JP7302524B2 - 微生物分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、微生物の分析方法に関する。
質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合される。そして、溶液中の溶媒を気化させることにより乾燥させ、分析対象物質を含んだ結晶を形成する。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。
こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、生命科学の分野で広く利用されている。生命科学分野におけるＭＡＬＤＩ－ＭＳの利用の一つに、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物の同定がある。これは、被検微生物を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法であり、短時間で分析結果を得ることができることから、簡便且つ迅速な微生物の同定が可能である。
例えば食中毒の代表的な原因細菌の一つに、グラム陰性通性嫌気桿菌の腸内細菌科に属するサルモネラがある。サルモネラ属にはSalmonella （以下「S.」と略す）enterica、S. bongori及びS. subterraneaの３つの菌種が属し、さらにS. entericaは６つの亜種に分類される。食中毒を引き起こす病原性サルモネラの多くは S. enterica subsp. entericaに属し、その亜種は更に多数の血清型に分類される。サルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、食中毒の感染経路の解明及び感染防止に重要であることから、近年、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いたサルモネラ属菌の識別が試みられている。
Appl. Microbiol. Biotechnol., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.101, No.23-24, pp.8557-8569, 2017
ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるサルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、菌種や亜種、血清型が異なる菌体の間で、マススペクトル上での位置(質量電荷比、m/z値)や高さ（ピーク強度、mV値）が異なるピーク、すなわちバイオマーカーピークを検出することにより行う。細菌をはじめとする微生物の判別では、バイオマーカーピークとしてタンパク質のピークが用いられることが多い（非特許文献１）。
一般的に近縁の微生物の場合、多くのタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zは同じであるか、或いは近似する。従って、サルモネラ属菌を血清型のレベルで正確に判別するためには、バイオマーカーピークとして１種類のタンパク質由来のピークを選出するだけでは足りず、血清型の種類に応じた適切な、複数のタンパク質由来のピークを選出する必要がある。
例えば非特許文献１には、微生物を含む試料を質量分析することにより得られるマススペクトルから１２種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比の値を読み取り、それらの値から該試料に含まれる微生物がサルモネラ属菌の血清型のいずれであるかを判別することが記載されている。しかし、上記１２種類のタンパク質由来のピークをマーカーピークとして用いても、サルモネラ属菌の所定の複数種類の血清型のいずれかであることは判別できても、いずれの血清型であるかを特定することができない場合があった。
本発明が解決しようとする課題は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物分析方法において、サルモネラ属菌の特定の血清型を正確に識別できるようにすることである。
上記課題を解決するために成された本発明は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるアボニー（Abony）、パキスタン（Pakistan）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
また、上記課題を解決するために成された本発明は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記３種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
さらに、上記課題を解決するために成された本発明は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
本発明によれば、試料に、サルモネラ属菌の２種類の血清型であるAbonyとPakistanのいずれかの菌が含まれる場合にその菌の血清型が前記２種類のいずれであるか、また、試料に、サルモネラ属菌の３種類の血清型であるMinnesotaとInfantisとBrandenburgのいずれかの菌が含まれる場合にその菌の血清型が前記３種類のいずれであるか、さらに、試料に、サルモネラ属菌の２種類の血清型であるSchwarzengrundとMontevideoのいずれかの菌が含まれる場合にその菌の血清型が前記２種類のいずれであるかを、正確に識別することができる。
