬가지이다. 전이체 118 내지 122를 나타내는 VIR43은 shiga독소 2를 발현한다. 다른 한편, 대장균의 AST1, AST2, AST3, AST4, AST5, VIR45, ID6, ID7, ID8, ID9 및 ID10 균주는 3개보다 적은 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 shiga독소를 발현하지 않는다. 따라서, 이들 균주는 shiga독소와 관련되는 병원성 특징을 갖지 않는다.
대장균 종에 속하지 않는 VIR10, VIR19 및 VIR28 균주는 또한 V 카테고리에 대해 3개보다 적은 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 stx1 또는 stx2를 발현하지 않으며, 따라서 본 방법의 특이성이 확인된다.
유형화를 위해, 각 균주의 T-카테고리 전이체들이 참조 균주로서 고려되는 다른 균주의 전이체들과 비교된다. 실제로, 2개의 균주 사이의 전이체가 동일한 카테고리(포지티브 또는 네거티브)로 분류될 때 값 0이 부여되고, 2개의 균주 사이의 전이체가 다른 카테고리(포지티브 전이체 및 네거티브 전이체)로 분류될 때 값 1이 부여된다. 상기 값은 각각의 균주 쌍의 T-카테고리 전이체 모두에 대해 합산되어, 스코어가 수립된다. 표 12에 스코어가 기재되어 있다:
스코어가 4와 같거나 더 작은 균주는 동일한 유형이며, 스코어가 4보다 엄밀히 더 높은 균주는 상이한 유형이다.
따라서, AST2, AST3, AST4 및 AST5 균주는 동일한 유형이다. AST1 및 ID6 균주와 ID7, ID8, ID9 및 ID10 균주에 대해서도 각각 마찬가지이다. 쌍으로 묶여진 다른 모든 균주들은 유형이 상이하다. S. 아우레우스가 아닌 VIR10, VIR19 및 VIR28 균주와 S. 아우레우스에 해당하는 다른 모든 균주들 사이에 획득되는 높은 합계가 주목되어야 한다. 이러한 결과들은 본 방법의 특이성을 확인시켜준다.
VIR10, VIR19 및 VIR28 균주는 다른 종이다. 따라서, 이들 균주는 서로 비교될 수 없으며, 표 12에 어떠한 값도 기재되어 있지 않다.
매우 유리하게는, 20보다 높은 스코어, 예컨대 AST4와 VIR41 사이의 스코어는 균주 사이의 큰 분기를 나타낸다. ID7과 VIR42 사이에서와 같이 12 내지 20의 스코어는 중간 정도의 분기를 나타내며, ID10과 AST1 사이에서와 같이 4 내지 12의 스코어는 약한 분기를 나타낸다.
이에 따라 수행되는 방법은 따라서 2개의 균주가 동일한 유형인지 여부를 수립할 수 있게 할 뿐만 아니라(이는 감염의 공통 진원을 식별하기 위해 중요함), 2개의 균주의 근접도를 측정할 수 있게 한다(이는 전염병학적 연구에서 매우 중요함).
본 실시예에 의해, 매우 유리하게도 본 발명은 대장균과 같은 종의 정체를 1시간 미만의 시간(이는 매우 짧음) 내에 확인할 수 있게 해주며, 동일한 분석 내에서 동시에 유형화 및 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특징을 결정하고 병원성 인자의 존재를 수립할 수 있게 해준다는 점이 입증된다. 상기 특징들은 동일한 기기에 의해 수립되었으며, 이는 결과의 분석과 보고를 매우 촉진시켜주었다. 마지막으로, 박테리아 DNA(이는 죽어있는 박테리아의 존재에 의해 왜곡될 수 있음)를 이용한 특징화와는 달리, 박테리아의 특징은 박테리아 단백질(이는 거주하고 살아있는 미생물의 존재를 반영함)을 이용하여 수립된다.
실시예 8: 메탄올의 존재하에서 미생물의 소화에 대한 프로토콜
통상적으로, 하기의 프로토콜이 17개의 단계로 수행된다:
1. 실시예 1에 따라 획득한 미생물 콜로니를 샘플링하고, 400 μl의 50 mM 암모늄 비카보네이트 용액, pH=8.0에서 현탁시킴.
2. 600 μl의 메탄올을 첨가함.
3단계 내지 7단계: 실시예 4의 2단계 내지 6단계와 같음.
8단계 내지 17단계: 실시예 6의 8단계 내지 17단계와 같음.
실시예 9:
C. 알비칸스
샘플의 특징화:
실시예 1 내지 3에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 샘플의 하나 이상의 종이 수립된 후에, 하기에 나열된 종들이 분석된다.
17개의 C. 알비칸스 균주들이 분석되어, 그의 동정이 확인되고 그의 특징들이 수립된다:
ATF1 ATF2
ATF3 ATF4
ATF5 ATF6
ATF7 VIR31
VIR32 VIR33
VIR34 VIR35
VIR36 VIR37
VIR38 VIR39
CA16
동일한 분석 방법이 C. 알비칸스 종에 속하지 않는 종에 적용되고, 이는 음성대조군으로서 제공된다:
- 대장균
VIR43
- S. 아우레우스
VIR5
- E. 패시움
AST-VAN8
각각의 샘플은 실시예 8에 따라 처리되고, 그 후 5 μl 부피의 소화된 단백질이 주입되고, 실시예 7에서와 동일한 조건에 따라 분석된다.
- 미생물의 단백질의 소화로부터 생성된 펩티드는 MRM 모드에서 질량분석기를 이용하여 분석된다. 표 13에 나타낸 펩티드만 검출된다. 이를 위해, 표 13에 나타낸 1세대 단편(들)이 검출된다. 각각의 전이체, 즉 1세대 단편과 연관되는 각각의 펩티드가 반응할 수 있게 되는 적용은 표 14의 임상적 관심 컬럼에서 문자 I, T, R 및 V에 의해 명시된다. I는 미생물의 동정의 확인을 나타내며, T는 유형화를 나타내며, R은 하나 이상의 항생물질에 대한 내성을 나타내며, V는 병원성 인자의 검출을 나타낸다.
전구 펩티드의 전하 상태, 그의 보유시간 및 전이체, 즉 Q1에서 비 (m/z)1 및 Q3에서 비 (m/z)2가 표 14에 나타나 있다. 전구 이온을 단편화하는데 사용되는 충돌 에너지가 또한 표 14에 나타난다.
사용된 다른 기기 파라미터들은 실시예 7에서와 동일하다. 시험되는 각각의 전이체와 각각의 미생물에 대해 획득된 면적이 측정되었다. 면적이 2000(임의 단위)과 같거나 더 큰 전이체들 모두는 포지티브인 것으로 고려되며, 표 15a 및 15b에서 "1"로 표시되었다. 면적이 2000보다 작은 전이체들 모두는 네거티브인 것으로 고려되며, 표 15a 및 15b에서 "0"으로 표시되었다. 어떠한 신호 피크도 관찰되지 않았을 경우, 전이체는 네거티브로 표시되었다.
포지티브-전이체 수는 I, R 및 V 적용에 대해 합산되어, 표 16에 표시된다:
C. 알비칸스 샘플 모두는 I 카테고리에서 60개보다 많은 포지티브 전이체들을 나타낸다. 따라서, 상기 샘플 모두는 실제로 C. 알비칸스 종에 속하는 것으로 확인된다.
다른 한편,VIR43, VIR5 및 AST-VAN8 샘플은 I 카테고리에서 13개보다 적은 포지티브 전이체들을 나타내며, 이에 따라 상기 샘플들은 C. 알비칸스 종에 속하지 않는 것으로 확인된다.
전이체 84 및 85의 관찰은 돌연변이된 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF6 및 ATF7 균주의 내성을 나타낸다.
전이체 86 및 87의 관찰은 돌연변이된 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF2 및 ATF3 균주의 내성을 나타낸다.
전이체 96의 관찰은 돌연변이된 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF5 균주의 내성을 나타낸다.
전이체 99 및 100의 관찰은 돌연변이된 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF7 균주의 내성을 나타낸다.
전이체 88 및 89의 관찰은 천연 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF4 균주의 민감성을 나타낸다.
전이체 93 및 94의 관찰은 천연 펩티드의 존재를 보여주며, 이는 ATF1 및 ATF4 균주의 민감성을 나타낸다.
I 전이체들의 면적 모두는 합산되어 합계 SI가 제공된다. V 전이체들의 면적 모두는 합산되어 합계 SV가 제공된다. 그 후, SV/SI 비가 산출되고, 이는 곱셈계수 MF에 의해 곱해진다. 획득된 결과는 표 17에 기재된다.
(SV/SI) 비 × MF 값이 9x104보다 더 큰 VIR31 및 VIR32 균주는 리파제 8을 과발현하고, 이들 균주는 따라서 병원성(virulent)이다. 다른 모든 균주들은 9x104보다 작은 비를 가지고, 리파제 8을 과발현하지 않으며, 따라서 병원성이 아니다. 흥미롭게도, (SV/SI) 비 × MF 값이 VIR32 균주에서보다 VIR31 균주에서 더 높기 때문에, VIR31 균주는 VIR32 균주보다 병원성이 더 큰 것으로 특징지워진다.
유형화를 위해, 각 균주의 T-카테고리 전이체들이 참조 균주로서 고려되는 다른 균주의 전이체들과 비교된다. 실제로, 2개의 균주 사이의 전이체가 동일한 카테고리(포지티브 또는 네거티브)로 분류될 때 값 0이 부여되고, 2개의 균주 사이의 전이체가 다른 카테고리(포지티브 전이체 및 네거티브 전이체)로 분류될 때 값 1이 부여된다. 상기 값은 각각의 균주 쌍의 T-카테고리 전이체 모두에 대해 합산되어, 스코어가 수립된다. 표 18에 스코어가 기재되어 있다:
스코어가 2와 같거나 더 작은 균주는 동일한 유형이며, 스코어가 2보다 엄밀히 더 높은 균주는 상이한 유형이다.
따라서, ATF1과 ATF2, VIR35와 VIR36, 및 VIR37과 VIR38 균주는 각각 동일한 유형이다. 쌍으로 묶여진 다른 모든 균주들은 유형이 상이하다. S. 아우레우스가 아닌 VIR43, VIR5 및 AST-VAN8 균주와 S. 아우레우스에 해당하는 다른 모든 균주들 사이에 획득되는 높은 합계가 주목되어야 한다. 이러한 결과들은 본 방법의 특이성을 확인시켜준다.
VIR43, VIR5 및 AST-VAN8 균주는 다른 종이다. 따라서, 이들 균주는 서로 비교될 수 없으며, 표 18에 어떠한 값도 기재되어 있지 않다.
매우 유리하게는, 20보다 높은 스코어, 예컨대 ATF1과 VIR39 사이의 스코어는 균주 사이의 큰 분기를 나타낸다. CA16과 ATF1 사이에서와 같이 14 내지 20의 스코어는 중간 정도의 분기를 나타내며, ATF1과 ATF7 사이에서와 같이 4 내지 14의 스코어는 약한 분기를 나타낸다.
이에 따라 수행되는 방법은 따라서 2개의 균주가 동일한 유형인지 여부를 수립할 수 있게 할 뿐만 아니라(이는 감염의 공통 진원을 식별하기 위해 중요함), 2개의 균주의 근접도를 측정할 수 있게 한다(이는 전염병학적 연구에서 매우 중요함).
본 실시예에 의해, 매우 유리하게도 본 발명은 C. 알비칸스와 같은 종의 정체를 1시간 미만의 시간(이는 매우 짧음) 내에 확인할 수 있게 해주며, 동일한 분석 내에서 동시에 유형화 및 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특징을 결정하고 병원성 인자의 존재를 수립할 수 있게 해준다는 점이 입증된다. 본 발명은 또한 정량적 분석을 할 수 있게 해주며, 이는 특히 하나 이상의 항생물질에 대한 내성, 또는 병원성의 특징들이 단백질 또는 대사물질의 발현 수준과 연관될 경우에 유리하다. 이것이 우리가 리파제 8의 정량 분석에 의해 보여준 것이다. 상기 특징들은 동일한 기기에 의해 수립되었으며, 이는 결과의 분석과 보고를 매우 촉진시켜주었다. 마지막으로, 균류 DNA(이는 죽어있는 효모의 존재에 의해 왜곡될 수 있음)를 이용한 특징화와는 달리, 효모의 특징은 균류 단백질(이는 거주하고 살아있는 미생물의 존재를 반영함)을 이용하여 수립된다.
