CN109154018A - 微生物的识别方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种选定并使用标记蛋白质的微生物的识别方法，该标记蛋白质对李斯特菌属的菌种的再现性良好，并能够迅速地识别李斯特菌属的菌种。本发明的微生物的识别方法，其特征在于，具有：对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；读取步骤，从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z；识别步骤，基于所述质荷比m/z对所述试样所含的微生物含有李斯特菌的哪一个菌种进行识别，使用17种核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、S9、L31以及S16中的至少一种作为所述标记蛋白质，特别是使用所述17种中的8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的至少一种作为所述标记蛋白质。

Description

微生物的识别方法
技术领域
本发明涉及利用了质量分析的微生物的识别方法。
背景技术
以往作为识别微生物的种类的方法之一，公知有基于DNA碱基序列的同源性分析，并被广泛地用于微生物的分类、鉴定(例如参照专利文献1)。在该方法中，首先从被检微生物中提取DNA并确定rRNA基因等在所有生物中以较高保存性存在的区域的DNA碱基序列。然后，使用该DNA碱基序列，对大量收录了已知微生物的DNA碱基序列的数据库进行检索，选出显示出与所述被检微生物的DNA碱基序列相似性较高的碱基序列。接下来，将该碱基序列所源自的物种判断为与所述被检微生物为相同物种或者近缘物种。
然而，在这样的利用了DNA碱基序列的方法中，由于从被检微生物中提取DNA以及确定碱基序列等需要较长的时间，所以存在难以迅速地进行微生物鉴定的问题。
于是近年来，基于对被检微生物进行质量分析从而得到的质谱图进行微生物鉴定的方法逐渐被使用。根据质量分析，由于能够使用极微量的微生物试样而在短时间内得到分析结果，并且也容易对多个被检体进行连续分析，所以能够简便且迅速地进行微生物鉴定。在该方法中，首先通过使用了MALDI-MS(基质辅助激光解吸离子化质量分析)等的软离子化法的质量分析装置，对包含从被检微生物提取的蛋白质的溶液或被检微生物的悬浮液等进行分析。另外“软”离子化法是指难以产生高分子量化合物的分解的离子化法。然后，通过将得到的质谱图与大量预先收录于数据库的已知微生物的质谱图进行对照，从而进行被检微生物的鉴定。由于这样的方法利用质谱图作为各微生物的特异的信息(即指纹)，所以被称为指纹图谱法。
然而，在根据使用了上述的质量分析的指纹法进行微生物的鉴定中，即便能够进行在属等级或者较远缘的种等级中的鉴定，但是一般难以进行近缘种间的识别或者比种更下位的分类等级即亚种、病原型、或者株等的等级中的识别。进而，在指纹图谱法中，出现在质谱上的各峰的每一个源自哪种蛋白质未被确定，从而在鉴定的理论依据以及可靠性方面存在技术问题。因此，为了解除该技术问题，开发出了如下的方法：利用大约一半的、对微生物菌体进行质量分析得到的峰的是源自核糖体蛋白质这一点，并将通过质量分析得到的峰的质荷比，与根据翻译了核糖体蛋白质基因的碱基序列信息的氨基酸序列而推测出的计算质量相关联，由此对作为该峰的来源的蛋白质种类进行归属(参照专利文献2、3)。根据该方法，使用质量分析而能够进行基于理论依据的可靠性高的微生物鉴定。
但是，由于根据微生物的分类等级(科、属、种、亚种、病原型、血清型、株等)的质量的不同，从而出现的峰不同，例如，为了再现性良好地进行病原型或株等级中的识别，需要选择能够用于作为鉴定对象的病原型或株等级中的识别的标记峰。例如作为对恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)以及它的类缘细胞进行鉴定、识别时的标记蛋白质，据报告能够利用23种的核糖体亚基蛋白质(L5、L13、L14、L15、L18、L19、L20、L22、L23、L24、L28、L30、L35、L36、S7、S8、S10、S13、S14、S17、S19、S20以及S21)(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-191922号公报
专利文献2：日本特开2007-316063号公报
专利文献3：日本特开2013-085517号公报
非专利文献
非专利文献1：List of prokaryotic names with standing in nomenclature，(检索日2015年9月18日)，网址<URL:http://www.bacterio.net/>
非专利文献2：BMC Genomics 2010年,11月,第688页
非专利文献3：JMM Case Reports,2014年,DOI10.1099/jmmcr.0.003103
非专利文献4：Microbes Infect 2007年,9月,第1236-1243页
非专利文献5：Int J med Microbiol,2011年,301期,第79-96页
非专利文献6：Appl Environ Micribiol,2008年,74期,第7629-7642页
非专利文献7：Int J Food Microbiol 2001年,65期:55？62
非专利文献8：J Clin Microbiol 2003年,41期:757？762
非专利文献9：PLoS Pathog 2008年,4:e1000146
非专利文献10：Vet Microbiol,2003年,92期,351？362.
非专利文献11：Appl Environ Micribiol,2008年,74期,第5402-5407页
非专利文献12：J Clin Microbiol.2012年,50期,第2702-2707页
非专利文献13：Int J Food Microbiol.2015年,202期,第1-9页
非专利文献14：J Clin Microbiol.2014年,52期,第2371-2379页
非专利文献15：J Clin Microbiol.2004年,42期,第3819-3822页
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，公知单核细胞增生李斯特菌(Listeria-monocytogenes，以下将“Listeria”省略成“L.”)为造成食物中毒的细菌的一种。单核细胞增生李斯特菌是属于革兰氏阳性菌的李斯特氏菌属的细菌，具有在低温(4℃)下的增殖能力以及抗盐性这样的特征。
目前为止发现有18个菌种的李斯特氏菌属(非专利文献1)，其中作为以往的菌种报道有关于从1960年代到1980年代发现的8种菌种(单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、格氏李斯特菌(L.grayi)、默氏李斯特菌(L.marthii)以及L.rocourtiae的大量见解(非专利文献2、3)。据报道，单核细胞增生李斯特菌以及伊氏李斯特菌对动物具有病原性，特别是单核细胞增生李斯特菌，经常经由食用肉或乳制品、蔬菜等身边的非加热熟食(即食食品)感染人类，并引起食物中毒的集体发生(爆发)。而且，若孕妇、新生儿、老年人以及艾滋、癌症、器官移植患者等的免疫缺陷者感染了单核细胞增生李斯特菌，则会导致有败血症或脑膜炎等严重症状的李斯特菌病，甚至可能会导致死亡。进而，近年来，还报告有英诺克李斯特菌的感染患者出现李斯特菌病的症状的例子(非专利文献3)。
单核细胞增生李斯特菌公知有13种血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7)，据报道集体发生的事例中，血清型4b最多，还包括血清型1/2b以及血清型1/2a(非专利文献4)。此外，单核细胞增生李斯特菌能够在遗传上分类为4个进化系统(谱系l、II、III以及IV)(非专利文献5)。谱系I以及II分别属于较多地从感染的人单离的血清型，具体地说谱系I属于血清型1/2b、3b、4b、4d、4e，但是谱系II属于1/2a、1/2c、3a、3c。另一方面，谱系III属于血清型4a、4c。谱系IV是近年来所提倡的分类，报道称存在血清型4a、4b、4c属于IV的情况(非专利文献6)。谱系III以及IV从人类分离出的例子较少，主要是从反刍动物检测出。
