JP7413911B2 - 微生物分析方法 - Google Patents
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Description
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られたピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ(Salmonella)属菌の6種の血清型であるアバエテトゥバ(Abaetetuba)、アナタム(Anatum)、ニューポート(Newport)、プーナ(Poona)、タラハシー(Tallahassee)、及びベッロール(Vellore)の少なくとも1種が含まれるか否かを識別する識別ステップを有するものである。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ(Salmonella)属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも1種が含まれるか否かを識別する識別ステップとを有する。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ(Salmonella)属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも1種が含まれるか否か、或いは、22種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも1種が含まれるかを識別する識別ステップとを有する。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記6種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
図1は、微生物分析システムの概略的な全体構成を示している。このシステムは、大別して質量分析部10と微生物判別部20とから成る。質量分析部10は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法(MALDI)によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部11と、イオン化部11から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器(TOF)12を備える。
(1) S. Abaetetuba, ATCC35640
(2) S. Anatum, ATCC9270
(3) S. Newport, ATCC6962
(4) S. Poona, NCTC 4840
(5) S. Tallahassee, ATCC12002
(6) S. Vellore, ATCC15611
(1) S. Enteritidis, GTC08914
(2) S. Typhimurium, NBRC13245
(3) S. Minnesota, NBRC15182
(4-1) S. Infantis, ATCC BAA-1675
(4-1) S. Infantis, jfrlSe1402-1
(5) S. Brandenburg, jfrlSe1402-3
(6) S. Rissen, jfrlSe1402-6
(7) S. Schwarzengrund, HyogoSO12004
(8) S. Montevideo, jfrlSe1409-6
(9-1) S. Mbandaka, jfrlSe1402-13
(9-2) S. Mbandaka, jfrlSe1402-14
(10) S. Orion, jfrlSe1402-7
(11) S. Pullorum_Gallinarum, NBRC3163
(12) S. Abony, NBRC100797
(13) S. Choleraesuis, NBRC105684
(14) S. Saintpaul, ATCC9712
(15) S. Braenderup, GTC09492
(16) S. Pakistan, GTC09493
(17) S. Thompson, ATCC BAA-1738
(18) S. Altona, jfrlSe1409-1
(19) S. Istanbul, jfrlSe1409-2
(20) S. Manhattan, HyogoSO11001
(21) S. Senftenberg, jfrlSe1409-3
(22) S. Amsterdam, jfrlSe1409-21
上述した第1グループに属する6種類のサルモネラ属菌、及び上述した第2グループに属する24種類のサルモネラ属菌の計30種類のサルモネラ属菌を、LB寒天培地を用いて37℃で20時間培養した。
以下の2種類のマトリックス溶液を作製した。
(2-1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸(SA)を25mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液(飽和溶液)を作製した。このマトリックス溶液を「SA-1」とする。
(2-2) 50%のアセトニトリル(ACN)及び0.6%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含む水溶液に、SAを25mg/mL、メチレンジホスホン酸(MDPNA)を1%、界面活性剤であるデシル-β-D-マルトピラノシド(decyl-β-D-maltopyranoside、DMP)を1mM、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「SA-2」とする。
マトリックス溶液SA-1及びSA-2に用いたSAは富士フイルム和光純薬工業株式会社製、MDPNA及びDMPはシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製のものを用いた。
(3-1) LB寒天培地で培養した30種類のサルモネラ属菌をそれぞれ約1mgずつ微量天秤で秤量してチューブに入れ、そこにマトリックスSA-2溶液を加えて菌濃度が1mg/0.075mL(約1×107CFU/μL)になるように調製し、それをニードルで懸濁した。
(3-2) チューブに1分間、超音波振動を与え、得られた懸濁液を遠心分離(12000rpm、5min)して遠心上清液を得た。
(4-1) MALDI用サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液SA-1を0.5μLずつ滴下した(プリコート)。
(4-2) 続いて、マトリックス溶液SA-1がプリコートされた各ウェルに、上記の遠心上清液を1μLずつ滴下し、自然乾燥させた。
(4-3) (4-2)で得られたMALDI用サンプルプレートを、MALDI-MS(AXIMA Performance, 株式会社島津製作所製)に挿入し、リニアモード(ポジティブイオンモード)で測定した。測定データは、全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
測定データに対してサルモネラ属菌の自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルについて、10種類のタンパク質(gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7)に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取った。ここで、自己キャリブレーションとは、サルモネラ属菌自身のいくつかの帰属済みのピークを内部標準としてキャリブレーションを行うことをいう。
その結果を図3~図5に示す。図3は、上述した第1グループに属する6種類のサルモネラ属菌について得られた結果であり、図4は第2グループに属する24種類のサルモネラ属菌について得られた結果である。また図5は、第1グループに属する3種の血清型Abaetetuba、Newport、Velloreのサルモネラ属菌におけるタンパク質YaiA、L25のマススペクトルを示している。なお、図3において「-」は少なくとも今回はピークが検出されなかったことを示している。
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
(第1項)一態様の微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも1種が含まれるかを識別する識別ステップと
を有する。
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも1種が含まれるか、或いは、22種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも1種が含まれるかを識別する識別ステップを有する。
前記識別ステップにおいて、前記試料に、前記6種の血清型の少なくとも1種が含まれると識別された場合に、前記10種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zから、前記試料に、前記6種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記6種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
Claims (5)
- 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ(Salmonella)属菌の6種の血清型であるアバエテトゥバ(Abaetetuba)、アナタム(Anatum)、ニューポ-ト(Newport)、プーナ(Poona)、タラハシー(Tallahassee)、及びベッロール(Vellore)の少なくとも1種が含まれるか否かを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法。 - 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも1種が含まれるか、或いは、22種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも1種が含まれるかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法。 - 請求項1又は2に記載の微生物分析方法において、
前記識別ステップにおいて、前記試料に、前記6種の血清型の少なくとも1種が含まれると識別された場合に、前記10種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zから、前記試料に、前記6種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する、微生物分析方法。 - 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、10種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1ないし10種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の6種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreのいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する、微生物分析方法。 - コンピュータに請求項1~4のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラム。
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