WO2024034453A1 - マトリックス溶液、質量分析方法、記憶媒体、判別方法 - Google Patents

マトリックス溶液、質量分析方法、記憶媒体、判別方法 Download PDF

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WO2024034453A1
WO2024034453A1 PCT/JP2023/028052 JP2023028052W WO2024034453A1 WO 2024034453 A1 WO2024034453 A1 WO 2024034453A1 JP 2023028052 W JP2023028052 W JP 2023028052W WO 2024034453 A1 WO2024034453 A1 WO 2024034453A1
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WO
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matrix solution
matrix
sample
mass spectrometry
microorganism
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Application number
PCT/JP2023/028052
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English (en)
French (fr)
Inventor
華奈江 寺本
Original Assignee
株式会社島津製作所
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Publication date
Application filed by 株式会社島津製作所 filed Critical 株式会社島津製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a matrix solution, a mass spectrometry method, a storage medium, and a discrimination method, and more particularly to a matrix solution, a mass spectrometry method, a storage medium, and a discrimination method for microorganism discrimination using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Regarding the method.
  • a matrix solution is used to ionize the target substance to be analyzed contained in the sample.
  • Typical matrix solutions also include components for dissolving the sample.
  • a dried product of the mixed solution can be obtained.
  • the target substance in the dried material is ionized.
  • the ionized target substance is detected as a peak in the mass spectrum.
  • An analyst can identify microorganisms based on the difference in the peak patterns.
  • the matrix solution used is, for example, a CHCA solution in which CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid) is dissolved in an organic solvent.
  • Non-Patent Document 4 discloses a CHCA solution containing organic solvents acetonitrile and ethanol in predetermined proportions.
  • the present disclosure has been made to solve such problems, and its purpose is to provide a matrix solution that allows highly sensitive mass spectrum measurement in matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Another objective is to improve the discrimination accuracy for samples derived from microorganisms.
  • the matrix solution according to the first aspect of the present disclosure is a matrix solution used for mixing with a sample in matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.
  • the matrix solution is an aqueous solution containing acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water.
  • the content of acetonitrile is 30 to 40% by volume based on the matrix solution.
  • the content of ethanol is 10 to 20% by volume based on the matrix solution.
  • the content of trifluoroacetic acid is 1 to 3% by volume based on the matrix solution.
  • the matrix solution contains 5-20 mg/ml of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, or sinapinic acid.
  • a mass spectrometry method includes the steps of: mixing a sample and a matrix solution; drying the matrix solution with the sample mixed on a sample plate to form a dried product; and acquiring a mass spectrum by performing mass spectrometry using a matrix-assisted laser desorption ionization method.
  • the matrix solution is an aqueous solution containing acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water.
  • the content of acetonitrile is 30 to 40% by volume based on the matrix solution.
  • the content of ethanol is 10 to 20% by volume based on the matrix solution.
  • the content of trifluoroacetic acid is 1 to 3% by volume based on the matrix solution.
  • the matrix solution contains 5-20 mg/ml of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, or sinapinic acid.
  • the matrix solution according to the present disclosure it is possible to provide a matrix solution that enables highly sensitive mass spectrum measurement in matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, and also improves the discrimination accuracy for samples derived from microorganisms. be able to.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of an analysis device according to an embodiment. It is a figure explaining the composition of a matrix solvent.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a method of forming a dried material on a sample plate. It is a figure which shows the photographed image of the dried material on a sample plate. It is a figure showing the mass spectrum of E. coli. It is a figure showing the number of detected ribosomal proteins. It is a flow chart showing mass spectrometry processing and microorganism discrimination processing.
  • FIG. 3 is a diagram showing an experimental example of the mass spectrometry method according to the embodiment.
  • this embodiment is not limited to this.
  • the notation in the format "A to Z” means the upper and lower limits of the range (i.e., from A to Z), and if there is no unit described in A and a unit is described only in Z, then A The units of and the units of Z are the same.
  • % means “volume %” unless otherwise specified.
  • the microorganism discrimination method according to the present embodiment includes the mass spectrometry method according to the present embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the analyzer 1.
  • the analyzer 1 is a mass spectrometer for performing mass spectrometry of a substance contained in a sample, and is, for example, a MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry).
  • the analyzer 1 uses a mass spectrum obtained by mass spectrometry to determine the type of living organism.
  • the sample may be derived from prokaryotes or eukaryotes.
  • the sample is preferably of microbial origin and may contain unknown microorganisms.
  • Prokaryotes include bacteria and archaea. Examples of bacteria include bacteria of the genus Escherichia (such as Escherichia coli), bacteria of the genus Bacillus (such as Bacillus subtilis), bacteria of the genus Lactobacillus (such as lactic acid bacteria), bacteria of the genus Synechocystis (such as cyanobacteria), and bacteria of the genus Mycobacteria (such as actinobacteria). It will be done.
  • Archaea include Methanophilus, Methanococcus, Thermococcus, Phyllococcus, and the like.
  • Eukaryotes include animals, plants, fungi and protists.
  • Fungi include filamentous fungi, yeasts, mushrooms, molds, and the like, and include phylum Chytridomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, Glomusmycota, Microsporidia, and the like.
  • the phylum Ascomycota includes the genus Aspercillus (Aspergillus mold, etc.), the genus Penicillium (Blue mold, etc.), the genus Saccharomyces (budding yeast, etc.), and the like.
  • the sample contains the target substance, which is the molecule to be analyzed. Furthermore, in this embodiment, the analysis in the analyzer 1 includes detecting a peak in a mass spectrum and measuring the mass-to-charge ratio (m/z) of a specific or non-specific substance contained in the sample. In one example, the substance is a protein. The analysis in the analyzer 1 includes determining the type of microorganism from which the sample originates based on the m/z corresponding to the peak on the mass spectrum. Note that m/z corresponding to a peak on a mass spectrum is generally also referred to as the "position" or "m/z position" of the peak.
  • a type of microorganism includes at least one phylogenetic class of the microorganism's genotype, strain, subspecies, species, genus, and family. Further, the determination of the type of microorganism includes classification, identification, and discrimination regarding the type of microorganism. Hereinafter, discrimination of the type of microorganism will also be simply referred to as discrimination of microorganism.
  • the analysis in the analyzer 1 may include determining whether a specific substance is contained in the sample and calculating the concentration of the specific substance in the sample.
  • analysis device 1 includes a control section 10 and a measurement section 20.
  • the measurement unit 20 ionizes a substance (for example, protein) in the sample using a high voltage, separates the ions S according to the flight time correlated to m/z, and then detects the ions.
  • the measurement section 20 includes an ionization section 21, an ion acceleration section 22, a mass separation section 23, and a detection section 24.
  • the movement of ions S in the measuring section 20 is schematically shown by arrow A1.
  • the ionization unit 21 ionizes the substance in the sample by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • any soft ionization method such as the electrospray ionization (ESI) method can be used.
  • ESI electrospray ionization
  • the ionization unit 21 includes a sample plate holder (not shown) that supports the sample plate, and an ion source that includes a laser device (not shown) that irradiates the sample plate with laser light.
  • a sample plate holder (not shown) that supports the sample plate
  • an ion source that includes a laser device (not shown) that irradiates the sample plate with laser light.
  • an analyst mixes a sample in a matrix solution in advance, and then drops the matrix solution into a well formed on a sample plate.
  • a well is a circle drawn or stamped on the sample plate (see W in Figure 4).
  • the matrix solution may be dropped onto the sample plate and then mixed with the sample on the sample plate.
  • the matrix solution contains a matrix substance that easily absorbs laser light and is easily ionized by laser light.
  • a matrix material is also simply referred to as a "matrix.”
  • the matrix is used to analyze substances that are difficult to absorb laser light and/or substances that are easily damaged by laser light (such as proteins).
  • the sample mixed with the matrix solution may be liquid or solid. More specifically, the sample may be, for example, a liquid containing a bacterial culture, or a bacterial colony cultured on a solid medium may be scooped out with a toothpick or the like.
  • the culture solution for the bacteria includes bacteria and a liquid medium for culturing the bacteria. However, it is preferable that the amount of liquid medium contained in the sample mixed with the matrix solution be small. Therefore, preferably, as a pretreatment, the sample is centrifuged, the supernatant is removed, and the remaining sample (precipitate) is mixed with the matrix solution. More preferably, the precipitate is further centrifugally washed with ultrapure water or the like and then mixed with the matrix solution.
  • sample may be a purified cell component such as ribosomal protein instead of the microorganism cell itself as described above.
  • the mixing ratio of the matrix solution and the sample is not limited as long as the effects of the invention can be achieved, but for example, the sample may be mixed in a volume ratio of less than a fraction of that of the matrix solution, and more than 1/100th of the volume of the matrix solution.
  • the analyst obtains a dried product by drying the matrix solution mixed with the sample as described above on the sample plate. Thereafter, the sample plate is placed in a sample plate holder within the vacuum container of the ionization section 21.
  • the dried product of a mixed solution of a sample and a matrix solution is also generally referred to as a "crystal,” and more specifically, it is referred to as a “crystal,” “mixed crystal,” “sample crystal,” or “matrix crystal.” ”, “sample/matrix crystal”, etc.
  • the description of the matrix solution at the stage of being placed on the sample plate and forming a dried product is a matrix solution in which the sample is mixed as described above (i.e., "mixed solution”). Including cases.
  • the ionization unit 21 reduces the pressure of the vacuum container in which the sample plate is installed, and then irradiates the dried material on the sample plate with laser light to ionize the target substance in the dried material.
  • the type of laser device that irradiates the laser beam is not particularly limited as long as it can oscillate light that is absorbed by the matrix solution used.
  • the matrix solution contains CHCA, an N2 laser (wavelength 337 nm) or the like may be used. It can be suitably used.
  • Ions S of the target substance ionized in the ionization section 21 are extracted by an electric field by an extraction electrode (not shown) and introduced into the ion acceleration section 22 .
  • the ion acceleration unit 22 includes an acceleration electrode 221 and accelerates the introduced ions S.
  • the flow of accelerated ions S is appropriately focused by an ion lens (not shown) and introduced into the mass separation unit 23.
  • the mass separation unit 23 includes a flight tube 231, and separates the ions S based on the difference in flight time when each ion S flies inside the flight tube 231.
  • a linear type flight tube 231 is shown, but a reflectron type, multiturn type, etc. may also be used.
  • the mass spectrometry method is not particularly limited as long as the ions S contained in the sample can be separated and detected.
  • the detection unit 24 includes an ion detector such as a multi-channel plate, detects the ions S separated by the mass separation unit 23, and outputs a detection signal with an intensity corresponding to the number of ions incident on the detection unit 24.