실시예 10: 하나 이상의 대사물질을 분석하는데 적합한, 메탄올의 존재하에서 미생물의 소화에 대한 프로토콜
통상적으로, 하기의 프로토콜이 19개의 단계로 수행된다:
1. 실시예 1에 따라 획득한 5개의 미생물 콜로니를 샘플링하고, 100 μl의 6M 구아니딘 염산염, 50 mM Tris-HCl 용액, pH=8.0에서 현탁시킴.
2. 5분 동안 15000g에서 원심분리함.
3. 400 μl의 50 mM 암모늄 비카보네이트 용액, pH=8.0에 펠릿이 포함됨.
4. 600 μl의 메탄올을 첨가함.
5단계 내지 9단계: 실시예 4의 2단계 내지 6단계와 같음.
10단계 내지 19단계: 실시예 6의 8단계 내지 17단계와 같음.
실시예 11: 단백질과 대사물질의 동시 분석에 의한
C. 알비칸스
샘플의 특징화:
실시예 1 내지 3에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 샘플의 하나 이상의 종이 수립된 후에, 하기에 나열된 종들이 분석된다.
5개의 C. 알비칸스 균주들이 분석되어, 그의 동정이 확인되고 그의 특징들이 수립된다:
ATF1 ATF2
ATF3 ATF4
ATF6
각각의 샘플은 실시예 10에 따라 처리되고, 그 후 20 μl 부피의 소화된 단백질이 주입되고, 실시예 7에서와 동일한 조건에 따라 분석된다.
표 13 및 14는 하나만 제외하고 동일하다. 전이체 번호 109가 본 방법에 추가된다. 이는 임상적 관심 I 및 R을 갖는 분자, 에르고스테롤에 대응한다.
전구체의 전하 상태는 1이고, 보유시간은 36.3분이며, Q1에서 필터링된 m/z는 379.4이고, Q3에서 필터링된 m/z는 69.2이며, 충돌 에너지는 47이다.
질량 파라미터는 하기 사항을 제외하고 실시예 7에서와 동일하다:
커튼 가스: 25.00 psi
원(source) 온도: 450.00℃
열 가스: 50.00 psi
Q0 이전의 EP(entry potential): 4.00 V
전이체 109에 대해서는, 하기의 파라미터들이 다르다:
DP(declustering potential): 200.00 V
Q0 이전의 EP(entry potential): 10.00 V
CXP(collision cell exit potential): 8 V
모든 전이체 1 내지 108이 실시예 9와 동일한 방식으로 분석된다. I 전이체들의 면적 모두는 합산되어 합계 SI가 제공된다. 전이체 109의 면적은 A109라고 한다. 그 후, A109/SI 비가 산출되고, 곱셈계수 MF가 곱해진다. 획득된 결과는 표 19에 기재된다.
(A109/SI) 비 × MF 값이 2x103보다 더 큰 ATF2, ATF3 및 ATF6 균주는 에르고스테롤을 과발현하며; 이들 균주는 따라서 내성이다. 다른 모든 균주들은 2x103보다 적은 비를 가지고, 에르고스테롤을 발현하지 않으며, 따라서 내성이 아니다.
본 실시예에 의해, 매우 유리하게도 본 발명은 단백질, 펩티드 또는 대사물질과 같은 다양한 화합물들을 동일한 분석 내에서 1시간 미만의 시간(이는 매우 짧음) 내에 정량적으로 동시에 분석할 수 있게 해준다는 점이 입증된다. 단백질의 분석보다 더욱더 유리하게, 상기 단백질의 작용으로부터 생성된 대사물질의 정량적 분석은 관능적 단백질의 존재를 특징화하며, 보다 넓게 관능 합성 경로를 특징화한다. 따라서, 에르고스테롤의 정량화는 본 경우에 관능적이고 강한 활성인 라노스테롤 탈메틸효소의 존재와 연관되는 플루코나졸에 대한 내성의 메카니즘의 존재를 수립할 수 있게 해준다.
실시예 12: 소변 샘플에 존재하는 미생물의 특징화:
실시예 1 내지 3에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 샘플의 하나 이상의 종이 수립된 후에, 대장균으로 오염된 5개의 소변 샘플(소변 1 내지 5)이 분석된다. 오염되지 않은 6번째 소변(소변 6)이 음성대조군으로서 제공되기 위해 또한 분석된다.
하기의 프로토콜은 29개의 단계로 수행된다(5단계 내지 12단계는 임의적이며, 결과를 유의적으로 변형시키지 않고 생략될 수 있음):
1. 30초 동안 2000g에서 오염된 소변 5 ml를 원심분리함.
2. 상청액을 제거함.
3. 5분 동안 15000g에서 원심분리함.
4. 상청액을 제거함.
5. 재현탁에 의해 3 ml의 증류수로 펠릿을 세척함.
6. 5분 동안 15000g에서 원심분리함.
7. 상청액을 제거함.
8. 1/10로 희석하여 용매를 펠릿과 접촉시킴.
9. -20℃에서 1시간 동안 방치함.
10. 5분 동안 15000g에서 원심분리함.
11. 상청액을 제거함.
12. 1/10로 희석하여 용매를 펠릿과 접촉시킴.
13. -20℃에서 1시간 동안 방치함.
14. 5분 동안 15000g에서 원심분리함.
15. 상청액을 제거함.
12. 펠릿을 10 내지 100 μl의 6M 구아니딘 염산염, 50 mM Tris-HCl 용액, pH=8.0에서 현탁시킴.
13. 14단계 내지 18단계: 실시예 4의 2단계 내지 6단계와 같음.
19. 19단계 내지 28단계: 실시예 6의 8단계 내지 17단계와 같음.
29. 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라, 크로마토그래피 시스템 및 질량분석기상에 100 μl의 산성화된 용출액을 주입함.
시험되는 각각의 전이체와 각각의 미생물에 대해 획득된 면적들이 측정되었다. 소변 샘플은 하나의 샘플과 다른 샘플간에 매우 상이한 박테리아 양을 갖고 있기 때문에, 포지티브 전이체를 선언하기 위해 실시예 7에서 사용된 한계값은 여기서 사용될 수 없다. 이는 박테리아의 존재량에 대해 조절되어야 한다. 이전의 실시예에서, 콜로니의 샘플링은 비슷항 양의 미생물을 생성하였다. 이는 본 실시예에서 더 이상 적용되지 않는다. 따라서, 박테리아의 양은 모든 I 전이체들의 면적을 합산함으로써 추산된다. I 전이체들의 면적의 합계는 표 20에 기재된다.
따라서, 샘플 4는 샘플 3보다 더 많은 박테리아 양을 포함하며, 이는 그 자체로 실시예 1 및 5보다 양이 더 많으며, 이는 그 자체로 샘플 2보다 양이 더 많다. 샘플 1 및 5는 비슷한 박테리아 양을 갖는다. 샘플 6은 대장균을 포함하지 않고 제로 값의 양을 나타내며, 이에 따라 본 기법의 특이성이 입증된다.
그 후, 각 전이체의 면적은 모든 I 전이체들의 면적에 의해 나눔으로써 표준화된다. 상기 비가 0.00015(무차원 비)와 같거나 더 큰 전이체들 모두는 포지티브인 것으로 고려되며, 이는 표 21에서 "1"로 표시된다. 상기 비가 0.00015보다 작은 전이체들 모두는 네거티브인 것으로 고려되며, 표 21에서 "0"으로 표시된다. 어떠한 신호 피크도 관찰되지 않았을 경우, 전이체는 네거티브로 표시되었다.
포지티브-전이체 수는 I, R 및 V 적용에 대해 합산되어, 표 22에 표시된다:
샘플의 농도를 고려하기 위하여 전이체 포지티비티 한계값이 변경되어야 하는 것과 같은 방식으로, 균주를 특징화하는데 필요한 펩티드의 수가 박테리아의 총 농도에 대해 조절되어야 한다. 실시예 7에서 약하게 검출된 특정 펩티드들은, 박테리아의 양이 1개 콜로니보다 더 작다면 검출의 한계 아래에 있을 수 있다.
소변 1 내지 5는 I 카테고리에서 30개보다 많은 포지티브 전이체들을 나타낸다. 따라서, 상기 샘플 모두는 대장균 종에 의해 오염된 것으로 확인된다.
다른 한편, 소변 6은 I 카테고리에서 포지티브 전이체를 나타내지 않는다. 따라서, 상기 샘플은 대장균 종에 의해 오염되지 않은 것으로 확인된다.
소변 1, 2, 3 및 5는 R 카테고리에 대해 5개 이상의 포지티브 전이체를 나타내며, 이에 따라 이들은 플라스미드-매개 페니실리나제 TEM-2를 발현하고, 이는 페니실린, 특히 아미노페니실린 또는 A 페니실린(암피실린), 카복시페니실린 또는 C 페니실린(티카르실린) 및 우레이도페니실린 또는 페니실린 U(피페라실린)에 대한 내성의 메카니즘과 아주 밀접하다.
다른 한편, 소변 4 및 6은 R 카테고리에 대해 포지티브 전이체를 나타내지 않으며, 이에 따라 이들은 플라스미드-매개 페니실리나제 TEM-2를 발현하지 않는다. 따라서, 이들 균주는 페니실린에 대해 민감성이다.
암피실린, 티카르실린 및 피페라실린에 대한 내성의 상기 결과들은 본 출원인이 시판하는 VITEK®2 자동화 기기와 AST-EXN 및 AST-N103 카드에 의해 확인되었다. 상기 확인에는 VITEK®2 자동화 기기상에서 6 내지 8시간이 소요되었으며, 이는 본 발명에 대한 것보다 더 느리다.
소변 1 내지 6은 V 카테고리에 대해 1개보다 많은 포지티브 전이체를 나타내지 않는다. 따라서, 이들 소변은 shiga독소 유형의 독소에 의해 오염되지 않았다.
유형화를 위해, 각 균주의 T-카테고리 전이체들이 참조 균주로서 고려되는 다른 균주의 전이체들과 비교된다. 실제로, 2개의 균주 사이의 전이체가 동일한 카테고리(포지티브 또는 네거티브)로 분류될 때 값 0이 부여되고, 2개의 균주 사이의 전이체가 다른 카테고리(포지티브 전이체 및 네거티브 전이체)로 분류될 때 값 1이 부여된다. 상기 값은 각각의 균주 쌍의 T-카테고리 전이체 모두에 대해 합산되어, 스코어가 수립된다. 표 23에 스코어가 기재되어 있다:
어떠한 소변도 스코어가 4와 같거나 더 작지 않았다. 따라서, 소변 1 내지 5를 감염시킨 균주는 다른 유형이다. 이들 소변 샘플은 다양한 환경에서 감염이 종종 발생하는 지역 의료 테스트 실험실에서 수집되었다. 상기 조건하에서, 동일한 균주와 연관되는 소변 감염을 관찰하는 것은 흔하지 않다.
본 실시예에 의해, 매우 유리하게도 본 발명은 대장균과 같은 종의 정체를 일차 샘플로부터 직접적으로(이는 매우 유리함) 확인할 수 있게 해주며, 동일한 분석 내에서 동시에 유형화 및 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특징을 결정할 수 있게 해준다는 점이 입증된다.