本発明に係る微生物の分析方法に用いられる微生物分析システムの概略的な全体構成図。 微生物分析方法の手順の一例を示すフローチャート。 サルモネラ属菌のAbonyとPakistan（第１グループ）の２種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準を満たす、表２の７個のピーク付近を示す図。 サルモネラ属菌のAbonyとPakistan（第１グループ）の２種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準は満たさないが第１基準を満たす、表１の７個のピーク付近を示す図。 サルモネラ属菌のMinnesotaとInfantisとBrandenburg（第２グループ）の３種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準を満たす、表４の３個のピーク付近を示す図。 サルモネラ属菌のMinnesotaとInfantisとBrandenburg（第２グループ）の３種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準は満たさないが第１基準を満たす、表３の３個のピーク付近を示す図。 サルモネラ属菌のSchwarzengrundとMontevideo（第３グループ）の２種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準を満たす、表６の４個のピーク付近を示す図。 サルモネラ属菌のSchwarzengrundとMontevideo（第３グループ）の２種類の血清型の各菌体を含む試料について得られたマススペクトル上のピークのうち、第２基準は満たさないが第１基準を満たす、表５の３個のピーク付近を示す図。
本発明の微生物分析方法は、そこに含まれる微生物が、サルモネラ属菌の３つの血清型のグループのいずれかの菌が含まれていることが既知である試料を対象とする。ここで３つの血清型のグループとは、２種類の血清型であるAbonyとPakistanからなるグループ（以下、第１グループという）、３種類の血清型であるMinnesotaとInfantisとBrandenburgとからなるグループ（以下、第２グループという）、２種類の血清型であるSchwarzengrundとMontevideoからなるグループ（以下、第３グループという）をいう。つまり、第１グループのサルモネラ属菌が含まれていることは既知であるが、その菌の血清型がAbonyとPakistanのいずれであるかが未知である試料、または第２グループのサルモネラ属菌が含まれていることは既知であるが、その菌の血清型がMinnesotaとInfantisとBrandenburgのいずれであるかが未知である試料、または第３グループのサルモネラ属菌が含まれていることは既知であるが、その菌がSchwarzengrundとMontevideoのいずれであるかが未知である試料、を分析対象とする。
すなわち、本発明に係る微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるアボニー（Abony）、パキスタン（Pakistan）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特に、3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
上述した質量電荷比に対する２種類の血清型であるアボニー（Abony）およびパキスタン（Pakistan）のピーク検出状況を、表１および表２に示す。本発明においては、表１あるいは表２の質量電荷比におけるピークをマーカーピークとし、これらのピークの検出状況を確認することで、２種類の血清型であるアボニー（Abony）およびパキスタン（Pakistan）のいずれの血清型であるかを判別する。
Figure 0007302524000001
Figure 0007302524000002
また、本発明に係る微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記３種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特に、6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
上述した質量電荷比に対する３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のピーク検出状況を、表３および表４に示す。本発明においては、表３あるいは表４の質量電荷比におけるピークをマーカーピークとし、これらのピークの検出状況を確認することで、３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれの血清型であるかを判別する。
Figure 0007302524000003
Figure 0007302524000004
また、本発明に係る微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特に、5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
上述の質量電荷比に対する２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のピーク検出状況を、表５および表６に示す。本発明においては、表５あるいは表６の質量電荷比におけるピークをマーカーピークとし、これらのピークの検出状況を確認することで、２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれの血清型であるかを判別する。
Figure 0007302524000005
Figure 0007302524000006
上記微生物分析方法におけるピーク抽出の基準としては、例えば、以下の第１基準、又は第２基準が用いられるが、これらに限定されるものではない。第１基準に比べて第２基準の方がピークの抽出基準が厳しく、第２基準を用いると誤判定を減らすことができる可能性がある。但し、菌株や培養条件によってはピークの強度比が変わることもあるため、血清型を判定する目的に応じて第１及び第２基準のどちらを採用するかを決めると良い。また、まずは第１基準でピークを抽出した後、抽出されたピークの中からさらに第２基準を満たすピークを抽出しても良い。あるいは、まずは第２基準でピークを抽出した後、目的とする血清型の識別が困難な場合、第２基準は満たさないが第１基準は満たすピークを抽出し、識別してもよい。各ピークの質量電荷比の値は大凡の値であり、質量分析に用いられる装置の種類や分析条件等の違いによって変動する範囲を含むものとする。表１、表３、及び表５は第１基準を用いた場合のピーク検出状況を示し、表２、表４、及び表６は第２基準を用いた場合のピーク検出状況を示す。各表において、丸印はピークが検出されたことを、Ｘ印はピークが検出されなかったことを示している。
(1) 第１基準
２種類の血清型から成るグループの場合、一方の血清型のサルモネラ属菌を含む試料から得られたマススペクトルにおいて、Ｓ／Ｎ≧３のピークとして検出され、他方の血清型のサルモネラ属菌を含む試料から得られたマススペクトルではピークが非検出であるか又はピークのＳ／Ｎの差が５倍以上であるピーク、または、一方のマススペクトルにおいてＳ／Ｎ≧３のピークとして検出され、他方のマススペクトルにおいてはピークが非検出であるか又はＳ／Ｎの差が１０倍以上であるピークであり、且つ質量電荷比 m/z値の近い近接ピークが存在するか近接ピークと一部重なるピークを抽出する。
