CN109154019A - 微生物的识别方法 - Google Patents

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Abstract

一种微生物的识别方法，其特征在于，具有：对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z的步骤；识别步骤，基于所述质荷比m/z对所述试样所含的微生物含有弯曲菌属菌的哪一个菌种进行识别，使用18种标记蛋白质S10、L23、S19、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S13、S11(Me)、L32、L7/L12中的至少一种作为所述标记蛋白质。

Description

微生物的识别方法
技术领域
本发明涉及利用了质量分析的微生物的识别方法。
背景技术
弯曲菌(Campylobacter)属菌是微需氧性无芽胞的革兰氏阴性螺旋状杆菌，目前报道有33个菌种(非专利文献1)。本属细菌中的胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)，虽然从大约100多年前作为造成家畜流产的细菌而熟知，但是目前，空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、大肠弯曲菌(Campylobaefer coli)作为造成人类的弯曲菌感染症的细菌而备受关注。在较多的发达国家,弯曲菌感染症具有增加的倾向(非专利文献2)，并引起作为并发症的格林巴利综合征或费希尔氏综合征等的末梢神经炎。
弯曲菌属菌的增殖时间较慢，是一般细菌的大约两倍，在37℃下以40～50分钟增殖。此外，在pH5.5～8.0下进行增殖。虽然本属菌在有氧条件的室温下2～3日即死亡，但是在10℃以下即便是有氧条件也可生存相当长的时间。此外，在以-20℃以下的温度冻结的生肉或真空包装以及惰性气体置换包装后的包装生肉中也能够生存1个月以上。虽然本属菌的大多数的种的最适发育温度为30～37℃，但也存在在25℃下发育的菌种与在42℃下发育的菌种。在42℃下发育的菌种被称为“嗜热弯曲菌(Thermophilic Campylobacter)”，与食物中毒有关系的菌种属于该菌种。
弯曲菌属菌大多广泛地分布在家畜、家禽、宠物以及野生动物的肠管中，并且被认为是来自这些动物的细菌是从河川或湖水、甚至下水道等分离的(非专利文献3)。在发达国家中被最为重视感染源的是鸡，鸡肉的污染率与其他的牲畜肉相比非常高(非专利文献5)。根据国内外的调查，在鸡中不会发生垂直感染，而是通过水平感染在短时间内蔓延。还报道了从候鸟到家禽的传播(非专利文献4、5)。
在空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的流行病学调查中，虽然两种血清分型法(Penner型和Lior型)被广泛地使用(非专利文献6、7)，但是Penner型诊断用血清只在有限的机构配备，并且Lior型的血清分型法花费时间。
由于上述情况，空肠弯曲菌、大肠弯曲菌作为食物中毒菌必须在食品以及医疗领域进行管理，并且有必要开发迅速的检测以及鉴定识别技术。
至今为止报道有m-PCR(非专利文献8、9)、脉冲场凝胶电泳(非专利文献10)、多位点序列分型(非专利文献11、12)等。然而，这些方法存在需要繁琐的操作，并且花费时间的问题。
另一方面，近年来根据基质辅助激光解吸电离飞行时间质量分析法(MALDI-TOFMS)对微生物进行鉴定的技术，在临床以及食品领域急速地普及。本方法是基于使用极微量的食物试样得到的质谱图谱进行微生物鉴定的方法，能够在短时间内得到分析结果，并且容易对多个被检体进行连续分析，因此能够简便并且迅速地进行微生物鉴定。
到目前为止，已经有多个研究组尝试了使用MALDI-TOF MS的弯曲菌属菌的识别(非专利文献13、14、15、16、17)。在非专利文献13中虽然报道了，弯曲菌属菌的6种中，大肠弯曲菌(以下，“Campylobacter”简称成“C.”)使用核糖体蛋白质L7/L12与DNA结合蛋白质HU、空肠弯曲菌使用核糖体蛋白质S13与DNA结合蛋白质HU、海欧弯曲菌(C.lali)使用核糖体蛋白质L7/L12与伴侣蛋白GroES、9651Da的未知蛋白质、唾液弯曲菌(C.spectorum)使用12786Da与9796Da的未知蛋白质、瑞士弯曲菌(C.helveticus)使用9504Da与DNA结合蛋白质HU、乌普萨拉弯曲菌(C.upsaliensi)使用DNA结合蛋白质HU进行识别，但是均没有遗传上的证据。
在非专利文献13中，以遗传上的证据为基础使用DNA结合蛋白质HU识别弯曲菌属菌的6种(大肠弯曲菌、空肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、唾液弯曲菌、瑞士弯曲菌以及乌普萨拉弯曲菌)。但是，根据我们进行的再现实验，未能在MALDI-TOF MS中稳定地检测出DNA结合蛋白质HU。
