CN113552206A - 微生物分析方法 - Google Patents

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Abstract

在使用MALDI‑MS的微生物分析方法中，能够尽可能准确地识别沙门氏菌属菌的更多的血清型。本发明的微生物分析方法具备：读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别前述试样所含的微生物是否包含Salmonella属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及Vellore中的至少1种。

Description

微生物分析方法
技术领域
本发明涉及微生物分析方法。
背景技术
作为质谱分析中的电离法之一的基质辅助激光解吸/电离(MALDI＝MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization)法是如下的方法：为了分析难以吸收激光的物质、蛋白质等容易受到激光损伤的物质，将在激光下容易吸收且容易电离的基质物质与分析对象物质混合，对其照射激光而使分析对象物质电离。通常基质物质以溶液的形式与分析对象物质混合。然后，通过使溶液中的溶剂气化来进行干燥，形成包含分析对象物质的晶体。对其照射激光时，基质物质吸收激光的能量而被迅速加热，发生气化。此时，分析对象物质也与基质物质一起气化，在该过程中使分析对象物质电离。
利用这种MALDI法的质谱分析装置(MALDI-MS)能够在基本不使蛋白质等高分子化合物解离的情况下进行分析，而且也适于微量分析，因此在生命科学的领域中广泛利用。作为生命科学领域中的MALDI-MS的利用之一，有使用MALDI-MS的微生物的鉴定。其为根据使用被检微生物得到的质谱图来进行微生物的鉴定的方法，能够以短时间得到分析结果，因此能够进行简便且迅速的微生物的鉴定。
例如食物中毒的代表性的原因细菌之一有属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌的肠杆菌科的沙门氏菌。Salmonella(以下简写为“S.”)enterica、S.bongori及S.subterranea这3个菌种属于沙门氏菌属，进而S.enterica被分类为6个亚种。引起食物中毒的病原性沙门氏菌大多是属于S.enterica subsp.enterica，该亚种进一步被分类为多个血清型。沙门氏菌属菌的菌种、亚种、血清型的判别对于食物中毒的感染路径的阐明及感染防止是重要的，因此近年来尝试了使用MALDI-MS的沙门氏菌属菌的识别。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.,Applied Microbiology andBiotechnology,Vol.101,No.23-24,pp.8557-8569,2017
发明内容
发明要解决的问题
利用MALDI-MS的沙门氏菌属菌的菌种、亚种、血清型的判别通过检测在菌种、亚种、血清型不同的菌体之间质谱上的位置(质荷比、m/z值)、高度(峰强度、mV值)不同的峰、即生物标记物峰来进行。以细菌为代表的微生物的判别常常使用蛋白质的峰作为生物标记物峰(非专利文献1)。
通常在近缘的微生物的情况下，源自多个蛋白质的峰的质荷比相同或相似。因此，为了以血清型的水平准确判别沙门氏菌属菌，仅选出源自1种蛋白质的峰作为生物标记物峰是不够的，需要选出与血清型的种类相应的适当的源自多个蛋白质的峰。另外，已判明能够使用生物标记物峰来识别的血清型是有限的，追求识别更多的血清型。
本发明要解決的问题是，在使用MALDI-MS的微生物分析方法中，使得能够尽可能准确地识别沙门氏菌属菌的更多的血清型。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题而做出的本发明的微生物分析方法具备如下步骤：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；
识别步骤，根据前述读取的峰的质荷比m/z，识别前述试样中是否含有沙门氏菌(Salmonella)属菌的6种血清型即阿巴特图巴(Abaetetuba)、鸭(Anatum)、纽波特(Newport)、浦那(Poona)、塔拉哈西(Tallahassee)、及韦洛尔(Vellore)中的至少1种。
发明的效果
根据本发明，能够识别试样中包含以往难以与其它沙门氏菌属菌和血清型区别的沙门氏菌属菌的规定6种血清型中的任意种菌。
附图说明
图1为本发明的微生物的分析方法中使用的微生物分析系统的概要整体构成图。
图2为示出微生物分析方法的过程的一例的流程图。
图3为针对包含沙门氏菌属菌的6种血清型的各菌体的试样得到的源自10种蛋白质的峰的质荷比。
图4为针对包含沙门氏菌属菌的22种血清型的各菌体的试样得到的源自10种蛋白质的峰的质荷比。
图5为属于第1组的3种血清型的沙门氏菌属菌中的蛋白质YaiA及L25的质谱。