因此，李斯特菌中的单核细胞增生李斯特菌作为对人类造成危害的食物中毒细菌，需要在食品领域以及医疗领域进行管理，从而期望开发出其迅速的检测方法以及鉴定识别技术。
迄今为止，作为识别李斯特菌属以及单核细胞增生李斯特菌的血清型的方法，报道有脉冲场凝胶电泳法(非专利文献7)、多位点序列分型法(非专利文献8、9)、微阵列法(非专利文献10)等。然而，这些方法存在需要繁琐的操作，并花费时间的问题。
另一方面，近年来在临床领域以及食品领域，使用了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的微生物鉴定技术在急速地普及。这是基于使用极微量的微生物试样得到的质谱图进行微生物鉴定的方法，能够在短时间内得到分析结果。并且，由于容易对多个被检体进行连续分析，所以能够简便且迅速地进行微生物鉴定。
为此，迄今为止多个研究组尝试了使用MALDI-TOF MS识别李斯特菌(非专利文献11～14)。例如在非专利文献10中，报告了将被检测出的所有的质量峰与现有数据库进行模式匹配，通过计算其分数，识别单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、伊氏李斯特菌以及西尔李斯特菌。此外，将检测的确定的质量峰(质荷比[m/z]5500以及11179)作为指标(生物标记物),对单核细胞增生李斯特菌的血清型4a与血清型4c进行了区别。
另一方面，根据非专利文献12，在属等级中对李斯特菌属的6种的菌种进行识别存在界限，而仅能够对格氏李斯特菌进行种的鉴定。此外，在非专利文献14中，报告了将5个检测质量的峰(m/z5594.85，6184.39，11871.31，5601.21，11199.33)作为生物标记，而将单核细胞增生李斯特菌识别为血清型1/2a与血清型1/2b以及血清型4b的组。
像这样地，虽然有多篇有关根据MALDI-TOF MS对李斯特菌的菌种以及单核细胞增生李斯特菌的血清型进行识别的报告，但是质谱上出现的各峰或生物标记峰的每一个源自哪种蛋白质并没有被限定，从而缺乏鉴定识别的理论根据或可靠性。此外，根据研究组的不同鉴定识别的结果不同，无法得到统一的见解。即，现状是还未确定能够优选地用于李斯特菌的菌种以及血清型的识别的、可靠性高的标记蛋白质。
本发明是鉴于上述内容而完成的，其目的在于，提供一种选定并使用标记蛋白质的微生物的识别方法，该标记蛋白质对李斯特菌属的菌种的再现性良好，并能够迅速地识别李斯特菌属的菌种。
用于解决上述技术问题的方案
本发明人不断锐意研究的结果，发现使用17种的核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、S9、L31以及S16中的至少一种作为用于根据质量分析对试样所含的李斯特菌进行识别的标记蛋白质，由此能够对李斯特菌进行识别，特别是通过使用这些中的8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的至少一种，再现性良好并且能够迅速地识别李斯特菌，从而完成了本发明。
即，为了解决上述技术问题而完成的本发明的微生物的识别方法，其特征在于，具有：
a)对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；
b)读取步骤，从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z；
c)识别步骤，基于所述质荷比m/z识别所述试样所含的微生物含有李斯特菌的哪一个菌种，
使用17种的核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、S9、L31以及S16中的至少一种作为所述标记蛋白质。
特别地，在上述微生物的识别方法中，优选使用所述17种核糖体蛋白质中的8种的核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的至少一种。
上述微生物的识别方法，优选作为识别微生物所含的李斯特菌的菌种为单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、格氏李斯特菌(L.grayi)以及L.rocourtiae的任一种的方法。
具体地说，所述识别步骤，至少基于以下质荷比，对所述微生物是否含有单核细胞增生李斯特菌进行识别：分别源自核糖体蛋白质L15、S11以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、L18以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质S11、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L15以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、S11以及S9的峰的质荷比m/z。
在识别出所述微生物中含有单核细胞增生李斯特菌时，所述识别步骤，进而基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z、与源自核糖体蛋白质L24以及L6的至少一种的峰的质荷比m/z，对该单核细胞增生李斯特菌的谱系进行识别。
此外，所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S16的峰的质荷比、或者分别源自核糖体蛋白质L15以及L31的峰的质荷比，识别所述微生物中是否含有英诺克李斯特菌。并且，在识别出所述微生物中含有英诺克李斯特菌时，所述识别步骤，进而至少基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z，对该英诺克李斯特菌的菌株进行确定。
此外，所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有核糖体蛋白质的质荷比的图形与英诺克李斯特菌的模式菌株(标准株)相似的组的菌株。
进而，所述识别步骤至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，将所述微生物所含有的菌株，分类成核糖体蛋白质的质荷比的图形与英诺克李斯特菌的模式菌株相似的组或者非相似的组。
此外，所述识别步骤至少基于源自核糖体蛋白质S9以及L31的峰的质荷比，对所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌进行识别。
进而，在识别出所述微生物中含有伊氏李斯特菌时，所述识别步骤进一步地、至少基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z、或者源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z，对该伊氏李斯特菌的亚种进行识别。
接着，所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伊氏亚种(L.ivanovii ivanovii)，并至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S11、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S11、L31的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伦敦亚种(L.ivanovii londiniensis)。
此外，所述识别步骤，基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z与源自L18、S11中的至少一种的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有西尔李斯特菌进行识别。
在识别出所述微生物中含有西尔李斯特菌时，所述识别步骤，还至少基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z，对该西尔李斯特菌的菌株进行确定。