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Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro
20 25 30
Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr
35 40 45
Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
50 55 60
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
65 70 75 80
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln
85 90 95
Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys
130 135 140
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
145 150 155 160
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
165 170 175
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
180 185 190
Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln
195 200 205
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe
210 215 220
Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
225 230 235 240
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu
245 250 255
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn
260 265 270
Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
275 280 285
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys
290 295 300
Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu
305 310 315 320
Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys
325 330 335
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys
340 345 350
Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys
355 360 365
Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys
370 375 380
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys
385 390 395 400
Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val
405 410 415
Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr
420 425 430
Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met
435 440 445
Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn
450 455 460
His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu
465 470 475 480
Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu
485 490 495
Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu
500 505
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
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<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
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Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
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Glu Glu Gln Arg
20
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Glu Glu Gln Arg
20
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 7
Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 8
Ile Ala Ala Asp Asn Lys
1 5
<210> 9
<211> 668
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 9
Met Lys Lys Ile Lys Ile Val Pro Leu Ile Leu Ile Val Val Val Val
1 5 10 15
Gly Phe Gly Ile Tyr Phe Tyr Ala Ser Lys Asp Lys Glu Ile Asn Asn
20 25 30
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Ser Ser Tyr Ile Ser Lys Ser Asp Asn Gly Glu Val Glu Met Thr Glu
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Arg Pro Ile Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys Asp Ile Asn Ile
65 70 75 80
Gln Asp Arg Lys Ile Lys Lys Val Ser Lys Asn Lys Lys Arg Val Asp
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Asn Ser Asn Thr Ile Ala His Thr Leu Ile Glu Lys Lys Lys Lys Asp
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Gly Lys Asp Ile Gln Leu Thr Ile Asp Ala Lys Val Gln Lys Ser Ile
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Glu Asp Lys Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser
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Gln Lys Asp Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu Val
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Ile Phe Phe Ala Arg Val Ala Leu Glu Leu Gly Ser Lys Lys Phe Glu
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<211> 8
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
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Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys
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1 5
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
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Met Ile Phe Met Val Lys Lys Arg Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ser Leu
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Asn Asn Ile Glu Asn Ile Gly Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Arg Thr
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<211> 14
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 19
Thr Asn Asp Pro Asn Val Asp Leu Ile Asn Tyr Leu Pro Lys
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 20
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<213> Staphylococcus aureus
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Ala Asn Ser Phe Ile Thr Ser Leu Gly Lys
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 22
Met Lys Lys Ile Val Lys Ser Ser Val Val Thr Ser Ile Ala Leu Leu
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65 70 75 80
Gly Asn Ile Tyr Ser Gly Tyr Thr Lys Pro Asn Pro Lys Asp Thr Ile
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Ser Ser Gln Phe Tyr Trp Gly Ser Lys Tyr Asn Ile Ser Ile Asn Ser
100 105 110
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Asn Glu Glu Phe Gln Val Gln Gln Thr Val Gly Tyr Ser Tyr Gly Gly
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Asp Ile Asn Ile Ser Asn Gly Leu Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ser Lys
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165 170 175
Leu Asp Lys Arg Thr Asn Phe Lys Lys Ile Gly Trp Asp Val Glu Ala
180 185 190
His Lys Ile Met Asn Asn Gly Trp Gly Pro Tyr Gly Arg Asp Ser Tyr
195 200 205
His Ser Thr Tyr Gly Asn Glu Met Phe Leu Gly Ser Arg Gln Ser Asn
210 215 220
Leu Asn Ala Gly Gln Asn Phe Leu Glu Tyr His Lys Met Pro Val Leu
225 230 235 240
Ser Arg Gly Asn Phe Asn Pro Glu Phe Ile Gly Val Leu Ser Arg Lys
245 250 255
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260 265 270
Met Asp Arg Tyr Thr Asn Phe Trp Asn Gln Leu His Trp Ile Gly Asn
275 280 285
Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Arg Ala Thr His Thr Ser Ile Tyr Glu Val
290 295 300
Asp Trp Glu Asn His Thr Val Lys Leu Ile Asp Thr Gln Ser Lys Glu
305 310 315 320
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325
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 23
Met Pro Val Leu Ser Arg
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 24
Gly Asn Phe Asn Pro Glu Phe Ile Gly Val Leu Ser Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 59
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 25
Met Ala Lys Leu Gln Ile Thr Leu Thr Arg Ser Val Ile Gly Arg Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 26
Leu Gln Ile Thr Leu Thr Arg
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 27
Thr Asn Ser Ser Val Val Val Glu Asp Asn Pro Ala Ile Arg
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<211> 49
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 28
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Lys
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 29
Val Asn Val Thr Leu Ala Cys Thr Glu Cys Gly Asp Arg
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<213> Staphylococcus aureus
<400> 30
Asn Tyr Ile Thr Thr Lys
1 5
<210> 31
<211> 267
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 31
Met Lys Lys Ile Ala Thr Ala Thr Ile Ala Thr Ala Gly Phe Ala Thr
1 5 10 15
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Ile Asp Ala Gln Gly Asn Tyr His Tyr Thr Trp Lys Gly Asn Trp His
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Asn Tyr Ser Arg Tyr Asn Asn Tyr Ser Asn Asn Asn Gln Ser Tyr Asn
100 105 110
Tyr Asn Asn Tyr Asn Ser Tyr Asn Thr Asn Ser Tyr Arg Thr Gly Gly
115 120 125
Leu Gly Ala Ser Tyr Ser Thr Ser Ser Asn Asn Val Gln Val Thr Thr
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Thr Met Ala Pro Ser Ser Asn Gly Arg Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Thr
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Ser Gly Arg Asn Leu Tyr Thr Ser Gly Gln Cys Thr Tyr Tyr Val Phe
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Asp Arg Val Gly Gly Lys Ile Gly Ser Thr Trp Gly Asn Ala Ser Asn
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<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 32
Ala Gly Tyr Thr Val Asn Asn Thr Pro Lys
1 5 10
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 33
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<210> 34
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<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 34
Glu Phe Val Glu Asn Ala Lys Glu Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Ala Thr Asp Phe Ile Asp Lys Val Lys
1 5
<210> 36
<211> 1248
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 36
Met Ala Lys Lys Phe Asn Tyr Lys Leu Pro Ser Met Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
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65 70 75 80
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Lys Tyr Ala Tyr Arg Asn Gly Val Gly Arg Pro Glu Gly Ile Val Val
245 250 255
His Asp Thr Ala Asn Asp Arg Ser Thr Ile Asn Gly Glu Ile Ser Tyr
260 265 270
Met Lys Asn Asn Tyr Gln Asn Ala Phe Val His Ala Phe Val Asp Gly
275 280 285
Asp Arg Ile Ile Glu Thr Ala Pro Thr Asp Tyr Leu Ser Trp Gly Val
290 295 300
Gly Ala Val Gly Asn Pro Arg Phe Ile Asn Val Glu Ile Val His Thr
305 310 315 320
His Asp Tyr Ala Ser Phe Ala Arg Ser Met Asn Asn Tyr Ala Asp Tyr
325 330 335
Ala Ala Thr Gln Leu Gln Tyr Tyr Gly Leu Lys Pro Asp Ser Ala Glu
340 345 350
Tyr Asp Gly Asn Gly Thr Val Trp Thr His Tyr Ala Val Ser Lys Tyr
355 360 365
Leu Gly Gly Thr Asp His Ala Asp Pro His Gly Tyr Leu Arg Ser His
370 375 380
Asn Tyr Ser Tyr Asp Gln Leu Tyr Asp Leu Ile Asn Glu Lys Tyr Leu
385 390 395 400
Ile Lys Met Gly Lys Val Ala Pro Trp Gly Thr Gln Phe Thr Thr Thr
405 410 415
Pro Thr Thr Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Ser Lys Pro Ser Thr Gly
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Gly Trp Val Lys Glu Gly Asp Val Val Tyr Asn Thr Ala Lys Ser Pro
500 505 510
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515 520 525
Thr Val Pro Trp Gly Thr Ser Lys Gln Val Ala Gly Ser Val Ser Gly
530 535 540
Ser Gly Asn Gln Thr Phe Lys Ala Ser Lys Gln Gln Gln Ile Asp Lys
545 550 555 560
Ser Ile Tyr Leu Tyr Gly Ser Val Asn Gly Lys Ser Gly Trp Val Ser
565 570 575
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580 585 590
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Val Asn Gly Lys Ser Gly Trp Val Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Val Pro
740 745 750
Ala Ala Pro Lys Lys Ala Val Ala Gln Pro Lys Thr Ala Val Lys Ala
755 760 765
Tyr Thr Val Thr Lys Pro Gln Thr Thr Gln Thr Val Ser Lys Ile Ala
770 775 780
Gln Val Lys Pro Asn Asn Thr Gly Ile Arg Ala Ser Val Tyr Glu Lys
785 790 795 800
Thr Ala Lys Asn Gly Ala Lys Tyr Ala Asp Arg Thr Phe Tyr Val Thr
805 810 815
Lys Glu Arg Ala His Gly Asn Glu Thr Tyr Val Leu Leu Asn Asn Thr
820 825 830
Ser His Asn Ile Pro Leu Gly Trp Phe Asn Val Lys Asp Leu Asn Val
835 840 845
Gln Asn Leu Gly Lys Glu Val Lys Thr Thr Gln Lys Tyr Thr Val Asn
850 855 860
Lys Ser Asn Asn Gly Leu Ser Met Val Pro Trp Gly Thr Lys Asn Gln
865 870 875 880
Val Ile Leu Thr Gly Asn Asn Ile Ala Gln Gly Thr Phe Asn Ala Thr
885 890 895
Lys Gln Val Ser Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Tyr Gly Thr Ile Asn
900 905 910
Asn Arg Thr Gly Trp Val Asn Ala Lys Asp Leu Thr Ala Pro Thr Ala
915 920 925
Val Lys Pro Thr Thr Ser Ala Ala Lys Asp Tyr Asn Tyr Thr Tyr Val
930 935 940
Ile Lys Asn Gly Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Thr Pro Asn Ser Asp Thr
945 950 955 960
Ala Lys Tyr Ser Leu Lys Ala Phe Asn Glu Gln Pro Phe Ala Val Val
965 970 975
Lys Glu Gln Val Ile Asn Gly Gln Thr Trp Tyr Tyr Gly Lys Leu Ser
980 985 990
Asn Gly Lys Leu Ala Trp Ile Lys Ser Thr Asp Leu Ala Lys Glu Leu
995 1000 1005
Ile Lys Tyr Asn Gln Thr Gly Met Thr Leu Asn Gln Val Ala Gln
1010 1015 1020
Ile Gln Ala Gly Leu Gln Tyr Lys Pro Gln Val Gln Arg Val Pro
1025 1030 1035
Gly Lys Trp Thr Asp Ala Asn Phe Asn Asp Val Lys His Ala Met
1040 1045 1050
Asp Thr Lys Arg Leu Ala Gln Asp Pro Ala Leu Lys Tyr Gln Phe
1055 1060 1065
Leu Arg Leu Asp Gln Pro Gln Asn Ile Ser Ile Asp Lys Ile Asn
1070 1075 1080
Gln Phe Leu Lys Gly Lys Gly Val Leu Glu Asn Gln Gly Ala Ala
1085 1090 1095
Phe Asn Lys Ala Ala Gln Met Tyr Gly Ile Asn Glu Val Tyr Leu
1100 1105 1110
Ile Ser His Ala Leu Leu Glu Thr Gly Asn Gly Thr Ser Gln Leu