具体实施方式
本发明的微生物分析方法具有如下步骤：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，
识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别前述试样中是否包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee及Vellore中的至少1种。
非专利文献1中报告了12种蛋白质(gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7、YciF、SodA)作为对沙门氏菌属菌的22种血清型的识别有效的生物标记物，但本发明新发现了，通过使用其中10种蛋白质(gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7)作为生物标记物，能够识别试样中是否包含6种血清型中的至少1种菌体。
试样中包含6种血清型中的至少1种菌体的情况下，可知对该试样得到的质谱中存在的峰中的至少一个为源自10种蛋白质中任意者的峰。源自前述10种蛋白质的峰的质荷比的范围是已知的，因此判断对试样得到的质谱上的10种蛋白质各自所对应的各质荷比范围内是否存在峰，在10种蛋白质中的至少1种所对应的质荷比范围内存在峰的情况下，有可能在前述试样中包含6种血清型中的至少1种菌体，不存在峰的情况下，能够判断前述6种血清型的菌体均未包含在前述试样中。
另外，本发明的微生物分析方法具有如下步骤：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，
识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别前述试样中是否包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee及Vellore中的至少1种，或者是否包含22种血清型即Enteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg及Amsterdam中的至少1种。
试样中包含6种血清型中的至少1种菌体、或22种血清型中的至少1种菌体的情况下，可知对该试样得到的质谱中存在的峰的至少一个为源自10种蛋白质中任意者的峰。源自前述10种蛋白质的峰的质荷比的范围是已知的，因此首先判断对试样得到的质谱上的10种蛋白质各自所对应的各质荷比范围内是否存在峰。
在10种蛋白质中的至少1种所对应的各质荷比范围内存在峰的情况下，读取该峰的质荷比m/z的值。并且，读取质荷比m/z的值后，根据该质荷比m/z的值、或多个质荷比m/z的值的组合，能够判断前述试样中包含6种血清型中的至少1种菌体、或22种血清型中的至少1种菌体。
上述微生物分析方法中，识别了前述试样中包含6种血清型中的至少1种沙门氏菌属菌的情况下，根据源自从由前述10种蛋白质及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z，能够识别前述试样中包含的沙门氏菌属菌的血清型为前述6种血清型中的哪个。
另外，本发明的微生物分析方法具有如下的步骤：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，
识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别前述试样中包含前述6种血清型中的哪种血清型。
作为本发明的微生物分析方法中使用的质谱分析装置，优选利用基质辅助激光解吸/电离(MALDI＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)法的质谱分析装置(MALDI-MS)。另外，作为MALDI-MS，优选使用MALDI飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOFMS)。MALDI-TOFMS由于能测定的质荷比的范围非常宽，因此能够获取对作为微生物的构成成分的蛋白质那样的高质量分子的分析而言适合的质谱。
接着，对本发明的微生物分析方法中使用的微生物分析系统的一实施方式进行说明。
图1示出微生物分析系统的概要整体构成。该系统大致包含质谱分析部10和微生物判别部20。质谱分析部10具备：电离部11，其通过基质辅助激光解吸/电离法(MALDI)将试样中的分子、原子电离；以及，飞行时间型质量分离器(TOF)12，其将从电离部11射出的各种离子根据质荷比进行分离。
TOF12具备：取出电极13，其用于从电离部11取出离子并导入到TOF12内的离子飞行空间；以及，检测器14，其检测在离子飞行空间中被质量分离的离子。