此外，在非专利文献17中，虽然报道了使用MALDI-TOF MS识别空肠弯曲菌的多位点序列分型后的组，但是未阐明生物标记的峰的来源。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-191922号公报
专利文献2：日本特开2013-085517号公报
非专利文献
非专利文献1：List of prokaryotic names with standing in nomenclature，(检索日2015年9月18日)，网址<URL:http://www.b acterio.net/>
非专利文献2：Rosenquist,H.et.al.,Int.J.Food Microbiol.,2003年,83(1),第87-103页
非专利文献3：Corr J.et.al.,Appl.Microbiol.2011年,96S－114S
非专利文献4：Hald,B.et.al.,Acta Vet Scand,2016年,58(1),1
非专利文献5：Newell G.et.al.,ASM press,2000年,第497－509页
非专利文献6：Penner,J.et.al.,J.Clin.Microbiol.1980年,12：第732－737页
非专利文献7：Lior,H.et al.J.Clin.Microbiol.1980年,15：第761－768页
非专利文献8：Samosornsuk,W.et al.Microbiol.Immunol.,2007年,51(9),第909-917页
非专利文献9：Asakura,M.,et al.,Microb.Pathog.,2007年,42,第174-183页
非专利文献10：Gibson,J.et al.,应用微生物学快报,1994年,19(5),第357-358页
非专利文献11：Behringer,M.,et al.,Journal of Microbiology Methods,2011年,84(2),第194-201页
非专利文献12：Zautner,A.E.,et al.,应用和环境微生物学,2011年,77(7),第2359-2365页
非专利文献13：Mandrell,R.E.,Harden,L.A.,Bates,A.,Miller,W.G.,Haddon,W.F.,&Fagerquist,C.K.,应用和环境微生物学,2005年,71(10),第6292-6307页
非专利文献14：Fagerquist,C.K.,Miller,W.G.,Harden,L.A.,Bat es,A.H.,Vensel,W.H.,Wang,G.,&Mandrell,R.E.,分析化学,2005年,77(15),第4897-4907页.
非专利文献15：Alispahic,M.,et.al.,Jouranl of medical microbiology,2010年,59(3),第295-301页
非专利文献16：Bessede,E.,et.al.,2011年,Clinical Microb iology andInfection,17(11),第1735-1739页
非专利文献17：Zautner,A.E.,et.al.,BMC microbiology,2013年,13:247.
发明内容
发明要解决的技术问题
如上所述，虽然有多篇有关利用MALDI-TOF MS的弯曲菌属菌的菌种识别以及类型划分的报道，但是没有提及亚种识别或菌株识别的报道，很少有对出现在质谱上的各峰或生物标记峰的每一个源自哪种蛋白质进行确定的报道，并且没有再现性。即，尚未确定能够优选地利用于弯曲菌属菌的亚种以及菌株的识别的可靠性高的标记蛋白质。
在专利文献1中示出了以下方法(S10-GERMS法)是有用的：利用大约一半的对微生物菌体进行质量分析得到的峰源自核糖体蛋白质，将由质量分析得到的峰的质荷比，与从翻译了核糖体蛋白质基因的碱基序列信息的氨基酸序列中推测的计算质量相关联，由此对该峰的来源的蛋白质的种类进行归属。根据该方法，使用质量分析以及其附属的软件，能够进行基于理论依据且可靠性高的微生物的鉴定(专利文献2)。
本发明要解决的技术问题，是提供一种基于遗传信息的可靠性高的生物标记，用于进行弯曲菌属菌的亚种以及空肠弯曲菌的菌株的识别。
用于解决上述技术问题的方案
本发明人不断锐意研究的结果，发现：18种核糖体蛋白质S10、L23、S19、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S13、S11(Me)、L32、L7/L12作为用于根据质量分析对试样所含的菌种是弯曲菌(Campylobacter)属菌的哪一个菌种、或者在该情况下对亚种或菌株(血清型)进行识别的标记蛋白质是有用的，通过使用这些核糖体蛋白质的至少一种，能够对弯曲菌属菌的菌种以及亚种与菌株(血清型)进行识别，并且特别是通过使用在这些中的7种核糖体蛋白质L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11的至少一种，能够再现性良好并且迅速地识别弯曲菌属菌的菌种以及亚种，从而完成了本发明。
即，为了解决上述技术问题而完成的本发明的微生物的识别方法，其特征在于，具有：
