CN113552207A - 微生物分析方法 - Google Patents

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Abstract

涉及微生物分析方法，具备识别步骤，根据含Salmonella属菌2种血清型Abony、Pakistan中任意菌的试样质谱分析所得质谱中有无规定质荷比的1或多个峰，识别所含微生物包含2种血清型中的哪种；或根据含Salmonella属菌3种血清型Minnesota、Infantis和Brandenburg中任意菌的试样质谱分析所得质谱中有无规定质荷比的1或多个峰，识别试样所含微生物包含3种血清型中的哪种；或根据含Salmonella属菌2种血清型Schwarzengrund和Montevideo中任意菌的试样质谱分析所得质谱中有无规定质荷比的1或多个峰，识别试样所含微生物包含2种血清型中的哪种。

Description

微生物分析方法
技术领域
本发明涉及微生物的分析方法。
背景技术
作为质谱分析中的电离法之一的基质辅助激光解吸/电离(MALDI＝MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization)法是如下的方法：为了分析难以吸收激光的物质、蛋白质等容易受到激光损伤的物质，将在激光下容易吸收且容易电离的基质物质与分析对象物质混合，对其照射激光而使分析对象物质电离。通常基质物质以溶液的形式与分析对象物质混合。然后，通过使溶液中的溶剂气化来进行干燥，形成包含分析对象物质的晶体。对其照射激光时，基质物质吸收激光的能量而被迅速加热，发生气化。此时，分析对象物质也与基质物质一起气化，在该过程中使分析对象物质电离。
利用这种MALDI法的质谱分析装置(MALDI-MS)能够在基本不使蛋白质等高分子化合物解离的情况下进行分析，而且也适于微量分析，因此在生命科学的领域中广泛利用。作为生命科学领域中的MALDI-MS的利用之一，有使用MALDI-MS的微生物的鉴定。其为根据使用被检微生物得到的质谱图来进行微生物的鉴定的方法，能够以短时间得到分析结果，因此能够进行简便且迅速的微生物的鉴定。
例如食物中毒的代表性的原因细菌之一有属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌的肠杆菌科的沙门氏菌。Salmonella(以下简写为“S.”)enterica、S.bongori及S.subterranea这3个菌种属于沙门氏菌属，进而S.enterica被分类为6个亚种。引起食物中毒的病原性沙门氏菌大多是属于S.enterica subsp.enterica，该亚种进一步被分类为多个血清型。沙门氏菌属菌的菌种、亚种、血清型的判别对于食物中毒的感染路径的阐明及感染防止是重要的，因此近年来尝试了使用MALDI-MS的沙门氏菌属菌的识别。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.,Applied Microbiology andBiotechnology,Vol.101,No.23-24,pp.8557-8569,2017
发明内容
发明要解决的问题
利用MALDI-MS的沙门氏菌属菌的菌种、亚种、血清型的判别通过检测在菌种、亚种、血清型不同的菌体之间质谱上的位置(质荷比、m/z值)、高度(峰强度、mV值)不同的峰、即生物标记物峰来进行。以细菌为代表的微生物的判别常常使用蛋白质的峰作为生物标记物峰(非专利文献1)。
通常在近缘的微生物的情况下，源自多个蛋白质的峰的质荷比相同或相似。因此，为了以血清型的水平准确判别沙门氏菌属菌，仅选出源自1种蛋白质的峰作为生物标记物峰是不够的，需要选出与血清型的种类相应的适当的源自多个蛋白质的峰。
例如非专利文献1中记载了，从通过对含微生物的试样进行质谱分析而得到的质谱读取源自12种蛋白质的峰的质荷比的值，根据这些值判别该试样所含的微生物是沙门氏菌属菌的血清型中哪一种。但是，即使使用上述源自12种蛋白质的峰作为标记峰，有时即使能够判别为沙门氏菌属菌的规定的多种的血清型中的任一种，也难以识别为哪种血清型。
本发明要解决的问题是，在使用MALDI-MS的微生物分析方法中，使得能够准确地识别沙门氏菌属菌的特定的血清型。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题而做出的本发明为一种微生物分析方法，具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即阿邦尼(Abony)、巴基斯坦(Pakistan)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990、及它们的任意组合组成的组中。
另外，为了解决上述问题而做出的本发明为一种微生物分析方法，具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物为前述3种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838、及它们的任意组合组成的组中。