微生物判别部20的实体为工作站、个人计算机等计算机，在中央运算处理装置即CPU(Central Processing Unit，中央处理单元)21上互相连接有存储器22、由LCD(LiquidCrystal Display，液晶显示器)等构成的显示部23、由键盘、鼠标等构成的输入部24、由硬盘、SSD(Solid State Drive，固态硬盘)等大容量存储装置构成的存储部30。存储部30中存储有OS(Operating System，操作系统)31、谱创建程序32、种确定程序33及血清型确定程序35(本发明的程序)，而且存储有第1数据库34及第2数据库36。微生物判别部20进一步具备用于管理与外部装置的直接连接、借助LAN(Local Area Network，局域网)等网络与外部装置等的连接的界面(I/F)25，从该界面25借助网线NW(或无线LAN)连接于质谱分析部10。
图1中，如血清型确定程序35那样，示出了谱获取部37、m/z读取部38、及血清型判定部39。这些基本上均为通过CPU21执行下级分类确定程序35而以软件方式实现的功能手段。需要说明的是，血清型确定程序35不必是单独的程序，也可以为在例如种确定程序33、用于控制质谱分析部10的程序的一部分内置的功能，其形态没有特别限定。需要说明的是，作为种确定程序33，例如可以利用以往的通过指纹法进行微生物识别的程序等。
另外，图1中设为在用户操作的终端搭载谱创建程序32、种确定程序33、及血清型确定程序35、第1数据库34、及第2数据库36的构成，但也可以设为如下构成：将它们中的至少一部分或全部设置在通过计算机网络与前述终端连接的另外的装置内，按照来自前述终端的指示，执行基于设置在前述另外的装置内的程序的处理和/或向数据库的访问。
存储部30的第1数据库34中登记了多个关于已知微生物的质量列表。该质量列表列举了对某个微生物细胞进行质谱分析时检测的离子的质荷比，除了该质荷比的信息之外至少还包括前述微生物细胞所属的分类单位(科、属、种等)的信息(分类信息)。这种质量列表理想的是根据预先对各种微生物细胞通过与利用前述质谱分析部10时同样的电离法及质量分离法进行实际质谱分析所得到的数据(实测数据)来制作。
根据前述实测数据制作质量列表时，首先，从作为前述实测数据获取的质谱提取在规定的质荷比范围出现的峰。此时，通过将前述质荷比范围设为4000～30000左右，能够主要提取源自蛋白质的峰。另外，通过仅提取峰的高度(相对强度)为规定的阈值以上的峰，能够排除不需要的峰(噪音)。此外，将提取的峰的质荷比(m/z)按每个细胞进行列表化并添加前述分类信息等，然后登记到第1数据库34中。需要说明的是，为了抑制由培养条件导致的基因表达的偏差，实测数据的采集所使用的各微生物细胞理想的是预先将培养环境进行标准化。
存储部30的第2数据库36中登记了用于对已知微生物以作为比种更下级的分类的血清型进行识别的标记蛋白质相关的信息。作为该标记蛋白质相关的信息，至少包括已知微生物中的该标记蛋白质的质荷比(m/z)的信息。需要说明的是，第2数据库36中也可以登记用于以除血清型以外的下级分类(例如亚种、病原型、株)等进行识别的标记蛋白质相关的信息。
本实施方式中的第2数据库36中，作为用于判定被检微生物是属于以下所示的第1组的沙门氏菌属菌或是属于第2组的沙门氏菌属菌、或者用于判定是属于第1组的沙门氏菌属菌种的哪个或是属于第2组的沙门氏菌属菌中的哪个的标记蛋白质相关的信息，存储了与至少10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7分别对应的质荷比范围和作为该质荷比范围的值的1个或多个质荷比的值。
＜第1组＞
(1)S.Abaetetuba,ATCC35640
(2)S.Anatum,ATCC9270
(3)S.Newport,ATCC6962
(4)S.Poona,NCTC 4840
(5)S.Tallahassee,ATCC12002
(6)S.Vellore,ATCC15611
＜第2组＞
(1)S.Enteritidis,GTC08914
(2)S.Typhimurium,NBRC13245
(3)S.Minnesota,NBRC15182
(4-1)S.Infantis,ATCC BAA-1675
(4-1)S.Infantis,jfrlSe1402-1
(5)S.Brandenburg,jfrlSe1402-3
(6)S.Rissen,jfrlSe1402-6
(7)S.Schwarzengrund,HyogoSO12004
(8)S.Montevideo,jfrlSe1409-6
(9-1)S.Mbandaka,jfrlSe1402-13
(9-2)S.Mbandaka,jfrlSe1402-14
(10)S.Orion,jfrlSe1402-7
(11)S.Pullorum_Gallinarum,NBRC3163
(12)S.Abony,NBRC100797
(13)S.Choleraesuis,NBRC105684
(14)S.Saintpaul,ATCC9712
(15)S.Braenderup,GTC09492
(16)S.Pakistan,GTC09493
(17)S.Thompson,ATCC BAA-1738
(18)S.Altona,jfrlSe1409-1
