JP7413911B2 - 微生物分析方法 - Google Patents
微生物分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7413911B2 JP7413911B2 JP2020076954A JP2020076954A JP7413911B2 JP 7413911 B2 JP7413911 B2 JP 7413911B2 JP 2020076954 A JP2020076954 A JP 2020076954A JP 2020076954 A JP2020076954 A JP 2020076954A JP 7413911 B2 JP7413911 B2 JP 7413911B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mass
- charge ratio
- proteins
- types
- serotypes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 36
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 81
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 70
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 63
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 29
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 101710198000 Protein gns Proteins 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 4
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 3
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 3
- MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N medronic acid Chemical compound OP(O)(=O)CP(O)(O)=O MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 241000607128 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis Species 0.000 description 2
- 241001437645 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Mbandaka Species 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000533331 Salmonella bongori Species 0.000 description 1
- 241000607361 Salmonella enterica subsp. enterica Species 0.000 description 1
- 241001148132 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony Species 0.000 description 1
- 241000596091 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Anatum Species 0.000 description 1
- 241001355103 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Braenderup Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000671036 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Manhattan Species 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 241000210647 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Montevideo Species 0.000 description 1
- 241000086242 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Poona Species 0.000 description 1
- 241000947639 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Rissen Species 0.000 description 1
- 241000293246 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul Species 0.000 description 1
- 241001135257 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Senftenberg Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000397423 Spongospora subterranea f. sp. subterranea Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N decyl beta-D-maltopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
- H01J49/0036—Step by step routines describing the handling of the data generated during a measurement
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/255—Salmonella (G)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、微生物分析方法に関する。
質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合される。そして、溶液中の溶媒を気化させることにより乾燥させ、分析対象物質を含んだ結晶を形成する。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。
こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、生命科学の分野で広く利用されている。生命科学分野におけるＭＡＬＤＩ－ＭＳの利用の一つに、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物の同定がある。これは、被検微生物を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法であり、短時間で分析結果を得ることができることから、簡便且つ迅速な微生物の同定が可能である。
例えば食中毒の代表的な原因細菌の一つに、グラム陰性通性嫌気桿菌の腸内細菌科に属するサルモネラがある。サルモネラ属にはSalmonella （以下「S.」と略す）enterica、S. bongori及びS. subterraneaの３つの菌種が属し、さらにS. entericaは６つの亜種に分類される。食中毒を引き起こす病原性サルモネラの多くは S. enterica subsp. entericaに属し、その亜種は更に多数の血清型に分類される。サルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、食中毒の感染経路の解明及び感染防止に重要であることから、近年、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いたサルモネラ属菌の識別が試みられている。
Appl. Microbiol. Biotechnol., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.101, No.23-24, pp.8557-8569, 2017
ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるサルモネラ属菌の菌種や亜種、血清型の判別は、菌種や亜種、血清型が異なる菌体の間で、マススペクトル上での位置(質量電荷比、m/z値)や高さ（ピーク強度、mV値）が異なるピーク、すなわちバイオマーカーピークを検出することにより行う。細菌をはじめとする微生物の判別では、バイオマーカーピークとしてタンパク質のピークが用いられることが多い（非特許文献１）。
一般的に近縁の微生物の場合、多くのタンパク質に由来するピークの質量電荷比は同じであるか、或いは近似する。従って、サルモネラ属菌を血清型のレベルで正確に判別するためには、バイオマーカーピークとして１種類のタンパク質由来のピークを選出するだけでは足りず、血清型の種類に応じた適切な、複数のタンパク質由来のピークを選出する必要があった。また、バイオマーカーピークを用いて識別できることが判明している血清型は限られており、より多くの血清型を識別することが求められている。
本発明が解決しようとする課題は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物分析方法において、サルモネラ属菌のより多くの血清型をできるだけ正確に識別できるようにすることである。
上記課題を解決するために成された本発明に係る微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られたピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるアバエテトゥバ（Abaetetuba）、アナタム（Anatum）、ニューポート（Newport）、プーナ（Poona）、タラハシー（Tallahassee）、及びベッロール（Vellore）の少なくとも１種が含まれるか否かを識別する識別ステップを有するものである。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られたピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるアバエテトゥバ（Abaetetuba）、アナタム（Anatum）、ニューポート（Newport）、プーナ（Poona）、タラハシー（Tallahassee）、及びベッロール（Vellore）の少なくとも１種が含まれるか否かを識別する識別ステップを有するものである。
本発明によれば、試料に、これまで他のサルモネラ属菌と血清型と区別することが難しかったサルモネラ属菌の所定の６種の血清型のいずれかの菌が含まれることを識別することができる。
本発明に係る微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか否かを識別する識別ステップとを有する。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか否かを識別する識別ステップとを有する。
非特許文献１では、サルモネラ属菌の２２種の血清型の識別に有効なバイオマーカーとして１２種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7, YciF, SodA）が報告されているが、本発明は、そのうち１０種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7）をバイオマーカーとして用いることで、新たに、６種の血清型の少なくとも１種の菌体が試料に含まれるか否かの識別が可能となることを見出したものである。
６種の血清型の少なくとも１種の菌体が試料に含まれる場合、その試料について得られたマススペクトルに存在するピークの少なくとも一つは１０種類のタンパク質のいずれかに由来するピークであることが分かっている。前記１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比の範囲は既知であるため、試料について得られたマススペクトル上の１０種類のタンパク質のそれぞれに対応する各質量電荷比範囲にピークが存在するか否かを判断し、１０種類のタンパク質の少なくとも１種類に対応する質量電荷比範囲にピークが存在する場合には６種の血清型の少なくとも１種の菌体が前記試料に含まれる可能性があり、存在しない場合には前記６種の血清型の菌体がいずれも前記試料に含まれないと判断することができる。
また、本発明に係る微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか否か、或いは、２２種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップとを有する。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか否か、或いは、２２種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップとを有する。
６種の血清型の少なくとも１種の菌体、或いは２２種の血清型の少なくとも１種の菌体が試料に含まれる場合、その試料について得られたマススペクトルに存在するピークの少なくとも一つは１０種類のタンパク質のいずれかに由来するピークであることが分かっている。前記１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比の範囲は既知であるため、まずは試料について得られたマススペクトル上の１０種類のタンパク質のそれぞれに対応する各質量電荷比範囲にピークが存在するか否かを判断する。
１０種類のタンパク質の少なくとも１種類に対応する各質量電荷比範囲にピークが存在する場合は、そのピークの質量電荷比m/zの値を読み取る。そして、質量電荷比m/zの値を読み取った後は、その質量電荷比m/zの値、もしくは複数の質量電荷比m/zの値の組み合わせに基づいて、前記試料に、６種の血清型の少なくとも１種の菌体、或いは２２種の血清型の少なくとも１種の菌体が含まれると判断することができる。
上述した微生物分析方法において、前記試料に、６種の血清型の少なくとも１種のサルモネラ属菌が含まれると識別された場合は、前記１０種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれるサルモネラ属菌の血清型が前記６種の血清型のいずれであるかを識別することができる。
また、本発明に係る微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
本発明の微生物分析方法に用いられる質量分析装置としては、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）が好ましい。また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。
次に、本発明に係る微生物分析方法に用いられる微生物分析システムの一実施形態について説明する。
図１は、微生物分析システムの概略的な全体構成を示している。このシステムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
図１は、微生物分析システムの概略的な全体構成を示している。このシステムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４及び第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５によりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
図１においては、血清型決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、及び血清型判定部３９が示されている。これはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が血清型決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、血清型決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物識別を行うプログラム等を利用することができる。