  • the detection signal output from the detection section 24 is input to the processing section 11 of the control section 10.
  • FIG. 1 the flow of a detection signal of ions S from the detection section 24 of the measurement section 20 is schematically shown by an arrow A2.
  • the control unit 10 includes a processing unit 11, a storage unit 12, and an input/output unit 13.
  • the processing unit 11 is configured to include a processor such as a CPU, and functions as a main body for controlling the analysis device 1 .
  • the processing unit 11 performs various processes by executing programs stored in the storage unit 12 and the like.
  • the processing unit 11 includes an apparatus control unit 111, a mass spectrum creation unit 112, and a mass spectrum analysis unit 113.
  • the mass spectrum analysis section 113 includes a discrimination section 114.
  • the device control unit 111 controls the operation of the measurement unit 20 based on data related to analysis conditions input from the input unit 131, which will be described later.
  • control of the measurement unit 20 by the device control unit 111 is schematically shown by arrow A3.
  • the mass spectrum creation unit 112 converts the flight time into m/z from the measurement data including the detected amount of the ion detected by the detection unit 24 and the flight time of the ion, and calculates the detected amount corresponding to each m/z. Create a mass spectrum showing .
  • the number of detection signals of the target substance detected by the detection unit 24 and the intensity of the detection signals correlate with the number of peaks corresponding to the target substance in the mass spectrum and the intensity of the peaks.
  • the ratio of the intensity of the detection signal of the target substance to the intensity of noise detected by the detection unit 24 is the intensity ratio of the peak of the target substance to the intensity of noise in the mass spectrum (mass spectrum S/N ratio).
  • At least one of the number of peaks corresponding to the target substance in the mass spectrum, the intensity of the peaks, and the intensity ratio (S/N ratio) of the peaks to the intensity of noise in the mass spectrum The value that correlates to is called "sensitivity.”
  • the mass spectrum analysis unit 113 detects a mass spectrum peak in the mass spectrum. Calculate m/z corresponding to the detected peak.
  • the mass spectrum analysis unit 113 may determine the substance to which the m/z indicated by the peak on the mass spectrum corresponds based on a protein database or the like. That is, the mass spectrum analysis unit 113 can calculate the m/z of specific or non-specific substances contained in the sample.
  • the mass spectrum analysis unit 113 may further determine whether a specific substance is contained in the sample based on m/z (identification of components in the sample).
  • the mass spectrum analysis section 113 includes a discrimination section 114.
  • the determining unit 114 creates a database that includes mass spectra.
  • the database includes one or more, preferably a large number, of mass spectra of microorganisms of known types.
  • the discrimination unit 114 discriminates the type of microorganism using a mass spectrum database.
  • the discrimination unit 114 discriminates microorganisms using a fingerprint method. Specifically, the discrimination unit 114 discriminates the microorganism by comparing the mass spectrum pattern of the unknown microorganism with the mass spectrum pattern of the known microorganism stored in the database. Identification of microorganisms is performed, for example, with reference to the peak of a biomarker, which is a substance that exhibits a characteristic expression pattern for each microorganism. Discrimination of microorganisms based on the pattern of biomarker peaks will be described in detail later.
  • the storage unit 12 includes a nonvolatile storage medium.
  • the storage unit 12 stores a mass spectrum created by the mass spectrum creation unit 112, measurement data output from the measurement unit 20, a program for the processing unit 11 to execute processing, and the like.
  • the storage unit 12 corresponds to an example of "memory" in the present disclosure.
  • the storage unit 12 may include a storage medium that is removable from the analysis device 1.
  • the storage medium may be any medium capable of storing various data, such as a CD (Compact Disc), a DVD (Digital Versatile Disc), and a USB (Universal Serial Bus) memory.
  • the storage unit 12 stores a mass spectrum database.
  • the input/output unit 13 is an interface through which the analyzer 1 inputs and outputs information to and from the outside.
  • the input/output section 13 includes an input section 131, an output section 132, and a communication section 133.
  • the input unit 131 includes input devices such as a mouse, a keyboard, various buttons, and/or a touch panel.
  • the input unit 131 receives information necessary for controlling the operation of the measuring unit 20, information necessary for processing performed by the processing unit 11, etc. from the analyst.
  • the output unit 132 includes a display device such as a liquid crystal monitor, a printer, and the like.
  • the output unit 132 displays information related to measurement by the measurement unit 20, results of processing by the processing unit 11, etc. on a display device or prints it on a paper medium.
  • the communication unit 133 is configured to include a communication device that can communicate via wireless or wired connection such as the Internet.
  • the communication unit 133 receives data necessary for processing by the processing unit 11, transmits data processed by the processing unit 11 such as determination results, and transmits and receives necessary data as appropriate.
  • control unit 10 may be placed in a computer, server, etc. that is physically separate from the measurement unit 20.
  • control unit 10 may be configured by a plurality of computers. For example, as shown below, it may be configured with a first computer that creates a mass spectrum database and a second computer that uses the mass spectrum database to identify microorganisms.
  • the first computer creates a mass spectrum database based on the detection signal of the ions S output from the measurement unit 20, and stores it in the storage medium.
  • the second computer acquires a mass spectrum database from the storage medium, and uses the database to determine the type of microorganism.
  • a wired or wireless network may be used to transfer the database from the first computer to the second computer.
  • the analyzer 1 used in this embodiment is not particularly limited as long as it is combined with a MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) ion source.
  • a MALDI-IT matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap
  • a MALDI-IT-TOF matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap-time of flight
  • a MALDI-FTICR matrix-assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance
  • the analysis conditions in the analyzer 1 are set within the range normally set by a person skilled in the art.
  • MALDI-MS is one of the soft ionization methods that ionizes biopolymers such as proteins with almost no decomposition.
  • a matrix solution mixed with a sample is dried on a sample plate, thereby vaporizing the solvent in the matrix solution and forming a dried product containing the target substance.
  • the matrix material absorbs the energy of the laser light, is heated, and vaporized.
  • the target substance is also vaporized together with the matrix material, and in the process, the target substance is ionized.
  • sample plates used for dry matter formation and mass spectrometry are often disposable and are compatible with clinical microbial analysis and food hygiene testing. However, in microbial research, sample plates that can be used repeatedly are sometimes used.
  • the sample plate includes, for example, stainless steel or conductive resin.
  • the matrix used is, for example, CHCA, sinapinic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, etc. from the viewpoint of efficiently ionizing the protein sample.
  • the matrix is dissolved in a solvent and mixed with the sample as a matrix solution.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 disclose compositions of matrix solvents for various CHCAs.
  • Table 1 shows the composition of matrix solvents that contain substances such as acetonitrile (ACN), ethanol (EtOH), water, and trifluoroacetic acid (TFA) at predetermined content ratios, which are disclosed in Non-Patent Documents 1 to 4.
  • Matrix solutions containing 5-15 mg/mL CHCA have been prepared using these solvents.
  • the high mass region refers to a region where m/z is relatively large, for example, a region where m/z is 10,000 or more, and more specifically, a region where m/z is 11,000 or more.
  • the inventors investigated the experimental conditions necessary to obtain sufficient sensitivity even in high-quality regions.
  • the inventors first noticed that in the process of dropping a conventional matrix solution onto a well formed in a sample plate to form a dried product, the matrix solution is often concentrated in a narrow range. In this case, if sample crystals are formed at the edge of the well, the sample may not be properly irradiated with a laser during automatic measurement. In such cases, the sensitivity in the mass spectrum obtained by analyzing the sample may not be sufficient.
  • the inventors considered forming dry matter over the entire well by increasing the amount of matrix solution and dropping it in order to suppress the formation of dried matter unevenly distributed at the edges of the well. did. However, if the amount of matrix solution dropped into the well is increased, there is a possibility that the time required for drying the matrix solution becomes longer and/or the dried material becomes thicker, making it impossible to obtain a good mass spectrum.
  • the inventors considered forming a dried substance over the entire well without increasing the amount of matrix solution dropped into the well by devising the composition of the matrix solution.
  • the inventors discovered that by forming a dried product that satisfies the first to third conditions below, it is possible to obtain a mass spectrum with high sensitivity even in a high mass region. .
  • the first condition is that the dried matter is formed widely, more preferably throughout the well.
  • the phrase "the dried object is formed widely” means that the area of the upper surface (the surface on the side to which the laser is irradiated) of the dried object is formed to be large.
  • the second condition is that the dried product has high uniformity.
  • An example of high uniformity of the dried product is high uniformity of the shape of the top surface of the dried product.
  • An example of high uniformity of the shape of the top surface of a dried product is, for example, that the vertical thickness of the dried product has little variation depending on location, and also, for example, that the top surface of the dried product has few irregularities and is almost flat. It is.
  • high uniformity of the dried product is that the internal structure of the dried product has high uniformity.
  • the high uniformity of the internal structure of the dried material means, for example, that the ratio and/or bonding mode of the target substance and matrix in the dried material have little difference depending on location, at least on the upper surface of the dried material. Also, for example, the dried matter in the well should not be aggregated into one and multiple small dried matter should not be formed.
  • the third condition is that the dried product is derived from a mixed solution that has successfully extracted the bacterial cell components of the microorganism.
  • Successfully extracting the bacterial cell components of microorganisms means, for example, extracting the bacterial cell components of microorganisms with high efficiency, and more specifically, extracting a large amount of the target substance per microorganism. .
  • the concentration of the target substance in the dried material increases and a strong detection signal of the target substance is obtained, thereby improving sensitivity.
  • the inventors thought that if a matrix solution that forms a dry substance that satisfies the first to third conditions could be obtained, a highly sensitive mass spectrum could be obtained. In addition, the inventors thought that as a result of improved sensitivity in the entire mass spectrum, sufficient sensitivity could be obtained even in the high mass region where sufficient sensitivity could not be obtained in the past.
  • the inventors invented a composition of a matrix solution that forms a dry product from which highly sensitive mass spectra can be obtained.
  • the inventors have found that by devising the composition of the matrix solvent, it is possible to obtain a dried product whose peaks can be detected with high sensitivity in a high mass region.
  • the composition of the matrix solvent includes the types of reagents and substances contained in the matrix solvent, and the content ratio and/or concentration of the reagents and substances.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the composition of the matrix solvent according to the comparative example and the present embodiment.
  • the volume ratios of acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water in each matrix solvent are expressed as a percentage when the volume of the entire matrix solvent is taken as 100.
  • the above-mentioned acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water may each be produced by a known method, or may be obtained as a commercially available product.
  • the matrix solvent according to the present embodiment is characterized in that the proportions of acetonitrile and ethanol, which are organic solvents, are different from those of the matrix solvents according to Comparative Examples 1 and 2.