a)对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；
b)从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z的步骤；
c)识别步骤，基于所述质荷比m/z识别所述试样所含的微生物含有弯曲菌属菌的哪一个菌种，
使用18种核糖体蛋白质S10、L23、S19、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S13、S11(Me)、L32、L7/L12中的至少一种作为所述标记蛋白质。
优选为，在上述微生物的识别方法中，使用7种核糖体蛋白质L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11中的至少一种作为所述标记蛋白质。
上述微生物的识别方法优选作为对所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.jejuni)、空肠弯曲菌德莱亚种(Campylobacter jejunisubsp.doylei)、大肠弯曲菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lali)这5种中的任一种进行识别的方法。
具体地说，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌空肠亚种时，作为所述标记蛋白质，至少包括L24、L32、L23、S14、L7/L12的任一种以及L23。
此外，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌德莱亚种时，所述标记蛋白质至少包括L24。
进而，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为大肠弯曲菌时，作为所述标记蛋白质，至少包括L32、S14、由L23以及L24构成的组的任一种。
此外，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为胎儿弯曲菌时，至少使用L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11中的一种作为所述标记蛋白质。
进而，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为海鸥弯曲杆菌时，作为所述标记蛋白质，至少包括L23、L24、S14、L32、L7/L12中的一种。
此外，在上述的微生物的识别方法中，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，能够用作对其血清型进行识别的方法。具体地说，优选为，在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为R，则作为所述标记蛋白质至少包括L23。
此外，优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为A，则作为所述标记蛋白质至少包括L23、或者L32、L7/L12中的任一种。
优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为B，则作为所述标记蛋白质至少包括L7/L12。
优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为U，则作为所述标记蛋白质至少包括L7/L12。
优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为D，则作为所述标记蛋白质至少包括L32、L23或者L32、L24的任一种。
优选为，在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为复合DF，则作为所述标记蛋白质至少包括L32。
此外，在上述微生物的识别方法中，
若使用将至少源自L24、S14、S11的质荷比m/z作为指标的聚类解析，则能够对所述试样所含的微生物是所述弯曲菌属菌的亚种的哪一种精度良好地进行分类。
优选为，在上述的聚类解析中，将至少源自L24、S14、L36的质荷比m/z作为指标。
也可以是，在这种情况下，还具有制作表示根据所述聚类解析的识别结果的树状图的步骤。
此外，在上述微生物的识别方法中，使用将至少源自L32、L7/L12、L23、S11或者L32、L7/L12、L24、S11的质荷比m/z作为指标的聚类解析，能够将所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时的血清型进行分类。
也可以是，在这种情况下，还优选将源自L23、L24、S14、L32、L7/L12的质荷比m/z作为指标，进而将源自L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12的m/z作为指标。
发明效果
在上述本发明的微生物的识别方法中，由于使用了在弯曲菌属菌的菌种中示出特有的变异的核糖体蛋白质作为标记蛋白质，因此能够再现性良好、并且迅速地对弯曲菌属菌的菌种进行识别。