所述识别步骤至少基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z、以及源自核糖体蛋白质L24、L18、L15、S11、L31中的至少一种的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有核糖体蛋白质的质荷比的图形与西尔李斯特菌的模式菌株相似的组的菌株进行识别。
所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质S9、L18的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质S9、S11的峰的质荷比m/z，将所述微生物所含的菌株，分类成核糖体蛋白质的质荷比的图形与西尔李斯特菌的模式菌株相似的组或者非相似的组。
进而，所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S11的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有威尔斯李斯特菌进行识别。
此外，所述识别步骤，基于源自核糖体蛋白质L6、L15、S11、S9、L31、S16中的至少1种的峰的质荷比m/z，对所述微生物中所含的李斯特菌的菌种是格氏李斯特菌还是罗氏李斯特菌进行识别。
此外，在上述的本发明的微生物的识别方法中，
所述识别步骤，使用至少将分别源自核糖体蛋白质L24、L18、S9、L31的峰的质荷比m/z与源自标记蛋白质L6、L15、S11的任一种的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L18、S9、S16的峰的质荷比与源自标记蛋白质L6、L15、S11的任一种的峰的质荷比m/z作为指标的聚类解析，可以识别所述试样所含微生物包含李斯特菌的何种菌种，特别是若使用将源自所有8种标记蛋白质(L24、L18、S9、L31、S16、L6、L15、S11)的峰的质荷比m/z的全部作为指标的聚类解析，能够精度良好地识别所述试样所含的微生物是李斯特菌的何种菌种。
在这种情况下，优选为，还具有制作表示根据所述聚类解析的识别结果的树状图的步骤。
发明效果
在上述本发明的微生物的识别方法中，由于使用了在李斯特菌属的菌种中显示出特有的变异的核糖体蛋白质作为标记蛋白质，所以对李斯特菌属的菌种的再现性良好，并且能够迅速地识别。
此外，使用在李斯特菌属的菌种中显示出特有的变异的核糖体蛋白质作为标记蛋白质使用，将质谱上的来自标记蛋白质的峰的质荷比m/z作为指标进行聚类解析，由此能够一并地进行多个试样所含的李斯特菌属的细菌的识别。
附图说明
图1是示出本发明的微生物的识别方法所采用的微生物识别系统的要部的构成图。
图2是示出本发明的微生物的识别方法的顺序的一例的流程图。
图3是示出在实施例中使用的李斯特菌的菌种名以及菌株名的一览的图。
图4是示出在实施例中使用的引物的一览的图。
图5是示出各氨基酸的质量的图。
图6是示出在实施例中使用的单核细胞增生李斯特菌的菌株中各蛋白质的理论质量值的一览的图。
图7A是示出在是实例中使用的菌株的各核糖体蛋白质的实际测量值归属的一览的图。
图7B是示出图7A中的归属编号与各核糖体蛋白质的理论质量值的关系的图。
图8是示出在实施例中使用的李斯特菌属的种的各蛋白质的理论质量值的一览的图。
图9A是通过MALDI-TOF MS测量得到的图表(其1)。
图9B是通过MALDI-TOF MS测量得到的图表(其2)。
图10是基于SARAMIS的解析结果。
图11A是通过MALDI-TOF MS测量得到的峰图表(其1)。
图11B是通过MALDI-TOF MS测量得到的峰图表(其2)。
图12A是8种的核糖体蛋白质的实际测量值的归属结果。
图12B是示出了图12A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图13A是使用8种的核糖体蛋白质制作而成的树状图。
图13B是使用5种的核糖体蛋白质制作而成的树状图。
具体实施方式
以下对本发明的微生物的识别方法的具体实施方式进行说明。
图1是本发明的微生物的识别方法所采用的微生物识别系统的整体图。该微生物识别系统，大致上由质量分析部10与微生物辨别部20构成。质量分析部10具备：离子化部11，通过基质辅助激光解吸离子化法(MALDI)使试样中的分子或原子离子化；飞行时间型质量分离器(TOF)12，根据质荷比对从离子化部11射出的各种离子进行分离。
TOF12具备：引出电极13，将离子从离子化部11引出并导入至TOF12内的离子飞行空间；检测器14，对在离子飞行空间中被质量分离的离子进行检测。
微生物辨别部20的实体是工作站或个人计算机等的计算机，中央运算处理装置即CPU(中央处理器)21与存储器22、由LCD(液晶显示屏)等构成的显示部23、键盘或鼠标等构成的输入部24、由硬盘或SSD(固态硬盘)等的大容量存储装置构成的存储部30相互地连接。在存储部30中存储了OS(操作系统)31、质谱制作程序32、属/种确定程序33、以及下位分类确定程序35(本发明的程序)，并且容纳有第1数据库34以及第2数据库36。微生物辨别部20还具备接口(I/F)25，并通过该接口25经由网线NW(或者无线局域网)与质量分析部10连接，所述接口25用于管理与外部装置的直接连接或经由LAN(局域网)与外部装置等的连接。
在图1中，示出了与下位分类确定程序35有关的质谱获取部37、m/z读取部38、下位分类判断部39、聚类解析部40以及树状图(系统图)制作部41。这些均基本上是通过CPU21执行下位分类决定程序35而在软件上实现的功能机构。另外，下位分类确定程序35并不需要一定是单个的程序，也可以是例如编入了用于控制属/种确定程序33或者质量分析部10的程序的一部分的功能，而无论其形态如何。另外，例如能够利用根据以往的指纹图谱法进行微生物鉴定的程序等作为属/种确定程序33。
此外，在图1中，虽然构成为在用户所操作的终端搭载质谱制作程序32、属/种确定程序33/下位分类确定程序35、第1数据库34以及第2数据库36，但是也可以构成为，将这些程序或者数据库中的至少一部分或者全部设置于通过计算机网络与所述终端连接的其他装置内，按照来自所述终端的指示，执行设置于所述其他装置内的程序的处理以及/或者数据库的访问。
在存储部30的第1数据库34中，记录有大量与已知微生物有关的质量列表。该质量列表列举了对某种微生物细胞进行质量分析时检测出的离子的质荷比，除了该质荷比的信息以外，至少包括所述微生物细胞所属的分类群(科、属、种等)的信息(分类信息)。这样的质量列表优选是基于以如下方式得到的数据(实测数据)而制作的：预先通过与所述质量分析部10相同的离子化法以及质量分离法对各种微生物细胞实际地进行质量分析而得到的数据。
根据所述实测数据制作质量列表时，首先从作为所述实测数据而获取的质谱中提取出现在规定的质荷比范围的峰。这时，通过使所述质荷比的范围为2，000～35，000左右，能够主要提取源自蛋白质的峰。此外，通过仅提取峰的高度(相对强度)为规定的阈值以上的峰，能够排除不期望的峰(噪声)。另外，由于在细胞内大量地发现核糖体蛋白质组，所以通过适当地设定所述阈值，能够使质量列表所记载的质荷比的大部分为来源于核糖体蛋白质。并且，按照细胞将通过以上内容所提取的峰的质荷比(m/z)列表化，在添加了所述分类情报之后，记录在第1数据库34。另外，为了抑制培养条件引起的基因发现的偏差，优选为，预先将用于实测数据的采集的各微生物细胞的培养条件标准化。