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び血清型決定プログラム３５、第１データベース３４、及び第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理及び／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法及び質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を4,000～30,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。そして、抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養環境を規格化しておくことが望ましい。
記憶部３０の第２データベース３６には、既知微生物を種よりも下位の分類である血清型で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。なお、第２データベース３６には、血清型以外の下位の分類（例えば亜種、病原型、株）などで識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されていてもよい。
本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物が、以下に示す第１グループに属するサルモネラ属菌であるか、或いは第２グループに属するサルモネラ属菌であるかを判定するため、又は第１グループに属するサルモネラ属菌のいずれであるか、或いは第２グループに属するサルモネラ属菌のいずれであるかを判定するためのマーカータンパク質に関する情報として、少なくとも１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7にそれぞれ対応した質量電荷比範囲と該質量電荷比範囲の値である１又は複数の質量電荷比の値が記憶されている。
＜第１グループ＞
(1) S. Abaetetuba, ATCC35640
(2) S. Anatum, ATCC9270
(3) S. Newport, ATCC6962
(4) S. Poona, NCTC 4840
(5) S. Tallahassee, ATCC12002
(6) S. Vellore, ATCC15611
(1) S. Abaetetuba, ATCC35640
(2) S. Anatum, ATCC9270
(3) S. Newport, ATCC6962
(4) S. Poona, NCTC 4840
(5) S. Tallahassee, ATCC12002
(6) S. Vellore, ATCC15611
＜第２グループ＞
(1) S. Enteritidis, GTC08914
(2) S. Typhimurium, NBRC13245
(3) S. Minnesota, NBRC15182
(4-1) S. Infantis, ATCC BAA-1675
(4-1) S. Infantis, jfrlSe1402-1
(5) S. Brandenburg, jfrlSe1402-3
(6) S. Rissen, jfrlSe1402-6
(7) S. Schwarzengrund, HyogoSO12004
(8) S. Montevideo, jfrlSe1409-6
(9-1) S. Mbandaka, jfrlSe1402-13
(9-2) S. Mbandaka, jfrlSe1402-14
(10) S. Orion, jfrlSe1402-7
(11) S. Pullorum_Gallinarum, NBRC3163
(12) S. Abony, NBRC100797
(13) S. Choleraesuis, NBRC105684
(14) S. Saintpaul, ATCC9712
(15) S. Braenderup, GTC09492
(16) S. Pakistan, GTC09493
(17) S. Thompson, ATCC BAA-1738
(18) S. Altona, jfrlSe1409-1
(19) S. Istanbul, jfrlSe1409-2
(20) S. Manhattan, HyogoSO11001
(21) S. Senftenberg, jfrlSe1409-3
(22) S. Amsterdam, jfrlSe1409-21
(1) S. Enteritidis, GTC08914
(2) S. Typhimurium, NBRC13245
(3) S. Minnesota, NBRC15182
(4-1) S. Infantis, ATCC BAA-1675
(4-1) S. Infantis, jfrlSe1402-1
(5) S. Brandenburg, jfrlSe1402-3
(6) S. Rissen, jfrlSe1402-6
(7) S. Schwarzengrund, HyogoSO12004
(8) S. Montevideo, jfrlSe1409-6
(9-1) S. Mbandaka, jfrlSe1402-13
(9-2) S. Mbandaka, jfrlSe1402-14
(10) S. Orion, jfrlSe1402-7
(11) S. Pullorum_Gallinarum, NBRC3163
(12) S. Abony, NBRC100797
(13) S. Choleraesuis, NBRC105684
(14) S. Saintpaul, ATCC9712
(15) S. Braenderup, GTC09492
(16) S. Pakistan, GTC09493
(17) S. Thompson, ATCC BAA-1738
(18) S. Altona, jfrlSe1409-1
(19) S. Istanbul, jfrlSe1409-2
(20) S. Manhattan, HyogoSO11001
(21) S. Senftenberg, jfrlSe1409-3
(22) S. Amsterdam, jfrlSe1409-21
上記第１グループには６種の血清型に分類される６種類のサルモネラ属菌が属する。また、上記第２グループには２２種の血清型に分類される２４種類のサルモネラ属菌が属する。２２種の血清型のうち血清型Infantis、血清型Mbandakaにはそれぞれ２種類のサルモネラ属菌が含まれる。血清型が同じサルモネラ属菌には枝番１，２を付けた同じ番号を付している。
第２データベース３６に記憶されるマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ－末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ－末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
次に、上記の微生物分析システムを用いたサルモネラ属菌の血清型の分析手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップ１０１）。
次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップ１０３）。そして、この生物種がサルモネラ属菌でなかった場合（ステップ１０４でNoの場合）は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップ１１０）、分析処理を終了する。一方、前記生物種がサルモネラ属菌であった場合（ステップ１０４でYesの場合）は、続いて血清型決定プログラム３５による分析処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中にサルモネラ属菌が含まれることが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、血清型決定プログラム３５に進めばよい。
血清型決定プログラム３５では、まず血清型判定部３９がマーカータンパク質である１０種類のタンパク質gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7の質量電荷比範囲（つまり、１０個の質量電荷比範囲）をそれぞれ第２データベース３６から読み出す（ステップ１０５）。続いてスペクトル取得部３７が、ステップ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲にピークが現れているか否かを判別する（ステップ１０６）。
ここで第２データベース３６に記憶された１０個の質量電荷比範囲のいずれにもピークが現れていなかった場合（ステップ１０６でNoの場合）は、試料に含まれるサルモネラ属菌が第１グループ及び第２グループのいずれでもない血清型として表示部２３に出力し（ステップ１１０）、識別処理を終了する。