此外，使用在弯曲菌属菌的菌种中示出特有的变异的核糖体蛋白质作为标记蛋白质使用，将质谱上的源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z作为指标进行聚类解析，由此能够一并地进行多个试样所含的弯曲菌属菌的识别。
附图说明
图1是示出本发明的微生物的识别方法所采用的微生物识别系统的要部的构成图。
图2是示出本发明的微生物的识别方法的顺序的一例的流程图。
图3是示出在实施例中使用的弯曲菌属菌的菌种名、亚种名以及菌株名的一览的图。
图4是示出在实施例中使用的引物的一览的图。
图5是示出各氨基酸的质量的图。
图6是示出在实施例中使用的弯曲菌属菌的各核糖体蛋白质的理论质量值与MALDI-TOF MS的实测值的一览的图。
图7A是7种核糖体蛋白质的实测值的归属结果。
图7B是示出图7A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图7C是使用图7A所示的4种核糖体蛋白质而制作的树状图。
图8是通过MALDI-TOF MS测量得到的图表。
图9是SARAMIS的识别结果。
图10是通过MALDI-TOF MS测量得到的峰图表。
图11A是6种核糖体蛋白质的实测值的归属结果。
图11B是示出图11A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图11C是使用图11A所示的6种核糖体蛋白质而制作的树状图。
图12A是4种核糖体蛋白质的实测值的归属结果。
图12B是示出图12A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图12C是使用图12A所示的4种核糖体蛋白质而制作的树状图。
图13A是其他4种核糖体蛋白质的实测值的归属结果(血清型识别)。
图13B是示出图13A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图13C是使用图13A所示的4种核糖体蛋白质制作而成的树状图。
图14A是3种核糖体蛋白质的实测值的归属结果(血清型识别)。
图14B是示出图14A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图14C是使用图14A所示的3种核糖体蛋白质制作而成的树状图。
图15A是其他3种核糖体蛋白质的实测值的归属结果(血清型识别)。
图15B是示出图15A所示的归属编号与理论质量值的关系的表。
图15C是使用图15A所示的3种核糖体蛋白质制作而成的树状图。
具体实施方式
以下对本发明的微生物的识别方法的具体实施方式进行说明。
图1是本发明的微生物的识别方法所采用的微生物识别系统的整体图。该微生物识别系统，大致上由质量分析部10与微生物辨别部20构成。质量分析部10具备：离子化部11，通过基质辅助激光解吸离子化法(MALDI)使试样中的分子或原子离子化；飞行时间型质量分离器(TOF)12，根据质荷比对从离子化部11射出的各种离子进行分离。
TOF12具备：引出电极13，将离子从离子化部11引出并导入至TOF12内的离子飞行空间；检测器14，对在离子飞行空间中被质量分离的离子进行检测。
微生物辨别部20的实体是工作站或个人计算机等的计算机，中央运算处理装置即CPU(中央处理器)21中，与存储器22、由LCD(液晶显示屏)等构成的显示部23、键盘或鼠标等构成的输入部24、由硬盘或SSD(固态硬盘)等的大容量存储装置构成的存储部30相互地连接。在存储部30中存储了OS(操作系统)31、质谱制作程序32、属/种确定程序33、以及下位分类确定程序35(本发明的程序)，并且储存有第1数据库34以及第2数据库36。微生物辨别部20，还具备接口(I/F)25，并通过该接口25经由网线NW(或者无线局域网)与质量分析部10连接，所述接口25用于管理与外部装置的直接连接或经由LAN(局域网)与外部装置等连接。
在图1中，示出了与下位分类确定程序35有关的质谱获取部37、m/z读取部38、下位分类判断部39、聚类解析部40以及树状图(系统图)制作部41。这些均基本上是通过CPU21执行下位分类决定程序35而在软件上实现的功能机构。另外，下位分类确定程序35并不需要一定是单个的程序，也可以是例如编入了用于控制属/种确定程序33或者质量分析部10的程序的一部分的功能，而无论其形态如何。另外，例如能够利用根据以往的指纹图谱法进行微生物鉴定的程序等作为属/种确定程序33。
此外，在图1中，虽然构成为在用户所操作的终端搭载质谱制作程序32、属/种确定程序33、下位分类确定程序35、第1数据库34以及第2以及数据库36，但是也可以构成为，将这些程序或者数据库中的至少一部分或者全部设置于通过计算机网络与所述终端连接其他装置内，按照来自所述终端的指示，执行设置于所述其他装置内的程序的处理以及/或者数据库的访问。