1115 1120 1125
Ala Lys Gly Ala Asp Val Val Asn Asn Lys Val Val Thr Asn Ser
1130 1135 1140
Asn Thr Lys Tyr His Asn Val Phe Gly Ile Ala Ala Tyr Asp Asn
1145 1150 1155
Asp Pro Leu Arg Glu Gly Ile Lys Tyr Ala Lys Gln Ala Gly Trp
1160 1165 1170
Asp Thr Val Ser Lys Ala Ile Val Gly Gly Ala Lys Phe Ile Gly
1175 1180 1185
Asn Ser Tyr Val Lys Ala Gly Gln Asn Thr Leu Tyr Lys Met Arg
1190 1195 1200
Trp Asn Pro Ala His Pro Gly Thr His Gln Tyr Ala Thr Asp Val
1205 1210 1215
Asp Trp Ala Asn Ile Asn Ala Lys Ile Ile Lys Gly Tyr Tyr Asp
1220 1225 1230
Lys Ile Gly Glu Val Gly Lys Tyr Phe Asp Ile Pro Gln Tyr Lys
1235 1240 1245
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 37
Leu Tyr Ser Val Pro Trp Gly Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 38
Ala Tyr Leu Ala Val Pro Ala Ala Pro Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 394
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 39
Met Ala Lys Glu Lys Phe Asp Arg Ser Lys Glu His Ala Asn Ile Gly
1 5 10 15
Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile
20 25 30
Ala Thr Val Leu Ala Lys Asn Gly Asp Ser Val Ala Gln Ser Tyr Asp
35 40 45
Met Ile Asp Asn Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asn
50 55 60
Thr Ser His Ile Glu Tyr Gln Thr Asp Lys Arg His Tyr Ala His Val
65 70 75 80
Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile Thr Gly Ala
85 90 95
Ala Gln Met Asp Gly Gly Ile Leu Val Val Ser Ala Ala Asp Gly Pro
100 105 110
Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ser Arg Asn Val Gly Val
115 120 125
Pro Ala Leu Val Val Phe Leu Asn Lys Val Asp Met Val Asp Asp Glu
130 135 140
Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Val Arg Asp Leu Leu Ser Glu
145 150 155 160
Tyr Asp Phe Pro Gly Asp Asp Val Pro Val Ile Ala Gly Ser Ala Leu
165 170 175
Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Gln Tyr Glu Glu Lys Ile Leu Glu Leu
180 185 190
Met Glu Ala Val Asp Thr Tyr Ile Pro Thr Pro Glu Arg Asp Ser Asp
195 200 205
Lys Pro Phe Met Met Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile Thr Gly Arg
210 215 220
Gly Thr Val Ala Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Gln Ile Lys Val Gly
225 230 235 240
Glu Glu Val Glu Ile Ile Gly Leu His Asp Thr Ser Lys Thr Thr Val
245 250 255
Thr Gly Val Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Ala Glu Ala Gly
260 265 270
Asp Asn Ile Gly Ala Leu Leu Arg Gly Val Ala Arg Glu Asp Val Gln
275 280 285
Arg Gly Gln Val Leu Ala Ala Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Thr Glu
290 295 300
Phe Lys Ala Glu Val Tyr Val Leu Ser Lys Asp Glu Gly Gly Arg His
305 310 315 320
Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr Thr
325 330 335
Asp Val Thr Gly Val Val His Leu Pro Glu Gly Thr Glu Met Val Met
340 345 350
Pro Gly Asp Asn Val Glu Met Thr Val Glu Leu Ile Ala Pro Ile Ala
355 360 365
Ile Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Val
370 375 380
Gly Ser Gly Val Val Thr Glu Ile Ile Lys
385 390
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 40
Thr Val Gly Ser Gly Val Val Thr Glu Ile Ile Lys
1 5 10
<210> 41
<211> 233
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 41
Met Lys Lys Thr Ile Met Ala Ser Ser Leu Ala Val Ala Leu Gly Val
1 5 10 15
Thr Gly Tyr Ala Ala Gly Thr Gly His Gln Ala His Ala Ala Glu Val
20 25 30
Asn Val Asp Gln Ala His Leu Val Asp Leu Ala His Asn His Gln Asp
35 40 45
Gln Leu Asn Ala Ala Pro Ile Lys Asp Gly Ala Tyr Asp Ile His Phe
50 55 60
Val Lys Asp Gly Phe Gln Tyr Asn Phe Thr Ser Asn Gly Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Trp Ser Tyr Glu Ala Ala Asn Gly Gln Thr Ala Gly Phe Ser Asn
85 90 95
Val Ala Gly Ala Asp Tyr Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Ser Asn Val
100 105 110
Gln Ser Val Ser Tyr Asn Ala Gln Ser Ser Asn Ser Asn Val Glu Ala
115 120 125
Val Ser Ala Pro Thr Tyr His Asn Tyr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser
130 135 140
Ser Val Arg Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ser Ser
145 150 155 160
Ala Ala Gln Ile Met Ala Gln Arg Thr Gly Val Ser Ala Ser Thr Trp
165 170 175
Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Ser Asn Gly Gln Val Asn Ala Tyr Asn
180 185 190
Pro Ser Gly Ala Ser Gly Leu Phe Gln Thr Met Pro Gly Trp Gly Pro
195 200 205
Thr Asn Thr Val Asp Gln Gln Ile Asn Ala Ala Val Lys Ala Tyr Lys
210 215 220
Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp Gly Phe
225 230
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 42
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ser Ser Ala Ala Gln
1 5 10 15
Ile Met Ala Gln Arg
20
<210> 43
<211> 86
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 43
Met Ala Met Thr Val Lys Lys Asp Asn Asn Glu Val Arg Ile Gln Trp
1 5 10 15
Arg Val Ala Asp Ile Lys Ile Pro Thr Ser Glu Ile Lys Asn Ile Thr
20 25 30
Gln Asp Gln Asp Ile His Ala Val Pro Lys Leu Asp Ser Lys Asp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Ser Thr Phe Gly Lys Thr Asn Arg Val Ile Ile Asp
50 55 60
Thr Glu Asp His Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Gln Asn Asp Gln Lys Val
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Leu Thr Lys
85
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 44
Asn Ile Thr Gln Asp Gln Asp Ile His Ala Val Pro Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 45
Leu Asp Ser Lys Asp Val Ser Arg
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 46
Ile Leu Glu Ile Glu Gly Leu Pro Asp Leu Lys
1 5 10
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 47
Val Ala Asp Gly Ala Thr Val Val Ser Thr Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 48
Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 49
Leu Asp Thr Thr Gly Leu Ile Asp Arg
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 50
Val Gly Leu Ile Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 51
Ala Ile Asp Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 52
Leu Gly Ala Trp Asp Thr Leu Ser Pro Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 53
Phe Gly Glu Ile Glu Glu Val Glu Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 54
Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 55
Leu Ala Thr Ala Trp Glu Gly Phe Thr Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 56
Asp Ser Ile Leu Glu Ala Ile Asp Ala Gly Ile Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 57
Phe Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Val Lys
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 58
Ser Leu Ala Asp Ile Gly Glu Ala Leu Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 59
Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg
1 5 10
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 60
Ala Glu Ala Glu Gln Thr Leu Ala Ala Leu Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 61
Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 62
Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg
1 5 10
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 63
Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys
1 5 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 64
Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg
1 5
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 65
Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 66
Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser Arg
1 5 10
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 67
Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 68
Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 69
Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg
1 5
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 70
Thr Ala Leu Ala Ile Asp Ala Ile Ile Asn Gln Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 71
Val Val Asn Thr Leu Gly Ala Pro Ile Asp Gly Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 72
Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 73
Ala Val Thr Ala Ala Val Glu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 74
Ala Leu Asp Ala Ile Ile Ala Ser Val Thr Glu Ser Leu Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 75
Tyr Trp Asp Val Glu Leu Arg
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 76
Leu Pro Gly Ile Leu Glu Leu Ser Arg
1 5
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 77
Ser Lys Ala Thr Asn Leu Leu Tyr Thr Arg
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 78
Ser Glu Ala Leu Lys Ile Leu Asn Asn Ile Arg
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 79
Leu Phe Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 80
Ala Ser Leu Pro Thr Ile Glu Leu Ala Leu Lys
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 81
Leu Leu Ser Asp Thr Glu Cys Leu Val Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 82
Ser Ile Leu Ser Glu Leu Val Arg
1 5
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 83
Gly Gly Phe Thr Val Glu Leu Asn Gly Ile Arg
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 84
Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 85
Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 86
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg
1 5 10
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 87
Ile Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 88
Ala Asp Glu Glu Phe Phe Ala Lys
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 89
Ala Phe Asp Asp Glu Ser Val Gln Lys
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 90
Ala Lys Ile Asp Val Val Asp Gln Ala Lys
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 91
Ala Val Glu Val Pro Glu Gln Thr Ala Tyr Arg
1 5 10
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 92
Cys Gly Val Ile Gln Pro Arg
1 5
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 93
Asp Leu Gln Glu Leu Ile Ala Glu Gly Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 94
Phe Ala Asp Glu Asn Phe Val Lys Arg
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 95
Phe Ala Leu Asp Thr Gly Val Lys
1 5
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 96
Gly Arg Leu Pro Glu Val Pro Val Ile Val Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 97
Ile Ala Glu Ala Leu Asp Ile Phe His Thr Lys
1 5 10
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 98
Ile Asp Val Val Asp Gln Ala Lys
1 5
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 99
Ile Glu Glu Glu Leu Gly Ser Glu Ala Ile Tyr Ala Gly Lys Asp Phe
1 5 10 15
Gln Lys
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 100
Ile Glu Ser Phe Gly Ser Gly Ser Gly Ala Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 101
Leu Ala Ser Leu Pro Phe Gln Lys
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 102
Leu Asp Ala Thr Asp Asp Val Val Ala Val Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 103
Asn Val Glu His Leu Val Glu Lys
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 104
Ser Gly Ile Ala Ala Gly Val Asn Lys
1 5
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 105
Ser Gly Val Asp Tyr Val Ile Glu Ser Thr Gly Val Phe Thr Lys
1 5 10 15
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 106
Ser Leu Asn Glu Phe Leu Ala Asp Lys
1 5
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 107
Ser Gln Glu Thr Phe Asp Ala Asn Val Ala Arg
1 5 10
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 108
Ser Ser Ser Ser Thr Thr Lys Lys
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 109
Ser Thr Leu Asp Pro Val Gly Lys
1 5
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 110
Ser Val Glu Leu Phe Gln Gln Ala Val Ala Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 111
Thr Ala Asn Asp Val Leu Glu Leu Arg
1 5
<210> 112
<211> 19
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 112
Val Gly Asp Lys Ile Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn
1 5 10 15
Pro Thr Arg
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 113
Val Val Ala Ile Asp Gly Gly Asp Glu Lys
1 5 10
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 114
Trp Thr Asp Asn Leu Leu Pro Ala Arg
1 5
<210> 115
<211> 18
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 115
Tyr Lys Gly Glu Val Thr Ala Ser Gly Asp Asp Leu Val Ile Asp Gly
1 5 10 15
His Lys
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 116
Tyr Val Leu Asp Thr Ser Lys
1 5
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 117
Ala Val Ile Tyr Asp Cys Pro Asn Ser Arg
1 5 10
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 118
Gly His Tyr Val Leu Val Ser Pro Gly Tyr Ala His Thr Ser Glu Arg
1 5 10 15
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 119
Gly Val Ile Tyr Asp Cys Pro Asn Ser Arg
1 5 10