在存储部30的第2数据库36中，记录了有关标记蛋白质的信息，该标记蛋白质用于在比由属/种确定程序33所能识别的分类等级更下位的等级中，对已知微生物进行识别。即，记录了与进行如下识别有关的标记蛋白质的信息：在通过属/种确定程序33能够识别已知微生物的属的情况下，在比属下位的分类(种、亚种、病原型、血清型、株等)中进行识别，在能够识别已知微生物的种的情况下，在比种下位的分类(亚种、病原型、血清型、株等)等级中进行识别。作为有关该标记蛋白质的信息，至少包括已知微生物中该标记蛋白质的质荷比(m/z)的信息。在本实施方式中的第2数据库36中，至少存储了以下8种的核糖体蛋白质的质荷比的值：L24的质荷比的值(m/z 11180.22、11194.25、11254.35、11558.65)、L6的质荷比的值(m/z 19270.04、19256.01、19097.81、19371.01)、L18的质荷比的值(m/z13096.86、13110.89、13082.84、13066.84)、L15的质荷比的值(m/z 15782.02、15797.08、15811.1、15743.01、15601.77)、S11的质荷比的值(m/z 13655.65、13674.66、13683.67、13591.66、13591.67)、S9+Ac的质荷比的值(m/z 14283.40、14359.50、14302.45、14372.55、14330.55)、L31typeB的质荷比的值(m/z 9259.36、9290.34、9271.3、9327.44)、S16的质荷比的值(m/z10234.94、10252.97、10003.54、10230.88)，作为与用于识别被检微生物为李斯特菌属的7种(单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、L.rocourtiae以及格氏李斯特菌(L.grayi))的某一种的标记蛋白质有关的信息。下位分类确定程序35，至少使用这8种核糖体蛋白质的1种来识别被检微生物是李斯特菌的7种菌种的哪一种。
具体地说，至少基于以下的质荷比识别被检微生物是否含有单核细胞增生李斯特菌：分别源自核糖体蛋白质L15、S11以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、L18以及L9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质S11、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L15以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、S11以及S9的峰的质荷比m/z。
此外，至少基于源自核糖体蛋白质S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15以及L31的峰的质荷比m/z，识别所述被检微生物中是否含有英诺克李斯特菌。
进而，基于源自核糖体蛋白质S9以及L31的峰的质荷比m/z，识别所述被检微生物中是否含有伊氏李斯特菌。
此外，还基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z与源自源自核糖体蛋白质L18、S11中的至少一种的峰的质荷比m/z，识别所述被检微生物中是否含有西尔李斯特菌。
此外，至少基于源自核糖体蛋白质S11的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9的峰的质荷比m/z，识别所述被检微生物中是否含有威尔斯李斯特菌。
像这样地，由于通过将上述8种的核糖体蛋白质单独地、或者将多个进行组合，能够作为用于识别李斯特菌属的菌种的标记蛋白质而利用，所以质荷比的值与菌种的信息一起被存储于第2数据库36。
另外，在识别出所述被检微生物中包含单核细胞增生李斯特菌时，至少基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z、与源自核糖体蛋白质L24以及L6的一种的峰的质荷比m/z，能够识别该单核细胞增生李斯特菌的谱系。像这样地，也能够利用核糖体蛋白质S9、L24、L6作为用于识别单核细胞增生李斯特菌的系统(谱系)的标记蛋白质，并且还能够利用核糖体蛋白质L24、L18、L15、S11、S9、L31作为用于识别单核细胞增生李斯特菌的血清型的标记蛋白质。因此，这些核糖体蛋白质的质荷比的值，作为与用于识别单核细胞增生李斯特菌的系统以及血清型的标记蛋白质有关的信息，也被存储在第2数据库36。
此外，在识别出被检微生物中含有英诺克李斯特菌时，至少基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z，能够对该英诺克李斯特菌的菌株进行确定。
进而，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，能够识别被检微生物中是否含有核糖体蛋白质的质荷比的图形(图谱)与英诺克李斯特菌的模式菌株(标准株)相似的组的菌株(例如英诺克李斯特菌ATCC33090T(L.innocuaATCC33090T))。
进而，至少能够基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，将被检微生物所含的菌株，分类成核糖体蛋白质的质荷比的图形与英诺克李斯特菌的模式菌株相似的组或者非相似的组。
因此，核糖体蛋白质L18、S16、L31的质荷比的值作为与用于识别英诺克李斯特菌的标记蛋白质有关的信息，也被存储在第2数据库36。
此外，在识别出所述微生物中含有伊氏李斯特菌时，基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z以及源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z的至少一种，能够识别该伊氏李斯特菌的亚种。
进而，至少基于源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，能够识别被检微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伊氏亚种(L.ivanoviiivanovii)。
此外，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S11、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S11、L31的峰的质荷比m/z，能够识别被检微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伦敦亚种(L.ivanoviilondiniensis)。
因此，核糖体蛋白质L18、S9、L31、L15、S11的质荷比的值作为与用于识别伊氏李斯特菌的亚种的标记蛋白质有关的信息，也被存储在第2数据库36。
此外，基于源自核糖体蛋白质L6、L15、S11、S9、L31、S16中的至少1种的峰的质荷比m/z，能够识别被检微生物中所含的李斯特菌的菌种是格氏李斯特菌还是罗氏李斯特菌。
因此，核糖体蛋白质L6、L15、S11、S9、L31、S16的质荷比的值作为与用于识别是格氏李斯特菌还是罗氏李斯特菌的标记蛋白质有关的信息，被存储在第2数据库36。
上述的8种的核糖体蛋白质能够用于李斯特菌属的菌种的识别、单核细胞增生李斯特菌的谱系或血清型的识别、英诺克李斯特菌的菌株的确定或菌株的分组、伊氏李斯特菌的亚种的识别等，是根据如下的结果导出的：按照李斯特菌属的菌种或者按照菌株求出8种核糖体蛋白质的质荷比，并使各菌株与各菌种的8种核糖体蛋白质的质荷比进行归属。例如关于英诺克李斯特菌，将作为模式菌株的英诺克李斯特菌ATCC33090T(L.innocuaATCC33090T)的8种的核糖体蛋白质的质荷比，与非模式菌株的英诺克李斯特菌GTC02960(L.innocuaGTC02960)的8种的核糖体蛋白质的质荷比进行比较，由此选择了对菌株的分组有用的核糖体蛋白质(详细内容参照下述的实施例以及示出8种的核糖体蛋白质的理论质量值的图8、示出基于8种的核糖体蛋白质的实测值的归属结果的图12A等)。
作为存储在第2数据库36的标记蛋白质的质荷比的值，优选为，将各标记蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列而由此求出的计算质量与通过实测检测出的质荷比进行比较从而筛选。另外，标记蛋白质的碱基序列，除了由序列决定以外，还能够使用从公共的数据库例如从NCBI(国立生物工程信息中心：：National Center for BiotechnologyInformation)的数据库等获取的数据。优选为，在根据所述氨基酸序列求出计算质量时，作为翻译后的修饰考虑将N-末端甲硫氨酸残基切断。具体地说，在倒数第2个氨基酸残基为Gly、Ala、Ser、Pro、Val、Thr或者Cys的情况下，基于N-末端甲硫氨酸被切断后的氨基酸序列而计算出所述理论值。此外，由于通过MALDI-TOF MS实际观测到的是附加了质子的分子，所以优选为也加入该质子的部分从而求出所述计算质量(即利用MALDI-TOF MS对各蛋白质进行分析的情况下得到的离子的质荷比的理论值)。