在存储部30的第1数据库34中，记录有大量与已知微生物有关的质量列表。该质量列表列举了对某种微生物细胞进行质量分析时检测出的离子的质荷比，除了该质荷比的信息以外，至少还包括所述微生物细胞所属的分类群(科、属、种等)的信息(分类信息)。这样的质量列表优选是基于以如下方式得到的数据(实测数据)而制作的：预先通过与所述质量分析部10相同的离子化法以及质量分离法对各种微生物细胞实际地进行质量分析。
根据所述实测数据制作质量列表时，首先从作为所述实测数据而获取的质谱中提取出现在规定的质荷比范围的峰。这时，通过使所述质荷比的范围为2，000～35，000左右，能够主要提取源自蛋白质的峰。此外，通过仅提取峰的高度(相对强度)为规定的阈值以上的峰，能够排除不期望的峰(噪声)。另外，由于在细胞内大量地发现核糖体蛋白质组，所以通过适当地设定所述阈值，能够使质量列表所记载的质荷比的大部分为来源于核糖体蛋白质。并且，按照细胞将通过以上内容而提取的峰的质荷比(m/z)列表化，在添加了所述分类情报之后，记录在第1数据库34。另外，为了抑制培养条件引起的基因发现的偏差，优选为，预先将用于实测数据的采集的各微生物细胞的培养条件标准化。
在存储部30的第2数据库36中，记录了有关标记蛋白质的信息，该标记蛋白质用于在比种更下位的分类(亚种、病原型、血清型、株等)中，对已知微生物进行识别。作为与该标记蛋白质有关的信息，至少包括已知微生物中该标记蛋白质的质荷比(m/z)的信息。在本实施方式中的第2数据库36中，作为有关用于判断被检微生物是弯曲菌属菌的哪一种的标记蛋白质的信息，至少存储了核糖体蛋白质S10、L23、S19、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S13、S11(Me)、L32、L7/L12的质荷比的值。关于这些核糖体蛋白质的质荷比的值将后述。
作为储存在第2数据库36的标记蛋白质的质荷比的值，优选是将各标记蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列，由此求出的计算质量与通过实测检测出的质荷比进行比较并筛选。另外，标记蛋白质的碱基序列，除了由序列决定以外，还能够使用从公共的数据库例如从NCBI(国立生物工程信息中心：National Center for Biotechnology Information)的数据库等获取的数据。优选为，在根据所述氨基酸序列求出计算质量时，作为翻译后的修饰，考虑将N-末端甲硫氨酸残基切断。具体地说，在倒数第2个氨基酸残基为Gly、Ala、Ser、Pro、Val、Thr或者Cys的情况下，根据N-末端甲硫氨酸被切断后的氨基酸序列来计算出所述理论值。此外，由于通过MALDI-TOF MS实际观测到的是附加了质子的分子，所以优选为也加入该质子的部分从而求出所述计算质量(即利用MALDI-TOF MS对各蛋白质进行分析的情况下得到的离子的质荷比的理论值)。
一边参照流程图，一边对使用了本实施方式的微生物识别系统的弯曲菌属菌的识别顺序进行说明。
首先，用户对含有被检微生物的构成成分的试样进行制备，将其放在质量分析部10从而执行质量分析。此时，作为所述试样，除了能够使用细胞提取物或者将来自细胞提取物的核糖体蛋白质等的细胞构成成分进行提纯后得到物质以外，还能够原样地使用菌体或细胞悬浮液。
质谱制作程序32中，经由接口25获取从质量分析部10的检测器14得到的检测信号，基于该检测信号制作被检微生物的质谱(步骤S101)。
接下来，属/种确定程序33，将所述被检微生物的质谱与收录在第1数据库34的已知微生物的质量列表进行对照，提取具有与被检微生物的质谱类似的质荷比模式的已知微生物的质量列表，例如较多地含有在规定的误差范围内与被检微生物的质谱中的各峰一致的峰的质量列表(步骤S102)。接着，属/种确定程序33与在步骤S102中提取的质量列表相对应地参照存储于第1数据库34的分类信息，由此对与该质量列表对应的已知微生物所属的生物种进行确定(步骤S103)。然后，在该生物种并非弯曲菌属菌的情况(在步骤S104中为否的情况)下，将该生物种作为被检微生物的生物种输出至显示部23(步骤S112)从而结束识别处理。另一方面，在所述生物种是弯曲菌属菌的情况(在步骤S104中为是的情况)下，接着进入根据下位分类确定程序35的识别处理。另外，在预先利用其他的方法，判断试样中含有弯曲菌属菌的情况下，不利用使用了质谱的属/种确定程序，而进入下位分类确定程序35即可。
在下位分类确定程序35中，首先下位分类判断部39从第2数据库36中分别读出标记蛋白质即7种核糖体蛋白质L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11的质荷比的值(步骤S105)。接着质谱获取部37获取在步骤S101中制作的被检微生物的质谱。然后，m/z读取部38，在该质谱上，将与所述的各标记蛋白质相关联并出现在第2数据库36所储存的质荷比范围的峰，作为与各标记蛋白质相对应的峰选出，并读取其质荷比(步骤S106)。然后，执行将读取的质荷比作为指标的聚类解析。具体地说，下位分类判断部39，将该质荷比与从所述第2数据库36读出的各标记蛋白质的质荷比的值进行比较，根据该读取的质荷比，确定蛋白质的归属(步骤S107)。然后，基于确定的归属执行聚类解析从而判断被检微生物的种(步骤S108),将该内容作为被检微生物的识别结果输出至显示部23(步骤S109)。
