CN111721828B - 微生物的识别方法及记录介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用质量分析的微生物的识别方法。更具体而言，本发明涉及一种通过利用质量分析来识别痤疮杆菌的种系型的方法。本发明更涉及一种记录介质，记录有用于使计算机执行所述识别方法中的各步骤的程序，以及一种皮肤细菌丛的分析方法，其使用所述的识别方法。本发明的目的在于确定可再现性良好、且迅速地识别作为痤疮杆菌的进化种系群的类型I、类型II及类型III，以及构成类型I的种系型的生物标记蛋白质，并提供使用其的微生物，特别是痤疮杆菌的识别法。

Description

微生物的识别方法及记录介质
技术领域
本发明涉及一种利用质量分析的微生物的识别方法。更具体而言，本发明涉及一种通过利用质量分析来识别痤疮杆菌(Cutibacterium acnes)的种系型(phylotype)的方法。
背景技术
作为识别微生物的种类的方法之一，从先前以来已知有基于脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)碱基序列的同源性分析，广泛用于微生物的分类及鉴定等(专利文献1)。在此方法中，首先从被检测微生物中提取DNA，决定核糖体核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)基因等的在全生物中以高保存性存在的区域的DNA碱基序列。其次，使用所述DNA碱基序列，检索收录有许多已知微生物的DNA碱基序列数据的数据库，选出与所述被检测微生物的DNA碱基序列的类似性高的碱基序列。然后，将作为所述碱基序列的来源的生物种判定为与所述被检测微生物同一种或近缘种。但是，在利用此种DNA碱基序列的方法中，从被检测微生物中的DNA提取或DNA碱基序列的决定等需要比较长的时间，因此存在难以进行迅速的微生物鉴定这一问题。另外，核糖体RNA基因的进化速度比较慢，因此容易在种系相差悬殊的生物间进行比较，但通常难以在非常近缘的菌种间进行比较。
因此，近年来，使用根据对被检测微生物进行质量分析所获得的质谱图案进行微生物鉴定的方法。根据质量分析，可使用微量的微生物试样在短时间内获得分析结果、且也容易进行多样本的连续分析，因此可实现简便且迅速的微生物鉴定。在此方法中，首先，通过利用基质辅助激光解吸电离质谱法(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry，MALDI-MS)等软性的电离法的质量分析装置，对包含从被检测微生物中提取的蛋白质的溶液及被检测微生物的悬浮液等进行分析。此外，所谓“软性的”电离法，是指其中容易被热分解的分子(例如蛋白质和合成聚合物)具有抗分解性的电离方法。然后，将所获得的质谱图案与事先收录在数据库中的许多已知微生物的质谱图案进行对照，由此进行被检测微生物的鉴定。此方法将质谱图案作为特别的信息(即指纹)而用于各微生物，因此被称为指纹法(非专利文献1及非专利文献2)。
在使用所述利用质量分析的指纹法的微生物鉴定中，即便可进行种级别的鉴定，通常也难以进行作为更下位的分类级别的亚种、病原型或株等级别的识别。进而，在指纹法中，质谱上出现的各峰值源自哪种蛋白质未被确定，在鉴定微生物上的理论依据及可靠性方面存在问题。因此，为了解决所述问题，开发有如下的方法：利用对微生物菌体进行质量分析所获得的峰值的约一半源自核糖体蛋白质这一点，将通过质量分析所获得的峰值的质荷比(m/z值)与根据对核糖体蛋白质基因的碱基序列信息进行翻译所得的氨基酸序列所推测的质量建立关联，由此对成为所述峰值的来源的蛋白质的种类进行归类(专利文献2)。根据此方法，可进行基于理论依据的可靠性高的微生物鉴定。
源自微生物的蛋白质存在即便蛋白质的种类相同，质量也因微生物的分类级别(科、属、种、亚种、病原型、血清型、株等)而不同的情况，其结果，质量分析的峰值的观测值(m/z值)不同。因此，为了再现性良好地进行病原型或株级别的识别，选择可用于作为鉴定对象的病原型或株级别的识别的标记峰值变得重要。例如，在专利文献2中公开有：作为用于鉴定及识别恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)及其类似细胞的生物标记蛋白质，可利用23种核糖体亚基蛋白质(L5、L13、L14、L15、L18、L19、L20、L22、L23、L24、L28、L30、L35、L36、S7、S8、S10、S13、S14、S17、S19、S20、及S21)。另外，在专利文献3中公开有：作为用于通过质量分析来鉴定及识别O157、O26及O111的标记蛋白质，针对O157，可利用核糖体蛋白质S15、核糖体蛋白质L25及酸应激伴侣(acid stress chaperone)HdeB，另外，针对O26及O111，可利用DNA结合蛋白质H-NS，所述O157、O26及O111是病原型的大肠杆菌，且作为肠管出血性大肠杆菌而为人所知。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本专利特开2006-191922
[专利文献2]日本专利特开2007-316063
[专利文献3]日本专利特开2015-184020
[非专利文献]
[非专利文献1]Dekio I,Culak R,Fang M,等人.《痤疮丙酸杆菌的遗传谱系与细胞内蛋白质组之间的关联、及厌氧生长细胞与有氧生长细胞之间的蛋白质表达谱的不同(Correlation between phylogroups and intracellular proteomes ofPropionibacterium acnes and differences in the protein expression profilesbetween anaerobically and aerobically grown cells)》.《国际生物医学研究(BiomedRes Int)》.2013；2013：151797.