一方、前記１０個の質量電荷比範囲の少なくとも一つにピークが現れていた場合（ステップ１０６でYes）は、そのピークを、該ピークが存在する質量電荷比範囲のマーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップ１０７）。その後、血清型判定部３９が、この読み取った質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質の質量電荷比の値を比較して両者が所定の許容誤差範囲内で一致するか否かを判断する（ステップ１０８）。このとき、質量電荷比範囲に含まれる質量電荷比として複数の値が第２データベース３６に記憶されている場合は、いずれの値と一致するか判断する。その結果、第２データベース３６に記憶されている質量電荷比の中に読み取った質量電荷比の値と一致する値が存在した場合には、その結果に基づき、被検微生物が第１グループに属する血清型又は第２グループに属する血清型のいずれかである、もしくは第１グループ及び第２グループに属する血清型のうちのいずれであるかを判定し（ステップ１０９）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップ１１０）。
なお、予め他の方法で試料に含まれるサルモネラ属菌が第１グループ及び第２グループのいずれかであると判定されている場合は、ステップ１０６におけるピークの存在有無の判定を省略して次のステップ１０７に進めばよい。
以下、本発明に係る微生物分析方法の効果を実証するために行った実験について説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．サルモネラ属菌の培養
上述した第１グループに属する６種類のサルモネラ属菌、及び上述した第２グループに属する２４種類のサルモネラ属菌の計３０種類のサルモネラ属菌を、ＬＢ寒天培地を用いて３７℃で２０時間培養した。
上述した第１グループに属する６種類のサルモネラ属菌、及び上述した第２グループに属する２４種類のサルモネラ属菌の計３０種類のサルモネラ属菌を、ＬＢ寒天培地を用いて３７℃で２０時間培養した。
２．マトリックス溶液の作製
以下の２種類のマトリックス溶液を作製した。
(2-1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－１」とする。
(2-2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）及び０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％、界面活性剤であるデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－２」とする。
マトリックス溶液ＳＡ－１及びＳＡ－２に用いたＳＡは富士フイルム和光純薬工業株式会社製、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰはシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製のものを用いた。
以下の２種類のマトリックス溶液を作製した。
(2-1) エタノールにマトリックス物質であるシナピン酸（ＳＡ）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－１」とする。
(2-2) ５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）及び０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％、界面活性剤であるデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ、それぞれ含むように溶解して、マトリックス溶液を作製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－２」とする。
マトリックス溶液ＳＡ－１及びＳＡ－２に用いたＳＡは富士フイルム和光純薬工業株式会社製、ＭＤＰＮＡ及びＤＭＰはシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製のものを用いた。
３．マトリックス・微生物懸濁液の調製
(3-1) ＬＢ寒天培地で培養した３０種類のサルモネラ属菌をそれぞれ約１mgずつ微量天秤で秤量してチューブに入れ、そこにマトリックスＳＡ－２溶液を加えて菌濃度が１mg/0.075mL（約１×１０７CFU/μＬ）になるように調製し、それをニードルで懸濁した。
(3-2) チューブに１分間、超音波振動を与え、得られた懸濁液を遠心分離（12000rpm、５min）して遠心上清液を得た。
(3-1) ＬＢ寒天培地で培養した３０種類のサルモネラ属菌をそれぞれ約１mgずつ微量天秤で秤量してチューブに入れ、そこにマトリックスＳＡ－２溶液を加えて菌濃度が１mg/0.075mL（約１×１０７CFU/μＬ）になるように調製し、それをニードルで懸濁した。
(3-2) チューブに１分間、超音波振動を与え、得られた懸濁液を遠心分離（12000rpm、５min）して遠心上清液を得た。
４．ＭＡＬＤＩ－ＭＳによる分析
(4-1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬずつ滴下した（プリコート）。
(4-2) 続いて、マトリックス溶液ＳＡ－１がプリコートされた各ウェルに、上記の遠心上清液を１μＬずつ滴下し、自然乾燥させた。
(4-3) (4-2)で得られたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートを、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（AXIMA Performance, 株式会社島津製作所製）に挿入し、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。測定データは、全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
(4-1) ＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの各ウェルにマトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬずつ滴下した（プリコート）。
(4-2) 続いて、マトリックス溶液ＳＡ－１がプリコートされた各ウェルに、上記の遠心上清液を１μＬずつ滴下し、自然乾燥させた。
(4-3) (4-2)で得られたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートを、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（AXIMA Performance, 株式会社島津製作所製）に挿入し、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。測定データは、全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。
５．結果
測定データに対してサルモネラ属菌の自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルについて、１０種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7）に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取った。ここで、自己キャリブレーションとは、サルモネラ属菌自身のいくつかの帰属済みのピークを内部標準としてキャリブレーションを行うことをいう。
その結果を図３～図５に示す。図３は、上述した第１グループに属する６種類のサルモネラ属菌について得られた結果であり、図４は第２グループに属する２４種類のサルモネラ属菌について得られた結果である。また図５は、第１グループに属する３種の血清型Abaetetuba、Newport、Velloreのサルモネラ属菌におけるタンパク質YaiA、L25のマススペクトルを示している。なお、図３において「-」は少なくとも今回はピークが検出されなかったことを示している。
測定データに対してサルモネラ属菌の自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルについて、１０種類のタンパク質（gns, YaiA, YibT, PPI, L25, L21, S8, L17, L15, S7）に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取った。ここで、自己キャリブレーションとは、サルモネラ属菌自身のいくつかの帰属済みのピークを内部標準としてキャリブレーションを行うことをいう。