以上，虽然一边参照附图一边对本发明的具体实施方式进行了说明，但是本发明并不限于上述实施方式，允许在本发明的主旨的范围内进行适当变更。
实施例
(1)使用的菌株
在解析中使用从图3所记载的菌株保藏机构、理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM)(筑波市)以及美国模式培养物积存库(美国，弗吉尼亚州，马纳萨斯)得到的弯曲菌属菌。空肠弯曲菌的血清型(Penner型的血清型)是通过弯曲菌免疫血清“生研”(电化生研株式会社)而确定的。
(2)DNA的解析
通过基于基因组解读株的对象区域的上游以及下游的共有序列而设计的如图4所示的引物，对S10-spc-alpha操纵子的核糖体蛋白质基因的DNA序列进行了解析。详细地说，通过常规方法从各菌株提取基因组，将此作为模板并通过KOD plus进行PCR，对目标基因区域进行了扩增。将得到的PCR产物进行提纯，并将其用作序列解析的模板。使用Big Dyever.3.1循环测序试剂盒(加利福尼亚州，福斯特城，美国应用生物系统公司)进行了序列解析。将基因的DNA碱基序列转换为各个基因的氨基酸序列，并基于图5的氨基酸质量，计算出质荷比作为理论质量值。
(3)通过MALDI-TOF MS进行的测量
将在含5％养血的胰酶大豆琼脂培养基(日本，东京，日本BD株式会社)或者EGMEDIUM培养基繁殖的菌体作为分析样品。将大约1个菌落部分的上述分析样品加入到10μL的芥子酸基质剂(在50v/v％乙腈、1v/v％三氟乙酸溶液中含20mg/mL的芥子酸(日本，大阪，和光纯药工业株式会社)而成的溶液)并充分混合，接着，将1.2μL的该混合液滴到样品板上，使其自然干燥。在MALDI-TOF MS测量中使用AXIMA微生物鉴定系统(日本，京都市，株式会社岛津制作所)，以台式线性模式、2000m/z～35000m/z的质谱范围对试样进行了测量。将以上述的方法计算出的理论质量值，在容许误差500ppm的范围内与测量的质荷比进行匹配，并实施了适当的修正。另外使用大肠杆菌DH5α菌株，按照说明书实施质量分析装置的校正。
(4)识别弯曲菌属菌的株的数据库的构建
将通过上述(2)得到的核糖体蛋白质的理论质量值与通过MALDI-TOF MS测量得到的峰图表进行对照，确认了关于实际能够检测出的蛋白质，根据它的基因序列求出的理论质量值与实测值没有差异。接下来，对于S10-spc-alpha操纵子内的核糖体蛋白质以及根据菌株的不同显示不同的质量而能够作为其他的生物标记的26种核糖体蛋白质，对其理论质量值与实测值的关系进行了调查。其结果在图6中示出。
在图6中，关于弯曲菌属菌的各菌种，示出了表示根据基因求出的质荷比(m/z)的理论质量值与在实测中的质量峰的检测结果的〇、×、△的记号。〇表示了在AXIMA微生物鉴定系统的缺省的峰处理设定(阈值偏移：0.015mV，阈值响应：1.200)下检测出与理论值的差在500ppm范围内的峰的情况，×表示存在未能检测出的情况。△是指各菌株的理论值质量差或者与其他的蛋白质峰的分别在500ppm以内，即便检测出了峰也无法识别该质量差。此外，关于在图6所示的26种核糖体蛋白质中的S11，虽然有根据菌种而甲基化的情况，但是对于这种情况，将甲基化后的质荷比作为理论质量值与实测值进行了对照。在图6中，理论质量值的后面添加了(Me)表示将甲基化后的质荷比作为理论质量值。
从图6可知，在S10-spc-alpha操纵子内进行编码的核糖体蛋白质S10、L23、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S11以及S13与其他的核糖体蛋白质L23以及L7/L12(共计16种),由于其理论值因弯曲菌属的菌株而不同，显示出了作为能够用于菌株识别的有用的蛋白质标记的可能性。
然而，由于S10、L22、L16、L29、S17、L14、L18、L15以及S13存在杂质峰，因此被认为不适合作为生物标记。另一方面，L23、L24、S14、L36、S11、L32以及L7/L12共计7种核糖体蛋白质，由于无论对哪种菌株都能够稳定地检测，进而菌株的质量值的差也在500ppm以上，所以作为用于在MALDI-TOF MS中识别弯曲菌属菌的菌株的标记蛋白质是有用的。因此，在以下的实验中，使用这7种核糖体蛋白质作为生物标记。
(5)根据软件的MALDI-TOF MS实测值的归属
首先，将上述7种核糖体蛋白质的理论质量值记录在专利文献2所示软件中。
接着，通过该软件对由MALDI-TOF MS测量得到的实测值数据进行解析，调查各个生物标记是否作为记录的质量峰被正确地归属。其结果如图7A所示，对于所有的菌株，所有的生物标记的质量峰作为已记录的质量数进行了被归属。记录的理论质量值与归属编号之间的关系如图7B所示。与Penner型血清型进行了对照，空肠弯曲菌的Penner型血清型分别被识别为A、B、D、复合DF、U、R。