[非专利文献2]Dekio I,Culak R,Misra R,等人.《痤疮丙酸杆菌中的分类异质性的剖析：对于痤疮丙酸杆菌亚种.痤疮亚种.nov.及痤疮丙酸杆菌亚种.伸长亚种.nov的提议(Dissecting the taxonomic heterogeneity within Propionibacterium acnes：proposal for Propionibacterium acnes subsp.acnes subsp.nov.andPropionibacterium acnes subsp.elongatum subsp.nov)》.《国际系统与进化微生物学杂志(Int J Syst Evol Microbiol)》.2015；65：4776-4787.
发明内容
[发明所要解决的问题]
痤疮杆菌(Cutibacterium acnes，C.acnes)是厌氧性革兰氏阳性的代表性的皮肤常驻细菌。报告有痤疮杆菌通过作为代谢产物的丙酸等来将皮肤表面保持为弱酸性，且抑制有害菌朝皮肤上的附着等有用性。进而，也报告有痤疮杆菌产生具有抑制由紫外线等的氧化应激所引起的皮肤的细胞的损伤的功能的抗氧化酶，具有保护皮肤的作用(AllhornM,等人.《科学报告(Sci Rep.)》2016；6：36412)。另一方面，痤疮杆菌也作为寻常性痤疮(粉刺)等的原因而为人所知。若在皮肤中皮脂分泌旺盛，毛囊被角栓封闭，在毛囊内形成充满皮脂的粉刺，则作为厌氧性菌的痤疮杆菌在粉刺中增殖，产生炎症性物质而诱发炎症。为了识别有用的痤疮杆菌与成为机会性感染的原因的痤疮杆菌，谋求由痤疮杆菌所引起的皮肤炎症的治疗，成为骨髓炎、心内膜炎、眼内炎等的原因的痤疮杆菌感染的预防，及由痤疮杆菌所引起的美容器具、人工关节及医疗器具的污染的防止，必须迅速地对痤疮杆菌的种系型(phylotype)进行分析。
利用所述指纹法尝试了痤疮杆菌的鉴定及分类(非专利文献1及非专利文献2)。在这些非专利文献中，将痤疮杆菌与其菌体构成成分的电离所需要的试剂在小瓶或试样板上混合来制备分析用的试样，通过表面辅助激光解吸电离质谱法(Surface Assisted LaserDesorption-Ionization Mass Spectrometry，SALDI-MS)或MALDI-MS(基质辅助激光解吸电离质谱法)来进行分析，并利用质谱的图案、或在m/z 7000～7300附近所观测到的峰值的图案来对痤疮杆菌进行鉴定及分类。但是，非专利文献1的SALDI-MS的质谱的信噪比(signal/noise ratio，S/N比)低，缺乏可靠性。在非专利文献2中使用SALDI-MS及MALDI-MS，但SALDI-MS的质谱的S/N比低，缺乏可靠性，另外，在MALDI-MS中，未进行将用于分类的峰值归属于具体的蛋白质的归类，因此分类的依据并不明确。Nagy等人也报告了利用MALDI-MS的痤疮杆菌的鉴定及分类，但未进行将用于分类的峰值归属于具体的蛋白质的归类(Nagy E,等人.《厌氧菌(Anaerobe)》.2013；20：20-26)。进而，在这些利用质量分析的方法中，目前未成功地对痤疮杆菌的种系型完整地进行分类。
如上所述，通常难以进行用于识别痤疮杆菌的种系型的详细的分析，在质量分析中，峰值分离，可用于识别的生物标记蛋白质仍未被确定是现状。因此，在质量分析中，需要对在质谱中所观察到的峰值进行了归类的可靠性更高的方法。
本发明是鉴于所述方面而成者。本发明的目的在于确定可再现性良好、且迅速地识别作为痤疮杆菌的进化种系群的类型I、类型II及类型III，以及构成类型I的种系型的生物标记蛋白质，并提供使用其的微生物，特别是痤疮杆菌的识别法。
[解决问题的技术手段]
即，本发明的目的通过以下的发明来达成。
[1]
一种微生物的识别方法，包括：
a)读取通过对包含微生物的试样进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
b)根据所述m/z值，判定在所述试样中是否包含痤疮杆菌(C.acnes)的步骤；且
所述标记蛋白质是选自由核糖体蛋白质L7/核糖体蛋白质L12、核糖体蛋白质L9、核糖体蛋白质L18、核糖体蛋白质L28、核糖体蛋白质L29、核糖体蛋白质L30、核糖体蛋白质L31、核糖体蛋白质S8、核糖体蛋白质S15、核糖体蛋白质S19及核糖体蛋白质S20所组成的群组中的一种以上。
[2]
一种微生物的识别方法，包括：
a)读取通过对被检测微生物进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
b)根据所述m/z值，判定所述被检测微生物是否为C.acnes类型I、类型II或类型III的步骤；且