进而，为了解决上述问题而做出的本发明为一种微生物分析方法，具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001、及它们的任意组合组成的组中。
发明的效果
根据本发明，在试样中包含沙门氏菌属菌的2种血清型即Abony和Pakistan中任意菌的情况下，能够准确识别该菌的血清型为前述2种中的哪种，此外，在试样中包含沙门氏菌属菌的3种血清型即Minnesota、Infantis和Brandenburg中任意菌的情况下，能够准确识别该菌的血清型为前述3种中的哪种，进而，在试样中包含沙门氏菌属菌的2种血清型即Schwarzengrund和Montevideo中任意菌的情况下，能够准确识别该菌的血清型为前述2种中的哪种。
附图说明
图1为本发明的微生物的分析方法中使用的微生物分析系统的概要整体构成图。
图2为示出微生物分析方法的过程的一例的流程图。
图3为示出针对包含沙门氏菌属菌的Abony和Pakistan(第1组)的2种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中符合第2标准的、表2的7个峰附近的图。
图4为示出针对包含沙门氏菌属菌的Abony和Pakistan(第1组)的2种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中不符合第2标准但符合第1标准的、表1的7个峰附近的图。
图5为示出针对包含沙门氏菌属菌的Minnesota、Infantis和Brandenburg(第2组)的3种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中符合第2标准的、表4的3个峰附近的图。
图6为示出针对包含沙门氏菌属菌的Minnesota、Infantis和Brandenburg(第2组)的3种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中不符合第2标准但符合第1标准的、表3的3个峰附近的图。
图7为示出针对包含沙门氏菌属菌的Schwarzengrund和Montevideo(第3组)的2种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中符合第2标准的、表6的4个峰附近的图。
图8为示出针对包含沙门氏菌属菌的Schwarzengrund和Montevideo(第3组)的2种血清型的各菌体的试样得到的质谱上的峰之中不符合第2标准但符合第1标准的、表5的3个峰附近的图。
具体实施方式
本发明的微生物分析方法以如下的试样作为对象：已知其中所含的微生物包含沙门氏菌属菌的3个血清型的组中的任意菌的试样。此处，3个血清型的组是指，由2种血清型即Abony和Pakistan组成的组(以下称为第1组)；由3种血清型即Minnesota、Infantis和Brandenburg组成的组(以下称为第2组)；由2种血清型即Schwarzengrund和Montevideo组成的组(以下称为第3组)。换言之，以如下的试样作为对象：已知包含第1组的沙门氏菌属菌，但未知该菌的血清型为Abony和Pakistan中的哪种的试样；或，已知包含第2组的沙门氏菌属菌，但未知该菌的血清型为Minnesota、Infantis和Brandenburg中的哪种的试样；或，已知包含第3组的沙门氏菌属菌，但未知该菌为Schwarzengrund和Montevideo中的哪种的试样。
即，本发明的微生物分析方法具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即阿邦尼(Abony)、巴基斯坦(Pakistan)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990、及它们的任意组合组成的组中。特别优选选自由3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990、及它们的任意组合组成的组中。
将针对上述质荷比的2种血清型即阿邦尼(Abony)和巴基斯坦(Pakistan)的峰检测状况示于表1和表2。本发明中，通过将表1或表2的质荷比处的峰作为标记峰并确认这些峰的检测状况，从而判别其为2种血清型即阿邦尼(Abony)和巴基斯坦(Pakistan)中的哪种血清型。
[表1]
Figure BDA0003034552870000071
[表2]
Figure BDA0003034552870000081
另外，本发明的微生物分析方法具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物为前述3种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838、及它们的任意组合组成的组中。特别优选选自由6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735、及它们的任意组合组成的组中。