３種類の血清型から成るグループの場合、当該３種類の血清型のうちのいずれか一つを含む試料から得られた３個のマススペクトルのうちの一つにおいて、Ｓ／Ｎ≧３のピークとして検出され、残り２つのマススペクトルではピークが非検出であるか又はピークのＳ／Ｎの差が５倍以上であるピーク、または、３個のマススペクトルのうちの一つではＳ／Ｎ≧３のピークとして検出され、残り２つのマススペクトルではピークが非検出であるか又はピークのＳ／Ｎの差が１０倍以上であるピークであり、且つ質量電荷比m/z値の近い近接ピークが存在するか近接ピークと一部重なるピークを抽出する。
(2) 第２基準
２種類の血清型から成るグループの場合、一方の血清型のサルモネラ属菌を含む試料から得られたマススペクトルにおいて、Ｓ／Ｎ≧１０のピークとして検出され、他方の血清型のサルモネラ属菌を含む試料から得られたマススペクトルではピークが非検出であるか又はピークのＳ／Ｎの差が１０倍以上であるピークを抽出する。
３種類の血清型から成るグループの場合、当該３種類の血清型のうちのいずれか一つを含む試料から得られた３個のマススペクトルのうちの一つにおいて、Ｓ／Ｎ≧１０のピークとして検出され、残り二つのマススペクトルではピークが非検出であるか又はピークのＳ／Ｎの差が１０倍以上であるピークを抽出する。
いずれの場合も、第２基準に基づき抽出したピークには、誤判定につながる近接ピークや一部が重なるピークが存在せず、単独で存在するピークであることを条件とする。
このとき、m/z値は、例えば800 ppm、好ましくは500 ppmの精度で、その精度内に複数のピークが存在する場合はより近いm/z値のマーカーピークが選択されるものとする。
試料に含まれる微生物が第１～第３グループのうちのどのグループのサルモネラ属菌であるかは、例えば非特許文献１に開示されている１２種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比の値を用いて識別することができる。
本発明の微生物識別方法では、１個の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、各グループのいずれの血清型の菌であるかを識別しても良いが、複数個の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて各グループのいずれの血清型の菌であるかを識別することにより、識別の精度が上がる。
本発明の微生物分析方法に用いられる質量分析装置としては、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）が好ましい。また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。
次に、本発明に係る微生物分析方法に用いられる微生物分析システムの一実施形態について説明する。
図１は、微生物分析システムの概略的な全体構成を示している。このシステムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４及び第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５によりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
図１においては、血清型決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、及び血清型判定部３９が示されている。これはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が血清型決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、血清型決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物識別を行うプログラム等を利用することができる。
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５、第１データベース３４、及び第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理及び／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法及び質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を4,000～30,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。そして、抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養環境を規格化しておくことが望ましい。
記憶部３０の第２データベース３６には、既知微生物を種よりも下位の分類である血清型で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。なお、第２データベース３６には、血清型以外の下位の分類（例えば亜種、病原型、株）などで識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されていてもよい。
本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物がサルモネラ属菌である場合にその血清型を判定するための１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）に由来するピークの質量電荷比の値（非特許文献１参照）、及び被検微生物が、サルモネラ属菌のうち第１～第３グループのいずれかに属する血清型であると判定された場合にその血清型を特定するためのマーカータンパク質に関する情報、具体的には、第１グループに属する２種類の血清型のいずれかであると判定された場合にその２種類の血清型のどちらか、第２グループに属する３種類の血清型のいずれかであると判定された場合にそれら３種類の血清型のいずれであるか、或いは第３グループに属する２種類の血清型のいずれかであると判定された場合にその２種類の血清型のどちらか、を特定するための所定のマーカーピークの質量電荷比の値（具体的には表１～表６に記載されている質量電荷比の値の組み合わせ）が記憶されている。