所述标记蛋白质是核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L23的组合、核糖体蛋白质L15与核糖体蛋白质L23的组合、或核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L15的组合。
[3]
一种微生物的识别方法，包括：
a)读取通过对被检测微生物进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
b)根据所述m/z值，判定所述被检测微生物是否为C.acnes类型I的种系型IA1或种系型IA2、或者种系型IB的步骤；且
所述标记蛋白质是核糖体蛋白质L13与抗毒素(antitoxin)的组合。
[4]
根据[3]中记载的识别方法，其中质谱上的所述抗毒素的峰值的m/z值(m/z)为7034.6。
[5]
根据[1]至[4]的任一项中记载的识别方法，其中质谱上的所述标记蛋白质还包含二价离子。
[6]
一种微生物的识别方法，包括：
a)读取通过对包含微生物的试样进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
b)根据所述m/z值，判定在所述试样中是否包含C.acnes类型I、类型II或类型III的至少一种的步骤；且
在所述步骤b)中，当在所述质谱上，关于核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L23的组合、核糖体蛋白质L15与核糖体蛋白质L23的组合、或核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L15的组合，存在具有C.acnes类型I、类型II及类型III中特有的变异时的m/z值的峰值的至少一个的情况下，判定在所述试样中包含C.acnes类型I、类型II或类型III的至少一种。
[7]
一种记录介质，记录有用于使计算机执行[1]至[6]的任一项中记载的各步骤的程序。
[8]
一种皮肤细菌丛的分析方法，使用[1]至[6]的任一项中记载的识别方法。
[发明的效果]
根据本发明，可再现性良好、且迅速地识别作为代表性的皮肤常驻细菌的痤疮杆菌(C.acnes)是否包含在试样中、或被检测微生物是否为C.acnes的类型I、类型II或类型III。进而，根据本发明，可再现性良好、且迅速地识别C.acnes类型I的子类型IA1或子类型IA2、或者子类型IB。
C.acnes与粉刺等皮肤疾病及皮肤的炎症的诱发相关，但可认为主要起因于C.acnes类型I。通过本发明，可迅速且简便地识别试样中的C.acnes类型I，因此可迅速且简便地进行对于粉刺等皮肤疾病的治疗或预防而言重要的皮肤细菌丛分析。进而，通过本发明，可简便地进行基于皮肤细菌丛分析的皮肤的状态评估，因此可容易地进行护肤的评估。
附图说明
图1是本发明的微生物的识别方法中所使用的微生物识别系统的整体图。
图2是表示使用本发明的微生物的识别方法的C.acnes的类型识别顺序的图。
图3是表示用于C.acnes分型的标记蛋白质的列表。序列类型(Sequence type)是利用多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)的分类。
图4是表示有助于C.acnes分型的质谱上的峰值的图。
图5是表示用于C.acnes蛋白分型(proteotyping)的峰值轮廓的图。序列类型是利用多位点序列分型(MLST)的分类。
图6是表示C.acnes的分类结果的图。
[符号的说明]
10：质量分析部
11：电离部
12：飞行时间型质量分离器
13：引出电极
14：检测器
20：微生物辨别部
21：中央处理器
22：存储器
23：显示部
24：输入部
25：I/F
30：存储部
31：OS
32：光谱制作程序
33：种决定程序
34：第一数据库
35：种系型决定程序
36：第二数据库
37：光谱获取部
38：m/z读取部
39：种系型判定部
具体实施方式
图1是本发明的微生物的识别方法中所使用的微生物识别系统的整体图。
所述微生物识别系统大致包含质量分析部10与微生物辨别部20。质量分析部10包括：电离部11，通过基质辅助激光解吸电离法(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization，MALDI)来将试样中的分子及原子电离；以及飞行时间型质量分离器(Time OfFlight，TOF)12，对应于m/z值来将从电离部11中射出的各种离子分离。