将针对上述质荷比的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)的峰检测状况示于表3和表4。本发明中，通过将表3或表4的质荷比处的峰作为标记峰并确认这些峰的检测状况，从而判别其为3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中的哪种血清型。
[表3]
Figure BDA0003034552870000091
[表4]
Figure BDA0003034552870000101
另外，本发明的微生物分析方法具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001、及它们的任意组合组成的组中。特别优选选自由5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835、及它们的任意组合组成的组中。
将针对上述质荷比的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)的峰检测状况示于表5和表6。本发明中，通过将表5或表6的质荷比处的峰作为标记峰并确认这些峰的检测状况，从而判别其为2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中的哪种血清型。
[表5]
Figure BDA0003034552870000111
[表6]
Figure BDA0003034552870000112
作为上述微生物分析方法中的峰提取的标准，例如可使用以下的第1标准或第2标准，但不限定于它们。与第1标准相比，第2标准的峰的提取标准更严格，若使用第2标准，则有可能能够减少错误判定。但是，峰的强度比也有时会随着菌株、培养条件而发生变化，因此根据判定血清型的目的来决定采用第1标准和第2标准中的哪一个即可。另外，也可以首先以第1标准提取峰，然后从所提取的峰中进一步提取符合第2标准的峰。或者，也可以首先以第2标准提取峰，然后，在难以识别目标血清型的情况下，提取不符合第2标准但符合第1标准的峰并进行识别。各峰的质荷比的值为大概的值，包括随着质谱分析中使用的装置的种类、分析条件等的差异而发生变动的范围。表1、表3、及表5示出使用第1标准时的峰检测状况，表2、表4、及表6示出使用第2标准时的峰检测状况。各表中，圆圈标记表示检测到峰，X标记表示未检测到峰。
(1)第1标准
由2种血清型组成的组的情况下，提取如下的峰：在由包含一者的血清型的沙门氏菌属菌的试样得到的质谱中，以S/N≥3的峰的形式被检测到，且在由包含另一者的血清型的沙门氏菌属菌的试样得到的质谱中，峰未被检测到或者峰的S/N的差异为5倍以上；或，在一者的质谱中，以S/N≥3的峰的形式被检测到，且在另一者的质谱中，峰未被检测到或S/N的差异为10倍以上，且存在质荷比m/z值与该峰相近的邻近峰、或该峰与邻近峰部分重叠。
由3种血清型组成的组的情况下，提取如下的峰：在由包含该3种血清型之中任一个的试样得到的3个质谱之中的一个中，以S/N≥3的峰的形式被检测到，在其余2个质谱中峰未被检测到或峰的S/N的差异为5倍以上；或者，在3个质谱之中的一个中，以S/N≥3的峰的形式被检测到，在其余2个质谱中峰未被检测到或峰的S/N的差异为10倍以上，且存在质荷比m/z值与该峰相近的邻近峰、或该峰与邻近峰部分重叠。
(2)第2标准
由2种血清型组成的组的情况下，提取如下的峰：在由包含一者的血清型的沙门氏菌属菌的试样得到的质谱中，以S/N≥10的峰的形式被检测到，在由包含另一者的血清型的沙门氏菌属菌的试样得到的质谱中，峰未被检测到或峰的S/N的差异为10倍以上。
由3种血清型组成的组的情况下，提取如下的峰：在由包含该3种血清型之中任一个的试样得到的3个质谱之中的一个中，以S/N≥10的峰的形式被检测到，在其余二个质谱中，峰未被检测到或峰的S/N的差异为10倍以上。
任一情况下均存在如下的条件：根据第2标准提取的峰中，不存在导致错误判定的邻近峰或部分重叠的峰，为单独存在的峰。
此时，关于m/z值，例如为800ppm、优选500ppm的精度，在该精度内存在多个峰的情况下选择更近的m/z值的标记峰。
关于试样所含的微生物为第1～第3组之中的哪个组的沙门氏菌属菌，可以使用例如非专利文献1中公开的源自12种蛋白质(gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA)的峰的质荷比的值来识别。
本发明的微生物识别方法中，可以根据1个质荷比处有无峰，来识别其为各组中的哪种血清型的菌，但是，通过根据多个质荷比处有无峰来识别其为各组中的哪种血清型的菌，识别的精度提高。
作为本发明的微生物分析方法中使用的质谱分析装置，优选利用基质辅助激光解吸/电离(MALDI＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)法的质谱分析装置(MALDI-MS)。另外，作为MALDI-MS，优选使用MALDI飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOFMS)。MALDI-TOFMS由于能测定的质荷比的范围非常宽，因此能够获取对作为微生物的构成成分的蛋白质那样的高质量分子的分析而言适合的质谱。