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 120
Gly Val Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Gly Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 121
<211> 13
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 121
Gly Val Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Ser Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 122
Gly Val Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Ser Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 123
Ala Ala Val Gly Asp Ile Leu Gln Ser Arg
1 5 10
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 124
Ile Thr Pro Asp Asp Leu Arg
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 125
Thr Gly Trp Asp Ile Leu Lys
1 5
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<211> 263
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 126
His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys Asp Ala Glu Asp Lys Leu Gly
1 5 10 15
Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu
20 25 30
Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe Pro Met Met Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser Arg Val Asp Ala Gly Gln Glu
50 55 60
Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr Asp Gly Met Thr Val Arg Glu
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Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu
100 105 110
Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys Glu Leu Thr Ala Phe Leu His
115 120 125
Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu
130 135 140
Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg Asp Thr Thr Met Pro Ala Ala
145 150 155 160
Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu
165 170 175
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180 185 190
Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp
195 200 205
Lys Ser Gly Val Gly Glu Arg Gly Ser Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu
210 215 220
Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly
225 230 235 240
Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly
245 250 255
Ala Ser Leu Ile Lys His Trp
260
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<211> 865
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 127
Met Leu Glu Glu Tyr Arg Lys His Val Ala Glu Arg Ala Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ile Ala Pro Lys Pro Leu Asp Ala Asn Gln Met Ala Ala Leu Val Glu
20 25 30
Leu Leu Lys Asn Pro Pro Ala Gly Glu Glu Glu Phe Leu Leu Asp Leu
35 40 45
Leu Thr Asn Arg Val Pro Pro Gly Val Asp Glu Ala Ala Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Gly Phe Leu Ala Ala Ile Ala Lys Gly Glu Ala Lys Ser Pro Leu
65 70 75 80
Leu Thr Pro Glu Lys Ala Ile Glu Leu Leu Gly Thr Met Gln Gly Gly
85 90 95
Tyr Asn Ile His Pro Leu Ile Asp Ala Leu Asp Asp Ala Lys Leu Ala
100 105 110
Pro Ile Ala Ala Lys Ala Leu Ser His Thr Leu Leu Met Phe Asp Asn
115 120 125
Phe Tyr Asp Val Glu Glu Lys Ala Lys Ala Gly Asn Glu Tyr Ala Lys
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Lys Leu Thr Val Thr Val Phe Lys Val Thr Gly Glu
165 170 175
Thr Asn Thr Asp Asp Leu Ser Pro Ala Pro Asp Ala Trp Ser Arg Pro
180 185 190
Asp Ile Pro Leu His Ala Leu Ala Met Leu Lys Asn Ala Arg Glu Gly
195 200 205
Ile Glu Pro Asp Gln Pro Gly Val Val Gly Pro Ile Lys Gln Ile Glu
210 215 220
Ala Leu Gln Gln Lys Gly Phe Pro Leu Ala Tyr Val Gly Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Thr Gly Ser Ser Arg Lys Ser Ala Thr Asn Ser Val Leu Trp Phe
245 250 255
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260 265 270
Cys Leu Gly Gly Lys Ile Ala Pro Ile Phe Phe Asn Thr Met Glu Asp
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Phe Arg Gln Ala Lys Asp Val Ala Glu Ser Asp Arg Gly Phe Ser Leu
370 375 380
Ala Gln Lys Met Val Gly Arg Ala Cys Gly Val Lys Gly Ile Arg Pro
385 390 395 400
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485 490 495
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530 535 540
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Arg Ile Leu Glu Ile Glu Gly Leu Pro Asp Leu Lys Val Glu Gln Ala
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625 630 635 640
Leu Glu Arg Arg Ile Gln Gly Met Glu Lys Trp Leu Ala Asn Pro Glu
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Leu Leu Glu Ala Asp Ala Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Val Ile Asp Ile
660 665 670
Asp Leu Ala Asp Ile Lys Glu Pro Ile Leu Cys Ala Pro Asn Asp Pro
675 680 685
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Val Phe Ile Gly Ser Cys Met Thr Asn Ile Gly His Phe Arg Ala Ala
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Gly Lys Leu Leu Asp Ala His Lys Gly Gln Leu Pro Thr Arg Leu Trp
725 730 735
Val Ala Pro Pro Thr Arg Met Asp Ala Ala Gln Leu Thr Glu Glu Gly
740 745 750
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Leu Ser Gln Tyr Thr Glu Lys Ala Asp Gly Val Ile Phe Gln Thr Ala
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Val
865
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<213> Escherichia coli
<400> 128
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Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
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Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
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Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
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Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
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Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
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Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
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Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
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Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
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Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
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<213> Escherichia coli
<400> 129
Met Lys Arg Ala Val Ile Thr Gly Leu Gly Ile Val Ser Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asn Asn Gln Gln Glu Val Leu Ala Ser Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gly
20 25 30
Ile Thr Phe Ser Gln Glu Leu Lys Asp Ser Gly Met Arg Ser His Val
35 40 45
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50 55 60
Val Arg Phe Met Ser Asp Ala Ser Ile Tyr Ala Phe Leu Ser Met Glu
65 70 75 80
Gln Ala Ile Ala Asp Ala Gly Leu Ser Pro Glu Ala Tyr Gln Asn Asn
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Pro Arg Val Gly Leu Ile Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Phe
100 105 110
Gln Val Phe Gly Ala Asp Ala Met Arg Gly Pro Arg Gly Leu Lys Ala
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Val Gly Pro Tyr Val Val Thr Lys Ala Met Ala Ser Gly Val Ser Ala
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Cys Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ile His Gly Val Asn Tyr Ser Ile Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ala Thr Ser Ala His Cys Ile Gly Asn Ala Val Glu Gln
165 170 175
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Leu Cys Trp Glu Met Ala Cys Glu Phe Asp Ala Met Gly Ala Leu Ser
195 200 205
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245 250 255
Ile Val Gly Tyr Gly Ala Thr Ser Asp Gly Ala Asp Met Val Ala Pro
260 265 270
Ser Gly Glu Gly Ala Val Arg Cys Met Lys Met Ala Met His Gly Val
275 280 285
Asp Thr Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Ser His Gly Thr Ser Thr Pro Val
290 295 300
Gly Asp Val Lys Glu Leu Ala Ala Ile Arg Glu Val Phe Gly Asp Lys
305 310 315 320
Ser Pro Ala Ile Ser Ala Thr Lys Ala Met Thr Gly His Ser Leu Gly
325 330 335
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Gly Phe Ile Ala Pro Ser Ile Asn Ile Glu Glu Leu Asp Glu Gln Ala
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370 375 380
Val Met Ser Asn Ser Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala Thr Leu Val
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Met Arg Lys Leu Lys Asp
405
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 130
Met Lys Ser Val Leu Lys Val Ser Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Phe
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Thr Ala Phe Val Pro Phe Glu Phe Lys Gln Gly Asp Lys Tyr Val Gly
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Thr Lys Asn Val Asp Leu Ala Leu Ala Gly Ile Thr Ile Thr Asp Glu
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Arg Lys Lys Ala Ile Asp Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Lys Ser Gly Leu
100 105 110
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Leu Asp Gly Lys Val Val Ala Val Lys Ser Gly Thr Gly Ser Val Asp
130 135 140
Tyr Ala Lys Ala Asn Ile Lys Thr Lys Asp Leu Arg Gln Phe Pro Asn
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Ile Asp Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Thr Asn Arg Ala Asp Ala Val
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Gly Gln Phe Lys Ala Val Gly Asp Ser Leu Glu Ala Gln Gln Tyr Gly
195 200 205
Ile Ala Phe Pro Lys Gly Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Asn Gly
210 215 220
Ala Leu Lys Thr Leu Arg Glu Asn Gly Thr Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys
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Lys Trp Phe Gly Thr Glu Pro Lys
245
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<213> Escherichia coli
<400> 131
Met Ala Arg Lys Trp Leu Asn Leu Phe Ala Gly Ala Ala Leu Ser Phe
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Ala Ala Ala Ser Leu Thr Asn Ala Met Gln Asp Ile Ala Thr Gln Phe
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Lys Lys Glu Lys Gly Val Asp Val Val Ser Ser Phe Ala Ser Ser Ser
50 55 60
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Ser Ala Asp Gln Lys Trp Met Asp Tyr Ala Val Asp Lys Lys Ala Ile
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Gly Ala Trp Asp Thr Leu Ser Pro Lys Leu Ala Pro Ala Glu Asp Val
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Lys Gly Pro Gln Ala Ala Glu Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Phe Thr Ile
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Lys
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<213> Escherichia coli
<400> 132
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Ser Leu Ile Thr Val Glu Gly Asp Lys Ala Ser Met Glu Val Pro Ser
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Pro Gln Ala Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Val Ser Val Gly Asp Lys
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65 70 75 80
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Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Asp Val Asn Val Pro Asp
100 105 110
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115 120 125
Asp Lys Val Glu Ala Glu Gln Ser Leu Ile Thr Val Glu Gly Asp Lys
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180 185 190
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195 200 205
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Met Val Lys Val Gly Asp Lys Val Ala Ala Glu Gln Ser Leu Ile Thr
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Val Glu Gly Asp Lys Ala Ser Met Glu Val Pro Ala Pro Phe Ala Gly
245 250 255
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275 280 285
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Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Gly Lys Ser Glu Phe
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325 330 335
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340 345 350
Lys Gly Arg Ile Leu Arg Glu Asp Val Gln Ala Tyr Val Lys Glu Ala
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Ile Lys Arg Ala Glu Ala Ala Pro Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ile Pro
370 375 380
Gly Met Leu Pro Trp Pro Lys Val Asp Phe Ser Lys Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 133
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala
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<210> 134
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 134
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Glu Leu Asp Pro Met Ile Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr
130 135 140
His Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Pro Asp Ile Leu Arg Cys
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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<213> Escherichia coli