第２データベース３６に記憶されるマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ－末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ－末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
次に、上記の微生物分析システムを用いたサルモネラ属菌の血清型の分析手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップ１０１）。
次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップ１０３）。そして、この生物種がサルモネラ属菌でなかった場合は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップ１１４）、分析処理を終了する。一方、前記生物種がサルモネラ属菌であった場合は、続いて血清型決定プログラム３５による分析処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中にサルモネラ属菌が含まれることが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、血清型決定プログラム３５に進めばよい。
血清型決定プログラム３５では、被検微生物のマススペクトルを第２データベースに収録されているマーカータンパク質の質量電荷比の値と照合し、被検微生物の血清型を判別する（ステップ１０４）。具体的には、まず血清型判定部３９が上述した１２種類のマーカータンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA））に由来するピークの質量電荷比の値を、第２データベース３６から読み出す。続いてスペクトル取得部３７が、ステップ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲にピークが現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、そのピークの質量電荷比の値に基づいて血清型を判別する。
その結果、被検微生物の血清型が第１グループに属する血清型（Abony, Pakistan）であると判定された場合（ステップ１０５）は、第２データベースから第１グループに属する血清型に対応する所定のマーカーピークの質量電荷比の値を取得する（ステップ１０９）。
一方、被検微生物の血清型が第２グループに属する血清型（Minnesota, Infantis, Brandenburg）であると判定された場合（ステップ１０６）は、第２データベースから第２グループに属する血清型に対応する所定のマーカーピークの質量電荷比の値を取得する（ステップ１１０）。
また、被検微生物の血清型が第３グループに属する血清型（Schwarzengrund, Montevideo）であると判定された場合（ステップ１０７）は、第２データベースから第３グループに属する血清型に対応する所定のマーカーピークの質量電荷比の値を取得する（ステップ１１１）。
ここで、被検微生物の血清型が第１～第３グループのいずれに属する血清型でもないと判定された場合（ステップ１０８）は、被検微生物の血清型を第１～第３グループに属する血清型のいずれでもない血清型として表示部２３に出力する（ステップ１１４）。
そして、第１～第３グループのいずれかに属する血清型であると判定され、各グループに属する血清型に対応する所定のマーカーピークの質量電荷比の値が取得されると、それら質量電荷比の値に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークの有無を確認し（ステップ１１２）、その状況に基づいて被検微生物の血清型を決定し（ステップ１１３）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップ１１４）。
以下、本実施形態の微生物分析方法の効果を実証するために行った実験について説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．サルモネラ属菌の培養
サルモネラ属菌（Salmonella enterica）のうち、第１グループに属する２種類のサルモネラ属菌と、第２グループに属する３種類のサルモネラ属菌と、第３グループに属する２種類のサルモネラ属菌の計７種類のサルモネラ属菌を、ＬＢ寒天培地を用いて３７℃で２０時間培養した。
第１～第３グループには、それぞれ以下のサルモネラ属菌が属する。
(1) 第１グループ
S. Abony, NBRC100797
S. Pakistan, GTC09493
(2) 第２グループ
S. Minnesota, NBRC15182
S. Infantis, ATCC BAA-1675
S. Brandenburg, jfrlSe1402-3
(3) 第３グループ
S. Schwarzengrund, HyogoSO12004
S. Montevideo, jfrlSe1409-6
２．マトリックス溶液の作製
以下の２種類のマトリックス溶液を作製した。
(2-1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－１」とする。
(2-2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）及び０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％、界面活性剤であるデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－２」とする。
マトリックス溶液ＳＡ－１及びＳＡ－２に用いたＳＡは富士フイルム和光純薬工業株式会社製、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰはシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製のものを用いた。
３．マトリックス・微生物懸濁液の調製
(3-1) ＬＢ寒天培地で培養した７種類のサルモネラ属菌をそれぞれ約１mgずつ微量天秤で秤量してチューブに入れ、そこにマトリックスＳＡ－２溶液を加えて菌濃度が１mg/0.075mL（１×１０７CFU/ μＬ）になるように調製し、それをニードルで懸濁した。