(19)S.Istanbul,jfrlSe1409-2
(20)S.Manhattan,HyogoSO11001
(21)S.Senftenberg,jfrlSe1409-3
(22)S.Amsterdam,jfrlSe1409-21
被分类为6种血清型的6种沙门氏菌属菌属于上述第1组。另外，被分类为22种血清型的24种沙门氏菌属菌属于上述第2组。22种血清型之中血清型Infantis、血清型Mbandaka中分别包含2种沙门氏菌属菌。对血清型相同的沙门氏菌属菌赋予标有次级序号1、2的相同编号。
作为第2数据库36中存储的标记蛋白质的质荷比的值，理想的是，将通过将各标记蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列而求出的计算质量与通过实测检测到的质荷比进行比较来选择。需要说明的是，标记蛋白质的碱基序列除了通过序列确定之外，也可以使用从公共的数据库、例如NCBI(美国国立生物技术信息中心：National Center forBiotechnology Information)的数据库等获取的碱基序列。由前述氨基酸序列求出计算质量时，理想的是，考虑N-末端蛋氨酸残基的切断作为翻译后修饰。具体而言，倒数第2个氨基酸残基为Gly、Ala、Ser、Pro、Val、Thr、或Cys的情况下，以N-末端蛋氨酸被切断的形态算出前述理论值。另外，通过MALDI-TOF MS实际观测的是加成有质子的分子，因此理想的是，也考虑该质子的量来求出前述计算质量(即对各蛋白质通过MALDI-TOF MS进行分析时得到的离子的质荷比的理论值)。
接着，参照流程图，对使用上述微生物分析系统的沙门氏菌属菌的血清型的分析过程进行说明。
首先，用户制备包含被检微生物的构成成分的试样，安装于质谱分析部10并执行质谱分析。此时，作为前述试样，除了细胞提取物、或从细胞提取物精制的核糖体蛋白等细胞构成成分之外，也可以直接使用菌体、细胞悬液。
谱创建程序32经由界面25获取由质谱分析部10的检测器14得到的检测信号，根据该检测信号制作被检微生物的质谱(步骤101)。
接着，种确定程序33将前述被检微生物的质谱与收录于第1数据库34中的已知微生物的质量列表进行对照，提取具有与被检微生物的质谱类似的质荷比图案的已知微生物的质量列表、例如包含多个在规定的误差范围内与被检微生物的质谱中的各峰一致的峰的质量列表(步骤102)。种确定程序33接着通过参照与步骤102中提取的质量列表对应地存储于第1数据库34中的分类信息，从而识别与该质量列表对应的已知微生物所属的生物种(步骤103)。然后，该生物种不是沙门氏菌属菌的情况下(步骤104中No的情况下)，将该生物种作为被检微生物的生物种而输出至显示部23(步骤110)，结束分析处理。另一方面，前述生物种为沙门氏菌属菌的情况下(步骤104中Yes的情况下)，接着推进至利用血清型确定程序35的分析处理。需要说明的是，预先用其它方法判定了试样中含有沙门氏菌属菌的情况下，不使用质谱的种确定程序，而是推进至血清型确定程序35即可。
血清型确定程序35中，首先，血清型判定部39从第2数据库36分别读取作为标记蛋白质的10种蛋白质gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7的质荷比范围(即10个质荷比范围)(步骤105)。接着，谱获取部37获取步骤101中制作的被检微生物的质谱。然后，m/z读取部38判别在该质谱上在与前述各标记蛋白质相关联地存储于第2数据库36中的质荷比范围是否出现峰(步骤106)。
此处，存储于第2数据库36中的10个质荷比范围均未出现峰的情况下(步骤106中No的情况)，试样所含的沙门氏菌属菌作为既不是第1组也不是第2组的血清型而输出至显示部23(步骤110)，结束识别处理。
另一方面，前述10个质荷比范围的至少一个出现峰的情况下(步骤106中Yes)，选择该峰作为与该峰所存在的质荷比范围的标记蛋白质对应的峰，读取其质荷比(步骤107)。然后，血清型判定部39将该读取的质荷比与从前述第2数据库36读取的各标记蛋白质的质荷比的值进行比较，判断两者是否在规定的容许误差范围内一致(步骤108)。此时，作为质荷比范围内所含的质荷比而在第2数据库36中存储有多个值的情况下，判断与哪个值一致。其结果，存储于第2数据库36中的质荷比中存在与读取的质荷比的值一致的值的情况下，根据该结果，判定被检微生物是属于第1组的血清型或属于第2组的血清型中的哪一者，或者是属于第1组和第2组的血清型之中的哪个(步骤109)，将该结果作为被检微生物的识别结果而输出至显示部23(步骤110)。
需要说明的是，预先通过其它方法判定了试样所含的沙门氏菌属菌为第1组或第2组中的任一者的情况下，省略步骤106中的有无峰存在的判定，推进至接下来的步骤107即可。
实施例
以下，针对用于实际证明本发明的微生物分析方法的效果的实验进行说明，但它们是单纯的例示，本发明不限定于它们。
1.沙门氏菌属菌的培养
使用LB琼脂培养基，将属于上述第1组的6种沙门氏菌属菌、及属于上述第2组的24种沙门氏菌属菌的总计30种沙门氏菌属菌在37℃下培养20小时。