<400> 145
Met Ser Thr Ala Lys Leu Val Lys Ser Lys Ala Thr Asn Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Thr Arg Asn Asp Val Ser Asp Ser Glu Lys Lys Ala Thr Val Glu Leu
20 25 30
Leu Asn Arg Gln Val Ile Gln Phe Ile Asp Leu Ser Leu Ile Thr Lys
35 40 45
Gln Ala His Trp Asn Met Arg Gly Ala Asn Phe Ile Ala Val His Glu
50 55 60
Met Leu Asp Gly Phe Arg Thr Ala Leu Ile Asp His Leu Asp Thr Met
65 70 75 80
Ala Glu Arg Ala Val Gln Leu Gly Gly Val Ala Leu Gly Thr Thr Gln
85 90 95
Val Ile Asn Ser Lys Thr Pro Leu Lys Ser Tyr Pro Leu Asp Ile His
100 105 110
Asn Val Gln Asp His Leu Lys Glu Leu Ala Asp Arg Tyr Ala Ile Val
115 120 125
Ala Asn Asp Val Arg Lys Ala Ile Gly Glu Ala Lys Asp Asp Asp Thr
130 135 140
Ala Asp Ile Leu Thr Ala Ala Ser Arg Asp Leu Asp Lys Phe Leu Trp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Ser Asn Ile Glu
165
<210> 146
<211> 137
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 146
Met Ser Glu Ala Leu Lys Ile Leu Asn Asn Ile Arg Thr Leu Arg Ala
1 5 10 15
Gln Ala Arg Glu Cys Thr Leu Glu Thr Leu Glu Glu Met Leu Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Val Val Val Asn Glu Arg Arg Glu Glu Glu Ser Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Glu Val Glu Glu Arg Thr Arg Lys Leu Gln Gln Tyr Arg Glu Met
50 55 60
Leu Ile Ala Asp Gly Ile Asp Pro Asn Glu Leu Leu Asn Ser Leu Ala
65 70 75 80
Ala Val Lys Ser Gly Thr Lys Ala Lys Arg Ala Gln Arg Pro Ala Lys
85 90 95
Tyr Ser Tyr Val Asp Glu Asn Gly Glu Thr Lys Thr Trp Thr Gly Gln
100 105 110
Gly Arg Thr Pro Ala Val Ile Lys Lys Ala Met Asp Glu Gln Gly Lys
115 120 125
Ser Leu Asp Asp Phe Leu Ile Lys Gln
130 135
<210> 147
<211> 312
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 147
Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu
20 25 30
Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His
35 40 45
Ile Pro Thr Ala Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr
50 55 60
Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asn Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala
65 70 75 80
Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly
85 90 95
Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Val Ala Lys Thr Cys Pro Lys Ala
100 105 110
Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala
115 120 125
Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe
130 135 140
Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Lys Gly Lys Gln Pro Gly Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly
165 170 175
His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Val
180 185 190
Ser Phe Thr Glu Gln Glu Val Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn
195 200 205
Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr
210 215 220
Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg
225 230 235 240
Ala Leu Gln Gly Glu Gln Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly
245 250 255
Asp Gly Gln Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys
260 265 270
Asn Gly Val Glu Glu Arg Lys Ser Ile Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu
275 280 285
Lys Asn Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Gly Glu Glu Phe Val Asn Lys
305 310
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 148
Met Ser Val Ile Lys Met Thr Asp Leu Asp Leu Ala Gly Lys Arg Val
1 5 10 15
Phe Ile Arg Ala Asp Leu Asn Val Pro Val Lys Asp Gly Lys Val Thr
20 25 30
Ser Asp Ala Arg Ile Arg Ala Ser Leu Pro Thr Ile Glu Leu Ala Leu
35 40 45
Lys Gln Gly Ala Lys Val Met Val Thr Ser His Leu Gly Arg Pro Thr
50 55 60
Glu Gly Glu Tyr Asn Glu Glu Phe Ser Leu Leu Pro Val Val Asn Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Asp Lys Leu Ser Asn Pro Val Arg Leu Val Lys Asp Tyr Leu
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Asp Gly Val Asp Val Ala Glu Gly Glu Leu Val Val Leu Glu Asn Val
100 105 110
Arg Phe Asn Lys Gly Glu Lys Lys Asp Asp Glu Thr Leu Ser Lys Lys
115 120 125
Tyr Ala Ala Leu Cys Asp Val Phe Val Met Asp Ala Phe Gly Thr Ala
130 135 140
His Arg Ala Gln Ala Ser Thr His Gly Ile Gly Lys Phe Ala Asp Val
145 150 155 160
Ala Cys Ala Gly Pro Leu Leu Ala Ala Glu Leu Asp Ala Leu Gly Lys
165 170 175
Ala Leu Lys Glu Pro Ala Arg Pro Met Val Ala Ile Val Gly Gly Ser
180 185 190
Lys Val Ser Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Ser Leu Ser Lys Ile Ala
195 200 205
Asp Gln Leu Ile Val Gly Gly Gly Ile Ala Asn Thr Phe Ile Ala Ala
210 215 220
Gln Gly His Asp Val Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ala Asp Leu Val Asp
225 230 235 240
Glu Ala Lys Arg Leu Leu Ser Thr Cys Asn Ile Pro Val Pro Ser Asp
245 250 255
Val Arg Val Ala Thr Glu Phe Ser Glu Thr Ala Pro Ala Thr Leu Lys
260 265 270
Ser Val Asn Asp Val Lys Ala Asp Glu Gln Ile Leu Asp Ile Gly Asp
275 280 285
Ala Ser Ala Gln Glu Leu Ala Glu Ile Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ile
290 295 300
Leu Trp Asn Gly Pro Val Gly Val Phe Glu Phe Pro Asn Phe Arg Lys
305 310 315 320
Gly Thr Glu Ile Val Ala Asn Ala Ile Ala Asp Ser Glu Ala Phe Ser
325 330 335
Ile Ala Gly Gly Gly Asp Thr Leu Ala Ala Ile Asp Leu Phe Gly Ile
340 345 350
Ala Asp Lys Ile Ser Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ala Phe Leu Glu
355 360 365
Phe Val Glu Gly Lys Val Leu Pro Ala Val Ala Met Leu Glu Glu Arg
370 375 380
Ala Lys Lys
385
<210> 149
<211> 237
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 149
Met Gln Lys Gln Ala Glu Leu Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Thr Val Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Glu Asn Pro Asp Leu Leu Val Leu Glu Phe Arg Asn Asp Thr
20 25 30
Ser Ala Gly Asp Gly Ala Arg Ile Glu Gln Phe Asp Arg Lys Gly Met
35 40 45
Val Asn Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ile Met Ser Lys Leu Ala Glu Ala
50 55 60
Gly Ile Pro Thr Gln Met Glu Arg Leu Leu Ser Asp Thr Glu Cys Leu
65 70 75 80
Val Lys Lys Leu Asp Met Val Pro Val Glu Cys Val Val Arg Asn Arg
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Ala Ala Gly Ser Leu Val Lys Arg Leu Gly Ile Glu Glu Gly Ile Glu
100 105 110
Leu Asn Pro Pro Leu Phe Asp Leu Phe Leu Lys Asn Asp Ala Met His
115 120 125
Asp Pro Met Val Asn Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Phe Gly Trp Val Ser
130 135 140
Lys Glu Asn Leu Ala Arg Met Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Ala Asn Asp
145 150 155 160
Val Leu Lys Lys Leu Phe Asp Asp Ala Gly Leu Ile Leu Val Asp Phe
165 170 175
Lys Leu Glu Phe Gly Leu Tyr Lys Gly Glu Val Val Leu Gly Asp Glu
180 185 190
Phe Ser Pro Asp Gly Ser Arg Leu Trp Asp Lys Glu Thr Leu Glu Lys
195 200 205
Met Asp Lys Asp Arg Phe Arg Gln Ser Leu Gly Gly Leu Ile Glu Ala
210 215 220
Tyr Glu Ala Val Ala Arg Arg Leu Gly Val Gln Leu Asp
225 230 235
<210> 150
<211> 201
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 150
Met Glu Leu Val Leu Lys Asp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu
1 5 10 15
Thr Thr Phe Gly Arg Asp Phe Asn Glu Ala Leu Val His Gln Val Val
20 25 30
Val Ala Tyr Ala Ala Gly Ala Arg Gln Gly Thr Arg Ala Gln Lys Thr
35 40 45
Arg Ala Glu Val Thr Gly Ser Gly Lys Lys Pro Trp Arg Gln Lys Gly
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Arg Ser Gly Ser Ile Lys Ser Pro Ile Trp Arg Ser
65 70 75 80
Gly Gly Val Thr Phe Ala Ala Arg Pro Gln Asp His Ser Gln Lys Val
85 90 95
Asn Lys Lys Met Tyr Arg Gly Ala Leu Lys Ser Ile Leu Ser Glu Leu
100 105 110
Val Arg Gln Asp Arg Leu Ile Val Val Glu Lys Phe Ser Val Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Thr Lys Leu Leu Ala Gln Lys Leu Lys Asp Met Ala Leu Glu
130 135 140
Asp Val Leu Ile Ile Thr Gly Glu Leu Asp Glu Asn Leu Phe Leu Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asn Leu His Lys Val Asp Val Arg Asp Ala Thr Gly Ile Asp
165 170 175
Pro Val Ser Leu Ile Ala Phe Asp Lys Val Val Met Thr Ala Asp Ala
180 185 190
Val Lys Gln Val Glu Glu Met Leu Ala
195 200
<210> 151
<211> 557
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 151
Met Thr Glu Ser Phe Ala Gln Leu Phe Glu Glu Ser Leu Lys Glu Ile
1 5 10 15
Glu Thr Arg Pro Gly Ser Ile Val Arg Gly Val Val Val Ala Ile Asp
20 25 30
Lys Asp Val Val Leu Val Asp Ala Gly Leu Lys Ser Glu Ser Ala Ile
35 40 45
Pro Ala Glu Gln Phe Lys Asn Ala Gln Gly Glu Leu Glu Ile Gln Val
50 55 60
Gly Asp Glu Val Asp Val Ala Leu Asp Ala Val Glu Asp Gly Phe Gly
65 70 75 80
Glu Thr Leu Leu Ser Arg Glu Lys Ala Lys Arg His Glu Ala Trp Ile
85 90 95
Thr Leu Glu Lys Ala Tyr Glu Asp Ala Glu Thr Val Thr Gly Val Ile
100 105 110
Asn Gly Lys Val Lys Gly Gly Phe Thr Val Glu Leu Asn Gly Ile Arg
115 120 125
Ala Phe Leu Pro Gly Ser Leu Val Asp Val Arg Pro Val Arg Asp Thr
130 135 140
Leu His Leu Glu Gly Lys Glu Leu Glu Phe Lys Val Ile Lys Leu Asp
145 150 155 160
Gln Lys Arg Asn Asn Val Val Val Ser Arg Arg Ala Val Ile Glu Ser
165 170 175
Glu Asn Ser Ala Glu Arg Asp Gln Leu Leu Glu Asn Leu Gln Glu Gly
180 185 190
Met Glu Val Lys Gly Ile Val Lys Asn Leu Thr Asp Tyr Gly Ala Phe
195 200 205
Val Asp Leu Gly Gly Val Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Asp Met Ala
210 215 220
Trp Lys Arg Val Lys His Pro Ser Glu Ile Val Asn Val Gly Asp Glu
225 230 235 240
Ile Thr Val Lys Val Leu Lys Phe Asp Arg Glu Arg Thr Arg Val Ser
245 250 255
Leu Gly Leu Lys Gln Leu Gly Glu Asp Pro Trp Val Ala Ile Ala Lys
260 265 270
Arg Tyr Pro Glu Gly Thr Lys Leu Thr Gly Arg Val Thr Asn Leu Thr
275 280 285
Asp Tyr Gly Cys Phe Val Glu Ile Glu Glu Gly Val Glu Gly Leu Val
290 295 300
His Val Ser Glu Met Asp Trp Thr Asn Lys Asn Ile His Pro Ser Lys
305 310 315 320
Val Val Asn Val Gly Asp Val Val Glu Val Met Val Leu Asp Ile Asp
325 330 335
Glu Glu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Gly Leu Lys Gln Cys Lys Ala Asn
340 345 350
Pro Trp Gln Gln Phe Ala Glu Thr His Asn Lys Gly Asp Arg Val Glu
355 360 365
Gly Lys Ile Lys Ser Ile Thr Asp Phe Gly Ile Phe Ile Gly Leu Asp
370 375 380
Gly Gly Ile Asp Gly Leu Val His Leu Ser Asp Ile Ser Trp Asn Val
385 390 395 400
Ala Gly Glu Glu Ala Val Arg Glu Tyr Lys Lys Gly Asp Glu Ile Ala
405 410 415
Ala Val Val Leu Gln Val Asp Ala Glu Arg Glu Arg Ile Ser Leu Gly
420 425 430
Val Lys Gln Leu Ala Glu Asp Pro Phe Asn Asn Trp Val Ala Leu Asn
435 440 445
Lys Lys Gly Ala Ile Val Thr Gly Lys Val Thr Ala Val Asp Ala Lys
450 455 460
Gly Ala Thr Val Glu Leu Ala Asp Gly Val Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
465 470 475 480
Ser Glu Ala Ser Arg Asp Arg Val Glu Asp Ala Thr Leu Val Leu Ser
485 490 495
Val Gly Asp Glu Val Glu Ala Lys Phe Thr Gly Val Asp Arg Lys Asn
500 505 510
Arg Ala Ile Ser Leu Ser Val Arg Ala Lys Asp Glu Ala Asp Glu Lys
515 520 525
Asp Ala Ile Ala Thr Val Asn Lys Gln Glu Asp Ala Asn Phe Ser Asn
530 535 540
Asn Ala Met Ala Glu Ala Phe Lys Ala Ala Lys Gly Glu
545 550 555
<210> 152
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 152
Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala
35 40 45
Gln Ala Arg Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr
85 90 95
Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg
115 120 125
<210> 153
<211> 315
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 153
Met Lys Ile Ile Ile Phe Arg Val Leu Thr Phe Phe Phe Val Ile Phe
1 5 10 15
Ser Val Asn Val Val Ala Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala
20 25 30
Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr
35 40 45
Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp
65 70 75 80
Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn
85 90 95
Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr
100 105 110
Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val
115 120 125
Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly
130 135 140
Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser
145 150 155 160
Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val
165 170 175
Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg
180 185 190
Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser
195 200 205
Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn
210 215 220
Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser
225 230 235 240
Val Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala
260 265 270
Arg Met Ala Ser Asp Glu Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg
275 280 285
Val Arg Gly Ile Thr His Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu
290 295 300
Gly Ala Ile Leu Met Arg Arg Thr Ile Ser Ser
305 310 315
<210> 154
<211> 319
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 154
Met Lys Cys Ile Leu Phe Lys Trp Val Leu Cys Leu Leu Leu Gly Phe