TOF 12包括：引出电极13，用于从电离部11引出离子并引导至TOF 12内的离子飞行空间；以及检测器14，在离子飞行空间内检测经质量分离的离子。
微生物辨别部20的实体是工作站及个人计算机等计算机，作为中央运算处理装置的中央处理器(Central Processing Unit，CPU)21与存储器22、包含液晶显示器(LiquidCrystal Display，LCD)等的显示部23、包含键盘及鼠标等的输入部24、包含硬盘及固态硬盘(Solid State Drive，SDD)等大容量存储装置的存储部30(即记录介质)相互连接。在存储部30存储操作系统(Operating System，OS)31、光谱制作程序32、种决定程序33、及种系型决定程序35(与本发明相关的程序)，并且存储有第一数据库34及第二数据库36。微生物辨别部20进而包括接口(Interface，I/F)25，所述接口(I/F)25用于掌管与外部装置的直接的连接、及与外部装置等的经由局域网(Local Area Network，LAN)等网络的连接，从所述接口25经由网络电缆NW(或无线LAN)而与质量分析部10连接。
在图1中，以与种系型决定程序35(与本发明相关的程序)相关的方式表示光谱获取部37、m/z读取部38及种系型判定部39。它们均是基本上通过CPU 21执行种系型决定程序35而以软件方式实现的功能部件。此外，种系型决定程序35未必需要是单体的程序，例如也可以是被编入种决定程序33、或用于控制质量分析部10的程序的一部分的功能，其形态并无特别限定。
另外，在图1中，设为如下构成：在使用者进行操作的终端搭载光谱制作程序32、种决定程序33、及种系型决定程序35、第一数据库34、以及第二数据库36，但也可以设为如下的构成：将它们的至少一部分或全部设置在通过计算机网络而与所述终端连接的另一装置内，按照来自所述终端的指示，执行利用设置在所述另一装置内的程序的处理和/或对于数据库的访问。
在存储部30的第一数据库34，登记有许多与已知微生物相关的质量列表。所述质量列表是列举对某一微生物细胞进行了质量分析时所检测的离子的m/z值者，除所述m/z值的信息以外，至少包含所述微生物细胞所属的分类群(科、属、种等)的信息(分类信息)。所述质量列表理想的是根据如下的数据来制作，所述数据是事先通过与利用所述质量分析部10的电离法及质量分离法相同的电离法及质量分离法，对各种微生物细胞实际进行质量分析所获得的数据(实测数据)。
当根据所述实测数据来制作质量列表时，首先，从作为所述实测数据所获取的质谱中提取在规定的m/z值范围内出现的峰值。此时，将所述m/z值范围设为3,000～20,000左右，由此可提取主要源自蛋白质的峰值。另外，仅提取峰值的高度(相对强度)为规定的阈值以上者，由此可排除不期望的峰值(噪声)。此外，核糖体蛋白质群在细胞内大量地表达，因此通过适当地设定所述阈值，可将质量列表中记载的m/z值的大部分设为源自核糖体蛋白质者。然后，针对各细胞将通过以上方式所提取的峰值的m/z值列表化，在附加所述分类信息等后登记在第一数据库34。此外，为了抑制由培养条件所造成的基因表达的偏差，理想的是事先将用于实测数据的采集的各微生物细胞的培养环境规格化。
在存储部30的第二数据库36，登记有与用于以比种更下位的分类(亚种、病原型、血清型、株等)来识别已知微生物的标记蛋白质相关的信息。作为与所述标记蛋白质相关的信息，至少包含已知微生物的所述标记蛋白质的m/z值的信息。被存储在第二数据库36的标记蛋白质也可以是二价离子。此外，只要无特别明示，则本说明书中记载的m/z值(m/z)是相对于一价离子的值。在本实施方式的第二数据库36，作为与用于判定被检测微生物是否为C.acnes的标记蛋白质相关的信息，至少存储有与核糖体蛋白质L7/核糖体蛋白质L12、核糖体蛋白质L9、核糖体蛋白质L18、核糖体蛋白质L28、核糖体蛋白质L29、核糖体蛋白质L30、核糖体蛋白质L31、核糖体蛋白质S8、核糖体蛋白质S15、核糖体蛋白质S19及核糖体蛋白质S20分别对应的m/z值的值(L7/L12：m/z13571.4、L9：m/z 16118.8、L18：m/z 13570.6、L28：m/z6807.0、L29：m/z 8754.9、L30：m/z 6786.9、L31：m/z 7718.8、S8：m/z 14525.7、S15：m/z10080.7、S19：m/z 10380.0及S20：m/z 9570.0)。进而，在第二数据库36，作为与用于判定被检测微生物是C.acnes类型I、类型II及类型III的哪一种的标记蛋白质L6、标记蛋白质L15及标记蛋白质L23相关的信息，存储有与各个标记蛋白质对应的m/z值(L6：m/z 19678.6或m/z 19706.6、L15：m/z 15384.7或m/z 15357.6、及L23：m/z 11181.0或m/z 11200.0)。