另外，也可以是，存储于第2数据库36的与标记蛋白质有关的信息的一部分或者全部存储于第1数据库34。
一边参照图2所示的流程图，一边对使用了本实施方式的微生物识别系统的李斯特菌属的菌种的识别顺序进行说明。
首先，用户对含有被检微生物的构成成分的试样进行制备，将其放在质量分析部10从而执行质量分析。此时，作为所述试样，除了能够使用细胞提取物或者将来自细胞提取物的核糖体蛋白质等的细胞构成成分进行提纯后得到的物质以外，还能够原样地使用菌体或细胞悬浮液。
质谱制作程序32中，经由接口25获取从质量分析部10的检测器14得到的检测信号，基于该检测信号制作被检微生物的质谱(步骤S101)。
接下来，属/种确定程序33，将所述被检微生物的质谱与收录在第1数据库34的已知微生物的质量列表进行对照，提取具有与被检微生物的质谱类似的质荷比图形的已知微生物的质量列表，例如较多地含有在规定的误差范围内与被检微生物的质谱中的各峰一致的峰的质量列表(步骤S102)。接着，属/种确定程序33与在步骤S102中提取的质量列表相对应地参照存储于第1数据库34的分类信息，由此对与该质量列表对应的已知微生物的分类(属或者种)进行确定(步骤S103)。然后，在被检微生物不是李斯特菌属的细菌的情况，或者被检微生物是李斯特菌属的细菌，并且其菌种已被确定的情况(在步骤S104中为否的情况)下，将该分类作为被检微生物的分类输出至显示部23(步骤S112)，从而结束识别处理。另一方面，在所述物种是属于李斯特菌属的细菌，并且其菌种不明的情况(在步骤S104中为是的情况)下，接着进入根据下位分类确定程序35的识别处理。另外，在预先利用其他的方法，判断试样中含有李斯特菌的情况下，不利用使用了质谱的属/种确定程序，而进入下位分类确定程序35即可。
在下位分类确定程序35中，首先从第2数据库36中分别读出下位分类判断部39为标记蛋白质即8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的质荷比的值(步骤S105)。接着质谱获取部37获取在步骤S101中制作的被检微生物的质谱。然后，m/z读取部38，在该质谱上，将与所述的标记蛋白质相关联并出现在第2数据库36所存储的质荷比范围的峰，作为与各标记蛋白质相对应的峰选出，并读取其质荷比(步骤S106)。然后，执行将读取的质荷比作为指标的聚类解析。具体地说，下位分类判断部39，将该质荷比与从所述第2数据库36读出的标记蛋白质的质荷比的值进行比较，根据该读取的质荷比，确定蛋白质的归属(步骤S107)。然后，基于确定的归属执行聚类解析从而判断被检微生物的种(步骤S108),将该内容作为被检微生物的识别结果输出至显示部23(步骤S109)。
以上，虽然一边参照附图一边对本发明的具体实施方式进行了说明，但是本发明并不限于上述实施方式，允许在本发明的主旨的范围内进行适当变更。
例如，在上述实施方式中，为了便于说明，虽然在进行了被检微生物为李斯特菌属的哪一种的判断之后，对单核细胞增生李斯特菌的血清型或系统进行了识别，但是也可以同时地进行。此外，也可以省略对单核细胞增生李斯特菌的菌种的血清型或系统的识别。
实施例
以下，对本发明中的标记蛋白质的选定顺序以为了证实本发明的效果而进行的实验进行说明。
(1)使用菌株以及培养用的培养基
为了构建蛋白质质量数据库，使用了14株单核细胞增生李斯特菌、2株英诺克李斯特菌、2株伊氏李斯特菌、2株西尔李斯特菌、3株威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌以及罗氏李斯特菌分别各1株，合计24株菌株(图3)。可以从日本国家生物资源项目(日本，岐阜市，岐阜大学，病原菌部门，NBPR)、美国模式培养物积存库(美国，马里兰州，罗克维尔，ATCC，American Type Culture Collection)、日本微生物保藏中心(日本，筑波市，独立行政法人理化学研究所生物资源中心，JCM，Japan Collection of Microorganisms)以及独立行政法人制品技术评价基础机构生物遗传资源中心(日本，木更津市，NBRC)得到这些菌株。在培养中，使用了脑心浸出液肉汤液体培养基(日本，东京，株式会社日本BD(Becton·Dickinson)株式会社)或者琼脂培养基。此外，图3所示的单核细胞增生李斯特菌的血清型(serotype)是通过使用了李斯特菌分型用免疫血清“生研”(日本，东京，株式会社电化生研株式会社)的多重PCR(多重聚合酶链反应)法(参照非专利文献15)而确定的。
(2)DNA的解析
通过基于基因组解读株的对象区域的上游以及下游的共有序列而设计的引物，并通过DNA测序确定被S10-spc-alpha操纵子编码的核糖体蛋白质、以及生物标记候选的核糖体蛋白质基因的DNA碱基序列。具体地说，通过常规方法从图3所示的李斯特菌属的各种菌株中提取基因组，将这些作为模板，通过使用了高准确性(高保真度)DNA聚合酶即KOD plus(日本，大阪，东洋纺)的PCR(聚合酶链反应)对核糖体蛋白质基因的区域(～5kbp)以及生物标记蛋白质的领域进行了扩增。将得到的PCR产物进行提纯，并将其用做DNA测序的模板。使用Big Dye ver.3.1循环测序试剂盒(加利福尼亚州，福斯特城，美国应用生物系统公司)进行了DNA测序。另外，在图4中示出用于PCR以及DNA测序的引物。
此外，根据对由以上确定的核糖体蛋白质基因的DNA碱基序列进行翻译得到的氨基酸序列与图5所示的各氨基酸序列的质量，计算出核糖体蛋白质的的质荷比，并将其作为理论质量值。
(3)通过MALDI-TOF MS进行的测量
从脑心浸出液肉汤液体培养基或者琼脂培养基回收菌体，使大约3个菌落部分的菌体悬浮于0.5ml的70％的乙醇。将使其以10000rpm离心2分钟而得到的菌体粒在减压干燥器中进行五分钟的干燥而使乙醇蒸发。在干燥后的菌体粒中加入10μL的35％甲酸并搅拌，将其作为分析样品。将1.5μL的该分析样品加入至10μL的芥子酸基质剂(在50v/v％乙腈、1v/v％三氟乙酸溶液中含20mg/mL的芥子酸(日本，大阪，和光纯药工业株式会社)而成的溶液)并充分混合。接着，将1.5μL的该混合液滴到样品板上，使其自然干燥。在MALDI-TOF MS测量中使用AXIMA微生物鉴定系统(日本，京都市，株式会社岛津制作所)，以台式线性模式、2000m/z～35000m/z的质谱范围对试样进行了检测。将以上述的方法计算出的理论质量值，在容许误差500ppm的范围内与测量的质荷比进行匹配，并实施了适当的修正。另外上述AXIMA微生物鉴定系统的校正中，使用大肠杆菌DH5α菌株。
(4)用于单核细胞增生李斯特菌的识别的蛋白质量数据库的构建
对于上述的14株单核细胞增生李斯特菌，将上述的核糖体蛋白质的理论质量值与通过MALDI-TOF MS测量得到的峰图表进行对照，确认了关于实际能够检测出的核糖体蛋白质，其理论质量值与实测值没有差异。接下来，对于由S10-spc-alpha操纵子编码的核糖体蛋白质以及其他的生物标记候选的核糖体蛋白质，对与单核细胞增生李斯特菌的菌株或者血清型与质荷比的关系进行了调查。其结果示出在图6。另外，由于已知在核糖体蛋白质S9中修饰有乙酰基(COCH3)，所以在根据基因的DNA序列计出的质量值上附加上乙酰基(S9+Ac)的质量值作为理论质量值。
关于上述的14株单核细胞增生李斯特菌，在图6中示出了由S10-spc-alpha操纵子编码的核糖体蛋白质、以及其他的生物标记候选的核糖体蛋白质的理论质量值(质荷比(m/z))。此外，分别将血清型1/2b、3b、4b、4d以及4e分类为谱系I,血清型1/2a、1/2c、3a以及3c分类为谱系II，血清型4a分类为谱系III。此外，图6所示的〇、×、△分别表示在AXIMA微生物鉴定系统的缺省处理条件(阈值偏移：0.015mV，阈值响应：1.200)下进行峰处理的结果。即〇表示了在理论质量值与容许误差500ppm内检测出了峰，×表示为存在未检测出峰的情况。此外，△表示了虽然检测出了峰，但是与其他菌株或者其他血清型的理论质量值的差较小，或者与其他核糖体蛋白质的峰的差在500ppm以内。