(3-2) チューブに１分間、超音波振動を与え、得られた懸濁液を遠心分離（12000rpm、５min）して遠心上清液を得た。
４．ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる分析
(4-1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬずつ滴下した（プリコート）。
(4-2) 続いて、マトリックス溶液ＳＡ－１がプリコートされた各ウェルに、上記の遠心上清液を１μＬずつ滴下し、自然乾燥させた。
(4-3) (4-2)で得られたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートを、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（AXIMA Performance, 株式会社島津製作所製）に挿入し、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。測定データは、全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
５．ピークの抽出
測定データに対してサルモネラ属菌の自己キャリブレーションを適用し（具体的には、サルモネラ自身の幾つかの帰属済みのピークを内部標準として用いてキャリブレーションを行い）、得られたマススペクトルについて、血清型の識別に有用なピークを抽出した。抽出したピークに対し、非特許文献１で示される１２種類のマーカータンパク質に由来するピークの質量電荷比の値を読み取り、それらの値から該試料に含まれる微生物がサルモネラ属菌の血清型のいずれであるかを判別した。
上記１２種類のマーカータンパク質による血清型の判別において、サルモネラ属菌の２種類の血清型であるアボニー（Abony）、パキスタン（Pakistan） のいずれかの菌であると判別された場合は、得られたマススペクトルに対し、3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990から選択される、１又は複数の質量電荷比の値のピーク検出状況を確認した。
上記１２種類のマーカータンパク質による血清型の判別において、サルモネラ属菌の３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれかの菌であると判別された場合は、得られたマススペクトルに対し、6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13367、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838から選択される、１又は複数の質量電荷比の値のピーク検出状況を確認した。
上記１２種類のマーカータンパク質による血清型の判別において、サルモネラ属菌の２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれかの菌であると判別された場合は、得られたマススペクトルに対し、5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001から選択される、１又は複数の質量電荷比の値のピーク検出状況を確認した。
なお、m/z値は、800 ppm、好ましくは500 ppmの精度で評価し、その精度内に複数のピークが存在する場合はより近いm/z値のマーカーピークが選択されるものとして評価した。
５．結果
（１）第１グループ
第１グループに属する２種類のサルモネラ属菌（S. Abony、S. Pakistan）のいずれかを含む試料から得られたマススペクトルについて、上述の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認すると、表１および表２の検出状況が確認された。表１及び表２において「○」はその質量電荷比のマーカーピークが検出されたことを、「×」は検出されなかったことを示している。
図３は、第２基準を満たすピークのm/z値（つまり表２に示されたm/z値）のうち、4165.7、5487.4、6238.3、7858.2、8329.5、9911.9、15713.9付近のマススペクトルを示している。また、図４は、第１基準を満たすが第２基準は満たさないピークのm/z値のうち、5506.7、6261.2、7588.5、9669.0、11847.4、13444.3、15990.2付近のマススペクトルを示している。図３及び図４において、上段はS. Abonyのマススペクトル、下段はS. Pakistanのマススペクトルを示す。図３及び図４において矢印は抽出されたピークを示している。
図３及び図４に示すように、第１及び第２基準に基づき抽出されたピークは、S. AbonyのマススペクトルとS. Pakistanのマススペクトルのいずれか一方にのみ現れていることから、そのピークの有無により試料に含まれるサルモネラ属菌がS. Abony、S. Pakistanのいずれであるか、つまり、サルモネラ属菌の血清型を識別することができる。特に、第２基準を満たすピークは、第１基準のみを満たすピークに比べるとＳ／Ｎが大きく、また近接ピークが存在しないことから血清型をより正確に識別することができる。なお、表１に示されている42個の質量電荷比（m/z値）のピークは、いずれか一つでも、試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型を識別するマーカーピークとなり得るが、複数の質量電荷比（m/z値）のピークをマーカーピークとすれば、試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型をより精度良く識別することができる。
このように、表１あるいは表２の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認することで、第１グループに属する２種類のサルモネラ属菌（S. Abony、S. Pakistan）のいずれの血清型であるかを識別することができた。
(2) 第２グループ
第２グループに属する３種類のサルモネラ属菌（S. Minnesota、S. Infantis、S. Brandenburg）のいずれか一つを含む試料から得られた３個のマススペクトルについて、上述の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認すると、表３および表４に示されるような検出状況が確認された。