接着，对本发明的微生物分析方法中使用的微生物分析系统的一实施方式进行说明。
图1示出微生物分析系统的概要整体构成。该系统大致包含质谱分析部10和微生物判别部20。质谱分析部10具备：电离部11，其通过基质辅助激光解吸/电离法(MALDI)将试样中的分子、原子电离；以及，飞行时间型质量分离器(TOF)12，其将从电离部11射出的各种离子根据质荷比进行分离。
TOF12具备：取出电极13，其用于从电离部11取出离子并导入到TOF12内的离子飞行空间；以及，检测器14，其检测在离子飞行空间中被质量分离的离子。
微生物判别部20的实体为工作站、个人计算机等计算机，在中央运算处理装置即CPU(Central Processing Unit，中央处理单元)21上互相连接有存储器22、由LCD(LiquidCrystal Display，液晶显示器)等构成的显示部23、由键盘、鼠标等构成的输入部24、由硬盘、SSD(Solid State Drive，固态硬盘)等大容量存储装置构成的存储部30。存储部30中存储有OS(Operating System，操作系统)31、谱创建程序32、种确定程序33及血清型确定程序35(本发明的程序)，而且存储有第1数据库34及第2数据库36。微生物判别部20进一步具备用于管理与外部装置的直接连接、借助LAN(Local Area Network，局域网)等网络与外部装置等的连接的界面(I/F)25，从该界面25借助网线NW(或无线LAN)连接于质谱分析部10。
图1中，如血清型确定程序35那样，示出了谱获取部37、m/z读取部38、及血清型判定部39。这些基本上均为通过CPU21执行血清型确定程序35而以软件方式实现的功能手段。需要说明的是，血清型确定程序35不必是单独的程序，也可以为在例如种确定程序33、用于控制质谱分析部10的程序的一部分内置的功能，其形态没有特别限定。需要说明的是，作为种确定程序33，例如可以利用以往的通过指纹法进行微生物识别的程序等。
另外，图1中设为在用户操作的终端搭载谱创建程序32、种确定程序33、及血清型确定程序35、第1数据库34、及第2数据库36的构成，但也可以设为如下构成：将它们中的至少一部分或全部设置在通过计算机网络与前述终端连接的另外的装置内，按照来自前述终端的指示，执行基于设置在前述另外的装置内的程序的处理和/或向数据库的访问。
存储部30的第1数据库34中登记了多个关于已知微生物的质量列表。该质量列表列举了对某个微生物细胞进行质谱分析时检测的离子的质荷比，除了该质荷比的信息之外至少还包括前述微生物细胞所属的分类单位(科、属、种等)的信息(分类信息)。这种质量列表理想的是根据预先对各种微生物细胞通过与利用前述质谱分析部10时同样的电离法及质量分离法进行实际质谱分析所得到的数据(实测数据)来制作。
根据前述实测数据制作质量列表时，首先，从作为前述实测数据获取的质谱提取在规定的质荷比范围出现的峰。此时，通过将前述质荷比范围设为4000～30000左右，能够主要提取源自蛋白质的峰。另外，通过仅提取峰的高度(相对强度)为规定的阈值以上的峰，能够排除不需要的峰(噪音)。此外，将提取的峰的质荷比(m/z)按每个细胞进行列表化并添加前述分类信息等，然后登记到第1数据库34中。需要说明的是，为了抑制由培养条件导致的基因表达的偏差，实测数据的采集所使用的各微生物细胞理想的是预先将培养环境进行标准化。
存储部30的第2数据库36中登记了用于对已知微生物以作为比种更下级的分类的血清型进行识别的标记蛋白质相关的信息。作为该标记蛋白质相关的信息，至少包括已知微生物中的该标记蛋白质的质荷比(m/z)的信息。需要说明的是，第2数据库36中也可以登记用于以除血清型以外的下级分类(例如亚种、病原型、株)等进行识别的标记蛋白质相关的信息。
本实施方式中的第2数据库36中存储有如下信息：在被检微生物为沙门氏菌属菌的情况下用于判定其血清型的源自12种标记蛋白质(gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA)的峰的质荷比的值(参照非专利文献1)、及在被检微生物被判定为沙门氏菌属菌之中属于第1～第3组中任一者的血清型的情况下用于识别其血清型的标记蛋白质相关的信息，具体而言，在被判定为属于第1组的2种血清型中任一者的情况下用于识别其为该2种血清型中哪种的规定标记峰的质荷比的值、在被判定为属于第2组的3种血清型中任一者的情况下用于识别其为这3种血清型中哪种的规定标记峰的质荷比的值、或在被识别为属于第3组的2种血清型中任一者的情况下用于识别其为该2种血清型中哪种的规定标记峰的质荷比的值(具体为表1～表6中记载的质荷比的值的组合)。