2.基质溶液的制作
制作以下的2种基质溶液。
(2-1)在乙醇中以含有25mg/mL的作为基质物质的芥子酸(SA)的方式将其溶解，制作基质溶液(饱和溶液)。将该基质溶液设为“SA-1”。
(2-2)在包含50％的乙腈(ACN)及0.6％的三氟乙酸(TFA)的水溶液中以分别含有SA 25mg/mL、亚甲基二膦酸(MDPNA)1％、作为表面活性剂的癸基-β-D-麦芽糖苷(decyl-β-D-maltopyranoside、DMP)1mM的方式将它们溶解，制作基质溶液。将该基质溶液记作“SA-2”。
基质溶液SA-1及SA-2中使用的SA使用富士胶片和光纯药工业株式会社制的产品，MDPNA及DMP使用Sigma-Aldrich Japan制的产品。
3.基质/微生物悬浊液的制备
(3-1)用微量天平，逐一将LB琼脂培养基上培养的30种沙门氏菌属菌分别称量约1mg并放入到管中，向其中添加基质SA-2溶液以菌浓度成为1mg/0.075mL(约1×107CFU/μL)的方式制备，用针使其悬浊。
(3-2)对管施加超声波振动1分钟，将所得悬浊液离心分离(12000rpm、5min)，得到离心上清液。
4.利用MALDI-MS的分析
(4-1)向MALDI用样品板的各孔中逐一滴加基质溶液SA-1 0.5μL(预涂)。
(4-2)接着，在预涂有基质溶液SA-1的各孔中逐一滴加上述离心上清液1μL，使其自然干燥。
(4-3)将由(4-2)得到的MALDI用样品板插入到MALDI-MS(AXIMA Performance,株式会社岛津制作所制)，以线性模式(正离子模式)测定。测定数据全部通过栅格分析获取。栅格分析为上述质谱分析装置所具备的自动测定功能，是对样品板的各孔内的试样以预先设定的点数、射击数进行激光照射，来获取质谱数据的方法。
5.结果
对测定数据应用沙门氏菌属菌的自校准，对于所得的质谱，读取源自10种蛋白质(gns,YaiA,YibT,PPI,L25,L21,S8,L17,L15,S7)的峰的质荷比m/z。此处，自校准是指，以沙门氏菌属菌自身的若干已归属的峰作为内标来进行校准。
将其结果示于图3～图5。图3为针对属于上述第1组的6种沙门氏菌属菌得到的结果，图4为针对属于第2组的24种沙门氏菌属菌得到的结果。另外，图5示出属于第1组的3种血清型Abaetetuba、Newport、Vellore的沙门氏菌属菌中的蛋白质YaiA、L25的质谱。需要说明的是，图3中“-”表示至少本次未检测到峰。
由图3及图4可知，源自10种蛋白质的峰的质荷比的值中包含在多个血清型中共通的值，但是，根据从源自10种蛋白质的峰的质荷比中选择的1个至多个值的组合，能够识别是第1组和第2组中的哪种血清型、或者缩小候选的范围。此时，质荷比的组合与多种血清型重复的情况下，能够将血清型的候选的范围缩小至该多种血清型。
具体而言，知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组或第2组的血清型的情况下，在与标记蛋白质Gns对应的质荷比的值为“6542”时、或与L25对应的质荷比的值为“10569”时，血清型被识别为第1组的Vellore，在与标记蛋白质YaiA对应的质荷比的值为“7097”时，血清型被识别为第1组的Newport或为第2组的Typhimurium。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组或第2组的血清型的情况下，在与标记蛋白质YibT对应的质荷比的值为“7894”时，血清型被识别为第1组的Tallahassee或Vellore，在与L21对应的质荷比的值为“11593”时，血清型被识别为第1组的Poona或Vellore。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组或第2组的血清型的情况下，在与标记蛋白质YaiA对应的质荷比的值为“7110”时，血清型被识别为第2组的Pullorum_Gallinarum，在与PPI对应的质荷比的值为“10216”时，血清型被识别为第2组的Orion，在与L15对应的质荷比的值为“14948”时，血清型被识别为第2组的Altona。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组或第2组的血清型的情况下，在与标记蛋白质YibT对应的质荷比的值为“8023”时，血清型被识别为第2组的Braenderup或Thompson，在与L25对应的质荷比的值为“10528”时，血清型被识别为第2组的Braenderup、Manhattan、或Amsterdam，进而，在与标记蛋白质Gns对应的质荷比的值为“6511”时，血清型被识别为第2组的Infantis、Mbandaka、Manhattan、Senftenberg、Amsterdam中的任一者。