此外，将空肠弯曲菌的各质量图形(归属结果)进行聚类解析，并将该结果作为二进制图输出，通过系统树制作软件Past制作系统分类图(树状图)(图7C)，能够识别空肠弯曲菌的亚种空肠亚种与德莱亚种，并且通过子树进行归纳。此外，能够识别胎儿弯曲菌的亚种胎儿亚种与性病亚种。根据以上内容证明了，上述7种的生物标记，对弯曲菌属菌的菌种的识别以及亚种识别是有用的。
虽然此次发现的生物标记与在非专利文献13中报道的质量峰大肠弯曲菌L7/L12；12854Da、空肠弯曲菌S13；13735Da名称相同，但是根据基因信息计算出了准确的峰，并且也与实测值进行了对照。此外，排除了非专利文献15所使用的L29那样的杂质峰较多的生物标记。由此，这次首次是能够提供可靠性高的质量数据库。
(6)与指纹图谱法(SARAMIS)的比较
实际地将现有的指纹图谱法(SARAMIS)的识别结果与表6所示的将生物标记理论质量值作为指标的识别结果进行比较。首先，在MALDI-TOF MS的实测中得到图8所示的图表。利用SARAMI按照AXIMA微生物鉴定系统的说明书对该结果进行了解析。由此得到的结果如图9所示。空肠弯曲菌德莱亚种ATCC49350由于是76％的较低的值，被识别为空肠弯曲菌，至于空肠弯曲菌德莱亚种ATCC49349，由于在SARAMI中没有储存与之一致的数据库，所以也未进行属的鉴定。大肠弯曲菌、空肠弯曲菌空肠亚种、胎儿弯曲菌胎儿亚种(Campylobacterfetus subsp.fetus)、胎儿弯曲菌性病亚种(Campylobacter fetus subsp.venerealis)、海鸥弯曲杆菌海鸥亚种(Campylobacter lari subsp.lari)由于识别率在95％以上所以被准确地鉴定。均未进行亚种的识别。
因此，我们尝试了是否能够将不同的亚种的菌株的实测结果以图8A所示的理论质量数据库为基础进行识别。图10是将图8的图表中7种生物标记部分放大后的图表。从图10中可知，由于各个生物标记质量发生偏移，所以能够对峰进行区分。与7种生物标记的实测值进行比较并归属后，与图7A所示的结果一致。
此外，在上述实施例中，虽然作为用于弯曲菌属菌的菌种或亚种的识别的标记蛋白质，使用了7种核糖体蛋白质，但是并不限于此。例如，图11A～图11C示出了，使用了从上述7种标记蛋白质中去掉S11的6种生物标记的归属结果进行聚类解析，从而制作系统分类图(树状图)的结果。如图11C所示，在该方法中，能够识别空肠弯曲菌的亚种空肠亚种与德莱亚种，并且虽然利用子树进行了归纳，但是未能够进行胎儿弯曲菌的亚种的识别。然而，能够对空肠弯曲菌与胎儿弯曲菌的菌种进行识别。通过以上内容证明了6种的生物标记在弯曲菌属菌的种的识别以及空肠弯曲菌的亚种的识别中的有用性。
此外，图12A～图12C示出了使用标记蛋白质的归属结果对4种核糖体蛋白质L32、L7/L12、L23以及S11进行聚类解析，从而制作系统分类图(树状图)的结果。在该方法中，虽然与将7种核糖体蛋白质作为生物标记的情况(图8C所示的结果)略有不同，但是能够对弯曲菌属菌的菌种或亚种进行识别。因此，也证明于4种核糖体蛋白质在弯曲菌属菌的菌种或亚种的识别中的有用性。
进而，图13A～图13C示出了，使用标记蛋白质的归属结果对其他4种核糖体蛋白质L32、L7/L12、L24以及S11进行聚类解析，从而制作系统分类图(树状图)的结果。在该方法中，虽然与将7种核糖体蛋白质作为生物标记的情况(图8C所示的结果)略微不同，但是能够对弯曲菌属菌的种或亚种进行识别。因此，也证明了这些4种核糖体蛋白质在弯曲菌属菌的种与亚种的识别中的有用性。
图14A～图14C示出了，使用标记蛋白质的归属结果对3种核糖体蛋白质L24、S14以及S11进行聚类解析，从而制作系统分类图(树状图)的结果。在该方法中，虽然未能进行空肠弯曲菌的亚种的识别，但是能够进行弯曲菌属菌的识别。
此外，图15A～图15C示出了，使用标记蛋白质的归属结果对其他3种核糖体蛋白质L24、S14以及L36进行聚类解析，从而制作系统分类图(树状图)的结果。在该方法中，虽然未能进行空肠弯曲菌的亚种的识别以及胎儿弯曲菌的亚种的识别，但是能够进行弯曲菌属菌的识别。
(7)生物标记的基因序列以及氨基酸序列
因弯曲菌属菌的菌株不同而示出了不同的理论质量值，从而在序列表中示出：在S10-spc-α操纵子内编码的核糖体蛋白质L23、L24、S14以及L36、在S10-spc-α操纵子外编码的核糖体蛋白质L32以及L7/L12的共计6种核糖体蛋白质的各菌株中的DNA序列以及氨基酸序列。
附图标记说明
10 质量分析部
11 离子化部
12 TOF
13 引出电极
14 检测部
20 微生物辨别部
21 CPU
22 存储器
23 显示部
24 输入部
25 I/F
30 存储部
31 OS
32 质谱制作程序
33 属/种确定程序
34 第1数据库
35 下位分类确定程序
36 第2数据库
37 质谱获取部
38 m/z读取部
39 下位分类判断部
40 聚类解析部
41 树状图制作部

Claims (21)

1.一种微生物的识别方法，其特征在于，具有：
a)对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；
b)从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z的步骤；