作为第2数据库36中存储的标记蛋白质的质荷比的值，理想的是，将通过将各标记蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列而求出的计算质量与通过实测检测到的质荷比进行比较来选择。需要说明的是，标记蛋白质的碱基序列除了通过序列确定之外，也可以使用从公共的数据库、例如NCBI(美国国立生物技术信息中心：National Center forBiotechnology Information)的数据库等获取的碱基序列。由前述氨基酸序列求出计算质量时，理想的是，考虑N-末端蛋氨酸残基的切断作为翻译后修饰。具体而言，倒数第2个氨基酸残基为Gly、Ala、Ser、Pro、Val、Thr、或Cys的情况下，以N-末端蛋氨酸被切断的形态算出前述理论值。另外，通过MALDI-TOF MS实际观测的是加成有质子的分子，因此理想的是，也考虑该质子的量来求出前述计算质量(即对各蛋白质通过MALDI-TOF MS进行分析时得到的离子的质荷比的理论值)。
接着，参照流程图，对使用上述微生物分析系统的沙门氏菌属菌的血清型的分析过程进行说明。
首先，用户制备包含被检微生物的构成成分的试样，安装于质谱分析部10并执行质谱分析。此时，作为前述试样，除了细胞提取物、或从细胞提取物精制的核糖体蛋白等细胞构成成分之外，也可以直接使用菌体、细胞悬液。
谱创建程序32经由界面25获取由质谱分析部10的检测器14得到的检测信号，根据该检测信号制作被检微生物的质谱(步骤101)。
接着，种确定程序33将前述被检微生物的质谱与收录于第1数据库34中的已知微生物的质量列表进行对照，提取具有与被检微生物的质谱类似的质荷比图案的已知微生物的质量列表、例如包含多个在规定的误差范围内与被检微生物的质谱中的各峰一致的峰的质量列表(步骤102)。种确定程序33接着通过参照与步骤102中提取的质量列表对应地存储于第1数据库34中的分类信息，从而识别与该质量列表对应的已知微生物所属的生物种(步骤103)。然后，该生物种不是沙门氏菌属菌的情况下，将该生物种作为被检微生物的生物种而输出至显示部23(步骤114)，结束分析处理。另一方面，前述生物种为沙门氏菌属菌的情况下，接着推进至利用血清型确定程序35的分析处理。需要说明的是，预先用其它方法判定了试样中含有沙门氏菌属菌的情况下，不使用质谱的种确定程序，而是推进至血清型确定程序35即可。
血清型确定程序35中，将被检微生物的质谱与收录于第2数据库中的标记蛋白质的质荷比的值进行对照，判别被检微生物的血清型(步骤104)。具体而言，首先，血清型判定部39从第2数据库36读取源自上述12种标记蛋白质(gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA))的峰的质荷比的值。接着，谱获取部37获取步骤101中制作的被检微生物的质谱。然后，m/z读取部38在该质谱上选出在与前述各标记蛋白质关联地存储于第2数据库36中的质荷比范围内出现峰的峰作为与各标记蛋白质对应的峰，根据该峰的质荷比的值来判别血清型。
其结果，在已判定被检微生物的血清型为属于第1组的血清型(Abony、Pakistan)的情况下(步骤105)，从第2数据库获取与属于第1组的血清型对应的规定的标记峰的质荷比的值(步骤109)。
另一方面，在已判定被检微生物的血清型为属于第2组的血清型(Minnesota、Infantis、Brandenburg)的情况下(步骤106)，从第2数据库获取与属于第2组的血清型对应的规定的标记峰的质荷比的值(步骤110)。
另外，在已判定被检微生物的血清型为属于第3组的血清型(Schwarzengrund、Montevideo)的情况下(步骤107)，从第2数据库获取与属于第3组的血清型对应的规定的标记峰的质荷比的值(步骤111)。
此处，在已判定被检微生物的血清型不是属于第1～第3组中任一者的血清型的情况下(步骤108)，将被检微生物的血清型作为不是属于第1～第3组的血清型中任一者的血清型而输出至显示部23(步骤114)。
然后，当被判定为属于第1～第3组中任一者的血清型，并获取与属于各组的血清型对应的规定的标记峰的质荷比的值时，确认与这些质荷比的值关联地存储于第2数据库36中的质荷比范围内出现的峰的有无(步骤112)，根据其状况来确定被检微生物的血清型(步骤113)，将其结果作为被检微生物的识别结果而输出至显示部23(步骤114)。
实施例
以下，针对用于实际证明本实施方式的微生物分析方法的效果的实验进行说明，但它们是单纯的例示，本发明不限定于它们。
1.沙门氏菌属菌的培养
使用LB琼脂培养基，将沙门氏菌属菌(Salmonella enterica)之中属于第1组的2种沙门氏菌属菌、属于第2组的3种沙门氏菌属菌、以及属于第3组的2种沙门氏菌属菌这些总计7种沙门氏菌属菌在37℃下培养20小时。
以下的沙门氏菌属菌分别属于第1～第3组。
(1)第1组
S.Abony,NBRC100797
S.Pakistan,GTC09493
(2)第2组
S.Minnesota,NBRC15182
S.Infantis,ATCC BAA-1675
S.Brandenburg,jfrlSe1402-3
(3)第3组
S.Schwarzengrund,HyogoSO12004
S.Montevideo,jfrlSe1409-6
2.基质溶液的制作
制作以下的2种基质溶液。
(2-1)在乙醇中以含有25mg/mL的作为基质物质的芥子酸(SA)的方式将其溶解，制作基质溶液(饱和溶液)。将该基质溶液设为“SA-1”。