另外，知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组的血清型的情况下，在与标记蛋白质L21对应的质荷比为“11565”、与S7对应的质荷比为“17474”时，或者在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.1的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Abaetetuba。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型不明的情况下，在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.1的行的数值的组合时，确认血清型有可能为Abaetetuba(能够缩小候选的范围)。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组的血清型的情况下，在与标记蛋白质L21对应的质荷比为“11579”、与YaiA对应的质荷比为“7111”、与YibT对应的质荷比为“7993”时，或者在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.2的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Anatum。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型不明的情况下，在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.2的行的数值的组合时，确认血清型有可能为Anatum(能够缩小候选的范围)。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组的血清型的情况下，在与标记蛋白质YaiA对应的质荷比为“7097”时，或者在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.3的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Newport。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为不明的情况下，在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.3的行的数值的组合时，确认血清型有可能为Newport(能够缩小候选的范围)。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组的血清型的情况下，在与标记蛋白质S7对应的质荷比为“17460”时，或者在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.4的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Poona。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型不明的情况下，10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.4的行的数值的组合时，确认血清型有可能为Poona(能够缩小候选的范围)。
知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组的血清型的情况下，在与标记蛋白质Gns对应的质荷比为“6483”、与YibT对应的质荷比为“7894”时，或者在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.5的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Tallahassee。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型不明的情况下，在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.5的数值的组合时，确认血清型有可能为Tallahassee(能够缩小候选的范围)。
对属于第一组的菌进行分析，在与标记蛋白质Gns对应的质荷比为“6542”时，或在与L25对应的质荷比为“10569”时，或在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.6的行中所示的数值的组合时，血清型被识别为Vellore。另外，被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型不明的情况下，在与标记蛋白质Gns对应的质荷比为“6542”时，或在与L25对应的质荷比为“10569”时，或在10种标记蛋白质的质荷比的组合为图3的No.6的行中所示的数值的组合时，确认血清型有可能为Vellore(能够缩小候选的范围)。