図５は、第２基準を満たすピークの質量電荷比（m/z値）（つまり表４に示されたm/z値）のうち、7939.5、13406.3、15878.4/15894.7付近のマススペクトルを示している。
また、図６は、第１基準を満たすが第２基準は満たさないピークの質量電荷比（m/z値）のうち、7947.5、9322.0、13366.5/13376.0付近のマススペクトルを示している。図５及び図６において、上段はS. Minnesotaを含む試料、中段はS. Infantisを含む試料、下段はS. Brandenburgを含む試料について得られたマススペクトルである。図５及び図６において矢印は抽出されたピークを示している。
図５と図６に示すように、第１及び第２基準に基づき抽出されたピークは、S. Minnesota、S. Infantis、S. Brandenburgのいずれか一つを含む試料から得られたマススペクトルのみに存在するか、あるいは存在しないため、そのピークの有無により試料に含まれるサルモネラ属菌がS. Minnesota、S. Infantis、S. Brandenburgのいずれであるか、つまりサルモネラ属菌の血清型を識別することができる。特に、第２基準を満たすピークは、第１基準のみを満たすピークに比べるとＳ／Ｎが大きく、また近接ピークが存在しないことから血清型をより正確に識別することができる。なお、表１に示されている35個の質量電荷比（m/z値）のピークは、いずれか一つでも、試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型を識別するマーカーピークとなり得るが、複数の質量電荷比（m/z値）のピークをマーカーピークとすれば、試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型をより精度良く識別することができる。
このように、表３あるいは表４の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認することで、第２グループに属する３種類のサルモネラ属菌（S. Minnesota、S. Infantis、S. Brandenburg）のいずれの血清型であるかを識別することができた。
(3) 第３グループ
第３グループに属する２種類のサルモネラ属菌（S. Schwarzengrund、S. Montevideo）のいずれかを含む試料から得られたマススペクトルについて、上述の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認すると、図７および図８の検出状況が確認された。
図７は、第２基準を満たすピークのm/z値（つまり表６に示されたm/z値）のうち、5096.4、6830.8、12276.1、15834.5付近のマススペクトルを示している。
また、図８は、第１基準を満たすが第２基準は満たさないピークのm/z値のうち、12261.9、13074.0、19001.0付近のマススペクトルを示している。図７及び図８において、上段はS. Schwarzengrundを含む試料について得られたマススペクトル、下段はS. Montevideoを含む試料について得られたマススペクトルである。図７及び図８において矢印は抽出されたピークを示している。
図７と図８に示すように、第１及び第２基準に基づき抽出されたピークは、S. Schwarzengrundを含む試料のマススペクトルとS. Montevideoを含む試料のマススペクトルのいずれか一方にのみ現れていることから、そのピークの有無により試料に含まれるサルモネラ属菌がS. SchwarzengrundとS. Montevideoのいずれであるか、つまり、サルモネラ属菌の血清型を識別することができる。特に、第２基準を満たすピークは、第１基準のみを満たすピークに比べるとＳ／Ｎが大きく、また近接ピークが存在しないことから血清型をより正確に識別することができる。なお、表５に示されている11個の質量電荷比m/z値のピークは、いずれか一つでも試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型を識別するマーカーピークとなり得るが、複数の質量電荷比m/z値のピークをマーカーピークとすれば、試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型をより精度良く識別することができる。
このように、表５あるいは表６の質量電荷比（m/z値）のピーク検出状況を確認することで、第３グループに属する２種類のサルモネラ属菌（S. Schwarzengrund、S. Montevideo）のいずれの血清型であるかを識別することができた。
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様の微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるアボニー（Abony）、パキスタン（Pakistan）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
（第２項）第１項に記載の微生物分析方法において、
前記所定の質量電荷比の値が、特に、3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
第１項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれるサルモネラ（Salmonella）属菌の血清型が２種類の血清型（Abony、Pakistan）のいずれかであることが既知の場合に、血清型がAbony、Pakistanのいずれであるかを識別することができ、第２項に記載の微生物分析方法によれば、血清型がAbony、Pakistanのいずれであるかをより正確に識別することができる。
（第３項）別の一態様の微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記３種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13366、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
（第４項）第３項に記載の微生物分析方法において、