(2-2)在包含50％的乙腈(ACN)及0.6％的三氟乙酸(TFA)的水溶液中以分别含有SA 25mg/mL、亚甲基二膦酸(MDPNA)1％、作为表面活性剂的癸基-β-D-麦芽糖苷(decyl-β-D-maltopyranoside、DMP)1mM的方式将它们溶解，制作基质溶液。将该基质溶液记作“SA-2”。
基质溶液SA-1及SA-2中使用的SA使用富士胶片和光纯药工业株式会社制的产品，MDPNA及DMP使用Sigma-Aldrich Japan制的产品。
3.基质/微生物悬浊液的制备
(3-1)用微量天平，逐一将LB琼脂培养基上培养的7种沙门氏菌属菌分别称量约1mg并放入到管中，向其中添加基质SA-2溶液以菌浓度成为1mg/0.075mL(1×107CFU/μL)的方式制备，用针使其悬浊。
(3-2)对管施加超声波振动1分钟，将所得悬浊液离心分离(12000rpm、5min)，得到离心上清液。
4.利用MALDI-MS的分析
(4-1)向MALDI用样品板的各孔中逐一滴加基质溶液SA-1 0.5μL(预涂)。
(4-2)接着，在预涂有基质溶液SA-1的各孔中逐一滴加上述离心上清液1μL，使其自然干燥。
(4-3)将由(4-2)得到的MALDI用样品板插入到MALDI-MS(AXIMA Performance,株式会社岛津制作所制)，以线性模式(正离子模式)测定。测定数据全部通过栅格分析获取。栅格分析为上述质谱分析装置所具备的自动测定功能，是对样品板的各孔内的试样以预先设定的点数、射击数进行激光照射，来获取质谱数据的方法。
5.峰的提取
对测定数据应用沙门氏菌属菌的自校准(具体而言，使用沙门氏菌自身的若干已归属的峰作为内标来进行校准)，针对得到的质谱，提取对血清型的识别而言有用的峰。对于提取的峰，读取非专利文献1中所示的源自12种标记蛋白质的峰的质荷比的值，由这些值判别该试样所含的微生物为沙门氏菌属菌的血清型中的哪种。
利用上述12种标记蛋白质来判别血清型时，在已判别其为沙门氏菌属菌的2种血清型即阿邦尼(Abony)、巴基斯坦(Pakistan)中任意菌的情况下，对于得到的质谱，确认选自3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990中的1个或多个质荷比的值的峰检测状况。
利用上述12种标记蛋白质来判别血清型时，在已判别其为沙门氏菌属菌的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中任意菌的情况下，对于得到的质谱，确认选自6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838中的1个或多个质荷比的值的峰检测状况。
利用上述12种标记蛋白质来判别血清型时，在已判别其为沙门氏菌属菌的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中任意菌的情况下，对于得到的质谱，确认选自5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001中的1个或多个质荷比的值的峰检测状况。
需要说明的是，m/z值以800ppm、优选500ppm的精度进行评价，在该精度内存在多个峰的情况下选择更近的m/z值的标记峰来进行评价。
5.结果
(1)第1组
对于由包含属于第1组的2种沙门氏菌属菌(S.Abony、S.Pakistan)中任意者的试样得到的质谱，确认上述质荷比(m/z值)的峰检测状况时，确认到表1和表2的检测状况。表1及表2中，“○”表示检测到该质荷比的标记峰，“×”表示未检测到。
图3示出符合第2标准的峰的m/z值(即表2所示的m/z值)之中4165.7、5487.4、6238.3、7858.2、8329.5、9911.9、15713.9附近的质谱。另外，图4示出符合第1标准但不符合第2标准的峰的m/z值之中5506.7、6261.2、7588.5、9669.0、11847.4、13444.3、15990.2附近的质谱。图3及图4中，上部示出S.Abony的质谱，下部示出S.Pakistan的质谱。图3及图4中，箭头表示提取的峰。
如图3及图4所示，根据第1标准和第2标准提取的峰仅在S.Abony的质谱和S.Pakistan的质谱中的任一者出现，因此能够根据该峰的有无来识别试样所含的沙门氏菌属菌为S.Abony、S.Pakistan中的哪种，换言之，能够识别沙门氏菌属菌的血清型。特别是，符合第2标准的峰与仅符合第1标准的峰相比，S/N更大，且不存在邻近峰，因此能够更准确地识别血清型。需要说明的是，表1所示的42个质荷比(m/z值)的峰中的任一个均可作为用于识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型的标记峰，但若将多个质荷比(m/z值)的峰作为标记峰，则能够精度更好地识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型。
如此，通过确认表1或表2的质荷比(m/z值)的峰检测状况，从而能够识别其为属于第1组的2种沙门氏菌属菌(S.Abony、S.Pakistan)中的哪种血清型。
(2)第2组
对于由包含属于第2组的3种沙门氏菌属菌(S.Minnesota、S.Infantis、S.Brandenburg)中任一者的试样得到的3个质谱，确认上述质荷比(m/z值)的峰检测状况时，确认到表3和表4所示那样的检测状况。
图5示出符合第2标准的峰的质荷比(m/z值)(即表4所示的m/z值)之中7939.5、13406.3、15878.4/15894.7附近的质谱。
另外，图6示出符合第1标准但不符合第2标准的峰的质荷比(m/z值)的之中7947.5、9322.0、13366.5/13376.0附近的质谱。图5及图6中，上部示出针对包含S.Minnesota的试样得到的质谱，中部示出针对包含S.Infantis的试样得到的质谱，下部示出针对包含S.Brandenburg的试样得到的质谱。图5及图6中，箭头表示提取的峰。
如图5和图6所示，根据第1标准和第2标准提取的峰仅在由包含S.Minnesota、S.Infantis、S.Brandenburg中任一者的试样得到的质谱中存在或者不存在，因此能够根据该峰的有无来识别试样所含的沙门氏菌属菌为S.Minnesota、S.Infantis、S.Brandenburg中的哪种，换言之，能够识别沙门氏菌属菌的血清型。特别是，符合第2标准的峰与仅符合第1标准的峰相比，S/N更大，且不存在邻近峰，因此能够更准确地识别血清型。需要说明的是，表1所示的35个质荷比(m/z值)的峰中的任一个均可作为用于识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型的标记峰，但若将多个质荷比(m/z值)的峰作为标记峰，则能够精度更好地识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型。
如此，通过确认表3或表4的质荷比(m/z值)的峰检测状况，从而能够识别其为属于第2组的3种沙门氏菌属菌(S.Minnesota、S.Infantis、S.Brandenburg)中的哪种血清型。
(3)第3组
对于由包含属于第3组的2种沙门氏菌属菌(S.Schwarzengrund、S.Montevideo)中任意者的试样得到的质谱，确认上述质荷比(m/z值)的峰检测状况时，确认到图7和图8的检测状况。
图7示出符合第2标准的峰的m/z值(即表6所示的m/z值)之中5096.4、6830.8、12276.1、15834.5附近的质谱。
另外，图8示出符合第1标准但不符合第2标准的峰的m/z值之中12261.9、13074.0、19001.0附近的质谱。图7及图8种，上部为针对包含S.Schwarzengrund的试样得到的质谱，下部为针对包含S.Montevideo的试样得到的质谱。图7及图8中，箭头表示提取的峰。
如图7和图8所示，根据第1标准和第2标准提取的峰仅在包含S.Schwarzengrund的试样的质谱和包含S.Montevideo的试样的质谱中任一者出现，因此能够根据该峰的有无来识别试样所含的沙门氏菌属菌为S.Schwarzengrund和S.Montevideo中的哪种，即能够识别沙门氏菌属菌的血清型。特别是，符合第2标准的峰与仅符合第1标准的峰相比，S/N更大，且不存在邻近峰，因此能够更准确地识别血清型。需要说明的是，表5所示的11个质荷比m/z值的峰中的任一个均可作为用于识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型的标记峰，但若将多个质荷比m/z值的峰作为标记峰，则能够精度更好地识别试样所含的沙门氏菌属菌的血清型。
如此，确认表5或表6的质荷比(m/z值)的峰检测状况，从而能够识别其为属于第3组的2种沙门氏菌属菌(S.Schwarzengrund、S.Montevideo)中的哪种血清型。
[方式]
本领域技术人员理解，上述多个例示性的实施方式为以下的方式的具体例。
(第1项)一方式的微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即阿邦尼(Abony)、巴基斯坦(Pakistan)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990及它们的任意组合组成的组中。
(第2项)根据第1项所述的微生物分析方法，其中，
前述规定的质荷比的值特别选自由3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990及它们的任意组合组成的组中。
根据第1项所述的微生物分析方法，在已知试样所含的沙门氏菌(Salmonella)属菌的血清型为2种血清型(Abony、Pakistan)中任意者的情况下，能够识别血清型为Abony、Pakistan中的哪种，根据第2项所述的微生物分析方法，能够更准确地识别血清型为Abony、Pakistan中的哪种。
(第3项)另一方式的微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物为前述3种血清型中的那种菌，