此处，与用于判定为类型I的标记蛋白质L6、标记蛋白质L15及标记蛋白质L23相关的信息是L6：m/z 19706.6且L23：m/z 11200.0、L15：m/z 15384.7且L23：m/z 11200.0、或L6：m/z19706.6且L15：m/z 15384.7。与用于判定为类型II的标记蛋白质L6、标记蛋白质L15及标记蛋白质L23相关的信息是L6：m/z 19678.6且L23：m/z 11200.0、L15：m/z15357.6且L23：m/z11200.0、或L6：m/z 19678.6且L15：m/z 15357.6。与用于判定为类型III的标记蛋白质L6、标记蛋白质L15及标记蛋白质L23相关的信息是L6：m/z 19678.6且L23：m/z 11181.0、L15：m/z 15384.7且L23：m/z11181.0、或L6：m/z 19678.6且L15：m/z 15384.7。
进而，在第二数据库36，作为与用于将C.acnes类型I细分为子类型IA1、子类型IA2及子类型IB的标记蛋白质相关的信息，存储有与L13对应的m/z值(m/z 16153.5、m/z16167.6及m/z 16180.7)、及与C.acnes的抗毒素(antitoxin)对应的m/z 7034.6。抗毒素(antitoxin)是指由细菌的染色体或质粒DNA进行了编码的抗毒素蛋白质。此处，与用于将C.acnes类型I细分成子类型IA1的标记蛋白质相关的信息是L13：m/z 16167.6且抗毒素：m/z 7034.6。与用于将C.acnes类型I细分成子类型IA2的标记蛋白质相关的信息是L13：m/z16167.6，且抗毒素并非m/z 7034.6。与用于将C.acnes类型I细分成子类型IB的标记蛋白质相关的信息是L13：m/z 16153.5，且抗毒素并非m/z 7034.6。
作为存储在第二数据库36的标记蛋白质的m/z值，理想的是将通过将各标记蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列所求出的计算质量、与通过实测所检测的m/z值进行比较来挑选。此外，标记蛋白质的碱基序列除由序列来决定以外，也可以使用从公共的数据库，例如美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库等中获取者。当根据所述氨基酸序列来求出计算质量时，作为翻译后修饰，理想的是考虑N-末端甲硫氨酸残基的切断。具体而言，在从N-末端起第二个氨基酸残基为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸或半胱氨酸的情况下，作为N-末端甲硫氨酸被切断者来算出所述理论值。另外，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MatrixAssisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy，MALDI-TOF MS)来实际观测者是加成有质子的分子，因此理想的是也加上所述质子部分来求出所述计算质量(即，利用MALDI-TOF MS对各蛋白质进行了分析时所获得的离子的m/z值的理论值)。
一边参照流程图(图2)，一边对使用本实施方式的微生物识别系统的C.acnes类型I、类型II及类型III的识别顺序进行说明。
首先，使用者制备包含被检测微生物的构成成分的试样，并设置在质量分析部10来执行质量分析。此时，作为所述试样，也可以直接使用菌体或细胞悬浮液，但优选使用细胞提取物，更优选使用从细胞提取物中对核糖体蛋白质等细胞构成成分进行浓缩或精制而成者。
光谱制作程序32经由接口25而获取从质量分析部10的检测器14获得的检测信号，并根据所述检测信号来制作被检测微生物的质谱(步骤S101)。
其次，种决定程序33将所述被检测微生物的质谱与已被收录在第一数据库34的已知微生物的质量列表进行对照，提取具有与被检测微生物的质谱类似的m/z值图案的已知微生物的质量列表，例如包含许多在规定的误差范围(优选50ppm～500ppm，更优选150ppm～200ppm)内与被检测微生物的质谱中的各峰值一致的峰值的质量列表(步骤S102)。继而，种决定程序33参照与在步骤S102中所提取的质量列表建立对应而存储在第一数据库34的分类信息，由此确定与所述质量列表对应的已知微生物所属的生物种(步骤S103)。然后，在所述生物种并非C.acnes的情况(在步骤S104中为“否(No)”的情况)下，将所述生物种作为被检测微生物的生物种而输出至显示部23(步骤S113)，并结束识别处理。另一方面，在所述生物种是C.acnes的情况(在步骤S104中为“是(Yes)”的情况)下，继而进入利用种系型决定程序35的识别处理。此外，在事先通过其他方法而判定试样中包含C.acnes的情况下，不利用使用质谱的种决定程序，只要进入种系型决定程序35即可。