从图6中得知，由S10-spc-alpha操纵子编码的核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13以及S11、和该操纵子以外的核糖体蛋白质L10、L21、L13以及S9+Ac共计15种，在用于测量的单核细胞增生李斯特菌的一部分的菌株中，理论质量值与其他的菌株不同。该内容启示了这些15种的核糖体蛋白质，是能够使用于单核细胞增生李斯特菌的菌株或者血清型的识别的标记蛋白质。将这些15种的核糖体蛋白质的各菌株中的DNA碱基序列表示为序列表的序列编号1～240。与各序列编号对应的序列的概要如下所述。
关于单核细胞增生李斯特菌的14个菌株(ATCC15313T、JCM 2873、JCM 7671、JCM7672、JCM 7673、JCM 7674、JCM 7675、JCM 7676、JCM7677、JCM 7678、JCM 7680、JCM 7683、ATCC51772、ATCC19115)以及西尔李斯特菌的2个菌株(JCM 7679、JCM7682)中的DNA碱基序列，如下所示。
序列编号1～16：上述16个菌株中的L3的DNA碱基序列。
序列编号17～32：上述16个菌株中的L4的DNA碱基序列。
序列编号33～48：上述16个菌株中的L23的DNA碱基序列。
序列编号49～64：上述16个菌株中的L2的DNA碱基序列。
序列编号65～80：上述16个菌株中的L24的DNA碱基序列。
序列编号81～96：上述16个菌株中的L6的DNA碱基序列。
序列编号97～112：上述16个菌株中的L18的DNA碱基序列。
序列编号113～128：上述16个菌株中的S5的DNA碱基序列。
序列编号129～144：上述16个菌株中的L15的DNA碱基序列。
序列编号145～160：上述16个菌株中的S13的DNA碱基序列。
序列编号161～176：上述16个菌株中的S11的DNA碱基序列。
序列编号177～192：上述16个菌株中的L10的DNA碱基序列。
序列编号193～208：上述16个菌株中的L21的DNA碱基序列。
序列编号209～224：上述16个菌株中的L13的DNA碱基序列。
序列编号225～240：上述16个菌株中的S9的DNA碱基序列。
然而，上述15种的核糖体蛋白质中L3、L4、L23、L2、L10以及L21，存在1个或者多个与其他菌株的理论质量值的差为500ppm以上的菌株，虽然能够考虑将其作为用于该菌株的识别的生物标记的候选，但是由于峰形状不清楚或者峰强度不充分而无法检测到峰，所以被认为不适合作为稳定的生物标记。
此外，核糖体蛋白质S5以及L13,虽然能够在MALDI-TOF MS测量中检测到峰，但是由于与其他菌株的理论质量值的差为500ppm以下，所以不适合作为生物标记。进而，S13(m/z 13578.69或13552.65)由于与其他核糖体蛋白质L20(m/z 13552.08)的峰重叠从而无法区分两个峰，所以果然被认为不适合作为生物标记。
另一方面，L24、L6、L18、L15、S11以及S9+Ac共计6种的核糖体蛋白质，由于不论对哪种菌株都能够稳定地检测，而且与其他菌株的理论质量值的差为500ppm以上，所以认为其作为生物标记物是有用的。因此，在本实施例中，将这些6种的核糖体蛋白质，用作在MALDI-TOF MS测量中用于识别单核细胞增生李斯特菌的血清型或菌株(或者谱系)的生物标记。
(5)用于识别李斯特菌属的种的质量数据库的构建
由于显示出对单核细胞增生李斯特菌的血清型或菌株的识别有用的6种的生物标记L24、L6、L18、L15、S11以及S9+Ac，在MALDI-TOF MS测量中，在所有单核细胞增生李斯特菌的菌株中都能被稳定地检测出，所以我们预测，对于李斯特菌的异种检体，也同样地检查出这些蛋白质的峰的可能性较高。
因此，对于李斯特菌中的能够从公共的分销商得到的格氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、罗氏李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌的6种的10个菌株，通过上述方法计算出上述6种的标记蛋白质的理论质量值。若对于这10个菌株进行了MALDI-TOF MS测量，则如预测的那样，稳定地检测出了上述6种的蛋白质峰。并且此外得知，除了上述6种的生物标记以外，作为明确的质量峰而被检测出的核糖体蛋白质L31typeB以及S16，根据李斯特菌属的种的不同，而显示出特有的峰质量。因此，认为这2种的核糖体蛋白质也是能够用于李斯特菌属的种的识别的生物标记，对于除了上述6种的核糖体蛋白质(L24、L6、L18、L15、S11以及S9)以外、还含有L31typeB(m/z 9259.36,9290.34,9327.44或者9271.3)以及S16(m/z 10234.94,10252.97,10230.88或者10003.54)的8种核糖体蛋白质，制作了用于识别李斯特菌属的种的理论质量值的表(图8)。另外，这8种的核糖体蛋白质不仅能够用于李斯特菌属的种的识别，当然还能够用于单核细胞增生李斯特菌的血清型的识别。
另外，格氏李斯特菌的核糖体蛋白质S11中第56个氨基酸特异地变化为赖氨酸，进而，在MALDI-TOF MS测量的结果中在附加了甲基(CH3)的质量的位置上观察到了质量峰。通过以上内容，将格氏李斯特菌的S11作为被甲基化的物质从而计算出理论质量值。此外，在罗氏李斯特菌的S11的、在m/z上比理论质量值大约大17的位置观测到了峰，因此加上了17的数值作为理论质量值。进而，关于S16，从基因组解读株的序列信息中计算出理论值，确认了与此次实测的菌株的测量值没有差异。此外，在单核细胞增生李斯特菌的S16中，虽然记录了2个模式的DNA序列，但是氨基酸序列是一致的。
将根据以上内容求出的上述8种核糖体蛋白质的6种8个菌株中的DNA碱基序列示出为序列表的序列编号241～304。与各序列编号对应的序列的概要如下所示。
序列编号241～248：英诺克李斯特菌的菌株ATCC 33090T中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。菌株ATCC33090T是英诺克李斯特菌的模式菌株(标准菌株)。
序列编号249～256：英诺克李斯特菌的菌株GTC02960中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号257～264：伊氏李斯特菌伊氏亚种的菌株JCM7681中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号265～272：伊氏李斯特菌伦敦亚种的菌株ATCC44954中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号273～280：西尔李斯特菌的菌株ATCC35967T中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号281～288：威尔斯李斯特菌的菌株GTC02963中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号289～296：罗氏李斯特菌的菌株GTC16429T中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
序列编号297～304：格氏李斯特菌的菌株ATCC19120T中的L24、L6、L18、L15、S11、S9+Ac、L31typeB、S16的DNA碱基序列。
(6)李斯特菌属的菌种的鉴定
使用SARAMIS(商标、质谱档案与微生物鉴定系统)并根据指纹图案法对蛋白质的质量的模式进行解析，确认了所有的菌株都是李斯特菌属的细菌。接下来，将各菌株的质谱上的峰的质荷比的、与未变异的生物标记蛋白质的质荷比一致的为“1”，不一致的为“2”～“5”(2～5表示彼此相互的质荷比)，将不存在与生物标记蛋白质对应的峰作为“0”，并制作了文件数据。将该数据导入至PAST软件(挪威，奥斯陆大学，自然史博物馆)，使用木村算法通过邻近结合法进行了聚类解析。进而使用FigTree ver.1.4.0软件制作系统发生树(图13A)。其结果是，如图13A清楚地所示，李斯特菌属的7个菌种被正确地分类，并且，单核细胞增生李斯特菌按照系统(谱系)被正确地分类。
(7)单核细胞增生李斯特菌菌株或者血清型、系统(谱系)的鉴定