前述规定的质荷比的值选自由6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13366、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838及它们的任意组合组成的组中。
(第4项)根据第3项所述的微生物分析方法，其中，
前述规定的质荷比的值特别选自6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735。
根据第3项所述的微生物分析方法，在已知试样所含的沙门氏菌(Salmonella)属菌的血清型为3种血清型(Minnesota、Infantis、Brandenburg)中任意者的情况下，能够识别血清型为Minnesota、Infantis、Brandenburg中的哪种，根据第4项所述的微生物分析方法，能够更准确地识别血清型为Minnesota、Infantis、Brandenburg中的哪种。
(第5项)又另一方式的微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别前述试样所含的微生物包含前述2种血清型中的哪种菌，
前述规定的质荷比的值选自由5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001及它们的任意组合组成的组中。
(第6项)根据第5项所述的微生物分析方法，其中，
前述规定的质荷比的值特别选自由5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835及它们的任意组合组成的组中。
根据第5项所述的微生物分析方法，在已知试样所含的沙门氏菌(Salmonella)属菌的血清型为2种血清型(Schwarzengrund、Montevideo)中的任意者的情况下，能够识别血清型为Schwarzengrund、Montevideo中的哪种，根据第6项所述的微生物分析方法，能够更准确地识别血清型为Schwarzengrund、Montevideo中的哪种。
(第7项)第2方式为用于使计算机执行上述第1项～第6项中任一项所述的各步骤的程序。

Claims (7)

1.一种微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即阿邦尼(Abony)、巴基斯坦(Pakistan)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别所述试样所含的微生物包含所述2种血清型中的哪种菌，
所述规定的质荷比的值选自由3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990及它们的任意组合组成的组中。
2.根据权利要求1所述的微生物分析方法，其中，所述规定的质荷比的值选自由3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990及它们的任意组合组成的组中。
3.一种微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的3种血清型即明尼苏达(Minnesota)、婴儿(Infantis)和勃兰登堡(Brandenburg)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别所述试样所含的微生物包含所述3种血清型中的哪种菌，
所述规定的质荷比的值选自由6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13366、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838及它们的任意组合组成的组中。
4.根据权利要求3所述的微生物分析方法，其中，所述规定的质荷比的值选自由6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735及它们的任意组合组成的组中。
5.一种微生物分析方法，其具备如下步骤：
识别步骤，根据对包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的2种血清型即胥伐成格隆(Schwarzengrund)和蒙得维的亚(Montevideo)中任意菌的试样进行质谱分析所得到的质谱中在规定的质荷比处有无峰，识别所述试样所含的微生物包含所述2种血清型中的哪种菌，
所述规定的质荷比的值选自由5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001及它们的任意组合组成的组中。
6.根据权利要求5所述的微生物分析方法，其中，所述规定的质荷比的值选自由5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835及它们的任意组合组成的组中。
7.一种非临时性计算机可读介质，其存储有用于使计算机执行权利要求1～6中任一项所述的各步骤的程序。
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