在种系型决定程序35中，首先，种系型判定部39从第二数据库36中分别读出作为标记蛋白质的核糖体蛋白质L6、核糖体蛋白质L13、核糖体蛋白质L15、核糖体蛋白质L23及抗毒素(antitoxin)的m/z值(步骤S105)。其次，光谱获取部37获取在步骤S101中所制作的被检测微生物的质谱。然后，m/z值读取部38在所述质谱上，将与所述各标记蛋白质建立关联而存储在第二数据库36的m/z值范围内出现的峰值作为与各标记蛋白质对应的峰值来选出，并读取其m/z值(步骤S106)。其后，种系型判定部39将所述m/z值与已从所述第二数据库36中读出的各标记蛋白质的m/z值进行比较，并判断两者在规定的容许误差范围内是否一致(步骤S107)。其结果，在两者一致的情况下，判定被检测微生物是C.acnes类型I、类型II或类型III的任一种(步骤S108)，并将此意思作为被检测微生物的识别结果而输出至显示部23(步骤S113)。进而，通过读取L13的m/z值及与抗毒素(antitoxin)对应的m/z 7034.6，可将已在步骤S108中被分类成类型I的C.acnes细分成子类型IA1或子类型IA2、或者子类型IB(步骤S111及步骤S112)。另外，在事先通过其他方法而判定试样中包含C.acnes类型I的情况下，通过仅执行步骤S111及步骤S112，可将C.acnes类型I进一步细分成子类型IA1或子类型IA2、或者子类型IB。
以上，一边参照图式一边对用于实施本发明的形态进行了说明，但本发明并不限定于所述实施方式，在本发明的主旨的范围内容许适宜变更。
[实施例]
以下，对为了证实本发明的标记蛋白质的选定顺序及本发明的效果所进行的实验进行说明，但本发明的范围并不由所述实验限定。
(1)菌株及培养条件
为了构建蛋白质质量数据库而使用C.acnes 22株。这些株从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(Japan Collection ofMicroorganisms，JCM)(筑波市，日本)购入。在C.acnes的培养中，使用日水制药股份有限公司的变法GAM培养基或GAM培养基。
(2)蛋白质质量数据库的构建
从美国的国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的数据库获得核糖体亚基蛋白质的氨基酸序列。各蛋白质的计算质量的算出使用由瑞士生物信息科学机构提供的ExPASy蛋白质组学服务器的计算序列等电点和分子量的工具(Compute pI/Mw tool)。此时，在从N-末端起第二个氨基酸残基为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸或半胱氨酸的情况下，作为N-末端甲硫氨酸被切断者来算出所述计算质量。
(3)利用MALDI-TOF MS的测定
在测定中，使用琼脂培养基上的菌落(colony)的菌体、或通过离心分离而从液体培养基中回收的菌体。利用蒸馏水，以在610nm下的吸光度变成约1(OD610＝1)的方式对菌体进行稀释，而制备菌体悬浮液。使用氧化锆制珠粒(直径0.5mm)对所述菌体悬浮液(500μL)进行破碎处理。对15000g的所述菌体悬浮液进行5分钟离心分离来去除碎片，而获得作为上清液的菌体破碎液。使用名义分子量极限(nominal molecular weight limit，NMWL)30kDa的过滤器对14000g的所获得的上清液进行10分钟离心分离，而获得核糖体组分(捕捉组分)。将核糖体馏分1μL、与利用含有1％(v/v)三氟乙酸的50％(v/v)乙腈水溶液所制备的包含15mg/mL的芥子酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸而成的10μl的基质溶液在微型管内混合，将其1μL滴加至试样板并使其干燥。在MALDI-TOF MS测定中使用原苏尔寿效能(AXIMAPerformanceTM mass spectrometer)(注册商标)，通过正线性模式来进行m/z 2000～20000的质量范围的测定。以容许误差200ppm将所述计算质量与经测定的m/z值进行匹配。