その結果を図３～図５に示す。図３は、上述した第１グループに属する６種類のサルモネラ属菌について得られた結果であり、図４は第２グループに属する２４種類のサルモネラ属菌について得られた結果である。また図５は、第１グループに属する３種の血清型Abaetetuba、Newport、Velloreのサルモネラ属菌におけるタンパク質YaiA、L25のマススペクトルを示している。なお、図３において「-」は少なくとも今回はピークが検出されなかったことを示している。
図３及び図４から分かるように、１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比の値の中には、複数の血清型で共通するものが含まれるものの、１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比から選択される１ないし複数の値の組み合わせから、第１グループと第２グループの中のいずれの血清型であるか識別する、あるいは候補を絞り込むことができる。このとき、質量電荷比の組み合わせが複数の血清型に重複する場合は、その複数種まで血清型の候補を絞り込むことができる。
具体的には、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループ又は第２グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質Gnsに対応する質量電荷比の値が「6542」であるとき、又はL25に対応する質量電荷比の値が「10569」であるときは血清型が第１グループのVelloreであり、マーカータンパク質YaiAに対応する質量電荷比の値が「7097」であるときは血清型が第１グループのNewportであるか第２グループのTyphimuriumであると識別される。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループ又は第２グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質YibTに対応する質量電荷比の値が「7894」であるときは血清型が第１グループのTallahassee又はVelloreであり、L21に対応する質量電荷比の値が「11593」であるときは血清型が第１グループのPoona又はVelloreであると識別される。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループ又は第２グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質YaiAに対応する質量電荷比の値が「7110」であるときは血清型が第２グループのPullorum_Gallinarumであり、PPIに対応する質量電荷比の値が「10216」であるときは血清型が第２グループのOrionであり、L15に対応する質量電荷比の値が「14948」であるときは血清型が第２グループのAltonaであると識別される。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループ又は第２グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質YibTに対応する質量電荷比の値が「8023」であるときは血清型が第２グループのBraenderup又はThompsonであり、L25に対応する質量電荷比の値が「10528」であるときは血清型が第２グループのBraenderup、Manhattan、又はAmsterdamであると識別され、さらに、マーカータンパク質Gnsに対応する質量電荷比の値が「6511」であるときは血清型が第２グループのInfantis、Mbandaka、Manhattan、Senftenberg、Amsterdamのいずれかであると識別される。
また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質L21に対応する質量電荷比が「11565」であり、S7に対応する質量電荷比が「17474」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．１の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がAbaetetubaであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合、マーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．１の行の数値の組み合わせであるときは血清型がAbaetetubaである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質L21に対応する質量電荷比が「11579」であり、YaiAに対応する質量電荷比が「7111」であり、YibTに対応する質量電荷比が「7993」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．２の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がAnatumであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合は、マーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．２の行の数値の組み合わせであるときは血清型がAnatumである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質YaiAに対応する質量電荷比が「7097」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．３の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がNewportであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合は、マーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．３の行の数値の組み合わせであるときは、血清型はNewportである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質S7に対応する質量電荷比が「17460」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．４の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がPoonaであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合は、マーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．４の行の数値の組み合わせであるときは血清型がPoonaである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グループに属する血清型であることが分かっている場合、マーカータンパク質Gnsに対応する質量電荷比が「6483」であり、YibTに対応する質量電荷比が「7894」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．５の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がTallahasseeであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合は、マーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．５の数値の組み合わせであるときは血清型がTallahasseeである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
第一グループに属する菌を分析し、マーカータンパク質Gnsに対応する質量電荷比が「6542」であるとき、又はL25に対応する質量電荷比が「10569」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．６の行に示される数値の組み合わせであるときは、血清型はVelloreであると識別される。また、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が不明な場合、マーカータンパク質Gnsに対応する質量電荷比が「6542」であるとき、又はL25に対応する質量電荷比が「10569」であるとき、あるいはマーカータンパク質１０種の質量電荷比の組み合わせが図３のＮｏ．６の行に示される数値の組み合わせであるときは血清型がVelloreである可能性が確認される（候補の絞り込みができる）。