  • the specific composition will be explained below.
  • the organic solvent contained in the matrix solvent according to Comparative Example 1 is 50% acetonitrile, and the organic solvent contained in the matrix solvent according to Comparative Example 2 is 35% acetonitrile and 25% ethanol.
  • the organic solvent contained in the matrix solvent according to the present embodiment is 30 to 40% acetonitrile and 10 to 20% ethanol, more preferably 33 to 37% acetonitrile and 13 to 17% ethanol, and even more preferably About 35% acetonitrile and about 15% ethanol.
  • the matrix solvent according to the present embodiment further contains 1 to 3% trifluoroacetic acid, more preferably 1 to 2% trifluoroacetic acid. It goes without saying that the remainder of the matrix solvent is water.
  • the content ratio of acetonitrile contained in the matrix solvent is 30 to 40%, preferably 33 to 37%, and more preferably about 35% by volume.
  • the content of ethanol in the matrix solvent is 10 to 20%, preferably 13 to 17%, and more preferably about 15% by volume.
  • Each matrix solvent is prepared so that the proportions of acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water add up to 100%.
  • the preparation method is not particularly limited; for example, acetonitrile, ethanol, and trifluoroacetic acid may be added to water in a test tube, or acetonitrile, ethanol, and trifluoroacetic acid may be prepared on an industrial scale in a chemical plant or the like. Acetic acid may also be prepared by adding it to water.
  • the matrix solvent according to the present embodiment is further prepared to contain 5 to 20 mg/ml of matrix, preferably 5 to 15 mg, more preferably 8 to 10 mg/ml, and used as a matrix solution. be done.
  • the matrix is ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-CHCA, also referred to herein simply as CHCA), one of the most commonly used matrices in mass spectrometry.
  • the matrix may be 2,5-dihydroxybenzoic acid or sinapinic acid, which are also the most commonly used matrices in mass spectrometry.
  • Other examples of matrices include, but are not limited to, 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid (3H4NBA), alpha-cyano-3-hydroxycinnamic acid (3-CHCA), ferulic acid, or , 1,5-diaminonaphthalene, etc.
  • a solution containing 10 mg/mL of CHCA in a matrix solvent containing 35% acetonitrile, 15% ethanol, 1% trifluoroacetic acid, and 39% water is shown. , showed an example of experimental results. Further, as an example of the matrix solution according to Comparative Example 1, a solution containing 10 mg/mL of CHCA in a matrix solvent containing 50% acetonitrile, 1% trifluoroacetic acid, and 49% water was used.
  • a solution containing 10 mg/mL of CHCA in a matrix solvent containing 35% acetonitrile, 25% ethanol, 1% trifluoroacetic acid, and 39% water was used.
  • a dried product is formed by mixing a matrix solution according to an embodiment with a sample and drying it on a sample plate.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a method of forming a dried material on a sample plate.
  • FIG. 3 shows how the matrix solution M is placed onto the well W in the sample plate P using the pipette 5.
  • the sample plate P is a general MALDI plate, for example, a plate containing stainless steel and/or conductive resin.
  • the sample is a sample derived from a microorganism, and according to one embodiment is a sample derived from E. coli.
  • the analyst adds 9 ⁇ L of matrix solution to a microtube, further adds 1 ⁇ L of E. coli culture solution, mixes well, and drops 1 ⁇ L of the mixed solution onto sample plate P.
  • a dried product is formed by drying the matrix solution placed on the well W of the sample plate P.
  • a dried product formed by the matrix solution of Comparative Example 1 (hereinafter also referred to as the dried product of Comparative Example 1) and a dried product formed by the matrix solution of Comparative Example 2 were found.
  • the dried product (hereinafter also referred to as the dried product of Comparative Example 2)
  • the particles are often formed in a narrow range of the plate.
  • dry matter may be formed at the edges of the plate in a related manner.
  • the dried product formed by the matrix solution of this embodiment (hereinafter also referred to as the dried product of the embodiment) spreads uniformly over the entire plate.
  • FIG. 4 shows examples of the external shapes of the dried product of Comparative Example 1, the dried product of Comparative Example 2, and the dried product of the embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing a photographed image of the dried material on the sample plate.
  • FIG. 4 is a black and white image of the dried material taken by a camera (CCD camera) including a CCD (Charge Coupled Device) as an image sensor in the ionization unit 21 in the analyzer 1.
  • CCD camera Charge Coupled Device
  • the dried material of Comparative Example 1 was formed unevenly in the lower right part of the well W.
  • the dried product is bright and has dense particulate irregularities (not shown). Moreover, a part of the dried material protrudes from the outer frame of the well W.
  • the central part of the dried product of Comparative Example 2 was slightly bright and particulate irregularities (not shown) were observed.
  • the outer edge of the dried product of Comparative Example 2 is darker than the center and appears to spread out in a planar manner.
  • the dried material of the embodiment spreads widely and uniformly throughout the well, the thickness becomes thinner as a whole, and it becomes so dark that it is difficult to distinguish it from the base of the sample plate in the CCD black and white image.
  • the dried product of the embodiment exhibits a different state from the dried product of Comparative Example 1 and the dried product of Comparative Example 2.
  • the difference in the state of the dried product is due to changes in the concentration of acetonitrile and ethanol, the strength of surface tension, the drying speed, the difference in the type and/or amount of bacterial cell components contained in the dried product, and the difference in the state of the dried product. It is thought that this reflects a change in at least one of the differences in the uniformity of .
  • the dried product of the embodiment has a wider and more uniform thickness than the dried product of Comparative Example 1 and the dried product of Comparative Example 2. The inventors have confirmed that this characteristic of the dried product of the embodiment has high reproducibility regardless of the sample.
  • the inventors have confirmed that the matrix solution according to the embodiment has a faster drying rate and forms a dried product in a shorter time than each of the matrix solutions according to Comparative Examples 1 and 2.
  • This speed of drying is due to the difference in vaporization rate due to the composition itself (especially the concentration of acetonitrile and ethanol), and the difference in the surface area of the matrix solution dropped onto the sample plate that comes into contact with the air (especially the difference in the area of the top surface of the matrix solution). It is thought that this mainly reflects the The difference in drying speed is due to at least one of the differences in the amount and/or type of bacterial cell components contained in the mixed solution and the uniformity of the mixed solution (uniformity of the ratio of target substance and matrix or bonding mode). It is also possible that this reflects the Due to this high drying rate, the above-mentioned highly uniform dried product can be formed in a short time.
  • FIG. 5 is a diagram showing the mass spectrum of E. coli, from the top: mass spectrum of the dried product of Comparative Example 1 (hereinafter also referred to as “mass spectrum of Comparative Example 1”), mass spectrum of the dried product of Comparative Example 2. (hereinafter also referred to as “mass spectrum of Comparative Example 2”), and the mass spectrum of the dried product of the embodiment (hereinafter also referred to as "mass spectrum of embodiment”).
  • the horizontal axis in FIG. 5 shows m/z, and the vertical axis shows the intensity of the detection signal. In the region of m/z 11,000 or higher, the signal strength multiplied by 10 is displayed.
  • the mass spectrum according to the embodiment has improved overall peak intensity and improved sensitivity compared to each of the mass spectra according to Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • the high mass region for example, the region of approximately m/z 11,000 or more
  • almost no peaks are detected in each of the mas spectra according to Comparative Example 1 and Comparative Example 2, and only a small number of peaks are detected.
  • the intensity is very low, many high intensity peaks are detected in the mass spectrum of this embodiment.
  • the sensitivity of the mass spectrum of this embodiment is improved overall, particularly in the high mass region. Thereby, sufficient sensitivity can be obtained even in a high mass region. That is, by using the matrix solution according to the embodiment, peaks can be detected with high sensitivity.
  • the matrix solution according to this embodiment can extract bacterial cell components with high efficiency, at least with an efficiency equal to or higher than that of the matrix solutions according to each of Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the number of detected ribosomal proteins. More specifically, FIG. 6 is a peak list including the corresponding m/z and peak intensity for each peak in the mass spectrum as partially shown in FIG. In Figure 6, the peak list includes a theoretical m/z calculated from the molecular weight of a ribosomal protein known to be expressed in E. coli, and a peak list m/z calculated by comparing the m/z of the peak list. The number of ribosomal proteins involved is indicated.
  • an average of 25 types of ribosomal proteins can be detected in 16 samples.
  • the sensitivity is improved in the entire mass spectrum, and in particular, it becomes possible to obtain sufficient sensitivity even in the high mass region. This improves the accuracy of identifying microorganisms based on the mass spectrum. This makes it possible to classify highly related microorganisms, as shown in FIG. 8, which will be described later.
  • the drying rate is improved as a result of the mixed solution being spread widely within the well.
  • a uniform dried product can be prepared in a short time, so that efficient and good sample preparation is possible.
  • microorganism-derived proteins can be detected by MALDI-MS. That is, the number of peaks detected in the mass spectrum increases. Such an increase in the amount of information also contributes to improving the accuracy of identifying microorganisms.
  • FIG. 7 is a flowchart showing mass spectrometry processing and microorganism discrimination processing. The steps shown in FIG. 7 are performed manually by an analyst using laboratory equipment commonly used for culturing microorganisms and mass spectrometry. In addition, in the figure, “S” is used as an abbreviation of "STEP".
  • the analyst mixes the matrix solution according to this embodiment into the sample.
  • the analyst dries the sample-mixed matrix solution on the sample plate to form a dry product.
  • the analyst acquires a mass spectrum by performing mass spectrometry using matrix-assisted laser desorption ionization on the dried material.
  • the analyst creates a database containing mass spectra and stores it in the storage unit 12.
  • the analyst determines the type of microorganism using the mass spectrum included in the database.
  • the matrix solution according to this embodiment shows that by using the matrix solution according to this embodiment, highly sensitive mass spectrum measurement is possible in MALDI-MS, and as a result, the discrimination accuracy for samples derived from microorganisms is improved.
  • the matrix solution according to this embodiment can also be used for biological samples derived from organisms other than microorganisms.
  • the types, content ratios, and/or concentrations of substances contained in the matrix solution according to this embodiment are merely examples.
  • the type, content ratio, and/or concentration of substances other than acetonitrile and ethanol e.g., trifluoroacetic acid, water, matrix
  • a matrix solution adjusted to contain a plurality of types of matrices at a total concentration of 8 to 20 mg/ml may be used as long as the effects of the present application are achieved.
  • the type, content ratio, and/or concentration of the substance (for example, acetonitrile, ethanol) contained in the matrix solution according to the present embodiment can be measured by, for example, a gas chromatograph.
  • FIG. 8 is a table showing peaks of ribosomal proteins obtained as a result of mass spectrometry of C. acnes by a mass spectrometry method using a matrix solution according to the present embodiment.
  • the left column 31 in FIG. 8 shows strains of P. acnes by phylotype and by management number in the Japan Collection of Microorganisms (JCM) of RIKEN.
  • the right column 32 shows the detection results of proteins serving as biomarkers (Biomarker proteins).
  • Row 33 shows the name of the ribosomal protein that is the biomarker.
  • row 34 below row 33 the molecular weight of each ribosomal protein is shown.
  • row 35 for each strain, whether or not a peak was detected at the above molecular weight is indicated as 1 (detected) or 0 (not detected).
  • the molecular weights of the ribosomal proteins represented by L6, L13, L15, and L23 shown in region 37 differed depending on the strain. More specifically, the molecular weights of ribosomal proteins represented by L6, L13, L15, and L23 varied by about 10 to 30 depending on the strain. This revealed that strains of P. acnes can be identified based on the peaks of L6, L13, L15, and L23. For example, three strains with serial numbers 6425, 18918, and 18920 could be identified based on the L13 peak. Thus, it was found that L6, L13, L15, and L23 can be used as biomarkers for strain discrimination within P. acnes.
  • L6, L13, L15, and L23 ribosomal proteins are 19679/19707, 16154/16168/16182, 15358/15385, and 11181/11200, respectively, and all are included in the high mass region with a molecular weight of 11,000 or more. . Therefore, strains within P. acnes could be identified based on the high mass of ribosomal proteins.
  • the matrix solution is a matrix solution used for mixing with a sample in matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.
  • the matrix solution is an aqueous solution containing acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water.
  • the content of acetonitrile is 30 to 40% by volume based on the matrix solution.
  • the content of ethanol is 10 to 20% by volume based on the matrix solution.
  • the content of trifluoroacetic acid is 1 to 3% by volume based on the matrix solution.
  • the matrix solution contains 5-20 mg/ml of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, or sinapinic acid.
  • the matrix solution described in item 1 it is possible to provide a matrix solution that allows highly sensitive mass spectrum measurement in MALDI-MS. Furthermore, when the sample is derived from a microorganism, the accuracy of microorganism discrimination using mass spectra can be improved.
  • the content of acetonitrile is more preferably 33 to 37% by volume based on the matrix solution.
  • the content of ethanol is 13 to 17% by volume based on the matrix solution.
  • the matrix solution according to Item 1 or 2 more preferably contains 8 to 10 mg/ml of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid.
  • the sample is a sample derived from a microorganism.
  • the mass spectrometry method includes the steps of: mixing a sample and a matrix solution; drying the matrix solution mixed with the sample on a sample plate to form a dried product; and acquiring a mass spectrum by performing mass spectrometry using a matrix-assisted laser desorption ionization method.
  • the matrix solution is an aqueous solution containing acetonitrile, ethanol, trifluoroacetic acid, and water.
  • the content of acetonitrile is 30 to 40% by volume based on the matrix solution.
  • the content of ethanol is 10 to 20% by volume based on the matrix solution.
  • the content of trifluoroacetic acid is 1 to 3% by volume based on the matrix solution.
  • the matrix solution contains 5-20 mg/ml of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, or sinapinic acid.
  • the mass spectrometry method described in item 5 it is possible to provide a matrix solution that allows highly sensitive mass spectrometry measurements. Furthermore, when the sample is derived from a microorganism, the accuracy of microorganism discrimination using mass spectra can be improved.
  • the sample is a sample derived from a microorganism.
  • the accuracy of microorganism discrimination using mass spectrometry can be improved.
  • (Section 7) A storage medium that stores a database containing mass spectra obtained by the mass spectrometry method according to Item 5 or 6.
  • a database including highly sensitive mass spectra can be stored and retrieved to the outside.
  • the type of microorganism includes at least one phylogenetic class of the microorganism's genotype, strain, subspecies, species, genus, and family.
  • Determining the type of microorganism described in Item 8 or 9 includes at least one of classification, identification, and discrimination regarding the type of microorganism.
  • 1 analysis device 5 pipette, M matrix solution, 10 control unit, 11 processing unit, 12 storage unit, 13 input/output unit, 20 measurement unit, 21 ionization unit, 22 ion acceleration unit, 23 mass separation unit, 24 detection unit, 111 Equipment control section, 112 Mass spectrum creation section, 113 Mass spectrum analysis section, 114 Discrimination section, 131 Input section, 132 Output section, 133 Communication section, 221 Accelerating electrode, 231 Flight tube, P sample plate, S ion, W well .

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Abstract

マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、試料との混合用に用いられるマトリックス溶液である。マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液である。アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％である。トリフルオロ酢酸の含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１～３体積％である。マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む。

Description

マトリックス溶液、質量分析方法、記憶媒体、判別方法
　本発明は、マトリックス溶液、質量分析方法、記憶媒体および判別方法に関し、より特定的には、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法を用いた微生物判別に関するマトリックス溶液、質量分析方法、記憶媒体および判別方法に関する。
　微生物に対して質量分析を行なって得られたマススペクトルのパターンに基づいて、微生物を判別する方法が知られている。特に、質量分析法の中でも、非特許文献１～３において開示される、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）を用いて微生物を判別する方法が、たとえば臨床微生物分析、食品衛生検査等の現場において、広く利用されている。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいては、試料中に含まれる分析対象の対象物質をイオン化するために、マトリックス溶液が使用される。一般的なマトリックス溶液は、試料を溶解するための成分も含む。このようなマトリックス溶液と試料との混合溶液を試料プレートに設置し、乾燥することにより、混合溶液の乾燥物が得られる。当該乾燥物に対し、レーザが照射されることにより、乾燥物中の対象物質がイオン化される。イオン化された対象物質はマススペクトルのピークとして検出される。分析者は当該ピークのパターンの差に基づいて、微生物を判別することが可能である。
　なお、このような微生物判別のためのＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいて、マトリックス溶液としては、たとえばＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）を有機溶媒に溶解したＣＨＣＡ溶液が用いられる。非特許文献４には、有機溶媒であるアセトニトリルおよびエタノールを各々所定の割合で含むＣＨＣＡ溶液が開示されている。
Victor　Ryzhov　and　Catherine　Fenselau，"Characterization　of　the　Protein　Subset　Desorbed　by　MALDI　from　Whole　Bacterial　Cells"，Anal．Chem．，2001，73，746-750． Fernando　J．　Pineda　et　al．，"Microorganism　Identification　by　Matrix-Assisted　Laser/Desorption　Ionization　Mass　Spectrometry　and　Model-Derived　Ribosomal　Protein　Biomarkers"，Anal．Chem．，2003，75，3817-3822． Teramoto　K　et　al．，"Phylogenetic　Classification　of　Pseudomonas　putida　Strains　by　MALDI-MS　Using　Ribosomal　Subunit　Proteins　as　Biomarkers"，Anal．Chem．，2007，79，22，8712-8719． バイテックＭＳマトリックス－ＣＨＣＡ　安全データシート、ビオメリュー・ジャパン株式会社、２０２１年６月３日、［検索日２０２２年５月１２日］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.biomerieux.co.jp/sites/subsidiary_jp/files/SPS-revamp/411071_vitek_ms_matrix-chca_sds_04_bmxj.pdf＞
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて微生物を判別する方法においては、対象物質のピークが高感度で検出されることが望ましい。しかし、従来のマトリックス溶液を用いて形成された乾燥物に対してＭＡＬＤＩ－ＭＳを行なうと、特に高質量領域において、充分な感度が得られないことが問題となっていた。そのため、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいて、対象物質のピークを高感度で検出することが可能な手段が求められていた。
　本開示は、かかる課題を解決するためになされたものであり、その目的は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、高感度のマススペクトル測定が可能なマトリックス溶液を提供することであり、また、微生物由来の試料に対する判別精度を向上することである。
　本開示の第１の局面に係るマトリックス溶液は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、試料との混合用に用いられるマトリックス溶液である。マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液である。アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％である。トリフルオロ酢酸の含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１～３体積％である。マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む。
　本開示の第１の局面に係る質量分析方法は、試料とマトリックス溶液とを混合するステップと、試料が混合されたマトリックス溶液を試料プレート上で乾燥し、乾燥物を形成するステップと、乾燥物に対し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとを備える。マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液である。アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％である。トリフルオロ酢酸の含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１～３体積％である。マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む。
　本開示によるマトリックス溶液によれば、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、高感度のマススペクトル測定が可能なマトリックス溶液を提供することができ、また、微生物由来の試料に対する判別精度を向上することができる。
実施形態に係る分析装置の構成を示す概略図である。 マトリックス溶媒の組成を説明する図である。 試料プレート上の乾燥物の形成方法を説明するための図である。 試料プレート上の乾燥物の撮影像を示す図である。 大腸菌のマススペクトルを示す図である。 検出されたリボソームタンパク質の数を示す図である。 質量分析処理および微生物の判別処理を示すフローチャートである。 実施形態に係る質量分析方法の実験例を示す図である。
　以下、本開示の一実施形態（以下「本実施形態」と記す。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。
　また、本明細書において、「％」は特に断らない限り、「体積％」を意味する。
　以下に、本実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、以下では図中の同一または相当部分には同一の符号を付して、その説明は原則的に繰返さないものとする。
　［１．分析装置の構成］
　まず、本実施形態に係る微生物の判別方法を実施する分析装置１の一例を示す。本実施形態に係る微生物の判別方法は、本実施形態に係る質量分析方法を含む。
　図１は、分析装置１の構成を示す概略図である。分析装置１は、試料に含まれる物質の質量分析を行なうための質量分析装置であり、たとえば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（Matrix-Assisted　Laser　Desorption/Ionization　Time-of-Flight　Mass　Spectrometry）である。分析装置１は、質量分析により得られたマススペクトルを用いて、生物の種類の判別を行なう。
　試料は、原核生物由来であってもよく、真核生物由来であってもよい。試料は好ましくは微生物由来であり、未知の微生物を含んでもよい。原核生物には、細菌および古細菌が含まれる。細菌としては、エスケリキア属細菌（大腸菌等）、バシラス属細菌（枯草菌等）、ラクトバシラス属細菌（乳酸菌等）、シネコシスティス属細菌（シアノバクテリア等）、マイコバクテリア属細菌（放線菌等）等が含まれる。古細菌としては、メタノフィルス属、メタノコッカス属、サーモコッカス属、フィロコッカス属等が含まれる。真核生物には、動物、植物、菌類および原生生物が含まれる。菌類には、糸状菌、酵母、キノコ、カビ等が含まれ、ツボカビ門、接合菌門、子嚢菌門、担子菌門、グロムス菌門、微胞子虫門等が含まれる。子嚢菌門には、アスペルキルス属（コウジカビ等）、ペニシリウム属（アオカビ等）、サッカロマイセス属（出芽酵母等）等が含まれる。
　試料には、分析対象の分子である対象物質が含まれる。また、本実施形態において、分析装置１における分析は、マススペクトルのピークを検出し、試料に含まれる特定または非特定の物質の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定することを含む。一実施例において、当該物質はタンパク質である。分析装置１における分析は、当該マススペクトル上のピークに対応するｍ／ｚに基づいて、試料の由来となる微生物の種類を判別することを含む。なお、マススペクトル上のピークに対応するｍ／ｚは、一般に、ピークの「位置」または「ｍ／ｚ位置」とも称される。
　本明細書において、特に説明しない限り、微生物の種類とは、微生物のジェノタイプ、株、亜種、種、属および科の少なくとも１つの系統分類学の階級を含む。また、微生物の種類の判別は当該微生物の種類に関しての、分類、同定および識別を含む。以下、微生物の種類の判別を、単に微生物の判別とも記載する。
　分析装置１における分析は、試料中に特定の物質が含まれるか否かを判別すること、試料中の特定の物質の濃度を算出することを含んでもよい。
　図１を参照して、分析装置１は、制御部１０および測定部２０を含む。
　測定部２０は、高電圧により試料中の物質（たとえばタンパク質）をイオン化し、当該イオンＳをｍ／ｚに相関する飛行時間に応じて分離したのち検出する。測定部２０は、イオン化部２１と、イオン加速部２２と、質量分離部２３と、検出部２４とを備える。図１において、測定部２０におけるイオンＳの移動を矢印Ａ１で模式的に示す。
　イオン化部２１は、試料中の物質をマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によりイオン化する。イオン化の方法としては、ＭＡＬＤＩ法以外にもエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：Electrospray　ionization）法等の任意のソフトイオン化法を用いることができる。ＥＳＩ法によりイオン化を行なう場合、分析装置１が液体クロマトグラフをさらに備え、液体クロマトグラフで分離された試料中の物質をイオン化部２１がイオン化する構成にすると、高い分離能を得ることができるため好ましい。
　イオン化部２１は、試料プレートを支持する試料プレートホルダ（図示せず）と、試料プレート上にレーザ光を照射するレーザ装置（図示せず）を含むイオン源を含む。分析者はまず、試料とマトリックス溶液との混合溶液とを試料プレートに配置する。
　具体的には、たとえば、分析者はマトリックス溶液に試料を予め混合した上で、マトリックス溶液を試料プレート上に形成されたウェルに滴下する。ウェルは、試料プレートに描画または刻印された円である（図４のＷ参照）。一方、マトリックス溶液は試料プレートに滴下された後、試料プレート上で試料と混合されてもよい。
　マトリックス溶液には、レーザ光を吸収しやすくかつレーザ光によってイオン化しやすいマトリックス物質が含まれる。本明細書では、マトリックス物質を、単に「マトリックス」とも記載する。マトリックスは、レーザ光を吸収しにくい物質、および／または、レーザ光で損傷を受けやすい物質（タンパク質等）を分析するために用いられる。
　マトリックス溶液と混合される試料は、液体状であってもよいし、固形であってもよい。より具体的には、試料は、たとえば菌の培養液を含む液であってもよいし、固形培地上で培養した菌のコロニーを爪楊枝等ですくい取ったものであってもよい。当該菌の培養液は、菌と、菌を培養するための液体培地とを含む。ただし、マトリックス溶液と混合される試料に含まれる液体培地の量は少ない方が好ましい。そのため好ましくは、前処理として試料を遠心分離し、上清を除去した後に残った試料（沈殿物）をマトリックス溶液と混合する。また、より好ましくは、当該沈殿物をさらに超純水等で遠心洗浄した後にマトリックス溶液と混合する。
　なお、試料は、上記のように微生物の細胞そのものの代わりに、リボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものであってもよい。
　マトリックス溶液と試料との混合比率は、発明の効果が奏される範囲で限定されないが、たとえば、体積比でマトリックス溶液の数分の１以下、数百分の１以上の試料が混合される。
　分析者は、上記のように試料を混合したマトリックス溶液を、試料プレート上で乾燥することにより、乾燥物を得る。その後、試料プレートはイオン化部２１の真空容器内の試料プレートホルダに設置される。
　なお、試料とマトリックス溶液との混合溶液の乾燥物は、一般に「結晶」と称されることもあり、より具体的には、「結晶」、「混合結晶」、「試料結晶」、「マトリックス結晶」、「試料／マトリックス結晶」等様々に呼称される。
　なお、以降において、試料プレートに配置され、乾燥物を形成する段階のマトリックス溶液についての記述は、特に説明の無い限り、上記のように試料を混合したマトリックス溶液（すなわち「混合溶液」）である場合も含む。
　イオン化部２１は、試料プレートが設置された真空容器を減圧した後、レーザ光を試料プレート上の乾燥物に照射して、乾燥物中の対象物質のイオン化を行なう。レーザ光を照射するレーザ装置の種類は、使用したマトリックス溶液に吸収される光を発振することができれば特に限定されず、たとえばマトリックス溶液がＣＨＣＡを含む場合には、Ｎ２レーザ（波長３３７ｎｍ）等を好適に用いることができる。イオン化部２１でイオン化された対象物質のイオンＳは、図示しない引出電極等による電場により引き出され、イオン加速部２２に導入される。
　イオン加速部２２は、加速電極２２１を備え、導入されたイオンＳを加速させる。加速されたイオンＳの流れは、図示しないイオンレンズにより適宜収束されて質量分離部２３に導入される。
　質量分離部２３は、フライトチューブ２３１を備え、それぞれのイオンＳがフライトチューブ２３１の内部を飛行する際の、飛行時間の違いによりイオンＳを分離する。図１ではリニア型のフライトチューブ２３１が示されているが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよい。試料に含まれるイオンＳを分離して検出することができれば、質量分析の方法は特に限定されない。
　検出部２４は、マルチチャンネルプレート等のイオン検出器を備え、質量分離部２３で分離されたイオンＳを検出し、検出部２４に入射したイオンの数に応じた強度の検出信号を出力する。検出部２４から出力された検出信号は、制御部１０の処理部１１に入力される。図１において、測定部２０の検出部２４からのイオンＳの検出信号の流れを矢印Ａ２で模式的に示す。
　制御部１０は、処理部１１、記憶部１２および入出力部１３を含む。
　処理部１１は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成され、分析装置１を制御する動作の主体として機能する。処理部１１は、記憶部１２等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行なう。
　処理部１１は、装置制御部１１１と、マススペクトル作成部１１２と、マススペクトル分析部１１３とを備える。マススペクトル分析部１１３は、判別部１１４を含む。
　装置制御部１１１は、後述する入力部１３１から入力された分析条件に関するデータに基づいて、測定部２０の動作を制御する。図１においては、装置制御部１１１による測定部２０の制御を矢印Ａ３で模式的に示す。
　マススペクトル作成部１１２は、検出部２４が検出したイオンの検出量と、当該イオンの飛行時間とを含む測定データから、飛行時間をｍ／ｚに換算し、各ｍ／ｚに対応する検出量を示すマススペクトルを作成する。
　検出部２４で検出される対象物質の検出信号の数および当該検出信号の強度は、マススペクトルにおける対象物質に対応するピークの数および当該ピークの強度に相関する。また、検出部２４で検出されるノイズの強度に対する対象物質の検出信号の強度の比（検出信号におけるＳ／Ｎ比）は、マススペクトルにおけるノイズの強度に対する対象物質のピークの強度比（マススペクトルにおけるＳ／Ｎ比）に相関する。よって、本明細書では、マススペクトルにおける、対象物質に対応するピークの数、当該ピークの強度、および、マススペクトルにおけるノイズの強度に対する当該ピークの強度比（Ｓ／Ｎ比）の中の少なくとも１つに相関する値を「感度」と称する。そして、対象物質に対応するピークの数が多い状態、当該ピークの強度が高い状態、および、マススペクトルのＳ／Ｎ比が大きい状態の少なくとも１つの状態を「高感度」と称する。
　マススペクトル分析部１１３は、マススペクトルにおいて、マススペクトルのピークを検出する。検出したピークに対応するｍ／ｚを算出する。マススペクトル分析部１１３は、タンパク質データベース等に基づいて、当該マススペクトル上のピークが示すｍ／ｚが対応する物質を判別してもよい。すなわち、マススペクトル分析部１１３は試料に含まれる特定または非特定の物質のｍ／ｚを算出できる。マススペクトル分析部１１３は、さらに、ｍ／ｚに基づいて試料中に特定の物質が含まれるか否かを判別してもよい（試料中の成分同定）。
　マススペクトル分析部１１３は判別部１１４を含む。一実施例において、判別部１１４は、マススペクトルを含むデータベースを作成する。当該データベースは、種類が既知の微生物のマススペクトルを１以上、好ましくは多数含む。判別部１１４は、マススペクトルのデータベースを用いて、微生物の種類の判別を行なう。
　一実施例において、判別部１１４は、フィンガープリント法により微生物の判別を行なう。具体的には、判別部１１４は、未知の微生物のマススペクトルのパターンについて、上記データベースに記憶された既知の微生物のマススペクトルのパターンと照合することにより、微生物の判別を行なう。微生物の判別は、たとえば、微生物ごとに特徴的な発現パターンを示す物質である、バイオマーカのピークを参照して行なわれる。バイオマーカのピークのパターンに基づく微生物の判別については、後に詳述する。
　記憶部１２は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部１２は、マススペクトル作成部１１２が作成したマススペクトル、測定部２０から出力された測定データおよび処理部１１が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。記憶部１２は、本開示における「メモリ」の一実施例に対応する。記憶部１２は、分析装置１から取り外し可能な、記憶媒体を含んでもよい。記憶媒体は、ＣＤ（Compact　Disc）、ＤＶＤ（Digital　Versatile　Disc）、およびＵＳＢ（Universal　Serial　Bus）メモリなど、各種のデータを記憶することができるものであればいずれのものであってもよい。記憶部１２は、マススペクトルのデータベースを記憶する。
　入出力部１３は、分析装置１が外部と情報を入出力するためのインターフェイスである。入出力部１３は、入力部１３１、出力部１３２および通信部１３３を含む。
　入力部１３１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部１３１は、測定部２０の動作の制御に必要な情報、および処理部１１の行なう処理に必要な情報等を、分析者から受け付ける。
　出力部１３２は、液晶モニタ等の表示装置、プリンター等を含んで構成される。出力部１３２は、測定部２０の測定に関する情報や、処理部１１の処理の結果等を、表示装置に表示したり、紙媒体に印刷したりする。
　通信部１３３は、インターネット等の無線や有線接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部１３３は、処理部１１の処理に必要なデータを受信したり、判別結果等の処理部１１が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
　上記した制御部１０の機能の一部または全部は、測定部２０とは物理的に離れた電子計算機、サーバ等に配置してもよい。また、制御部１０は、複数のコンピュータにより構成されてもよい。たとえば以下の通り、マススペクトルのデータベースを作成する第１のコンピュータと、マススペクトルのデータベースを用いて微生物を判別する第２のコンピュータにより構成されてもよい。この場合、たとえば、第１のコンピュータは測定部２０から出力されたイオンＳの検出信号を基にマススペクトルのデータベースを作成し、記憶媒体に記憶する。第２のコンピュータは、当該記憶媒体からマススペクトルのデータベースを取得し、当該データベースを用いて微生物の種類を判別する。第１のコンピュータから第２のコンピュータへのデータベースの受け渡しは、有線または無線のネットワークを用いてもよい。
　なお、本実施形態において使用される分析装置１としては、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。たとえば、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、または、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置であってもよい。また、分析装置１における分析条件は、通常当業者が設定する範囲内で設定される。
　［２．従来の質量分析方法］
　従来、質量分析法を利用して、微生物を判別する方法がある。質量分析法においては、微量の微生物試料を用いて、簡便に、かつ、短時間で、分析結果であるマススペクトルを得ることができる。また、自動分析を用いることにより、迅速簡便な多検体分析が可能である。
　このような質量分析法の中でも、特に、タンパク質等の生体高分子をほとんど分解せずにイオン化するソフトイオン化法の１つである、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる微生物の分析が広く利用されている。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる微生物分析では、試料を混合されたマトリックス溶液を試料プレート上で乾燥させることにより、マトリックス溶液中の溶媒を気化させ、対象物質を含む乾燥物を形成させる。試料プレート上の乾燥物にレーザ光を照射することにより、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して加熱され、気化する。その際、対象物質もマトリックス物質と共に気化し、その過程で対象物質がイオン化される。
　乾燥物の形成および質量分析に用いられる試料プレートは、臨床微生物分析や食品衛生検査の用途に対応した使い捨てのものが多く利用される。ただし、微生物研究の場等においては、繰り返し使用に対応した試料プレートが利用される場合もある。試料プレートは、たとえば、ステンレスまたは導電性樹脂を含む。
　マトリックスは、タンパク質試料を効率よくイオン化する観点から、たとえば、ＣＨＣＡ、シナピン酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸等が用いられる。一般にマトリックスは、溶媒に溶解されて、マトリックス溶液として、試料と混合される。
　マトリックス溶液の組成は、様々なものが提案されている。たとえば非特許文献１～４には、様々なＣＨＣＡに対するマトリックス溶媒の組成が開示されている。表１は、非特許文献１～４に開示される、アセトニトリル（ＡＣＮ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、水、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の物質を所定の含有割合で含むマトリックス溶媒の組成を示す。これらの溶媒を用いて、５～１５ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡを含むマトリックス溶液が調整されている。
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　しかし、これらのマトリックス溶液を用いた乾燥物に対してＭＡＬＤＩ－ＭＳを行なうと、特に高質量領域において、充分な感度が得られないことが問題となっていた。なお、高質量領域とは、ｍ／ｚが比較的大きい領域を示し、たとえばｍ／ｚ１０，０００以上の領域であり、より限定的には、ｍ／ｚ１１，０００以上の領域である。
　微生物の判別において、充分な感度を得ることは重要である。とりわけ、高質量領域において充分な感度を得ることは重要である。その理由は、分子量が大きいタンパク質の方がアミノ酸配列が長く、その分変異が生じる可能性が高くなるからである。そのため、特に類縁性の高い微生物を判別する場合には、高質量領域のピーク検出が重要である。類縁性の高い微生物の判別とは、たとえば、同種内の亜種または株の判別である。
　そのため、発明者らは、高質領領域においても充分な感度を得るために必要な実験条件を検討した。
　［３．従来のマトリックス溶液を用いた乾燥物の形成仮定についての検討］
　発明者らは、実験条件について検討する中で、従来の質量分析方法においては、乾燥物の形成過程に問題があると推定し、その解決方法を模索した。
　発明者らは、まず、従来のマトリックス溶液を試料プレートに形成されたウェル上に滴下して乾燥物を形成させる過程で、当該マトリックス溶液が狭い範囲に偏ってしまうことが多いことに着目した。この場合、ウェルの端に試料結晶が形成されると、自動測定の際にレーザが試料に適切に照射されない場合がある。このような場合、試料の分析により得られるマススペクトルにおける感度は十分でない可能性がある。
　次に発明者らは、ウェルの端に偏在して乾燥物が形成されることを抑制するために、マトリックス溶液の量を増やして滴下することにより、ウェル全体に乾燥物を形成することを検討した。しかし、ウェルに滴下するマトリックス溶液の量を増加させると、マトリックス溶液の乾燥にかかる時間が長くなる、および／または、乾燥物が分厚くなり良好なマススペクトルが得られなくなる、といった可能性がある。
　そこで、発明者らはマトリックス溶液の組成を工夫することで、ウェルに滴下するマトリックス溶液の量を増やすことなく、ウェル全体に乾燥物を形成することを検討した。
　［４．望ましいマトリックス溶液の組成についての検討］
　まず、発明者らは、マトリックス溶液をウェル全体に広げるために、有機溶媒を多く添加して表面張力を低下させることを検討した。しかし、マトリックス溶液の有機溶媒濃度が高すぎる場合、菌体から脂質が多く溶出し、タンパク質のイオン化が阻害される可能性が高くなる可能性があった。また、マトリックス溶液の有機溶媒濃度が高すぎる場合、乾燥速度が速くなるためにタンパク質のイオン化に適さない小さい乾燥物が形成されてマススペクトルのピーク強度が弱くなる可能性が考えられた。よって、単純に有機溶媒を増やすのではなく、別の方法によって、微生物のタンパク質を中心とした細胞構成成分のＭＡＬＤＩ－ＭＳ測定に適したマトリックス試薬の組成を編み出す必要があると考えられた。
　以上の検討結果に基づいて、発明者らは、下記の第１～第３条件を満たす乾燥物を形成することにより、高質量領域においても感度が高いマススペクトルを取得することができることを見いだした。
　第１条件は、乾燥物が広く、より好ましくは、ウェル全体に形成されることである。なお、本明細書において、乾燥物が広く形成されるとは、乾燥物の上面（レーザ照射される側の面）の面積が広く形成されることを示す。乾燥物が広く形成されることにより、好ましくは、ウェル全体に形成されることにより、質量分析においては、広い面積から対象物質の検出信号が得られる。よって、直接的に感度が向上する。
　第２条件は、乾燥物の均一性が高いことである。乾燥物の均一性が高いことの一例は、乾燥物の上面の形状の均一性が高いことである。乾燥物の上面の形状の均一性が高いことの例は、たとえば乾燥物の上下方向の厚みの場所による変化が小さいことであり、また、たとえば乾燥物の上面の凹凸が少なく、平坦に近いことである。
　乾燥物の均一性が高いことの他の例は、乾燥物の内部構造の均一性が高いことである。乾燥物の内部構造の均一性が高いことは、たとえば、乾燥物中の対象物質およびマトリックスの割合および／または結合様式が、乾燥物の少なくとも上面では、場所による差が小さいことである。また、たとえば、ウェル内の乾燥物が１つにまとまり、複数の小さな乾燥物が形成されないことである。
　乾燥物の均一性が高いことにより、タンパク質が適切にイオン化され、信号強度が大きくなることにより、感度が向上する。