1 5 10 15
Ser Ser Val Ser His Ser Arg Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln
20 25 30
Gln Ser Tyr Val Ser Ser Leu Asn Ser Ile Arg Thr Glu Ile Ser Thr
35 40 45
Pro Leu Glu His Ile Ser Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn
50 55 60
His Thr Pro Pro Gly Ser Tyr Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Leu Asp
65 70 75 80
Val Tyr Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gln Asn
85 90 95
Asn Leu Tyr Val Ala Gly Phe Val Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr
100 105 110
Arg Phe Ser Asp Phe Thr His Ile Ser Val Pro Gly Val Thr Thr Val
115 120 125
Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Ala
130 135 140
Leu Glu Arg Ser Gly Met Gln Ile Ser Arg His Ser Leu Val Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Leu Val Glu Phe Ser Gly Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala
165 170 175
Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg
180 185 190
Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu Phe Arg Gln Ala Leu Ser Glu Thr Ala
195 200 205
Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Gly Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp
210 215 220
Gly Arg Ile Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Val
225 230 235 240
Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Asn Asn Ile Ser Ala Ile Leu Gly Thr
245 250 255
Val Ala Val Ile Leu Asn Cys His His Gln Gly Ala Arg Ser Val Arg
260 265 270
Ala Val Asn Glu Asp Ser Gln Pro Glu Cys Gln Ile Thr Gly Asp Arg
275 280 285
Pro Val Ile Lys Ile Asn Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala Ala
290 295 300
Ala Phe Leu Asn Arg Lys Ser Gln Phe Leu Tyr Thr Thr Gly Lys
305 310 315
<210> 155
<211> 350
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 155
Met Ser Glu Gln Ile Pro Lys Thr Gln Lys Ala Val Val Phe Asp Thr
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gln Leu Val Tyr Lys Asp Tyr Pro Val Pro Thr Pro Lys
20 25 30
Pro Asn Glu Leu Leu Ile His Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr
35 40 45
Asp Leu His Ala Arg Lys Gly Asp Trp Pro Leu Ala Thr Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu
65 70 75 80
Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Phe Cys Gln Gln Gly Ala Glu Pro
100 105 110
Asn Cys Gly Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe
115 120 125
Glu Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Ala
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Ala Asn Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ala Leu Lys Thr Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gln Trp Val
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr
180 185 190
Ala Arg Ala Met Gly Leu Arg Val Val Ala Ile Asp Gly Gly Asp Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Phe Val Lys Ser Leu Gly Ala Glu Ala Tyr Val Asp Phe
210 215 220
Thr Lys Asp Lys Asp Ile Val Glu Ala Val Lys Lys Ala Thr Asp Gly
225 230 235 240
Gly Pro His Gly Ala Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Lys Ala Ile Asp
245 250 255
Gln Ser Val Glu Tyr Val Arg Pro Leu Gly Lys Val Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Pro Ala His Ala Lys Val Thr Ala Pro Val Phe Asp Ala Val Val
275 280 285
Lys Ser Ile Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Lys Asp Thr
290 295 300
Ala Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Ile Lys Cys Pro Ile
305 310 315 320
Lys Ile Val Gly Leu Ser Asp Leu Pro Glu Val Phe Lys Leu Met Glu
325 330 335
Glu Gly Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Val Leu Asp Thr Ser Lys
340 345 350
<210> 156
<211> 359
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 156
Met Ala Pro Pro Ala Val Leu Ser Lys Ser Gly Val Ile Tyr Gly Lys
1 5 10 15
Asp Val Lys Asp Leu Phe Asp Tyr Ala Gln Glu Lys Gly Phe Ala Ile
20 25 30
Pro Ala Ile Asn Val Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Ala Ala Leu Glu
35 40 45
Ala Ala Arg Asp Asn Lys Ala Pro Ile Ile Leu Gln Thr Ser Gln Gly
50 55 60
Gly Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Lys Gly Val Asp Asn Lys Asp Gln Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala His Tyr Ile Arg Ala Ile
85 90 95
Ala Pro Thr Tyr Gly Ile Pro Val Val Leu His Thr Asp His Cys Ala
100 105 110
Lys Lys Leu Leu Pro Trp Phe Asp Gly Met Leu Lys Ala Asp Glu Glu
115 120 125
Phe Phe Ala Lys Thr Gly Thr Pro Leu Phe Ser Ser His Met Leu Asp
130 135 140
Leu Ser Glu Glu Thr Asp Asp Glu Asn Ile Ala Thr Cys Ala Lys Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg Met Ala Lys Met Gly Gln Trp Leu Glu Met Glu Ile Gly
165 170 175
Ile Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asn Asn Glu His Val Glu Lys
180 185 190
Asp Ala Leu Tyr Thr Ser Pro Glu Thr Val Phe Ala Val Tyr Glu Ser
195 200 205
Leu His Lys Ile Ser Pro Asn Phe Ser Ile Ala Ala Ala Phe Gly Asn
210 215 220
Val His Gly Val Tyr Lys Pro Gly Asn Val Gln Leu Arg Pro Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gly Asp His Gln Val Tyr Ala Lys Lys Gln Ile Gly Thr Asp Ala
245 250 255
Lys His Pro Leu Tyr Leu Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Thr Gln
260 265 270
Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Lys Asn Gly Val Val Lys Val Asn Leu
275 280 285
Asp Thr Asp Cys Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Gly Ile Arg Asp Tyr Val
290 295 300
Thr Asn Lys Ile Glu Tyr Leu Lys Ala Pro Val Gly Asn Pro Glu Gly
305 310 315 320
Ala Asp Lys Pro Asn Lys Lys Tyr Phe Asp Pro Arg Val Trp Val Arg
325 330 335
Glu Gly Glu Lys Thr Met Ser Lys Arg Ile Ala Glu Ala Leu Asp Ile
340 345 350
Phe His Thr Lys Gly Gln Leu
355
<210> 157
<211> 528
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 157
Met Ala Ile Val Glu Thr Val Ile Asp Gly Ile Asn Tyr Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gln Gln Ile Ser Ile Leu Leu Gly Val Pro Phe Val
20 25 30
Tyr Asn Leu Val Trp Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Arg Lys Asp Arg Ala
35 40 45
Pro Leu Val Phe Tyr Trp Ile Pro Trp Phe Gly Ser Ala Ala Ser Tyr
50 55 60
Gly Gln Gln Pro Tyr Glu Phe Phe Glu Ser Cys Arg Gln Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Asp Val Phe Ser Phe Met Leu Leu Gly Lys Ile Met Thr Val Tyr Leu
85 90 95
Gly Pro Lys Gly His Glu Phe Val Phe Asn Ala Lys Leu Ser Asp Val
100 105 110
Ser Ala Glu Asp Ala Tyr Lys His Leu Thr Thr Pro Val Phe Gly Lys
115 120 125
Gly Val Ile Tyr Asp Cys Pro Asn Ser Arg Leu Met Glu Gln Lys Lys
130 135 140
Phe Ala Lys Phe Ala Leu Thr Thr Asp Ser Phe Lys Arg Tyr Val Pro
145 150 155 160
Lys Ile Arg Glu Glu Ile Leu Asn Tyr Phe Val Thr Asp Glu Ser Phe
165 170 175
Lys Leu Lys Glu Lys Thr His Gly Val Ala Asn Val Met Lys Thr Gln
180 185 190
Pro Glu Ile Thr Ile Phe Thr Ala Ser Arg Ser Leu Phe Gly Asp Glu
195 200 205
Met Arg Arg Ile Phe Asp Arg Ser Phe Ala Gln Leu Tyr Ser Asp Leu
210 215 220
Asp Lys Gly Phe Thr Pro Ile Asn Phe Val Phe Pro Asn Leu Pro Leu
225 230 235 240
Pro His Tyr Trp Arg Arg Asp Ala Ala Gln Lys Lys Ile Ser Ala Thr
245 250 255
Tyr Met Lys Glu Ile Lys Ser Arg Arg Glu Arg Gly Asp Ile Asp Pro
260 265 270
Asn Arg Asp Leu Ile Asp Ser Leu Leu Ile His Ser Thr Tyr Lys Asp
275 280 285
Gly Val Lys Met Thr Asp Gln Glu Ile Ala Asn Leu Leu Ile Gly Ile
290 295 300
Leu Met Gly Gly Gln His Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ala Trp Phe Leu
305 310 315 320
Leu His Leu Gly Glu Lys Pro His Leu Gln Asp Val Ile Tyr Gln Glu
325 330 335
Val Val Glu Leu Leu Lys Glu Lys Gly Gly Asp Leu Asn Asp Leu Thr
340 345 350
Tyr Glu Asp Leu Gln Lys Leu Pro Ser Val Asn Asn Thr Ile Lys Glu
355 360 365
Thr Leu Arg Met His Met Pro Leu His Ser Ile Phe Arg Lys Val Thr
370 375 380
Asn Pro Leu Arg Ile Pro Glu Thr Asn Tyr Ile Val Pro Lys Gly His
385 390 395 400
Tyr Val Leu Val Ser Pro Gly Tyr Ala His Thr Ser Glu Arg Tyr Phe
405 410 415
Asp Asn Pro Glu Asp Phe Asp Pro Thr Arg Trp Asp Thr Ala Ala Ala
420 425 430
Lys Ala Asn Ser Val Ser Phe Asn Ser Ser Asp Glu Val Asp Tyr Gly
435 440 445
Phe Gly Lys Val Ser Lys Gly Val Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Gly
450 455 460
Gly Gly Arg His Arg Cys Ile Gly Glu Gln Phe Ala Tyr Val Gln Leu
465 470 475 480
Gly Thr Ile Leu Thr Thr Phe Val Tyr Asn Leu Arg Trp Thr Ile Asp
485 490 495
Gly Tyr Lys Val Pro Asp Pro Asp Tyr Ser Ser Met Val Val Leu Pro
500 505 510
Thr Glu Pro Ala Glu Ile Ile Trp Glu Lys Arg Glu Thr Cys Met Phe
515 520 525
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<213> Candida albicans
<400> 158
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1 5 10 15
Arg Ser Leu Ile Asn Pro Asn Ala Arg Tyr Asp Tyr Arg Thr His Ser
20 25 30
Leu Ile Pro Leu Thr Gln Asn Asp Leu Asn Leu Leu Arg Ile Ala Phe
35 40 45
Gln Lys Lys Lys Glu Ala Pro Pro Ser Ala Phe Lys Met Lys Tyr Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Asp Val Tyr Ser Ile Asp Gly Ser Ile Leu Arg Phe Gly Asn Ile Asn
465 470 475 480
Ser Gly Ser Ser Gly Ser Asn Trp Glu Arg Asn Gly Ser Ser Ser Asn
485 490 495
Asn Arg Ile Leu Phe Lys Ser Asn Gln Ser Ile Ala Ser Thr Ala Ser
500 505 510
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210
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275 280 285
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Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val
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<213> Candida albicans
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
Asp Asp Tyr Arg Lys Ala Glu Leu Ala Leu Lys Arg Ala Val Thr Lys
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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275 280 285
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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<211> 151
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<400> 166
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Ser Val Gly Lys Ala Ile Gln Gln Ala Arg Gln Glu Lys Lys Leu Thr
85 90 95
Gln Lys Glu Leu Ala Thr Lys Val Asn Glu Lys Pro Asn Val Ile Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Ala Gly Arg Ala Ile Pro Asn Gln Gln Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Leu Glu Arg Ala Leu Gly Val Lys Leu Arg Gly Lys Asn Ile Gly Glu
130 135 140
Pro Leu Phe Ala Lys Lys Lys
145 150
<210> 167
<211> 124
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 167
Met Ser Val Asp Phe Asn Ala Val Ala Thr Glu Phe Cys Asn Phe Tyr
1 5 10 15
Tyr Asn Gln Phe Asp Ser Asp Arg Ser Gln Leu Gly Asn Leu Tyr Arg
20 25 30
Asn Glu Ser Met Leu Thr Phe Glu Thr Ser Gln Leu Gln Gly Ala Arg
35 40 45
Asp Ile Val Glu Lys Leu Ala Ser Leu Pro Phe Gln Lys Val Ala His
50 55 60
Arg Ile Ser Thr Leu Asp Ala Gln Pro Ala Ser Ala Asn Gly Asp Ile
65 70 75 80
Leu Val Met Val Thr Gly Glu Leu Leu Ile Asp Glu Glu Gln Asn Ala
85 90 95
Gln Arg Tyr Ser Gln Val Phe His Leu Ile Pro Asp Asn Gly Ser Tyr
100 105 110
Tyr Val Phe Asn Asp Ile Phe Arg Leu Asn Tyr Ser
115 120
<210> 168
<211> 417
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 168
Met Ser Leu Ser Asn Lys Leu Ser Val Lys Asp Leu Asp Val Ala Gly
1 5 10 15
Lys Arg Val Phe Ile Arg Val Asp Phe Asn Val Pro Leu Asp Gly Lys
20 25 30
Thr Ile Thr Asn Asn Gln Arg Ile Val Ala Ala Leu Pro Thr Ile Lys
35 40 45
Tyr Val Glu Glu His Lys Pro Lys Tyr Ile Val Leu Ala Ser His Leu
50 55 60
Gly Arg Pro Asn Gly Glu Arg Asn Asp Lys Tyr Ser Leu Ala Pro Val
65 70 75 80
Ala Thr Glu Leu Glu Lys Leu Leu Gly Gln Lys Val Thr Phe Leu Asn
85 90 95
Asp Cys Val Gly Pro Glu Val Thr Lys Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp
100 105 110
Gly Glu Ile Phe Leu Leu Glu Asn Leu Arg Tyr His Ile Glu Glu Glu
115 120 125
Gly Ser Ser Lys Asp Lys Asp Gly Lys Lys Val Lys Ala Asp Pro Glu
130 135 140
Ala Val Lys Lys Phe Arg Gln Glu Leu Thr Ser Leu Ala Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ile Asn Asp Ala Phe Gly Thr Ala His Arg Ala His Ser Ser Met Val
165 170 175
Gly Leu Glu Val Pro Gln Arg Ala Ala Gly Phe Leu Met Ser Lys Glu
180 185 190
Leu Glu Tyr Phe Ala Lys Ala Leu Glu Asn Pro Glu Arg Pro Phe Leu
195 200 205
Ala Ile Leu Gly Gly Ala Lys Val Ser Asp Lys Ile Gln Leu Ile Asp
210 215 220
Asn Leu Leu Asp Lys Val Asp Met Leu Ile Val Gly Gly Gly Met Ala
225 230 235 240
Phe Thr Phe Lys Lys Ile Leu Asn Lys Met Pro Ile Gly Asp Ser Leu
245 250 255
Phe Asp Glu Ala Gly Ala Lys Asn Val Glu His Leu Val Glu Lys Ala
260 265 270
Lys Lys Asn Asn Val Glu Leu Ile Leu Pro Val Asp Phe Val Thr Ala
275 280 285
Asp Lys Phe Asp Lys Asp Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Asp Ala Glu
290 295 300
Gly Ile Pro Asp Asn Trp Met Gly Leu Asp Cys Gly Pro Lys Ser Val
305 310 315 320