如此，知晓被检微生物为沙门氏菌属菌且其血清型为属于第1组或第2组的血清型的情况下，或者知晓其属于第1组的情况下，或者不明其是否为属于第1及第2组的血清型的情况下，在任一情况下均能够根据源自从由10种标记蛋白质及它们任意的组合组成的组中选择的1种或多种的峰的质荷比，来识别血清型、或缩小至若干个血清型候选的范围。
[方式]
本领域技术人员理解，上述多个例示性的实施方式为以下的方式的具体例。
(第1相)一方式的微生物分析方法具备：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，
识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别在前述试样中是否包含Salmonella属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及Vellore中的至少1种。
根据第1项所述的微生物分析方法，能够容易地识别试样所含的微生物是迄今难以与其它沙门氏菌属菌的血清型相区别的沙门氏菌属菌的规定6种血清型中的任意种。
(第2项)第1项所述的微生物分析方法中，代替前述识别步骤，具有：
识别步骤，根据前述读取的质荷比m/z，识别在前述试样中是否包含Salmonella属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及Vellore中的至少1种，或者是否包含22种血清型即Enteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及Amsterdam中的至少1种。
根据第2项所述的微生物分析方法，能够容易地识别试样所含的微生物为沙门氏菌属菌的规定6种血清型中的任意种、或为22种血清型中的任意种。
(第3项)第1项或第2项所述的微生物分析方法中，具有如下步骤：
在前述识别步骤中识别了前述试样中包含前述6种血清型中的至少1种的情况下，根据源自从由前述10种蛋白质及它们的任意组合组成的组中选择的1种至10种蛋白质的峰的质荷比m/z，识别在前述试样中包含前述6种血清型中的哪种血清型。
根据第3项所述的微生物分析方法，能够识别试样所含的微生物为沙门氏菌属菌的前述6种血清型中的哪种。
(第4项)第1项所述的微生物分析方法中，代替前述识别步骤，具有如下步骤：
根据前述读取的质荷比m/z，识别在前述试样中包含前述6种血清型中的哪种血清型。
根据第4项所述的微生物分析方法，能够识别试样所含的微生物为至今难以与其它沙门氏菌属菌的血清型相区别的沙门氏菌属菌的规定6种血清型中的哪种。
(第5项)另一方式的程序执行上述第1项～第4项中任一项所述的各步骤。

Claims (5)

1.一种微生物分析方法，其具备如下步骤：
读取步骤，从对含有微生物的试样进行质谱分析所得到的质谱，读取源自从由10种蛋白质即gns、YaiA、YibT、PPI、L25、L21、S8、L17、L15、S7及它们的任意组合组成的组中选择的1至10种蛋白质的峰的质荷比m/z；以及，
识别步骤，根据所述读取的质荷比m/z，识别在所述试样中是否包含沙门氏菌(Salmonella)属菌的6种血清型即阿巴特图巴(Abaetetuba)、鸭(Anatum)、纽波特(Newport)、浦那(Poona)、塔拉哈西(Tallahassee)、及韦洛尔(Vellore)中的至少1种。
2.根据权利要求1所述的微生物分析法，其中，代替所述识别步骤，具备如下步骤：
识别步骤，根据所述读取的质荷比m/z，识别在所述试样中是否包含Salmonella属菌的6种血清型即Abaetetuba、Anatum、Newport、Poona、Tallahassee、及Vellore中的至少1种，或者是否包含22种血清型即Enteritidis、Typhimurium、Minnesota、Infantis、Brandenburg、Rissen、Schwarzengrund、Montevideo、Mbandaka、Orion、Pullorum_Gallinarum、Abony、Choleraesuis、Saintpaul、Braenderup、Pakistan、Thompson、Altona、Istanbul、Manhattan、Senftenberg、及Amsterdam中的至少1种。
3.根据权利要求1或2所述的微生物分析方法，其具有如下步骤：
在所述识别步骤中识别了在所述试样中包含所述6种血清型中的至少1种的情况下，根据源自从由所述10种蛋白质及它们的任意组合组成的组中选择的1种至10种蛋白质的峰的质荷比m/z，识别在所述试样中包含所述6种血清型中的哪种血清型。
4.根据权利要求1所述的微生物分析方法，其中，代替所述识别步骤，具有如下步骤：
根据所述读取的质荷比m/z，识别在所述试样中包含所述6种血清型中的哪种血清型。
5.一种非临时性计算机可读介质，其存储有用于使计算机执行权利要求1或2所述的各步骤的程序。
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