　第３条件は、微生物の菌体構成成分を良好に抽出した混合溶液に由来する乾燥物であることである。微生物の菌体構成成分を良好に抽出するとは、たとえば、微生物の菌体構成成分を高効率で抽出することであり、より具体的には、微生物当たりの対象物質の抽出量が多いことである。これにより、乾燥物中の対象物質の濃度が上昇し、対象物質の検出信号も強く得られることから、感度が向上する。
　すなわち、発明者らは、第１条件～第３条件を満たす乾燥物を形成する、マトリックス溶液が得られれば、高感度のマススペクトルを取得することができると考えた。また、発明者らは、マススペクトル全体において感度が向上する結果、従来充分な感度が得られなかった高質量領域においても、充分な感度が得られると考えた。
　以上の観察および考察結果に基づいて、発明者らは、高感度のマススペクトルを取得できる乾燥物を形成するマトリックス溶液の組成を発明した。
　発明者らは特に、マトリックス溶媒の組成を工夫することにより、高質量領域で高感度にピークを検出できる乾燥物を得られることを見いだした。本明細書において、マトリックス溶媒の組成とは、マトリックス溶媒に含まれる試薬および物質の種類と、当該試薬および物質の含有割合および／または濃度とを含む。
　［５．実施形態に係るマトリックス溶液を用いた質量分析］
　（５－１．実施形態に係るマトリックス溶液の組成）
　図２は、比較例および本実施形態に係るマトリックス溶媒の組成を説明する図である。図２には、各マトリックス溶媒中のアセトニトリル、エタノール、トリフルオロ酢酸および水の体積の割合が、マトリックス溶媒全体の体積を１００としたときのパーセンテージで表されている。上述のアセトニトリル、エタノール、トリフルオロ酢酸および水は、それぞれ公知の方法によって製造してもよいし、市販品を入手してもよい。
　図２を参照して、本実施形態に係るマトリックス溶媒は、有機溶媒であるアセトニトリルおよびエタノールの割合が、比較例１，２に係るマトリックス溶媒の各々とは異なることを特徴とする。
　以下に、具体的な組成を説明する。比較例１に係るマトリックス溶媒に含まれる有機溶媒はアセトニトリル５０％であり、比較例２に係るマトリックス溶媒に含まれる有機溶媒はアセトニトリル３５％、エタノール２５％である。
　一方、本実施形態に係るマトリックス溶媒に含まれる有機溶剤はアセトニトリル３０～４０％、エタノール１０～２０％であり、より好ましくは、アセトニトリル３３～３７％、エタノール１３～１７％であり、さらに好ましくはアセトニトリル約３５％、エタノール約１５％である。本実施形態に係るマトリックス溶媒は、さらに、１～３％のトリフルオロ酢酸を含み、より好ましくは、１～２％のトリフルオロ酢酸とを含む。なお、マトリックス溶媒の残部が水であることは言うまでもない。
　本実施形態の一側面において、マトリックス溶媒に含まれるアセトニトリルの含有割合は、体積比で、３０～４０％であり、３３～３７％であることが好ましく、約３５％であることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、マトリックス溶媒に含まれるエタノールの含有割合は、体積比で、１０～２０％であり、１３～１７％であることが好ましく、約１５％であることがより好ましい。
　各マトリックス溶媒は、アセトニトリル、エタノール、トリフルオロ酢酸、水の割合が足して１００％となるように調製される。調製方法は、特に制限はなく、例えば試験管内で、アセト二トリル、エタノールおよびトリフルオロ酢酸を、水に加えて調製してもよいし、化学プラント等において、工業規模でアセトニトリル、エタノールおよびトリフルオロ酢酸を、水に加えて製造してもよい。
　本実施形態に係るマトリックス溶媒は、さらに、マトリックスを５～２０ｍｇ／ｍｌ含むように、好ましくは５～１５ｍｇ含むように、さらに好ましくは、８～１０ｍｇ／ｍｌ含むように調製され、マトリックス溶液として使用される。
　一実施例において、マトリックスは、質量分析において最もよく用いられているマトリックスの１つである、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（４－ＣＨＣＡ、本明細書では単にＣＨＣＡとも記載）である。マトリックスは、同じく質量分析において最もよく用いられているマトリックスである、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸であってもよい。マトリックスのその他の例は、これに限定されるものではないが、３－ヒドロキシ－４－ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、α－シアノ－３－ヒドロキシケイ皮酸（３－ＣＨＣＡ）、フェルラ酸、または、１，５－ジアミノナフタレン等であってもよい。
　なお、図４～図６では、実施形態に係るマトリックス溶液の一例として、アセトニトリル３５％、エタノール１５％、トリフルオロ酢酸１％、水３９％を含むマトリックス溶媒に、ＣＨＣＡを１０ｍｇ／ｍＬ含む溶液の、実験結果の一例を示した。また、比較例１に係るマトリックス溶液の一例として、アセトニトリル５０％、トリフルオロ酢酸１％、水４９％を含むマトリックス溶媒に、ＣＨＣＡを１０ｍｇ／ｍＬ含む溶液を使用した。比較例２に係るマトリックス溶液の一例として、アセトニトリル３５％、エタノール２５％、トリフルオロ酢酸１％、水３９％を含むマトリックス溶媒に、ＣＨＣＡを１０ｍｇ／ｍＬ含む溶液を使用した。
　（５－２．実施形態に係るマトリックス溶液を用いた乾燥物の形成）
　実施形態に係るマトリックス溶液を試料と混合して、試料プレート上で乾燥させることにより乾燥物が形成される。
　図３は、試料プレート上の乾燥物の形成方法を説明するための図である。図３においては、試料プレートＰにおけるウェルＷ上に、ピペット５によってマトリックス溶液Ｍが配置される様子が図示されている。
　試料プレートＰは、一般的なＭＡＬＤＩ用プレートであり、たとえば、ステンレスおよび／または導電性樹脂を含むプレートである。
　試料は微生物由来の試料であり、一実施例によれば、大腸菌由来の試料である。分析者は、マイクロチューブにマトリックス溶液９μＬを加え、さらに大腸菌の培養液１μＬを加え、よく混合し、混合溶液のうち１μＬを試料プレートＰに滴下する。
　試料プレートＰのウェルＷ上に配置されたマトリックス溶液を乾燥させることにより、乾燥物が形成される。
　発明者らの肉眼および撮影機器を利用した観察によれば、比較例１のマトリックス溶液により形成された乾燥物（以下、比較例１の乾燥物とも称する）、比較例２のマトリックス溶液により形成された乾燥物（以下、比較例２の乾燥物とも称する）においては、プレートの狭い範囲に偏って形成されることが多い。また、関連してプレートの端部に乾燥物が形成されてしまう場合もある。一方で、本実施形態のマトリックス溶液により形成された乾燥物（以下、実施形態の乾燥物とも称する）は、プレート全体に均一に広がる。図４に、比較例１の乾燥物、比較例２の乾燥物、実施形態の乾燥物の外形の一例を示す。
　図４は、試料プレート上の乾燥物の撮影像を示す図である。図４は、分析装置１内のイオン化部２１におけるＣＣＤ（Charge　Coupled　Device）をイメージセンサとして含むカメラ（ＣＣＤカメラ）によって、撮影した乾燥物の白黒画像である。
　図４に示すように、比較例１の乾燥物は、ウェルＷの右下部に偏って形成されている。乾燥物は明るく、また、粒子状の凹凸（図示せず）が密に見られる。また、乾燥物の一部は、ウェルＷの外枠からはみ出ている。
　比較例２の乾燥物の中央部は、やや明るく、粒子状の凹凸（図示せず）が見られる。比較例２の乾燥物の外縁部は、中央部よりは暗く平面的に広がるように見られる。
　実施形態の乾燥物は、ウェル全体に広く、均一に広がるため、全体に厚みが薄くなり、ＣＣＤ白黒画像においては試料プレートのベースと区別しがたい暗さとなる。
　このように、実施形態の乾燥物は、比較例１の乾燥物、比較例２の乾燥物の各々とは異なる状態を示す。当該乾燥物の状態の差は、アセトニトリルおよびエタノールの濃度を変更したことにより、表面張力の強さ、乾燥速度、乾燥物中に含まれる菌体構成成分の種類および／または量の差、乾燥物の均一性の差の少なくとも１つが変化したことを反映していると考えられる。
　より特定的には、実施形態の乾燥物は、比較例１の乾燥物、比較例２の乾燥物の各々よりも、広く均一な厚みを有する。発明者らは実施形態の乾燥物におけるこの特徴が、試料によらず、高い再現性を持つことを確認している。
　発明者らは、関連して、実施形態に係るマトリックス溶液は、比較例１および２に係るマトリックス溶液の各々に比べて、乾燥速度が速く、短時間で乾燥物を形成することを確認している。この乾燥速度の速さは、組成（特にアセトニトリルおよびエタノールの濃度）そのものによる気化速度の差、試料プレート上に滴下されたマトリックス溶液の空気に触れる表面積の差（特にマトリックス溶液上面の面積の差）を主に反映していると考えられる。乾燥速度の速さの差は、混合溶液中に含まれる菌体構成成分の量および／または種類の差、混合溶液の均一性（対象物質およびマトリックスの割合または結合様式の均一性）の少なくとも１つを反映している可能性も考えられる。この乾燥速度の速さにより、上記した、均一性の高い乾燥物を短時間で形成することができる。
　このような実施形態の乾燥物の特徴的な結晶状態が反映されて、続く図５で示すような、高感度のマススペクトルが得られたと考えられる。
　（５－３．実施形態に係るマトリックス溶液を用いた乾燥物による質量分析結果）
　図５は、大腸菌のマススペクトルを示す図であり、上から、比較例１の乾燥物のマススペクトル（以下、「比較例１のマススペクトル」とも称する）、比較例２の乾燥物のマススペクトル（以下、「比較例２のマススペクトル」とも称する）、実施形態の乾燥物のマススペクトル（以下、「実施形態のマススペクトル」とも称する）を含む。図５の横軸はｍ／ｚ、縦軸は検出信号の強度を示す。ｍ／ｚ１１，０００以上の領域は、１０倍された信号強度が表示されている。
　図５を参照して、実施形態に係るマススペクトルは、比較例１および比較例２に係るママススペクトルの各々よりも、全体的にピークの強度が向上し、感度が向上している。特に、高質量領域（たとえば約ｍ／ｚ１１，０００以上の領域）では、比較例１および比較例２に係るママススペクトルの各々ではピークがほとんど検出されておらず、ごく小数の検出されたピークも強度が非常に小さいのに対し、本実施形態のマススペクトルでは高強度のピークが多数検出されている。このように、本実施形態のマススペクトルは、全体に感度が向上し、特に高質量領域において顕著に感度が向上している。これにより、高質量領域においても、充分な感度が得られる。すなわち、実施形態に係るマトリックス溶液を使用することにより高感度でピークが検出できている。
　また、実施形態のマススペクトルにおいて多数のピークが高強度で検出されていることから、微生物からの菌体構成成分の抽出自体も良好に行なわれていることがわかる。すなわち、本実施形態に係るマトリックス溶液は、菌体構成成分を高効率で、少なくとも比較例１，２の各々に係るマトリックス溶液と同等以上の効率で、抽出できている。
　図６は、検出されたリボソームタンパク質の数を示す図である。
　より詳細には、図６は、図５に一部を示したようなマススペクトルにおける各ピークについて、対応するｍ／ｚおよびピーク強度を含むピークリストである。図６においては、大腸菌で発現することが知られているリボソームタンパク質の分子量から計算した理論的なｍ／ｚと、ピークリストのｍ／ｚとを比較することによって計算された、ピークリスト中に含まれるリボソームタンパク質の数が示されている。
　実施形態に係るマトリックス溶液を使用した乾燥物については、１６検体中、平均２５種のリボソームタンパク質を検出することができる。一方、比較例１，２に係るマトリックス溶液を使用した乾燥物については、１４種、２０種である。すなわち、本実施形態の乾燥物は、比較例１，２より多くのリボソームタンパク質を検出することができる。すなわち、実施形態に係るマトリックス溶液を使用することで、比較例１，２に係るマトリックス溶液を使用する場合に比べ、より多くのバイオマーカを利用して微生物を判別できる。
　図５、図６より、実施形態に係るマトリックス溶液を用いれば、マススペクトル全体において感度が向上し、特に、高質量領域においても充分な感度を得ることが可能となる。これにより、当該マススペクトルに基づく微生物の判別精度が向上する。これにより、後述する図８で示すように、類縁度の高い微生物の分類も可能になる。
　（５－４．実施形態に係るマトリックス溶液および質量分析方法の効果）
　図４に示したように、本実施形態に係るマトリックス溶液によれば、ウェル内に広く均一に広がる乾燥物を調製できる。これにより、乾燥物上面から広く均一な信号を取得することができるので、高効率に高感度のマススペクトルを得ることができる。
　関連して、ウェル内で混合溶液が広く広がる結果、乾燥速度が向上する。これにより、均一な乾燥物を短時間で調製することができるため、効率よく良好な試料調製が可能になる。
　菌体構成の構成成分の抽出が良好に行なわれるため、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより検出できる微生物由来のタンパク質が多くなる。すなわち、マススペクトルにおいて検出されるピークの数が増加する。このような情報量の増加も、微生物の判別精度の向上に寄与する。
　以上の効果から、本実施形態に係るマトリックス溶液を用いた質量分析法による微生物判別の精度が向上する。
　［６．質量分析処理および微生物の判別処理］
　図７は、質量分析処理および微生物の判別処理を示すフローチャートである。図７に示すステップは、一般的な微生物の培養および質量分析に用いられる実験装置を用いて分析者の手作業で行なわれる。なお、図中において、「Ｓ」は「ＳＴＥＰ」の略称として用いられる。
　Ｓ１において、分析者は、試料に、本実施の形態に係るマトリックス溶液を混合する。
　Ｓ２において、分析者は、試料が混合されたマトリックス溶液を試料プレート上で乾燥し、乾燥物を形成する。
　Ｓ３において、分析者は、乾燥物に対し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことにより、マススペクトルを取得する。
　Ｓ４において、分析者は、マススペクトルを含むデータベースを作成し、記憶部１２に記憶する。
　Ｓ５において、分析者は、データベースに含まれるマススペクトルを用いて、微生物の種類を判別する。