Glu Leu Phe Gln Gln Ala Val Ala Lys Ala Lys Thr Ile Val Trp Asn
325 330 335
Gly Pro Pro Gly Val Phe Glu Phe Glu Lys Phe Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Ser Leu Leu Asp Ala Ala Val Lys Ser Ala Glu Asn Gly Asn Ile Val
355 360 365
Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Ala Thr Val Ala Lys Lys Tyr Gly Val
370 375 380
Val Glu Lys Leu Ser His Val Ser Thr Gly Gly Gly Ala Ser Leu Glu
385 390 395 400
Leu Leu Glu Gly Lys Asp Leu Pro Gly Val Val Ala Leu Ser Asn Lys
405 410 415
Asn
<210> 169
<211> 162
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 169
Met Ser Thr Val Tyr Phe Asp Val Ser Ala Asp Gly Gln Lys Leu Gly
1 5 10 15
Lys Ile Thr Phe Lys Leu Tyr Asp Asp Val Val Pro Lys Thr Ala Glu
20 25 30
Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Lys Gly
35 40 45
Ser Ile Phe His Arg Val Ile Pro Gln Phe Met Leu Gln Gly Gly Asp
50 55 60
Phe Thr Asn Phe Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Phe Ala Asp Glu Asn Phe Val Lys Arg His Asp Arg Pro Gly Leu Leu
85 90 95
Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile
100 105 110
Thr Thr Val Pro Cys Pro Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly
115 120 125
Glu Val Thr Asp Gly Leu Asp Ile Val Lys Lys Ile Glu Ser Phe Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Ser Lys Lys Ile Val Ile Glu Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gln Leu
<210> 170
<211> 202
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 170
Met Ala Ile Ser Lys Asn Leu Pro Leu Leu Asn Asn His Phe Arg Lys
1 5 10 15
His Trp Gln Glu Arg Val Arg Val His Phe Asp Gln Ala Gly Lys Lys
20 25 30
Ala Ser Arg Arg Gln Ser Arg Leu Arg Lys Ala Ala Lys Ile Ala Pro
35 40 45
Arg Pro Ile Asp Ala Leu Arg Pro Val Val Arg Ala Pro Thr Val Lys
50 55 60
Tyr Asn Arg Lys Val Arg Ala Gly Arg Gly Phe Thr Leu Ala Glu Leu
65 70 75 80
Lys Ala Val Gly Ile Ala Pro Lys Tyr Ala Arg Thr Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Val Asp His Arg Arg Gln Asn Lys Ser Gln Glu Thr Phe Asp Ala Asn
100 105 110
Val Ala Arg Leu Gln Glu Tyr Lys Ser Lys Leu Val Ile Phe Asp Lys
115 120 125
Lys Thr Lys Ala Ser Glu Val Ala Ser Phe Glu Gln Val Asp Val Ser
130 135 140
Ala Thr Phe Pro Val Glu Gln Pro Ala Pro Glu Ser Gly Leu Arg Ala
145 150 155 160
Val Glu Val Pro Glu Gln Thr Ala Tyr Arg Thr Leu Arg Leu Ala Arg
165 170 175
Asn Glu Lys Lys Tyr Lys Gly Ile Arg Glu Lys Arg Ala Lys Glu Lys
180 185 190
Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Ala Lys Lys
195 200
<210> 171
<211> 62
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 171
Glu Lys Lys Asp Glu Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Ala Ser Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Ile Asp Thr Leu Ala His Gly Tyr Gly Lys Val Leu Gly Lys Gly
20 25 30
Arg Leu Pro Glu Val Pro Val Ile Val Lys Ala Arg Phe Val Ser Lys
35 40 45
Leu Ala Glu Glu Lys Ser Glu Ser Leu Val Val Leu Ser Asn
50 55 60
<210> 172
<211> 99
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 172
Met Ala Lys Ser Gly Ile Ala Ala Gly Val Asn Lys Gly Arg Lys Thr
1 5 10 15
Thr Ala Lys Glu Val Ala Pro Lys Ile Ser Tyr Arg Lys Gly Ala Ser
20 25 30
Ser Gln Arg Thr Val Phe Val Arg Ser Ile Val Lys Glu Val Ala Gly
35 40 45
Leu Ala Pro Tyr Glu Arg Arg Leu Ile Glu Leu Ile Arg Asn Ala Gly
50 55 60
Glu Lys Arg Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Arg Leu Gly Thr His Lys
65 70 75 80
Arg Ala Leu Arg Lys Val Glu Glu Met Thr Gln Val Ile Ala Glu Ser
85 90 95
Arg Arg His
<210> 173
<211> 111
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 173
Met Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Leu Val Gln Gly Gly Asn Thr
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ala Ser Asp Ile Thr Ala Leu Leu Glu Ser Val Gly Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Ser Arg Leu Gln Ala Leu Leu Lys Asp Leu Glu Gly
35 40 45
Lys Asp Leu Gln Glu Leu Ile Ala Glu Gly Asn Thr Lys Leu Ala Ser
50 55 60
Val Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ser Ala Ser Thr Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Glu Ala Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Ser Asp Asp Asp Met Gly Phe Gly Leu Phe Asp
100 105 110
<210> 174
<211> 130
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 174
Met Thr Arg Thr Ser Val Leu Ala Asp Ala Leu Asn Ala Ile Asn Asn
1 5 10 15
Ala Glu Lys Thr Gly Lys Arg Gln Val Leu Ile Arg Pro Ser Ser Lys
20 25 30
Val Ile Ile Lys Phe Leu Thr Val Met Gln Lys His Gly Tyr Ile Gly
35 40 45
Glu Phe Glu Tyr Ile Asp Asp His Arg Ser Gly Lys Ile Val Val Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Arg Leu Asn Lys Cys Gly Val Ile Gln Pro Arg Phe Asn
65 70 75 80
Val Lys Ile Asn Asp Ile Glu Arg Trp Thr Asp Asn Leu Leu Pro Ala
85 90 95
Arg Gln Phe Gly Tyr Val Ile Leu Thr Thr Ser Ala Gly Ile Met Asp
100 105 110
His Glu Glu Ala Arg Arg Lys His Val Ser Gly Lys Ile Leu Gly Phe
115 120 125
Val Tyr
130
<210> 175
<211> 248
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 175
Met Ala Arg Gln Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Ala Asn Gly Thr
1 5 10 15
Lys Gln Gln Ile Thr Ser Ile Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ala Asp Leu
20 25 30
Pro Lys Asp Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Leu Tyr Leu Gly
35 40 45
Leu Ala Val Glu Gln Asn Lys Gln Pro Thr Val Ala Ile Gly Ala Gln
50 55 60
Asn Val Phe Asp Lys Ser Cys Gly Ala Phe Thr Gly Glu Thr Cys Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ile Leu Asp Val Gly Ala Ser Trp Thr Leu Thr Gly His Ser
85 90 95
Glu Arg Arg Thr Ile Ile Lys Glu Ser Asp Glu Phe Ile Ala Glu Lys
100 105 110
Thr Lys Phe Ala Leu Asp Thr Gly Val Lys Val Ile Leu Cys Ile Gly
115 120 125
Glu Thr Leu Glu Glu Arg Lys Gly Gly Val Thr Leu Asp Val Cys Ala
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Ile Val Ser Asp Trp Ser Asn Ile
145 150 155 160
Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala
165 170 175
Thr Pro Glu Asp Ala Glu Glu Thr His Lys Gly Ile Arg Ala His Leu
180 185 190
Ala Lys Ser Ile Gly Ala Glu Gln Ala Glu Lys Thr Arg Ile Leu Tyr
195 200 205
Gly Gly Ser Val Asn Gly Lys Asn Ala Lys Asp Phe Lys Asp Lys Ala
210 215 220
Asn Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe
225 230 235 240
Val Asp Ile Ile Lys Ser Arg Leu
245
<210> 176
<211> 663
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 176
Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met
1 5 10 15
Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly
20 25 30
Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn
35 40 45
Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn
50 55 60
Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys
85 90 95
Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr
100 105 110
Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile
115 120 125
Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile
130 135 140
Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu
145 150 155 160
Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly
165 170 175
Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His
180 185 190
Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr
195 200 205
Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile
210 215 220
Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu
225 230 235 240
Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly
245 250 255
Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu
260 265 270
Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser
275 280 285
Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu
290 295 300
Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln
305 310 315 320
Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp
325 330 335
Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro
340 345 350
Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe
355 360 365
Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro
370 375 380
Ser Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala
385 390 395 400
Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala
405 410 415
Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser
420 425 430
Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala
435 440 445
Ala Leu Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile
450 455 460
Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala
465 470 475 480
Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln
485 490 495
Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly
500 505 510
Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg
515 520 525
Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly Tyr Val Leu Lys
530 535 540
Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu
545 550 555 560
Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val
565 570 575
Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln
580 585 590
Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg
595 600 605
Val Ala Val Glu Ala Gly Ile Ala Asp Tyr Trp Tyr Lys Tyr Val Gly
610 615 620
Leu Asn Gly Ala Ile Val Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro
625 630 635 640
Ala Glu Leu Leu Phe Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val
645 650 655
Ala Lys Ala Lys Glu Leu Leu
660
<210> 177
<211> 16
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 177
Gly His Tyr Val Leu Val Phe Pro Gly Tyr Ala His Thr Ser Glu Arg
1 5 10 15
Claims (33)
- 하나 이상의 미생물을 동정하는 단계와 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 잠재적 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법으로서,
상기 하나 이상의 미생물에 대해 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계는 상기 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성의 마커로서 단백질, 펩티드 및/또는 대사물질을 사용하여 질량분석에 의해 수행되고,
유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 잠재적 내성 및 병원성 인자의 특성에 대해 수행되는 상기 질량분석은 MRM 모드 내 MS/MS 유형의 분광분석법이며,
유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성을 결정하는 단계는 동일한 질량분석 기기에서 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 미생물을 동정하는 단계도 또한 질량분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 하나 이상의 미생물을 동정하기 위한 질량분석은 MS 유형의 분광분석법, MS/MS 유형의 분광분석법, 또는 MS 유형 이후 MS/MS 유형의 분광분석법인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 미생물의 동정을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하고, 여기서 상기 확인 단계는 질량분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 확인 단계의 질량분석은 MS/MS 유형의 질량분석인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 확인 단계의 질량분석은 MRM인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 유형화, 하나 이상의 항미생물제에 대한 내성 및 병원성 인자의 특성의 마커는 상기 하나 이상의 미생물의 단백질인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 미생물의 단백질은 펩티드로 소화되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 소화는 효소에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 효소는 트립신인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 미생물은 박테리아이며, 상기 항미생물제는 항생물질인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 박테리아는 스타필로코쿠스 아우레우스인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 유형화의 특성을 결정하는 단계는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44 또는 45를 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특성을 결정하는 단계는 서열번호 10 내지 17에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 병원성을 결정하는 단계는 서열번호 19, 20, 21, 23 또는 24를 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 동정 단계는 서열번호 26, 27, 29, 30, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44 또는 45의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제17항에 있어서,
상기 유형화 특성을 결정하는 단계는 서열번호 46 내지 87에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
상기 하나 이상의 항생물질에 대한 잠재적 내성의 특성을 결정하는 단계는 서열번호 85, 86 및 87에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제17항에 있어서,
상기 병원성을 결정하는 단계는 서열번호 62 내지 66에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제17항에 있어서,
상기 동정 단계는 서열번호 46 내지 61에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 미생물은 효모이고, 상기 항미생물제는 항균제인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 효모는 칸디다 알비칸스인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제23항에 있어서,
상기 유형화의 특성을 결정하는 단계는 서열번호 88 내지 125 및 177에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 하나 이상의 항균제에 대한 잠재적 내성의 특성을 결정하는 단계는 서열번호 117 내지 122 및 177에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제23항에 있어서,
상기 병원성을 결정하는 단계는 서열번호 123 내지 125에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제23항에 있어서,
상기 동정 단계는 서열번호 88 내지 116에서 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 대사물질은 에르고스테롤인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 미생물을 특징화하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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