前記所定の質量電荷比の値が、特に、6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735から選択される、微生物分析方法である。
第３項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれるサルモネラ（Salmonella）属菌の血清型が３種類の血清型（Minnesota、Infantis、Brandenburg）のいずれかであることが既知の場合に、血清型がMinnesota、Infantis、Brandenburgのいずれであるかを識別することができ、第４項に記載の微生物分析方法によれば、血清型がMinnesota、Infantis、Brandenburgのいずれであるかをより正確に識別することができる。
（第５項）さらに別の一態様の微生物分析方法は、
サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法であって、
前記所定の質量電荷比の値が、5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
（第６項）第５項に記載の微生物分析方法において、
前記所定の質量電荷比の値が、特に、5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法である。
第５項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれるサルモネラ（Salmonella）属菌の血清型が２種類の血清型（Schwarzengrund、Montevideo）のいずれかであることが既知の場合に、血清型がSchwarzengrund、Montevideoのいずれであるかを識別することができ、第６項に記載の微生物分析方法によれば、血清型がSchwarzengrund、Montevideoのいずれであるかをより正確に識別することができる。
（第７項）第２態様は、コンピュータに上述した第１項～第６項のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラムである。

Claims (7)

  1. サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるアボニー（Abony）、パキスタン（Pakistan）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
    を有する、微生物分析方法であって、
    前記所定の質量電荷比の値が、3028、3119、4166、5487、5507、5924、6011、6095、6238、6261、6369、6720、6725、6933、7272、7453、7480、7589、7858、7903、8053、8129、8330、8461、8536、8546、8634、8687、9669、9912、10956、11499、11506、11847、12276、13366、13373、13435、13444、15714、15803、15990及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法。
  2. 前記所定の質量電荷比の値が、3119、4166、5487、6238、6720、7858、8330、8536、8687、9912、12276、15714、15803、15990及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の微生物分析方法。
  3. サルモネラ（Salmonella）属菌の３種類の血清型であるミネソタ（Minnesota）とインファンティス（Infantis）とブランデンブルク（Brandenburg）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記３種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
    を有する、微生物分析方法であって、
    前記所定の質量電荷比の値が、6094、6483、6689、6719、6872、7858、7940、7948、9322、10667、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13366、13376、13406、13445、13476、14882、15716、15803、15878、15895、15991、17713、17735、17813、17835、18972、19127、20766、20838及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法。
  4. 前記所定の質量電荷比の値が、6483、7940、10990、11808、11821、11848、11857、12209、13406、13445、15803、15878、15895、17713、17735及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の微生物分析方法。
  5. サルモネラ（Salmonella）属菌の２種類の血清型であるシュワルツェングルント（Schwarzengrund）とモンテビデオ（Montevideo）のいずれかの菌を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、所定の質量電荷比におけるピークの有無に基づいて、前記試料に含まれる微生物が、前記２種類の血清型のいずれの菌を含むかを識別する識別ステップ
    を有する、微生物分析方法であって、
    前記所定の質量電荷比の値が、5096、6699、6733、6830、9034、12262、12276、13074、15820、15835、19001及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、微生物分析方法。
  6. 前記所定の質量電荷比の値が、5096、6699、6733、6830、9034、12276、15820、15835及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の微生物分析方法。
  7. コンピュータに請求項１～６のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラム。
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