将通过MALDI-TOF MS测量得到的峰的质荷比，与上述6种核糖体蛋白质的理论质量值进行关联，由此对该峰所来源的蛋白质的种类的归属进行解析，并对单核细胞增生李斯特菌的菌株进行了鉴定。在对蛋白质的种类的归属的解析中，开发并使用了基于S10-GERMS(S10-spcα操纵子基因编码核糖体蛋白质质谱)法(参照专利文献3)对细菌进行识别的软件。
首先，起动上述软件，记录6种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11以及S9+Ac的每个菌株的理论质量值(核糖体蛋白质L24的质荷比的值(m/z 11180.22、11194.25、11254.35)、L6的质荷比的值(m/z19270.08(19270.80)、19256.01)、L18的质荷比的值(m/z13096.86、13110.89)、L15的质荷比的值(m/z 15782.02、15797.08)、S11的质荷比的值(m/z13655.65、13674.66)、以及S9+Ac的质荷比的值(m/z14283.40、14359.50、14302.45)。另外，关于质量差为500ppm以下的L6的2个理论质量值m/z19270.08与19270.04，由于认为不能对两者进行区分，所以作为m/z19270.08进行了记录。
接着，对于各菌株，将通过MALDI-TOF MS测量得到的质谱数据进行解析，调查与生物标记对应的峰是否被正确地归属到被记录的生物标记的理论质量值。其结果是，如图7A所示，对于所有的菌株，所有的与生物标记对应的峰都被归属到记录的生物标记的理论质量值。图7B示出了6种的核糖体蛋白质的各质荷比与图7A所示的归属编号1～3之间的关系。将归属模式分类为组A～D并与各菌株的血清型进行了对照后可知，谱系II的菌株属于组A,谱系I的菌株属于组B以及C，谱系III的菌株属于组D。
根据以上内容，证实了L24(m/z 11180.22、11194.25、11254.35)、L6(m/z19270.08、19256.01)、L18(m/z 13096.86、13110.89)、L15(m/z 15782.02、15797.08、15668.86)、S11(m/z 13655.65、13674.66)、以及S9+Ac(m/z 14283.40、14359.50或者14302.45)在MALDI-TOF MS测量中，是对用于单核细胞增生李斯特菌的血清型与谱系的识别有用的标记蛋白质。此外，可知由于这些标记蛋白质，根据基因信息计算了准确的质量，并且也与实测值进行了对照，所以能够构成可靠性高的质量数据库。
(8)使用了SARAMI的识别结果与根据聚类解析的识别结果的比较
对上述的使用了SARAMI的李斯特菌属的种的识别，与图8所示的将8种核糖体蛋白质的理论质量值作为指标、根据聚类解析进行李斯特菌属的种的识别，并将它们的结果进行了比较。图9A以及9B，示出了通过MALDI-TOF MS测量得到的图表。图9A是组A～E的菌种或者菌株的图表，图9B是组F～M的菌种或者菌株的图表。使用SARAMIS对这些图表进行解析后得到图10所示的识别结果。从该图可知，2株英诺克李斯特菌、1株伊氏李斯特菌、西尔李斯特菌ATCC35967、威尔斯李斯特菌菌均被识别为“李斯特菌属”，但无法进行关于种的鉴定。关于伊氏李斯特菌JCM7681株、西尔李斯特菌JCM7679以及JCM7682株，被误鉴定为单核细胞增生李斯特菌。另外，对于西尔李斯特菌JCM7679以及JCM7682株，进行了生化学试验以及16S RNA的序列解析，并鉴定为西尔李斯特菌。可能因为罗氏李斯特菌的与其质量峰一致的理论质量值未被储存在SARAMIS的数据库，所以未进行种的鉴定。另一方面，利用SARAMIS而能够正确地鉴定格氏李斯特菌，直到鉴定出种。这考虑是因为格氏李斯特菌与其他李斯特菌属均在系统上属于远亲，所以能够利用现有的指纹图谱法进行鉴定。
接着，基于图8所示的理论质量值的数据库，尝试李斯特菌的种的识别。另外，由于认为对于质量值的差较小的L15的m/z 15797.08、15797.03以及15796.09，在实测中不能够对它们进行识别，所以均视作理论质量值m/z15797.08并进行了归属。图11A以及图11B将图9A以及图9B的图表的生物标记峰部分进行放大地示出。从图11A、11B中可知，根据李斯特菌属的种的不同，生物标记质量发生偏移，从而能够区分峰。
将8种核糖体蛋白质的实测值与理论值进行比较并归属后得到图12A所示的结果。图12B是示出图12A中的生物标记的归属编号与理论质量值的对应关系的表。另外，图11A以及图11B的图表上所示的数字1～5表示了各生物标记的归属编号。
从图8以及图12A中可知，关于罗氏李斯特菌以及格氏李斯特菌，虽然在一部分的核糖体蛋白质中发现了理论值与实测值的差异，但是在其他的李斯特菌属的菌种中，能够对核糖体蛋白质的质量值的差进行识别。
在图13A、13B示出表示图12A所示的使用了8种核糖体蛋白质的归属结果的树状图(系统图)以及表示使用了这些8种中的5种核糖体蛋白质L24、S9、L6、L18以及S16的归属结果的树状图。得知均能够进行李斯特菌属的种的识别，以及单核细胞增生李斯特菌的谱系的识别。根据以上内容得知，在将本实施例中发现的核糖体蛋白质作为标记蛋白质而使用的李斯特菌的识别方法是非常有效的方法。
另外，在上述实施方式中，虽然将8种核糖体蛋白质的质荷比存储于第2数据库36，作为用于识别被检微生物属于7个李斯特菌属的菌种中的哪一个的标记蛋白质，但也可以是，在上述实施例中，将在构建用于识别单核细胞增生李斯特菌的蛋白质质量数据库的过程中发现的15种核糖体蛋白质(L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、以及S9))，与在构建用于识别单核细胞增生李斯特菌以外的菌的蛋白质质量数据库的过程中发现的2种核糖体蛋白质(L31(L31typeB)以及S16)的共计17种质荷比存储于第2数据库36，下位分类确定程序35使用这17种中的至少一种，对被检微生物是李斯特菌属中的哪一个菌种进行识别。
此外，在上述实施方式中，虽然通过聚类解析对单核细胞增生李斯特菌的谱系进行了识别，但也可以通过将1个或者多个核糖体蛋白质的实测值与理论质量值进行比较从而识别。例如，也可以根据与核糖体蛋白质L24、L6、S9对应的质量峰的实测值进行识别。特别是由于核糖体蛋白质L24以及L6在单核细胞增生李斯特菌的谱系I中被观测到特有的质量偏移，所以作为用于将谱系I与其他的谱系进行区分的标记蛋白质是有用的。
进而，核糖体蛋白质L18能够在MALDI-TOF MS测量中检测出明确的峰，在西尔李斯特菌中观察到特有的质量偏移。因此，也可以将核糖体蛋白质L18作为用于识别西尔李斯特菌的标记蛋白质而使用。
此外，针对英诺克李斯特菌拥有特征性的质荷比的核糖体蛋白质S11、能够区分西尔李斯特菌的菌株的核糖体蛋白质S9，作为用于李斯特菌属的种的识别的标记蛋白质是有用的。进而，核糖体蛋白质L18以及L15是用于识别伊氏李斯特菌的亚种有用的标记蛋白质，核糖体蛋白质S11是对威尔斯李斯特菌的识别有用的标记蛋白质。
附图标记说明
10 质量分析部
11 离子化部
12 TOF
13 引出电极
14 检测部
20 微生物辨别部
21 CPU
22 存储器
23 显示部
24 输入部
25 I/F
30 存储部
31 OS
32 质谱制作程序
33 属/种确定程序
34 第1数据库
35 下位分类确定程序
36 第2数据库
37 质谱获取部
38 m/z读取部
39 下位分类判断部
40 聚类解析部
41 树状图制作部

Claims (23)

1.一种微生物的识别方法，其特征在于，具有：
a)对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；
b)读取步骤，从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z；
c)识别步骤，基于所述质荷比m/z，对所述试样所含的微生物含有李斯特菌的哪一个菌种进行识别，
使用17种核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、S9、L31以及S16中的至少一种作为所述标记蛋白质。
2.如权利要求1所述的微生物的识别方法，其特征在于，