以上的结果，若将与接近峰值重复且峰值形状不明确、峰值强度不充分、作为可稳定检测的生物标记不适当的核糖体蛋白质排除，则L7/L12、L9、L18、L28、L29、L30、L31、S8、S15、S19及S20在所有菌株中分别表示相同的m/z。
关于经测定的m/z值及质谱，挑出有助于种系型的识别的部分，分别示于图3及图4。根据图3及图4，示出以下内容。
通过着眼于L23，可鉴定类型III(类型III：m/z 11180.9，类型I及类型II：m/z11200.0)。
通过着眼于L15，可鉴定类型II(类型II：m/z 15357.6，类型I及类型III：m/z15384.7)。
通过着眼于L6，可鉴定类型I(类型I：m/z 19706.6，类型II及类型III：m/z19678.6)。
通过着眼于L13，可鉴定类型I的种系型IB(IB：m/z 16153.5，IA1及IA2：m/z16167.6)。
通过着眼于m/z 7034.6的峰值(抗毒素)，可鉴定类型I的IA1。
通过L13及m/z 7034.6的峰值(抗毒素)，可识别类型I的IA1或IA2与IB。
(4)聚类分析(cluster analysis)
利用MALDI-MS对蛋白质的质量图案进行分析，确认所有菌株为C.acnes。继而，将各菌株的质谱上的峰值的m/z值与无变异的生物标记蛋白质的m/z值一致者设为“1”，将不一致者设为“0”，制作图5中所示的轮廓数据。使用所述数据进行聚类分析来制作树状图(树形图)。将其结果示于图6。如根据图6而明确，C.acnes已被正确地分类成类型I、类型II及类型III。进而，与皮肤的炎症相关联的类型I可进一步细分成IA1、IA2及IB。因此，提供皮肤细菌丛的分析方法。

Claims (8)

1.一种微生物的识别方法，其特征在于包括：
步骤a，读取通过对包含微生物的试样进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
步骤b，根据所述m/z值，判定在所述试样中是否包含痤疮杆菌的步骤；且
所述标记蛋白质是选自由核糖体蛋白质L7/核糖体蛋白质L12、核糖体蛋白质L9、核糖体蛋白质L18、核糖体蛋白质L28、核糖体蛋白质L29、核糖体蛋白质L30、核糖体蛋白质L31、核糖体蛋白质S8、核糖体蛋白质S15、核糖体蛋白质S19及核糖体蛋白质S20所组成的群组中的一种以上，
其中，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L7/核糖体蛋白质L12的峰值的m/z值为13571.4、源自所述核糖体蛋白质L9的峰值的m/z值为16118.8、源自所述核糖体蛋白质L18的峰值的m/z值为13570.6、源自所述核糖体蛋白质L28的峰值的m/z值为6807.0、源自所述核糖体蛋白质L29的峰值的m/z值为8754.9、源自所述核糖体蛋白质L30的峰值的m/z值为6786.9、源自所述核糖体蛋白质L31的峰值的m/z值为7718.8、源自所述核糖体蛋白质S8的峰值的m/z值为14525.7、源自所述核糖体蛋白质S15的峰值的m/z值为10080.7、源自所述核糖体蛋白质S19的峰值的m/z值为10380.0、源自所述核糖体蛋白质S20的峰值的m/z值为9570.0。
2.根据权利要求1所述的识别方法，其中质谱上的所述标记蛋白质还包含二价离子。
3.一种微生物的识别方法，其特征在于包括：
步骤a，读取通过对被检测微生物进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
步骤b，根据所述m/z值，判定所述被检测微生物是否为痤疮杆菌类型I、类型II或类型III的步骤；且
所述标记蛋白质是核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L23的组合、核糖体蛋白质L15与核糖体蛋白质L23的组合、或核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L15的组合，
其中，当用于判定所述被检测微生物为所述痤疮杆菌类型I时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19706.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19706.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7，