　図７の処理によれば、本実施の形態に係るマトリックス溶液を使用することにより、高感度のマススペクトルが得られ、特に高質量領域でも充分な強度を有するピークが多数検出できる。その結果、微生物の判別精度を向上することができる。
　以上の例では、本実施形態に係るマトリックス溶液を用いれば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいて、高感度のマススペクトル測定が可能であり、その結果、微生物由来の試料に対して判別精度が向上することを示したが、本実施形態に係るマトリックス溶液は、微生物以外の生物に由来する生物試料にも援用可能であることは明らかである。
　なお、本実施形態に係るマトリックス溶液に含まれる物質の種類、含有割合および／または濃度は一例である。特に、アセトニトリルおよびエタノール以外の物質（たとえば、トリフルオロ酢酸、水、マトリックス）の種類、含有割合および／または濃度は、当業者によって通常考えられる範囲かつ調整可能な範囲で変更することが可能であり、その場合も、上記の実施形態と同等の作用効果が得られるものと考えられる。たとえば、本願の効果を奏する範囲であれば、複数の種類のマトリックスをその合計の濃度が８～２０ｍｇ／ｍｌ含むように調整したマトリックス溶液を用いてもよい。なお、本実施形態に係るマトリックス溶液に含まれる物質（たとえばアセトニトリル、エタノール）の種類、含有割合および／または濃度は、たとえば、ガスクロマトグラフによって測定可能である。
　［７．実験例］
　以下に、本実施形態に係るマトリックス溶液を用いた質量分析方法により、微生物を分析した結果を示す。
　図８は、本実施形態に係るマトリックス溶液を用いた質量分析方法により、アクネ菌（Ｃ．ａｃｎｅｓ：Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ）を質量分析した結果、得られたリボソームタンパク質のピークを示す表である。
　図８の左欄３１は、アクネ菌の株（ｓｔｒａｉｎ）を、系統型（ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ）ごとに、理化学研究所の微生物材料開発室（ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）における管理番号により示す。
　右欄３２は、バイオマーカーとなるタンパク質（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の検出結果を示している。行３３には、バイオマーカであるリボソームタンパク質の名称が示されている。行３３の下の行３４には、各リボソームタンパク質の分子量が示されている。行３５には、株ごとに、上記分子量においてピークが検出されたか否かが、１（検出された）または０（検出されなかった）で示されている。
　領域３６で示すＬ７／Ｌ１２～Ｓ１９のリボソームタンパク質については、特定のリボソームタンパク質の分子量は株によって変化しなかった。これにより、Ｌ７／Ｌ１２～Ｓ１９のピークを用いても、アクネ菌内での株は判別できなかった。
　一方、領域３７で示すＬ６、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ２３で示されるリボソームタンパク質については、分子量は株によって異なった。より特定的には、Ｌ６、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ２３で示されるリボソームタンパク質については、株によって、分子量が約１０～３０異なっていた。これにより、Ｌ６、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ２３のピークに基づいて、アクネ菌内での株が判別できることがわかった。たとえば、整理番号６４２５，１８９１８，１８９２０の３つの株については、Ｌ１３のピークに基づいて判別できた。このように、Ｌ６、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ２３は、アクネ菌内での株の判別のためのバイオマーカとして利用可能であることがわかった。
　Ｌ６、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ２３のリボソームタンパク質の分子量のバリエーションは、各々１９６７９／１９７０７、１６１５４／１６１６８／１６１８２、１５３５８／１５３８５、１１１８１／１１２００であり、全て分子量１１，０００以上の高質量領域に含まれる。よって、高質量のリボソームタンパク質に基づいて、アクネ菌内での株が判別できた。
　以上に示したように、高質量領域のピークを得ることにより、アクネ菌内での微生物の判別ができた。また、アクネ菌内での株の判別を行なうためには、高質量領域のピーク検出が重要であることがわかった。
　このように、高質量領域においても充分な感度を得ることにより、微生物の判別精度が向上する。その結果、遺伝情報が類似しており、判別が比較的困難である類縁性の高い微生物同士についても、判別することが可能になる。よって、微生物の判別において、特に類縁性の高い微生物の判別においては、高質量領域においても充分な感度を得ることが重要である。
　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係るマトリックス溶液は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、試料との混合用に用いられるマトリックス溶液である。マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液である。アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％である。トリフルオロ酢酸の含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１～３体積％である。マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む。
　第１項に記載のマトリックス溶液によれば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおいて、高感度のマススペクトル測定が可能なマトリックス溶液を提供することができる。また、試料が微生物由来の試料である場合、マススペクトルを用いた微生物判別精度を向上することができる。
　（第２項）第１項に記載のマトリックス溶液において、より好ましくは、アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３３～３７体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１３～１７体積％である。
　（第３項）第１または２項に記載のマトリックス溶液は、より好ましくは、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸を８～１０ｍｇ／ｍｌ含む。
　（第４項）第１～３項のいずれか１項に記載のマトリックス溶液において、試料は微生物由来の試料である。
　第４項に記載したように試料が微生物由来の試料である場合、マススペクトルを用いた微生物の判別精度を向上することができる。
　（第５項）一態様に係る質量分析方法は、試料とマトリックス溶液とを混合するステップと、試料が混合されたマトリックス溶液を試料プレート上で乾燥し、乾燥物を形成するステップと、乾燥物に対し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとを備える。マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液である。アセトニトリルの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％である。エタノールの含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％である。トリフルオロ酢酸の含有割合は、マトリックス溶液を基準として、１～３体積％である。マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む。
　第５項に記載の質量分析方法によれば、高感度のマススペクトル測定が可能なマトリックス溶液を提供することができる。また、試料が微生物由来の試料である場合、マススペクトルを用いた微生物判別精度を向上することができる。
　（第６項）第５項に記載の質量分析方法において、試料は微生物由来の試料である。
　第６項に記載したように試料が微生物由来の試料である場合、マススペクトルを用いた微生物の判別精度を向上することができる。
　（第７項）第５または６項に記載の質量分析方法により取得されたマススペクトルを含むデータベースを記憶する記憶媒体。
　第７項に記載した記憶媒体によれば、高感度のマススペクトルを含むデータベースを記憶し、また、外部に取り出すことができる。
　（第８項）第６項に記載の質量分析方法により取得されたマススペクトルを含むデータベースを用いて、微生物の種類の判別を行なう判別方法。
　第８項に記載した判別方法によれば、高感度のマススペクトルを含むデータベースを用いて、微生物を高精度で判別することが可能である。
　（第９項）第８項に記載の判別方法において、微生物の種類は、微生物のジェノタイプ、株、亜種、種、属および科の少なくとも１つの系統分類学の階級を含む。
　第９項に記載した判別方法によれば、第９項に記載したような微生物の種類について、判別精度を向上することが可能である。特に、類縁性の高い微生物同士についても判別することが可能になる。
　（第１０項）第８項または９項に記載の微生物の種類の判別は、微生物の種類に関しての、分類、同定および識別の少なくとも１つを含む。
　第１０項に記載した判別方法において、微生物の種類に関しての、分類、同定および識別についての精度が向上すると考えられる。
　今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　１　分析装置、５　ピペット、Ｍ　マトリックス溶液、１０　制御部、１１　処理部、１２　記憶部、１３　入出力部、２０　測定部、２１　イオン化部、２２　イオン加速部、２３　質量分離部、２４　検出部、１１１　装置制御部、１１２　マススペクトル作成部、１１３　マススペクトル分析部、１１４　判別部、１３１　入力部、１３２　出力部、１３３　通信部、２２１　加速電極、２３１　フライトチューブ、Ｐ　試料プレート、Ｓ　イオン、Ｗ　ウェル。

Claims (10)

  1. 　マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法において、試料との混合用に用いられるマトリックス溶液であって、
    　前記マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液であり、
    　前記アセトニトリルの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％であり、
    　前記エタノールの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％であり、
    　前記トリフルオロ酢酸の含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、１～３体積％であり、
    　前記マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む、マトリックス溶液。
  2. 　前記アセトニトリルの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、３３～３７体積％であり、
    　前記エタノールの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、１３～１７体積％である、請求項１に記載のマトリックス溶液。
  3. 　前記α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸を８～１０ｍｇ／ｍｌ含む、請求項１または２に記載のマトリックス溶液。
  4. 　前記試料は微生物由来の試料である、請求項１または２に記載のマトリックス溶液。
  5. 　試料とマトリックス溶液とを混合するステップと、
    　前記試料が混合された前記マトリックス溶液を試料プレート上で乾燥し、乾燥物を形成するステップと、
    　前記乾燥物に対し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとを備え、
    　前記マトリックス溶液は、アセトニトリルと、エタノールと、トリフルオロ酢酸と、水とを含む水溶液であり、
    　前記アセトニトリルの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、３０～４０体積％であり、
    　前記エタノールの含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、１０～２０体積％であり、
    　前記トリフルオロ酢酸の含有割合は、前記マトリックス溶液を基準として、１～３体積％であり、
    　前記マトリックス溶液は、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、または、シナピン酸を５～２０ｍｇ／ｍｌ含む、質量分析方法。
  6. 　前記試料は微生物由来の試料である、請求項５に記載の質量分析方法。
  7. 　請求項５または６に記載の質量分析方法により取得されたマススペクトルを含むデータベースを記憶する記憶媒体。
  8. 　請求項６に記載の質量分析方法により取得されたマススペクトルを含むデータベースを用いて、微生物の種類の判別を行なう判別方法。
  9. 　前記微生物の種類は、微生物のジェノタイプ、株、亜種、種、属および科の少なくとも１つの系統分類学の階級を含む、請求項８に記載の判別方法。
  10. 　前記微生物の種類の判別は、微生物の種類に関しての、分類、同定および識別の少なくとも１つを含む、請求項８または９に記載の判別方法。
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