使用8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的至少一种作为所述标记蛋白质。
3.如权利要求1或者权利要求2所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述李斯特菌的菌种为单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)以及Listeria rocourtiae的任一种。
4.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于以下质荷比，对所述微生物中是否含有单核细胞增生李斯特菌进行识别：分别源自核糖体蛋白质L15、S11以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、L18以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质S11、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L15以及S9的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L6、S11以及S9的峰的质荷比m/z。
5.如权利要求4所述的微生物的识别方法，其特征在于，
在识别出所述微生物中含有单核细胞增生李斯特菌时，所述识别步骤，进而基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z、与源自核糖体蛋白质L24以及L6的至少一种的峰的质荷比m/z，识别该单核细胞增生李斯特菌的谱系。
6.如权利要求5所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15以及L31的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有英诺克李斯特菌。
7.如权利要求6所述的微生物的识别方法，其特征在于，
在识别出所述微生物中含有英诺克李斯特菌时，所述识别步骤进而至少基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z，对该英诺克李斯特菌的菌株进行确定。
8.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有核糖体蛋白质的质荷比的图形与英诺克李斯特菌的模式菌株近似的组的菌株。
9.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S16的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，将所述微生物所含的菌株，分类成核糖体蛋白质的质荷比的图形与英诺克李斯特菌的模式菌株近似的组或者非近似的组。
10.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S9以及L31的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌进行识别。
11.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
在识别出所述微生物中含有伊氏李斯特菌时，所述识别步骤进而基于源自核糖体蛋白质L18的峰的质荷比m/z、或者源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z的至少一种，对该伊氏李斯特菌的亚种进行识别。
12.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质L15的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、L31的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伊氏亚种(Listeria ivanovii ivanovii)进行识别。
13.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质L18、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S11、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L15、S9、L31的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S11、L31的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有伊氏李斯特菌的亚种即伊氏李斯特菌伦敦亚种(Listeria ivanoviilondiniensis)进行识别。
14.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，基于源自L18、S11中的至少一种的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有西尔李斯特菌进行识别。
15.如权利要求14所述的微生物的识别方法，其特征在于，
在识别出所述微生物中含有西尔李斯特菌时，所述识别步骤还至少基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z，对该西尔李斯特菌的菌株进行确定。
16.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S9的峰的质荷比m/z、以及源自核糖体蛋白质L24、L18、L15、S11、L31中的至少一种的峰的质荷比m/z，识别所述微生物中是否含有核糖体蛋白质的质荷比的图形与西尔李斯特菌的模式菌株相似的组的菌株。
17.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于分别源自核糖体蛋白质S9、L18的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质S9、S11的峰的质荷比m/z，将所述微生物所含的菌株，分类成核糖体蛋白质的质荷比的图形与西尔李斯特菌的模式菌株相似的组或者非相似的组。
18.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，至少基于源自核糖体蛋白质S11的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L18、S9的峰的质荷比m/z，对所述微生物中是否含有威尔斯李斯特菌进行识别。
19.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，基于源自核糖体蛋白质L6、L15、S11、S9、L31、S16中的至少1种的峰的质荷比m/z，对所述微生物中所含的李斯特菌的菌种是格氏李斯特菌还是罗氏李斯特菌进行识别。
20.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，使用聚类解析，对所述试样所含微生物是李斯特菌的哪一种菌种进行识别，该聚类解析至少将分别源自核糖体蛋白质L24、L18、S9、L31的峰的质荷比m/z与源自核糖体蛋白质L6、L15、S11的任一种的峰的质荷比m/z、或者分别源自核糖体蛋白质L24、L18、S9、S16的峰的质荷比与源自核糖体蛋白质L6、L15、S11的任一种的峰的质荷比m/z作为指标。
21.如权利要求20所述的微生物的识别方法，其特征在于，
所述识别步骤，使用将分别源自8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的峰的质荷比m/z作为指标的聚类解析，对所述试样所含的微生物含有李斯特菌的哪一种菌种进行识别。
22.如权利要求20或者权利要求21所述的微生物的识别方法，其特征在于，还具有制作表示所述聚类解析的识别结果的树状图的步骤。
23.一种用于在计算机执行如权利要求1～22任一项所述的各步骤的程序。
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