このように、被検微生物がサルモネラ属菌であってその血清型が第１グル－プ又は第２グループに属する血清型であることが分かっている場合、あるいは第１グル－プに属することが分かっている場合、あるいは第１及び第２グループに属する血清型であるか否かが不明な場合、いずれの場合も、１０種のマーカータンパク質及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される１ないし複数種類に由来するピークの質量電荷比から、血清型を識別したり、あるいは幾つかの血清型の候補に絞り込んだりすることができる。
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様の微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップと
を有する。
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様の微生物分析方法は、
微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップと
を有する。
第１項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれる微生物が、これまで他のサルモネラ属菌の血清型と区別することが難しかったサルモネラ属菌の所定の６種の血清型のいずれかであることを容易に識別することができる。
（第２項）第１項に記載の微生物分析方法において、前記識別ステップに代えて、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか、或いは、２２種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップを有する。
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか、或いは、２２種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップを有する。
第２項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれる微生物が、サルモネラ属菌の所定の６種の血清型のいずれか、或いは２２種の血清型のいずれかであることを容易に識別することができる。
（第３項）第１項又は第２項に記載の微生物分析方法において、
前記識別ステップにおいて、前記試料に、前記６種の血清型の少なくとも１種が含まれると識別された場合に、前記１０種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zから、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
前記識別ステップにおいて、前記試料に、前記６種の血清型の少なくとも１種が含まれると識別された場合に、前記１０種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zから、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
第３項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれる微生物が、サルモネラ属菌の前記６種類の血清型のいずれであるかを特定することができる。
（第４項）第１項に記載の微生物分析方法において、前記識別ステップに代えて、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する。
第４項に記載の微生物分析方法によれば、試料に含まれる微生物が、これまで他のサルモネラ属菌の血清型と区別することが難しかったサルモネラ属菌の所定の６種の血清型のいずれであることを特定することができる。
（第５項）別の一態様に係るプログラムは、上記第１項～第４項のいずれかに記載の各ステップを実行させる。
Claims (5)
- 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、サルモネラ（Salmonella）属菌の６種の血清型であるアバエテトゥバ（Abaetetuba）、アナタム（Anatum）、ニューポ－ト（Newport）、プーナ（Poona）、タラハシー（Tallahassee）、及びベッロール（Vellore）の少なくとも１種が含まれるか否かを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法。 - 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreの少なくとも１種が含まれるか、或いは、２２種の血清型であるEnteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及びAmsterdamの少なくとも１種が含まれるかを識別する識別ステップ
を有する、微生物分析方法。 - 請求項１又は２に記載の微生物分析方法において、
前記識別ステップにおいて、前記試料に、前記６種の血清型の少なくとも１種が含まれると識別された場合に、前記１０種類のタンパク質及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zから、前記試料に、前記６種の血清型のいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する、微生物分析方法。 - 微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルから、１０種類のタンパク質であるgns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１ないし１０種類のタンパク質に由来するピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
前記読み取られた質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に、Salmonella属菌の６種の血清型であるAbaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及びVelloreのいずれの血清型が含まれるかを識別するステップを有する、微生物分析方法。 - コンピュータに請求項１～４のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラム。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020076954A JP7413911B2 (ja) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 微生物分析方法 |
| US17/232,236 US20220003778A1 (en) | 2020-04-23 | 2021-04-16 | Method for analyzing microorganism |
| CN202110439587.6A CN113552206A (zh) | 2020-04-23 | 2021-04-23 | 微生物分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020076954A JP7413911B2 (ja) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 微生物分析方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021173611A JP2021173611A (ja) | 2021-11-01 |
| JP2021173611A5 JP2021173611A5 (ja) | 2022-08-04 |
| JP7413911B2 true JP7413911B2 (ja) | 2024-01-16 |
Family