当用于判定所述被检测微生物为所述痤疮杆菌类型II时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15357.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15357.6，
当用于判定所述被检测微生物为所述痤疮杆菌类型III时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11181.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11181.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7。
4.根据权利要求3所述的识别方法，其中质谱上的所述标记蛋白质还包含二价离子。
5.一种微生物的识别方法，其特征在于包括：
步骤a，读取通过对被检测微生物进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
步骤b，根据所述m/z值，判定所述被检测微生物是否为痤疮杆菌类型I的种系型IA1或种系型IA2、或者种系型IB的步骤；且
所述标记蛋白质是核糖体蛋白质L13与抗毒素的组合，
其中，当用于判定为所述痤疮杆菌类型I的种系型IA1时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L13的峰值的m/z值为16167.6且源自所述抗毒素的峰值的m/z值为7034.6，
当用于判定为所述痤疮杆菌类型I的种系型IA2时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L13的峰值的m/z值为16167.6且源自所述抗毒素的峰值的m/z值并非7034.6，
当用于判定为所述痤疮杆菌类型I的种系型IB时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L13的峰值的m/z值为16153.5且源自所述抗毒素的峰值的m/z值并非7034.6。
6.根据权利要求5所述的识别方法，其中质谱上的所述标记蛋白质还包含二价离子。
7.一种微生物的识别方法，其特征在于包括：
步骤a，读取通过对包含微生物的试样进行质量分析所获得的质谱上的源自标记蛋白质的峰值的m/z值的步骤；以及
步骤b，根据所述m/z值，判定在所述试样中是否包含痤疮杆菌类型I、类型II或类型III的至少一种的步骤；且
在所述步骤b中，当在所述质谱上，关于核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L23的组合、核糖体蛋白质L15与核糖体蛋白质L23的组合、或核糖体蛋白质L6与核糖体蛋白质L15的组合，存在具有痤疮杆菌类型I、类型II及类型III中特有的变异时的m/z值的峰值的至少一个的情况下，判定在所述试样中包含痤疮杆菌类型I、类型II或类型III的至少一种，
其中，当用于判定所述试样中包含所述痤疮杆菌类型I时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19706.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19706.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7，
当用于判定所述试样中包含所述痤疮杆菌类型II时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15357.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11200.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15357.6，
当用于判定所述试样中包含所述痤疮杆菌类型III时，由质量分析所获得的质谱上的源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11181.0、源自所述核糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7且源自所述糖体蛋白质L23的峰值的m/z值为11181.0、或是源自所述核糖体蛋白质L6的峰值的m/z值为19678.6且源自所述糖体蛋白质L15的峰值的m/z值为15384.7。
8.一种记录介质，其记录有用于使计算机执行根据权利要求1至7中任一项所述的微生物的识别方法的各步骤的程序。
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