c)识别步骤，基于所述质荷比m/z识别所述试样所含的微生物含有弯曲菌属菌的哪一个菌种，
使用18种核糖体蛋白质S10、L23、S19、L22、L16、L29、S17、L14、L24、S14、L18、L15、L36、S13、S11(Me)、L32、L7/L12中的至少一种作为所述标记蛋白质。
2.如权利要求1所述的微生物的识别方法，其特征在于：
使用7种核糖体蛋白质L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11中的至少一种作为所述标记蛋白质。
3.如权利要求2所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌空肠亚种(Campylobacter jejunisubsp.jejuni)、空肠弯曲菌德莱亚种(Campylobacter jejuni subsp.doylei)、大肠弯曲菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lali)这5种中的任一种。
4.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌空肠亚种时，作为所述标记蛋白质，至少包括L24、L32、L23、S14、L7/L12的任一种以及L23。
5.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌德莱亚种时，作为所述标记蛋白质，至少包括L24。
6.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为大肠弯曲菌时，作为所述标记蛋白质，至少包括L32、S14、由L23以及L24构成的组的任一种。
7.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为胎儿弯曲菌时，所述标记蛋白质，使用L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12、S11中的至少一种。
8.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
所述弯曲菌属菌的菌种为海鸥弯曲杆菌时，作为所述标记蛋白质，至少包括L23、L24、S14、L32、L7/L12中的一种。
9.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若其血清型为R，则作为所述标记蛋白质至少包括L23。
10.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若其血清型为A，则作为所述标记蛋白质至少包括L23或者L32、L7/L12的任一种。
11.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若其血清型为B，则作为所述标记蛋白质至少包括L7/L12。
12.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若其血清型为U，则作为所述标记蛋白质至少包括L7/L12。
13.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若其血清型为D，则作为所述标记蛋白质至少包括L32、L23或者L32、L24的任一种。
14.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌为空肠弯曲菌时，若识别其血清型为复合DF，则作为所述标记蛋白质至少包括L23。
15.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
使用将至少源自L24、S14、S11的质荷比m/z作为指标的聚类解析，对所述试样所含的微生物是所述弯曲菌属菌的亚种的哪一种进行分类。
16.如权利要求15所述的微生物的识别方法，其特征在于：
还将至少源自L24、S14、L36的质荷比m/z作为指标。
17.如权利要求15或权利要求16所述的微生物的识别方法，其特征在于：
还具有制作表示所述聚类解析的识别结果的树状图的步骤。
18.如权利要求3所述的微生物的识别方法，其特征在于：
在所述弯曲菌属菌的菌种为空肠弯曲菌时，使用聚类解析对其血清型进行分类，该聚类分析至少将源自L32、L7/L12、L23、S11或者L32、L7/L12、L24、S11的质荷比m/z作为指标。
19.如权利要求18所述的微生物的识别方法，其特征在于：
还将源自L23、L24、S14、L32、L7/L12的质荷比m/z作为指标。
20.如权利要求18所述的微生物的识别方法，其特征在于：
还将源自L23、L24、S14、L36、L32、L7/L12的质荷比m/z作为指标。
21.一种程序，其特征在于，在计算机上执行如权利要求1～20的任一项所述的各步骤。
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