ID=78130220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020076954A Active JP7413911B2 (ja) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 微生物分析方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220003778A1 (ja) |
| JP (1) | JP7413911B2 (ja) |
| CN (1) | CN113552206A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017168740A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 株式会社島津製作所 | 微生物の識別方法 |
| CN116337986B (zh) * | 2022-12-16 | 2023-11-14 | 南京市食品药品监督检验院 | 一种基于maldi-tof ms的肯塔基沙门氏菌的快速鉴定方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120107864A1 (en) | 2010-05-07 | 2012-05-03 | Katrin Sparbier | Mass spectrometric rapid detection of salmonella |
| WO2017168740A1 (ja) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 株式会社島津製作所 | 微生物の識別方法 |
| JP2019138811A (ja) | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 株式会社島津製作所 | 微生物分析方法 |
| JP2019138810A (ja) | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 株式会社島津製作所 | 微生物分析方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0760865A1 (en) * | 1994-05-23 | 1997-03-12 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the rapid separation and identification of microbial contaminants from a complex matrix |
| JP6934650B2 (ja) * | 2016-03-31 | 2021-09-15 | 株式会社島津製作所 | 微生物の識別方法 |
-
2020
- 2020-04-23 JP JP2020076954A patent/JP7413911B2/ja active Active
-
2021
- 2021-04-16 US US17/232,236 patent/US20220003778A1/en active Pending
- 2021-04-23 CN CN202110439587.6A patent/CN113552206A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120107864A1 (en) | 2010-05-07 | 2012-05-03 | Katrin Sparbier | Mass spectrometric rapid detection of salmonella |
| WO2017168740A1 (ja) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 株式会社島津製作所 | 微生物の識別方法 |
| JP2019138811A (ja) | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 株式会社島津製作所 | 微生物分析方法 |
| JP2019138810A (ja) | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 株式会社島津製作所 | 微生物分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113552206A (zh) | 2021-10-26 |
| JP2021173611A (ja) | 2021-11-01 |
| US20220003778A1 (en) | 2022-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11137406B2 (en) | Method for discriminating microorganism | |
| JP4818981B2 (ja) | 細胞の迅速識別方法及び識別装置 | |
| US20240077493A1 (en) | Microorganism identification method | |
| JP6238069B2 (ja) | 微生物の識別方法 | |
| US11561228B2 (en) | Method for discriminating a microorganism | |
| JP7413911B2 (ja) | 微生物分析方法 | |
| US20230393134A1 (en) | Method for analyzing microorganism | |
| WO2014116711A1 (en) | Methods and apparatuses involving mass spectrometry to identify proteins in a sample | |
| JP6934650B2 (ja) | 微生物の識別方法 | |
| JP2021189089A (ja) | サルモネラの識別方法 | |
| JP7310694B2 (ja) | 微生物分析方法 | |
| Zhou et al. | Cell fingerprinting: An approach to classifying cells according to mass profiles of digests of protein extracts | |
| US20230243847A1 (en) | Method for identifying marker for discriminating microorganism | |
| Pierce | High throughput mass spectrometry for microbial identification | |
| Kooken | Development of proteomic characterization and speciation techniques utilizing tryptic peptides with MALDI-TOF MS and LC-ESI MS-MS | |
| Jones | An analytical approach to complex data derived from MALDI FTMS analysis of whole cells and organisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220727 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220727 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230523 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230524 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230629 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230815 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231005 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231128 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231211 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7413911 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |